DE602005004008T2 - Identifizierung einer, in der polycythemia vera implizierten, jak2 mutante - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Variante V617F des Tyrosinkinase-Proteins JAK2, wobei die Variante für die Vaquez-Polyzythämie verantwortlich ist. Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein Verfahren zur Diagnose in erster Intention der Erythrozytose und der Thrombozytose, welches erlaubt, diese mit myeloproliferativen Syndromen in Zusammenhang zu bringen, oder auf den Nachweis der Variante JAK2 V617F bei den myeloproliferativen Syndromen, welcher erlaubt, diese in eine neue nosologische Gruppe umzuklassifizieren, und auf die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren und von siRNA.
  • Die Vaquez-Polyzythämie (Polycythaemia vera oder PV) ist ein chronisches myeloproliferatives Syndrom, an welchem eine wahre Polyglobulie und oftmals eine Thrombozytose und eine Hyperleukozytose beteiligt sind. Es handelt sich um eine erworbene, klonale Erkrankung der hämopoetischen Stammzelle. Die hämopoetischen Vorläufer von PV sind in der Lage, in Abwesenheit von Erythropoietin (EPO) erythroblastische Kolonien zu bilden, welche als „spontale Kolonien" bezeichnet werden. Es ist gleichfalls eine Überempfindlichkeit der Erythroblasten-Vorläuferzellen von PV gegenüber mehreren anderen Wachstumsfaktoren nachgewiesen worden: Interleukin-3 (IL-3), Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Stammzellenfaktor (SCF) und insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-1). Mehrere Gruppen haben sich für die Pathophysiologie der PV interessiert, aber die molekulare Anomalie, die der Erkrankung zugrunde liegt, ist bis zu diesem Tag unbekannt geblieben (H. Pahl, 2000).
  • Die Überempfindlichkeit der Vorläuferzellen von PV gegenüber mehreren Zytokinen führt dazu, Anomalien zu untersuchen, welche die Signalübertragungswege, die den Zytokinrezeptoren gemein sind, berühren. Die Existenz eines molekularen Markers ist bei der PV niemals nachgewiesen worden, aber angesichts der Ähnlichkeiten zwischen der PV und den anderen myeloproliferativen Syndromen, insbesondere der CML, erscheint es wahrscheinlich, dass molekulare Mechanismen, welche jenen, die durch Bcr-Abl induziert werden, nahe stehen, für den Proliferationsvorteil des bösartigen Klons und seine terminale Differenzierung verantwortlich sind. Diese Hypothese ist unlängst bei zwei seltenen myeloproliferativen Syndromen, den myeloproliferativen Syndromen, die mit einer Translokation, an welcher die chromosomale Region 8p11, die eine konstitutive Aktivierung des FGF-Rezeptors induziert, beteiligt ist, in Zusammenhang stehen, und dem Hypereosinophilie-Syndrom, bei welchem eine kryptische chromosomale Deletion zu einem chimären PDGFRα-FIP1L1-Gen führt, bestätigt worden. In den beiden Fällen sind die molekularen Anomalien die Ursache für Fusionsproteine mit einer konstitutiven Tyrosinkinase-Aktivität.
  • Bei der PV wurde keine wiederkehrende zytogenetische Anomalie gefunden, obgleich eine Deletion 20q bei 10 bis 15% der Patienten und ein Verlust von Heterozygotie in 9p bei etwa 30% der Fälle nachgewiesen wird (Kralovics, 2002). Indessen sind diese Anomalien nicht für die Erkrankung spezifisch.
  • Da die Zellen von PV eine Unabhängigkeit gegenüber EPO aufweisen, wurden Untersuchungen an dem Weg des EPO-Rezeptors (R-EPO) ausgeführt. Zuallererst ist der Rezeptor sowohl auf struktureller als auch funktionaler Ebene normal (Hess et al., 1994; Le Couedic et al.; 1996; Means et al., 1989). Die Phosphatase SHP-1, die R-EPO und JAK2 bei Beendigung der Stimulation durch EPO dephosphoryliert, wird auf RNA- und Proteinebene normal exprimiert (Andersson et al., 1997; Asimakopoulos et al., 1997). Weiter oben im Signalweg von R-EPO wurde eine abnormale Aktivierung von STAT5 bei den vielkernigen Zellen (PNN; polynukleäre Neutrophile; polymorphkernige neutrophile Granulozyten) von Patienten, die eine PV aufweisen, untersucht, ohne eine Anomalie zu finden. Dafür wurde eine konstitutive Phosphorylierung von STAT3 in den PNN von 4 Fällen von PV bei 14 untersuchten Fällen nachgewiesen (Roder, 2001). Schließlich wurde die Expression des anti-apoptotischen Proteins bcl-x1, des transkriptionellen Ziels von STAT5, mittels Immunhistochemie und mittels Durchflusszytometrie untersucht (Silva et al., 1998). Es ist so gezeigt worden, dass bcl-x1 in den Erythroblasten von PV und insbesondere in einem reiferen Stadium, wo dieses Protein normalerweise nicht mehr exprimiert wird, überexprimiert wird.
  • Bei der Vaquez-Polyzythämie sind die hauptsächlichen diagnostischen Kriterien heutzutage klinische (PVSG-Kriterien; Pearson, 2001). Die biologische Diagnose beruht im Wesentlichen auf der Erstellung von Kulturen von erythroiden Vorläuferzellen in Abwesenheit von EPO (Nachweis von endogenen Kolonien). Aufgrund der fachlichen Qualifizierung, die für ihre korrekte Ausführung erforderlich ist, und des bedeutenden Aufwands an „Technikerzeit" steht diese Untersuchung nicht in allen Zentren zur Verfügung und ist nur dann zuverlässig, wenn sie durch ein erfahrenes Labor ausgeführt wird. Außerdem erfordert der Test, dass er für eine gute Empfindlichkeit an Knochenmarkszellen, die dem Patienten entnommen worden sind, ausgeführt wird, was für den Patienten nicht ungefährlich ist.
  • Durch subtraktive Hybridisierungstechniken hat eine deutsche Gruppe ein Gen kloniert, das in den PNN von PV überexprimiert wird, welches als PRV1 (Polycythemia Rubra Vera 1) bezeichnet wird (Temerinac et al., 2000). Das Protein PRV-1 gehört zu der Überfamilie der uPAR-Oberflächenrezeptoren. Die Überexpression der mRNA, die PRV-1 kodiert, in den polynuklearen Zellen von PV ist durch RT-PCR in Realzeit leicht nachweisbar und bildet einen unlängst entdeckten Marker für die Krankheit ohne pathophysiologische Rolle. Indessen zeigen die Untersuchungen, die unlängst veröffentlicht worden sind, dass er weder sehr empfindlich noch sehr spezifisch ist.
  • Spivak JL et al. beschreiben 2003 („Chronic myeloproliferative disorders"; Hematology; 2003; 200 24) bestimmte Marker der PV. Die mRNAs des neutrophilen Antigens NBI/CD177 werden in den Granulozyten von PV-Patienten überexprimiert. Dieser Marker scheint gleichwohl kein zuverlässiges Mittel zum Nachweis der PV zu sein, da bestimmte erkrankte Personen diese Überexpression nicht aufweisen oder diese Überexpression bei Patienten, die an anderen myeloproliferativen Syndromen als der Vaquez-Polyzythämie leiden, beobachtet werden kann. Eine verringerte Expression des Thrombopoietin-Rezeptors Mp1 auf Plättchen ist bei den PV gleichfalls gefunden worden. Obgleich diese Anomalie bei den PV dominiert, wird sie bei anderen myeloproliferativen Syndromen gefunden. Außerdem handelt es sich um eine schwierig auszuführende Untersuchung, die lediglich in spezialisierten Laboratorien ausgeführt werden kann. So gibt es im Stand der Technik kein einziges Verfahren, welches eine zuverlässige Diagnose der PV erlaubt. Außerdem sind die einzigen verfügbaren Behandlungen nicht spezifisch. Es handelt sich um Aderlasse, um den Hämatokrit in den Grenzen des Normalbereichs zu halten, oder um den Einsatz von zytotoxischen Mitteln oder ferner von IFN.
  • Im Rahmen der Erfindung haben wir nicht nur eine Mutation in dem Gen JAK2 bei etwa 90% der getesteten Patienten entdeckt, sondern wir haben gleichfalls ermittelt, dass diese Mutation für eine konstitutive Aktivierung dieser Tyrosinkinase verantwortlich ist, und gezeigt, dass ihre Inhibition erlaubt, die spontane Proliferation und Differenzierung der Erythroblasten von PV zu blockieren.
  • Die Sequenz von JAK2 wird in der Datenbank Uniprot unter der Nr. Q506Q0 beschrieben. Mutationen in JAK2 wurden ein Jahr nach der vorliegenden Erfindung in James Chloe et al., Nature, Band 434, Nr. 7037, S. 1144 und Baxter et al., Lancet, Band 365, Nr. 9464, S. 1054 beschrieben.
  • JAK2 gehört zu der Familie der Janus-Kinasen (JAKs), die mehrere intrazytoplasmatische Tyrosinkinasen: JAK1, JAK2, JAK3 und TYK2 zusammenfasst. Die JAK-Proteine sind an der intrazellulären Signalweiterleitung von zahlreichen membranständigen Rezeptoren, die keine intrinsische Tyrosinkinaseaktivität aufweisen, wie bestimmten Mitgliedern der Überfamilie der Zytokinrezeptoren und insbesondere dem EPO-Rezeptor (R-EPO), beteiligt. Das Protein JAK2 wird durch ein Gen, das 23 Exons umfasst, kodiert. Die komplementäre DNA hat eine Größe von 3500 Basenpaaren und kodiert ein Protein von 1132 Aminosäuren (130 kD) (1). Wir haben durch PCR und Sequenzierung eine erworbene und klonale Punktmutation in dem Exon 12 von JAK2 bei nahezu 90% der an PV leidenden Patienten identifiziert. Das Codon 617 „GTC", welches normalerweise ein Valin (V) kodiert, ist zu „TTC", welches ein Phenylalanin (F) kodiert, mutiert. Diese Mutation V617F wird bei den 25 getesteten Vergleichspersonen oder Patienten, die an sekundärer Polyglobulie leiden, nicht gefunden. Dafür wird sie bei 40% der essentiellen Thrombozythämien und bei 50% der Myelofibrosen gefunden, so dass diese Mutation einen neuen Rahmen für das myeloproliferative Syndrom definiert, wie Bcr-Abl die chronische myeloische Leukämie definiert hat.
  • Um zu untersuchen, ob die Variante der Erfindung JAK2 V617F effizient mit weit verbreiteten Instrumenten, die klassischerweise in den Hämatologie-Diagnoselaboratorien eingesetzt werden, nachgewiesen werden könnte, haben wir 119 Proben, die von Patienten mit einem Verdacht auf eine myeloproliferative Erkrankung stammten, analysiert. Wir haben gezeigt, dass JAK2 V617F durch die LightCycler®- und TaqMan®-Techniken effizient nachgewiesen wurde, wobei diese Letzteren ein wenig empfindlicher als die Sequenzierung waren. Wir haben dann den Nachweiswert von JAK2 V617F als diagnostischer Test in erster Intention bei 88 Patienten mit Hämatokritwerten über 51% geschätzt und gezeigt, dass die Mutation der PV-Diagnostik gemäß den WHO-Kriterien (R = 0,879) und PVSG (R = 0,717) mit einem positiven Vorhersagewert von 100% im Kontext der Erythrozytose entsprach. Auf der Grundlage von diesen Daten schlagen wir vor, dass der Nachweis von JAK2 V617F in den Granulozyten als ein Diagnosetest in erster Intention bei Patienten mit einer Erythrozytose angesehen werden soll, wodurch folglich die Ausführung einer Messung der Masse der roten Blutkörperchen, einer Aspiration von Knochenmark und einer in vitro-Analyse der Bildung von endogenen erythroiden Kolonien vermieden werden kann. Dieser Nachweis könnte auch in erster Intention auf die Gesamtheit der myeloproliferativen Syndrome oder deren Verdacht ausgedehnt werden. Dieser Nachweis wird bei den chronischen Thrombozytosen, für welche es keine sicheren biologischen Tests, um ein myeloproliferatives Syndrom zu bestätigen, gibt, von besonderer Bedeutung sein. Er wird gleichfalls bei der Diagnostik der Myelofibrosen und angesichts der klinischen Bilder, die mit Thrombosen unbestimmter Ätiologie verbunden sind, eine wichtige Untersuchung sein.
  • So stellt die Erfindung erstmals ein Diagnose-Hilfsmittel bereit und eröffnet den Weg für die gezielte Behandlung der PV und gleichfalls der mit dieser Mutation assoziierten myeloproliferativen Syndrome. Spezieller schlagen wir den Nachweis der Mutation JAK2 V617F als diagnostischen Test in erster Intention im Rahmen der Erythrozytose vor, was erlaubt, die Quantifizierung der Masse der roten Blutkörperchen und der endogenen erythroiden Zellen (EEC) eines Aspirats von Knochenmark bei der Hauptanzahl der Patienten und bei den chronischen Thrombozytosen zu vermeiden, was erlauben wird, eine lange ätiologische Untersuchung zu vermeiden.
  • Beschreibung der Erfindung
  • So betrifft die Erfindung unter einem ersten Aspekt das isolierte Protein JAK2 (Janus-Kinase 2), insbesondere das Protein Janus-Kinase 2 von Homo sapiens (NCBI-Aufnahmenummer NM_004972; GI: 13325062), welches eine Mutation an der Aminosäure 617 (Codon 617 der cDNA zu zählen ab dem ATG) umfasst, insbesondere die Mutation V617F, welche nachfolgend als Variante JAK2 V617F bezeichnet wird, wie sie in der nachfolgenden SEQ ID No. 1 dargestellt wird: SEQ ID No. 1 (V617F Janus-Kinase 2 von Homo sapiens oder JAK2 V617F)
    Figure 00040001
    Figure 00050001
  • Die Erfindung zielt gleichfalls auf Äquivalente von diesem an Position 617 mutierten Protein bei anderen Säugetieren, beispielsweise die JAK2 V617F bei anderen Säugetieren, wie der Ratte (NM_031514), dem Schwein, der Maus (NM_008413)... wie auch Varianten der SEQ ID No. 1, die außerdem eine oder mehrere Modifikationen, die die Aktivität und die 3D-Struktur der Variante nicht beeinflussen, umfassen, ab.
  • Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf eine Nukleotidsequenz, welche die SEQ ID No. 1 kodiert, vorzugsweise die SEQ ID No. 2 (Sequenz des humanen JAK2-Gens mit dem Codon TTC anstelle von GTC an dem Codon 617 (Mutation g/t an Position 1849, nachfolgend bezeichnet mit G1849T, ausgehend von dem ATG, welches den Translationsstart markiert).
  • Diese Sequenz kann sich in einem viralen oder Plasmid-Vektor oder ferner einer nackten DNA unter der Kontrolle eines in den Säugetierzellen wirksamen Promotors befinden. Die Erfindung erstreckt sich folglich auf einen Vektor, welcher das Protein JAK2 V617F exprimiert.
  • Der Vektor der Erfindung kann ein Kionierungs- und/oder Expressionsvektor sein und kann verwendet werden, um eine Wirtszelle, insbesondere eine Säugetierzelle mit Ausnahme der humanen embryonalen Stammzellen oder der humanen Keimzellen, vorzugsweise eine humane CD34+-Vorläuferzelle, zu transfizieren.
  • Nicht-humanes transgenes Tier als Modell der PV und anderer myeloproliferativer Syndrome
  • Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein nicht-humanes transgenes Tier, welches rekombinantes JAK2 V617F exprimiert. Dieses Tier kann vorzugsweise eine Maus oder eine Ratte sein. Die transgenen Ratten oder Mäuse, die als Modell dienen, können durch eine jegliche Methode, die durch den Fachmann geläufigerweise verwendet wird, insbesondere ein Knock-in (zielgerichtete Insertion einer Sequenz) durch homologe Rekombination oder gesteuerte Rekombination mit dem Cre-LoxP- oder FLP-FRT-System in ES-Zellen, erhalten werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung wird die erfindungsgemäße transgene Zelle durch Gen-Targeting („gene targeting") der Variante JAK2 G1849T auf der Ebene von einer oder mehreren Sequenzen des Genoms der Wirtszelle erhalten. Genauer wird das Transgen auf stabile Weise durch homologe Rekombination im Bereich von homologen Sequenzen in dem Genom der Wirtszelle inseriert. Wenn es sich darum handelt, eine transgene Zelle zu erhalten in Hinblick darauf, ein transgenes Tier herzustellen, ist die Wirtszelle vorzugsweise eine nicht-humane embryonale Stammzelle (ES-Zelle) (Thompson et al., 1989). Das Gen-Targeting stellt die gesteuerte Modifizierung eines chromosomalen Genorts durch homologe Rekombination mit einer exogenen DNA-Sequenz, welche eine Sequenzhomologie mit der endogenen Zielsequenz aufweist, dar. Man unterscheidet verschiedene Arten von genetischem Targeting. Hier kann das Gen-Targeting insbesondere dafür eingesetzt werden, um das wilde JAK2-Gen durch die Genvariante JAK2 G1849T oder eine jegliche andere genetisch ähnliche Variante zu ersetzen. In diesem Falle wird das Gen-Targeting als „Knock-in" (K-in) bezeichnet. Alternativ kann das Gen-Targeting eingesetzt werden, um die Expression von wildem JAK2 zu verringern oder zu beseitigen, dann um das Gen der Variante von JAK2 einzuführen. Es handelt sich dann um ein Gen-Targeting, welches als „Knock-Out” (KO) bezeichnet wird (siehe Bolkey et al., 1989). Die erfindungsgemäße Zelle ist dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen auf stabile Weise in das Genom der Zelle integriert ist und dass seine Expression durch die Regulationselemente des endogenen Gens gesteuert wird. Mit Integration auf stabile Weise soll die Insertion des Transgens in die genomische DNA der erfindungsgemäßen Zelle bezeichnet werden. Das so inserierte Transgen wird dann an die zelluläre Nachkommenschaft vererbt. Die Integration des Transgens erfolgt strangabwärts, strangaufwärts oder im Bereich des endogenen JAK2-Zielgens. Fakultativ können ein oder mehrere einer positiven oder negativen Selektion dienende Gene eingesetzt werden. Man kann auch DNA-Regionen mit Homologie zu dem Ziel-Genort, vorzugsweise in der Anzahl von zwei, gelegen auf beiden Seiten des Abschnitts des Reportergens oder auf beiden Seiten der vollständigen zu inserierenden Sequenz einsetzen. Mit „DNA-Regionen mit Homologie" sollen zwei DNA-Sequenzen bezeichnet werden, die nach einer optimalen auf Homologie basierenden Ausrichtung („Alignment”) und nach Vergleich für üblicherweise mindestens etwa 90% bis 95% der Nukleotide und vorzugsweise mindestens etwa 98 bis 99,5% der Nukleotide identisch sind. Das optimale Alignment der Sequenzen für den Vergleich kann mittels des lokale Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (1981), mittels des lokale Homologie-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970), mittels der Ähnlichkeitsuntersuchungsmethode von Pearson und Lipman (1988), mittels Datenverarbeitungssoftware, welche diese Algorithmen einsetzen (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ausgeführt werden. Auch wenn so wenig wie 14 bp zu 100% homologe Nukleotide ausreichend sind, um die homologe Rekombination in den Bakterien und den Säugetierzellen auszuführen, sind längere Abschnitte von homologen Sequenzen bevorzugt (im Allgemeinen bestehen diese Abschnitte aus mindestens 2000 bp, vorzugsweise mindestens 5000 bp für jeden homologen Sequenzabschnitt. Vorteilhafterweise wird die JAK-Sequenzvariante in die Gesamtheit der Elemente, welche eine Regulation vom endogenen Typ sicherstellen, inseriert, d. h. eine Gesamtheit, welche mindestens den Promotor, regulatorische Sequenzen (Enhancer, Silencer, Trennsequenzen), die Terminationssignale des endogenen JAK-Gens umfasst.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsweise umfasst das Transgen JAK G1849T mindestens die kodierende Sequenz, eine positive Selektionskassette, welche von Stellen, welche für die Wirkung von Rekombinasen spezifisch sind, eingerahmt ist oder nicht, beispielsweise eine Lox/Neo-TK/Lox- oder lox/Neo/lox- oder FRT/Neo-TK/FRT- oder FRT/Neo/FRT-Kassette, welche gleichfalls an der 5'-Position der Sequenz vorhanden sein kann, und dadurch gekennzeichnet, dass eine negative Selektionskassette, welche beispielsweise das oder die DTA- und/oder TK-Gene enthält, an mindestens einem der Enden des Transgens vorhanden ist. Das Transgen der Erfindung ist vorzugsweise direkt von einer exogenen DNA-Sequenz, welche von Natur aus in einer tierischen Zelle vorhanden ist, abgeleitet. Diese DNA-Sequenz in nativer Form kann beispielsweise durch Insertion von Restriktionsstellen, die für die Klonierung erforderlich sind, und/oder durch Insertion von ortsspezifischen Rekombinationsstellen (lox- und flp-Sequenzen) modifiziert sein.
  • Zu diesem Zweck kann die Variante JAK2 G1849T in einen Klonierungsvektor, der erlaubt, ihre Vermehrung in einer Wirtszelle sicherzustellen, und/oder fakultativ in einen Expressionsvektor, um die Expression des Transgens sicherzustellen, kloniert werden. Die Techniken der in vitro-DNA-Rekombination, die für die Konstruktion des Klonierungs- und/oder Expressionsvektors gemäß der Erfindung eingesetzt werden, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Für die Klonierung, die Isolierung der DNA, die Amplifzierung und die Reinigung werden die Standardtechniken eingesetzt; die enzymatischen Reaktionen, an welchen die DNA-Ligase, die DNA-Polymerase, die Restriktionsendonukleasen beteiligt sind, werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers ausgeführt. Diese Techniken und die anderen werden im Allgemeinen gemäß Sambrook et al., 1989) ausgeführt. Die Vektoren umfassen Plasmide, Cosmide, Bakteriophagen, Retroviren und andere tierische Viren, die künstlichen Chromosome, wie die YAC, BAC, HAC, und andere analoge Vektoren.
  • Die Verfahren, um transgene Zellen gemäß der Erfindung zu erzeugen, sind in Gordon et al., 1989, beschrieben. Diverse Techniken, um Zellen von Säugetieren zu transfizieren, werden von Keon et al., 1990, zusammenfassend dargestellt. Das erfindungsgemäße Transgen, welches fakultativ in einem linearisierten Vektor enthalten ist oder nicht, oder in Form eines Vektorfragments kann in die Wirtszelle durch Standardmethoden, wie beispielsweise die Mikroinjektion in den Kern ( US 4,873,191 ), die Transfektion durch Calciumphosphat-Präzipitation, die Lipofektion, die Elektroporation (Lo, 1983), den Wärmeschock, die Transformation mit kationischen Polymeren (PEG, Polybren, DEAE-Dextran...) oder ferner die Virusinfektion (Van der Putten et al., 1985), eingeführt werden.
  • Wenn die Zellen durch das Transgen transformiert worden sind, können sie in vitro kultiviert werden oder ebenso gut eingesetzt werden, um nicht-humane transgene Tiere herzustellen. Nach der Transformation werden die Zellen auf eine Nährschicht und/oder in ein geeignetes Medium ausgesät. Die Zellen, welche das Konstrukt enthalten, können unter Verwendung eines selektiven Mediums nachgewiesen werden. Nach einer ausreichenden Zeitspanne, um die Kolonien wachsen zu lassen, werden diese gewonnen und analysiert, um zu bestimmen, ob ein homologes Rekombinationsereignis und/oder eine Integration des Konstrukts stattgefunden haben. Um das Screening der Klone, die die Voraussetzung der homologen Rekombination möglicherweise erfüllen, auszuführen, können positive und negative Marker, welche ferner als Selektionsgene bezeichnet werden, in den homologen Rekombinationsvektor inseriert werden. Es wurden verschiedene Systeme zur Selektion der Zellen, in welchen das homologe Rekombinationsereignis stattgefunden hat, beschrieben (für eine zusammenfassende Übersicht US 5 627 059 ). Das einer positiven Selektion dienende Gen gemäß der Erfindung wird vorzugsweise unter den Antibiotikaresistenzgenen ausgewählt. Unter den Antibiotika kann man nicht-erschöpfend Neomycin, Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, Phleomycin, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol, Carbenicillin, Geneticin, Puromycin aufführen. Die diesen Antibiotika entsprechenden Resistenzgene sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt; als Beispiel macht das Neomycinresistenzgen die Zellen gegen das Vorhandensein des Antibiotikums G418 im Kulturmedium resistent. Das einer positiven Selektion dienende Gen kann gleichfalls unter dem HisD-Gen, wobei das entsprechende selektive Agens Histidinol ist, ausgewählt werden. Das einer positiven Selektion dienende Gen kann gleichfalls unter dem Gen der Guaninphosphoribosyltransferase (GpT), wobei das entsprechende selektive Agens Xanthin ist, ausgewählt werden. Das einer positiven Selektion dienende Gen kann gleichfalls unter dem Gen der Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), wobei das entsprechende selektive Agens Hypoxanthin ist, ausgewählt werden. Der oder die Selektionsmarker, die eingesetzt werden, um zu erlauben, die homologen Rekombinationsereignisse zu identifizieren, können in der Folge die Genexpression in Mitleidenschaft ziehen und können, sofern erforderlich, eliminiert werden durch das Einsetzen von ortsspezifischen Rekombinasen, wie der für die Lox- Stellen spezifischen Cre-Rekombinase (Sauer, 1994; Rajewski et al., 1996; Sauer, 1998) oder der für die FRT-Stellen spezifischen FLP-Rekombinase (Kilby et al., 1993).
  • Die positiven Kolonien, d. h. welche Zellen enthalten, in welchen mindestens ein homologes Rekombinationsereignis stattgefunden hat, werden durch eine Analyse durch Southern-Blotting und/oder durch PCR-Techniken identifiziert. Der Expressionsgrad der mRNA, welche dem Transgen entspricht, in den isolierten Zellen oder den Zellen des transgenen Tiers gemäß der Erfindung kann gleichfalls durch Techniken bestimmt werden, welche die Analyse durch Northern-Blotting, die Analyse durch in situ-Hybridisierung, durch RT-PCR umfassen. Die Zellen oder tierischen Gewebe, welche das Transgen exprimieren, können gleichfalls unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen das Reporterprotein gerichtet ist, identifiziert werden. Die positiven Zellen können dann verwendet werden, um die Manipulationen an dem Embryo und insbesondere die Injektion der durch homologe Rekombination modifizierten Zellen in die Blastozysten auszuführen.
  • Was die Maus betrifft, werden die Blastozysten ausgehend von weiblichen Tieren von 4 bis 6 Wochen, bei welchen eine Superovulation induziert worden ist, erhalten. Die Zellen werden trypsinisiert und die modifizierten Zellen werden in das Blastozöl einer Blastozyste injiziert. Nach der Injektion werden die Blastozysten in den Cornu uteri von pseudoschwangeren Weibchen eingeführt. Man lässt die Weibchen dann bis zum Geburtszeitpunkt in Ruhe und die resultierenden Würfe werden analysiert, um das Vorhandensein von mutierten Zellen, welche das Konstrukt aufweisen, zu bestimmen. Die Analyse eines unterschiedlichen Phänotyps zwischen den Zellen des neugeborenen Embryos und den Zellen der Blastozyste oder der ES-Zellen erlaubt, die chimären Neugeborenen nachzuweisen. Die chimären Embryos werden dann bis zum Erwachsenenalter aufgezogen. Die nicht-humanen Chimären oder chimären Tiere sind Tiere, in denen nur eine Subpopulation von Zellen ein verändertes Genom aufweist. Die chimären Tiere, welche das modifizierte Gen oder die modifizierten Gene aufweisen, werden im Allgemeinen miteinander oder mit einem nicht-humanen Wildtyp-Tier gekreuzt, um eine heterozygote oder homozygote Nachkommenschaft zu erhalten. Die männlichen und weiblichen Heterozygoten werden dann gekreuzt, um homozygote Tiere zu erzeugen. Außer, dass es nicht angegeben ist, umfasst das nicht-humane transgene Tier gemäß der Erfindung stabile Veränderungen der Nukleotidsequenz der Zellen der Keimbahn.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsweise der Erfindung kann die nicht-humane transgene Zelle gemäß der Erfindung als Kernspenderzelle im Rahmen eines Kerntransfers oder nuklearen Transfers dienen. Mit nuklearem Transfer soll der Transfer eines Kerns einer lebenden Vertebraten-Spenderzelle, eines erwachsenen Organismus oder eines Organismus im fötalen Stadium in das Zytoplasma einer entkernten Empfängerzelle der gleichen Spezies oder einer unterschiedlichen nicht-humanen Spezies bezeichnet werden. Der transferierte Kern ist umprogrammiert, um die Entwicklung von klonierten Embryonen zu steuern, die dann in trächtige Weibchen transferiert werden können, um den Fötus und die Neugeborenen zu erzeugen, oder eingesetzt werden können, um Zellen der internen Zellmasse in Kultur zu erzeugen. Es können verschiedene Kernklonierungstechniken eingesetzt werden; unter jenen kann man nicht-erschöpfend jene aufführen, die den Gegenstand der Patentanmeldungen WO 95 17500 , WO 97/07668 , WO 97 07669 , WO 98 30683 , WO 99 01163 und WO 99 37143 bilden.
  • So erstreckt sich die Erfindung gleichfalls auf ein nicht-humanes transgenes Tier, welches eine rekombinante Sequenz umfasst, welche JAK2 V617F kodiert. Diese Tiere können homozygot oder heterozygot (JAK2 V617F/JAK2 V617F oder JAK2 V617F/JAK2) sein. Diese Tiere reproduzieren insbesondere die Vaquez-Polyzythämie, aber gleichfalls ein jegliches myeloproliferatives Syndrom, welches durch JAK2 V617F induziert wird. Sie erlauben folglich, ein funktionelles Screening von Tyrosinkinase-Inhibitoren, insbesondere ein Screening von für JAK2 V617F spezifischen Inhibitoren auszuführen.
  • Eine andere Alternative kann darin bestehen, einen viralen Vektor (Retrovirus oder Lentivirus oder andere), welcher in der Lage ist, die Variante JAK2 V617F zu exprimieren, in nicht-humane hämopoetische Stammzellen, nicht-humane Vorläuferzellen oder nicht-humane ES-Zellen zu injizieren, um gleichfalls Modelle für Vaquez-Polyzythämie oder andere myeloproliferative Syndrome herzustellen.
  • Diagnose-Hilfsmittel
  • Unter einem dritten Aspekt zielt die Erfindung auf Diagnose-Hilfsmittel, welche erlauben, das Vorhandensein oder Fehlen der Mutation JAK2 V617F in einem Säugetier, das an einem myeloproliferativen Syndrom leidet oder ein solches möglicherweise aufweist, insbesondere bei den Patienten, welche eine Polyglobulie zeigen oder bei welchen man vermutet, dass sie die Symptome der Vaquez-Polyzythämie, von Thrombozythämien und/oder Myelofibrosen aufweisen, nachzuweisen, ab.
  • Zu diesem Zweck bezieht sich Erfindung auf Primer und Sonden, welche erlauben, das Vorhandensein oder Fehlen der Mutation in der nachfolgend beschriebenen Sequenz SEQ ID No. 2 nachzuweisen.
  • Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz von mindestens 10, 12, 15, 20, 30, 40 oder ferner 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden (beispielsweise von 10 bis 30 Nukleotiden oder von 10 bis 25 Nukleotiden) des Exons 12 oder der nachfolgenden Sequenz SEQ ID No. 3 oder 4 und umfassend das mutierte Nukleotid t1849, beispielsweise von 10 bis 30 Nukleotiden. SEQ ID No. 3
    Figure 00110001
  • Die unterstrichene Sequenz bezeichnet ein Beispiel von strangabwärts oder strangaufwärts gelegenen Zonen, welche die Gestaltung von Sonden oder Primern, welche für die Mutation an Position 1849 spezifisch sind (SEQ ID NO. 4), erlauben.
  • Beispiel von verschiedenen bevorzugten Primern und Sonden der Erfindung:
  • AUF DNA, PCR-PRIMER:
    Figure 00110002
  • AUF DNA, SEQUENZIERUNGSPRIMER:
    Figure 00110003
  • AUF cDNA, PCR- UND SEQUENZIERUNGSPRIMER:
    Figure 00110004
  • SNPS-SONDEN UND SONDEN FÜR DEN NACHWEIS VON MUTATIONEN UND siRNA (1829–1870):
    Figure 00110005
  • GENOTYPISIERUNG mittels LightCycler (DNA aus PNN oder Knochenmark)
    Figure 00120001
  • GENOTYPISIERUNG mittels LightCycler (beispielsweise cDNA von Plättchen)
    Figure 00120002
  • GENOTYPISIERUNG durch die Taqman-Technik (beispielsweise an DNA von mononuklearen Knochenmarkszellen)
  • Erkennung durch allel- und für einzelsträngige DNA spezifische fluoreszierende Sonden PCR-Reaktion
    Figure 00120003
  • Unter einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein in vitro- oder ex vivo-Diagnoseverfahren, welches erlaubt, das Vorhandensein oder Fehlen der Mutation JAK2 V617F in einer Probe nachzuweisen.
  • Tests mit den Nukleinsäuren der Erfindung
  • In einer ersten Ausführungsweise kann die Variante G1849T (welche der Mutation JAK2 V617F entspricht) nachgewiesen werden durch Analyse des Nukleinsäuremoleküls des JAK2-Gens. Im Rahmen der Erfindung versteht man unter „Nukleinsäure" eine mRNA, die genomische DNA oder die cDNA, welche von der mRNA abgeleitet ist.
  • Das Vorhandensein oder Fehlen der Nukleinsäure der Variante G1849T kann nachgewiesen werden durch Sequenzierung, Amplifizierung und/oder Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde und spezifischen Primern, wie vorstehend beschrieben: Sequenz abgeleitet von den SEQ ID No. 3 oder 4 und SEQ ID No. 5 bis 11 oder ferner SEQ ID No. 15 bis 24.
  • Die Erfindung schlägt folglich ein ex vivo- oder in vitro-Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante G1849T des JAK2-Gens in einer Probe eines Patienten, der an PV leidet oder möglicherweise eine PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom, insbesondere Erythrozytose, Thrombozythämien und Myelofibrosen, entwickeln könnte, vor, welches umfasst:
    den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante G1849T des JAK2-Gens in einer Nukleinsäureprobe des Patienten,
    dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein der Variante G1849T ein Hinweis auf PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom ist.
  • Die Nukleinsäureprobe kann ausgehend von einer jeglichen zellulären Quelle oder Gewebebiopsie erhalten werden. Diese Zellen müssen von hämopoetischem Ursprung sein und können ausgehend von zirkulierendem Blut, hämopoetischem Gewebe oder einem jeglichen Fluid, welches durch Blutzellen verunreinigt ist, erhalten werden. Die DNA kann extrahiert werden, indem ein jegliches Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, eingesetzt wird, wie die Verfahren, die in Sambrook et al. (1989) beschrieben werden. Die RNA kann gleichfalls isoliert werden, beispielsweise ausgehend von Geweben, die während einer Biopsie erhalten werden, unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, wie die Extraktion durch Guanidiniumthiophenat-Phenol-Chloroform.
  • Die Variante G1849T des JAK2-Gens kann in einer Probe von RNA oder DNA vorzugsweise nach Amplifizierung nachgewiesen werden. Die isolierte RNA kann beispielsweise einer Umkehrtranskription, dann einer Amplifizierung, wie einer RT-PCR-Reaktion unter Verwendung der für die mutierte Stelle spezifischen Oligonukleotide, oder die die Amplifizierung der Region, welche die Mutation enthält, beispielsweise das Exon 12 oder die Sequenz SEQ ID No. 3 oder 4, erlauben, unterworfen werden. Der Ausdruck „Oligonukleotid" wird hier eingesetzt, um eine Nukleinsäure von mindestens 10, vorzugsweise zwischen 15 und 25 Nukleotiden, vorzugsweise unter 100 Nukleotiden zu bezeichnen und die in der Lage ist, mit der genomischen DNA von JAK2, mit der cDNA oder ferner mit der mRNA zu hybridisieren.
  • Die Oligonukleotide der Erfindung können durch den Fachmann auf diesem Gebiet gemäß einer jeglichen bekannten Technik, wie radioaktive, fluoreszierende oder enzymatische Marker, markiert werden. Ein markiertes Oligonukleotid kann als Sonde, um das Vorhandensein oder das Fehlen der Variante G1849T des JAK2-Gens nachzuweisen, eingesetzt werden.
  • So sind die gemäß der Erfindung nützlichen Sonden und Primer jene, die spezifisch mit der Region des JAK2-Gens in der Nähe des Nukleotids an Position 1849 (Nummerierung ausgehend von dem ATG, welches den Transkriptionsbeginn markiert) hybridisieren.
  • Bei dem oben erläuterten Verfahren können die Nukleinsäuren vor dem Nachweis der Allelvariation durch PCR amplifiziert werden. Die Verfahren für den Nachweis der Allelvariation werden beispielsweise in „Molecular Cloning – A Laboratory Manual", zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) und Laboratory Protocols for Mutation Detection, hrsg. von U. Landegren, Oxford University Press, 1996, und PCR, 2. Auflage, von Newton & Graham, BIOS Scientific Publisher Limited, 1997, beschrieben.
  • Zu diesem Zweck ist es möglich, einen Amplifizierungsschritt, gefolgt von einem Nachweisschritt, welcher erlaubt, die Proben abhängig von dem Vorhandensein oder dem Fehlen der gesuchten Variante zu unterscheiden, zu kombinieren.
  • Verschiedene Techniken, die zu diesem Zweck angepasst sind, werden in EP 1 186 672 aufgeführt, wie die DNA-Sequenzierung, die Sequenzierung durch Hybridisierung SSCP, DGGE, TGGE, die Heteroduplex-Analyse, CMC, die enzymatische Spaltung von Fehlpaarungen, „hybridization based solid Phase hybridization", die DNA-Chips, „solution Phase hybridization TaqmanTM" (TaqmanTM-Hybridisierung in Lösungsphase) ( US 5 210 015 und US 5 487 972 ) wie auch die RFLP-Technik.
  • Der Nachweis kann ausgeführt werden, indem verschiedene alternative Verfahren eingesetzt werden: FREI, Fluoreszenz-Quenching, polarisierte Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Elektrolumineszenz, Radioaktivität und kolorimetrische Methoden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann umfassen, die Nukleinsäure der Probe zu extrahieren.
  • Wie vorstehend angegeben, kann die eingesetzte Probe Blut oder ein jegliches anderes Körperfluid oder Gewebe, das von einem Individuum erhalten wird, sein. Nach den Extraktions- und Reinigungsschritten der Nukleinsäure kann die PCR-Amplifizierung mittels der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt werden, um den Nachweis des Signals zu verbessern.
  • So kann das erfindungsgemäße Verfahren den Amplifizierungsschritt mittels der genannten Primer, gefolgt von einem Hybridisierungsschritt mit mindestens einer Sonde, vorzugsweise zwei Sonden, die unter Bedingungen hoher Stringenz mit den Sequenzen, welche der Region der vorstehend erwähnten Mutation G1849T entsprechen, hybridisieren, und dem Nachweis des durch die Marker der Sonden erzeugten Signals umfassen.
  • Beispielsweise zielt die Erfindung insbesondere auf ein in vitro-Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens der Variante G1849T des JAK2-Gens in einer Probe eines Patienten, welcher an PV leidet oder möglicherweise eine PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom entwickeln könnte, ab, welches den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante G1849T des JAK2-Gens in der Nukleinsäureprobe mittels eines oder mehrerer SNP („single nucleotide polymorphism"; Einzelnukleotidpolymorphismen), die für die Mutation G1849T des JAK2-Gens spezifisch sind, insbesondere der SEQ ID No. 17, 18 oder ferner 23 und 24 umfasst,
    dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein der Variante G1849T ein Hinweis auf PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom ist.
  • Dieser Nachweis mittels SNPs kann durch die TaqMan®-Technik, welche eine Allelunterscheidung erlaubt, ausgeführt werden. Diese Methode besteht im Wesentlichen in der Erkennung des Allels 1849 von JAK2 durch spezifische fluoreszierende Sonden auf einzelsträngiger DNA und umfasst eine PCR-Reaktion (mit einer Polymerase mit 5'-Exonuklease-Aktivität), den Nachweis der Emission von allelspezifischer Fluoreszenz der hybridsierten SNP, die Bestimmung des Genotyps durch Ablesung der Fluoreszenz am Endpunkt (Gewinnung eines Bilds, welches die Cluster von mutierter homozygoter, heterozygoter und normaler DNA zeigt).
  • Nachweis des mutierten Proteins JAK2 V617F
  • Gemäß einer anderen Ausführungsweise kann die Variante direkt innerhalb des JAK2-Proteins nachgewiesen werden.
  • Dazu zielt die Erfindung auf ein in vitro-Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante JAK2 V617F in einer Probe eines Patienten, der an PV oder einem jeglichen myeloproliferativen Syndrom, insbesondere Erythrozytose, leidet oder möglicherweise eine PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom, insbesondere Erythrozytose, entwickeln könnte, ab, welches umfasst:
    den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante JAK2 V617F in einer Probe des Patienten,
    dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein der Variante ein Hinweis auf PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom ist.
  • Die Variante JAK V617F kann durch ein jegliches geeignetes bekanntes Verfahren des Standes der Technik nachgewiesen werden.
  • Insbesondere kann eine Probe, die von einem Individuum erhalten worden ist, mit einem für die Variante V617F des JAK2-Proteins spezifischen Antikörper, beispielsweise einem Antikörper, der in der Lage ist, die Unterscheidung zwischen der Variante V617F und dem nicht mutierten JAK2-Protein (und einem jeglichen anderen Protein) zu treffen, in Kontakt gebracht werden.
  • Die Antikörper der Erfindung können monoklonale oder polyklonale, einzelkettige oder doppelkettige Antikörper, chimäre, humanisierte Antikörper oder Abschnitte von Immunglobulin-Molekülen, welche die Abschnitte umfassen, die in dem Stand der Technik dafür bekannt sind, dass sie den Bindungsfragmenten an das Antigen entsprechen, [humanes Fragment, human, F(ab')2 und F(v)] sein.
  • Diese Antikörper können immunkonjugiert sein, beispielsweise mit einem Toxin oder einem Marker.
  • Die Protokolle für die Gewinnung von polyklonalen Antikörpern sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt. Typischerweise können solche Antikörper durch die Verabreichung der Variante JAK2 V617F durch subkutane Injektion an weiße Neuseeland-Kaninchen, die vorab vorbereitet worden sind, um ein Vorimmunserum zu erhalten, erhalten werden. Die Antigene können bis zu 100 μl pro Stelle an 6 unterschiedlichen Stellen injiziert werden. Die Kaninchen werden zwei Wochen vor der ersten Injektion vorbereitet, dann periodisch durch dasselbe Antigen stimuliert, etwa drei Mal alle sechs Wochen. Dann wird eine Serumprobe zehn Tage nach jeder Injektion erhalten. Die polyklonalen Antikörper werden dann aus dem Serum durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des Proteins JAK2 V617F, um die Antikörper einzufangen, gereinigt.
  • Die monoklonalen Antikörper sind gegenüber den polyklonalen Antikörpern aufgrund ihrer hohen Spezifität bevorzugt.
  • Die Gewinnung von solchen monoklonalen Antikörpern liegt im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet, wissend, dass die Variante JAK2 V617F eine 3D-Struktur aufweist, die sich von dem wilden JAK2-Protein unterscheidet. Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezeichnet einen Antikörper, der in der Lage ist, nur ein Epitop eines Antigens zu erkennen.
  • Die monoklonalen Antikörper können durch Immunisierung eines Säugetiers, beispielsweise einer Maus, einer Ratte oder von anderen Säugetieren, mit der gereinigten Variante JAK2 V617F hergestellt werden. Die Zellen des immunisierten Säugetiers, die die Antikörper produzieren, werden isoliert und mit Myelom- oder Heteromyelomzellen fusioniert, um hybride Zellen (Hybridome) herzustellen.
  • Die Hybridomzellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren, werden als Quellen für die Produktion des Antikörpers eingesetzt. Die Techniken zur Erzeugung von Antikörpern, an welchen keine Immunisierung beteiligt ist, werden gleichfalls von der Erfindung ins Auge gefasst. Es handelt sich beispielsweise um die „phage display"-Technik.
  • Die gegen die Variante JAK2 V617F gerichteten Antikörper können in bestimmten Fällen eine Kreuzreaktion mit dem wilden JAK2-Protein zeigen. Wenn dies der Fall ist, ist eine Selektion der für die Variante V617F spezifischen Antikörper erforderlich. Zu diesem Zweck kann man beispielsweise eine Affinitätschromatographie mit dem wilden JAK2-Protein einsetzen, um die Antikörper einzufangen, die eine Kreuzreaktion mit wildem JAK2 zeigen.
  • So zielt die Erfindung auf einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch die Variante JAK2 V617F erkennt, wie auch die Hybridom-Linien, die diesen produzieren, ab.
  • Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf einen ELISA-Test mittels des Antikörpers, um das Vorhandensein oder das Fehlen der Variante JAK2 V617F in einer Probe nachzuweisen.
  • Eine Alternative zu der Verwendung der Antikörper kann beispielsweise in der Herstellung und der Identifizierung von Haptameren, die Klassen von Molekülen sind, die eine spezifische molekulare Erkennung erlauben, bestehen.
  • Haptamere sind Oligonukleotide oder Oligopeptide, die praktisch eine jegliche Klasse von Zielmolekülen mit einer hohen Affinität und Spezifität erkennen können.
  • Kits
  • Unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Kits, um zu bestimmen, ob ein Patient an der Vaquez-Polyzythämie oder an einem jeglichen anderen myeloproliferativen Syndrom, an welchem die Variante JAK2 V617F beteiligt ist, leidet.
  • Der Kit der Erfindung kann eine(n) oder mehrere Sonden oder Primer, wie vorstehend definiert, für den spezifischen Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Mutation G1849T in dem JAK2-Gen umfassen.
  • Der Kit kann gleichfalls eine wärmebeständige Polymerase für die PCR-Amplifizierung, eine oder mehrere Lösungen für die Amplifizierung und/oder den Hybridisierungsschritt wie auch ein jegliches Reagens, welches den Nachweis des Markers erlaubt, umfassen.
  • Bei einer anderen Ausführungsweise umfasst der Kit einen Antikörper, wie vorstehend definiert.
  • Die Kits der Erfindung können außerdem ein jegliches Reagens, welches für die Hybridisierung oder an die immunologische Reaktion auf einem festen Träger angepasst ist, enthalten.
  • Das Nachweisverfahren und der Nachweiskit werden in vorteilhafter Weise für die Subpopulation von Patienten, die einen Hämatokrit-Prozentsatz über 51% aufweisen, praktisch eingesetzt. Das Nachweisverfahren und der Nachweiskit werden gleichfalls in vorteilhafter Weise für die Subpopulation von Patienten, die eine Thrombozytenzahl über 450000 aufweisen, praktisch eingesetzt.
  • siRNA der Erfindung
  • Unter einem vierten Aspekt bezieht sich die Erfindung gleichfalls auf siRNAs, welche erlauben, die Expression von an Position 617 mutiertem JAK2, insbesondere von JAK2 V617F, um mehr als 50%, 75%, 90% oder 95% oder ferner um mehr als 99% zu verringern. Diese siR-NAs können in die Zellen oder Gewebe durch Lipofektion, Transduktion oder Elektroporation eingeführt werden. Sie erlauben, die mRNAs, die JAK2 V617F kodieren, spezifisch zu zerstören, was zahlreiche mögliche therapeutische Anwendungen, insbesondere die Behandlung der Vaquez-Polyzythämie, impliziert.
  • siRNAs werden in US 60/068562 (CARNEGIE) beschrieben. Die RNA ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Region mit einer doppelsträngigen Struktur (ds) aufweist. Die Inhibition ist spezifisch für die Zielsequenz, die Nukleotidsequenz eines Strangs der ds-Region der RNA, welche mindestens 25 Basen umfasst und zu dem Abschnitt des Zielgens identisch ist. Die Nukleotidsequenz des anderen Strangs der ds-Region der RNA ist komplementär zu jener des ersten Strangs und zu dem Abschnitt des Zielgens. Außerdem beschreibt die Anmeldung WO 02/44 321 (MIT/MAX PLANCK INSTITUTE) eine doppelsträngige RNA (oder Oligonukleotide derselben Natur, die chemisch synthetisiert worden sind), von denen jeder Strang eine Länge von 19 bis 25 Nukleotiden aufweist und in der Lage ist, spezifisch die posttranskriptionelle Expression eines Zielgens durch einen RNA-Interferenz-Prozess zu inhibieren, um die Funktion eines Gens zu bestimmen und um diese Funktion in einer Zelle oder einem Organismus zu modulieren. Schließlich bezieht sich WO 00/44895 (RIBOPHARMA) auf ein Verfahren zur Inhibition der Expression eines gegebenen Zielgens in einer eukaryotischen Zelle in vitro, in welchem eine dsRNA, die aus zwei getrennten einzelsträngigen RNAs gebildet wird, in die Zelle eingeführt wird, wobei ein Strang der dsRNA eine zu dem Zielgen komplementäre Region aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die komplementäre Region weniger als 25 Paare von aufeinanderfolgenden Nukleotiden aufweist. Der Fachmann wird sich auf die in diesen Dokumenten enthaltene Lehre für die Herstellung der siRNAs der Erfindung beziehen können.
  • Spezieller bezieht sich die Erfindung auf doppelsträngige RNAs von etwa 15 bis 30 Nukleotiden, 19 bis 25 Nukleotiden oder vorzugsweise etwa 19 Nukleotiden Länge, die komplementär (Strang 1) und identisch (Strang 2) zu der Sequenz SEQ ID No. 3, umfassend die Mutation G1849T, sind. Diese siRNAs der Erfindung können außerdem ein Dinukleotid TT oder UU am 3'-Ende umfassen.
  • Für die Gestaltung der siRNAs der Erfindung stehen zahlreiche Programme zur Verfügung:
    • – „siSearch Program" unter http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.6.html („Improved and automated prediction of effective siRNA", Chalk AM, Wahlesdelt C und Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004).
    • – "siDirect" unter http://design.rnai.jp/sidirect/index.php (Direct: highly effective, target-specific warsiRNA design softe for mammalian RNA interference, Yuki Naito et al., Nucleic Acids Res., 32, Nr. Web Server issuBand e© Oxford University Press, 2004).
    • – "siRNA Target Finder” von Ambion unter der Adresse http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_tools.html
    • – das „siRNA design tool" des Whitehead Institute of Biomedical Research am MIT unter der Adresse: http://jura.wi.mit.edu/pubint/http://iona.wi.mit.edu/siRNAext/.
  • Andere Programme sind aufgelistet unter:
    http://web.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAs.htm,
    insbesondere http://athena.bioc.uvic.ca/cgi-bin/emboss.p1?_action=input&_app=sirna.
  • Beispielsweise ist für die Sequenz TATGGAGTATGTT1849TCTGTGGAGA (SEQ ID No. 12) die Sinn-siRNA UGGAGUAUGUUUCUGUGGAdTdT (SEQ ID No. 13) und ist die Antisinn-siRNA UCCACAGAAACAUACUCCAdTdT (SEQ ID No. 14).
  • In einer besonderen Ausführungsweise werden die vorstehend beschriebenen siRNAs der Erfindung getestet und selektiert auf ihr Vermögen, die Expression von JAK2 V617F spezifisch zu verringern, ja sogar zu blockieren, wobei die Expression von wildem JAK2 so wenig wie möglich in Mitleidenschaft gezogen wird. Beispielsweise zielt die Erfindung auf siRNAs ab, welche eine Verringerung der Expression von JAK2 V617F über 80%, 90%, 95% oder 99% und keinerlei Verringerung oder eine Verringerung von wildem JAK2 unter 50%, 25%, 15%, 10% oder 5% oder ferner unter 1% erlauben.
  • Beispielsweise können die siRNAs der Erfindung ausgewählt werden in der Gruppe, bestehend aus:
    Figure 00190001
  • In einer anderen Ausführungsweise betrifft die Erfindung ein ddRNAi-Molekül, wie es generisch in der Anmeldung WO 01/70949 (Benitec) beschrieben wird, aber spezifisch abzielend auf JAK2 V617F. Die ddRNAi der Erfindung erlaubt die Auslöschung der JAK2 V617F kodierenden Sequenz und umfasst (i) eine Sequenz, die zu der SEQ ID No. 3, 4 oder 11 identisch ist; (ii) eine Sequenz, die zu der unter (i) definierten Sequenz komplementär ist; (iii) ein Intron, welches die Sequenzen (i) und (ii) trennt; wobei die Einführung dieses Konstrukts in eine Zelle oder ein Gewebe eine RNA erzeugt, welche in der Lage ist, die Expression von JAK2 V617F zu verändern.
  • Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf ein genetisch modifiziertes nicht-humanes Tier, welches eine oder mehrere Zellen, welche ein genetisches Konstrukt, welches in der Lage ist, die Expression von JAK2 V617F in dem Tier zu blockieren, zu verzögern oder zu verringern, enthalten, umfasst. Das Herstellungsverfahren eines solchen genetisch modifizierten Tiers ist in WO 04/022748 (Benitec) aufgeführt.
  • Screeningverfahren
  • Unter einem fünften Aspekt hat die Erfindung ein Screeningverfahren von für JAK2 V617F spezifischen Inhibitoren zum Gegenstand.
  • Mit „spezifischen Inhibitoren" sollen Verbindungen bezeichnet werden, die ein IC50-Verhältnis hinsichtlich JAK2/IC50 hinsichtlich JAK2 V617F über 5, 10 25 oder ferner 50 aufweisen. Beispielsweise weist die Verbindung eine IC50 hinsichtlich JAK2 V617F unter 1 µm, vorzugsweise 100 nM auf, wohingegen sie eine IC50 hinsichtlich JAK2 über 5 μM oder 10 μM aufweist.
  • Dieses Verfahren kann mit Hilfe des Proteins der Erfindung, einer Membranfraktion, welche das Protein umfasst, einer Zelle, welche das Protein exprimiert, oder ferner eines nicht-humanen transgenen Tiers, wie weiter oben beschrieben, ausgeführt werden.
  • So bezieht sich die Erfindung auf einen Test, welcher erlaubt, die spezifische Inhibition von JAK2 V617F durch eine oder mehrere Verbindungen zu bestimmen, umfassend die Schritte, welche darin bestehen, eine oder mehrere Verbindungen mit dem Protein JAK2 V617F, das oben beschrieben worden ist, einer Membranfraktion, welche JAK2 V617F umfasst, oder ferner einer Zelle, welche JAK2 V617F exprimiert, die vorstehend beschrieben worden ist, unter Bedingungen, welche für eine Bindung und einen Nachweis der spezifischen Bindung und/oder der Inhibition von JAK2 V617F geeignet sind, in Kontakt zu bringen.
  • Dieses Verfahren kann außerdem eine Messung der Bindung an wildes JAK2 umfassen. Dieses Verfahren kann gleichfalls in einer Aufeinanderfolge von Tests von mehreren Molekülen bestehen und einen Schritt einer Auswahl der Moleküle, welche eine IC50 für JAK2 V617F unter 1 µM, vorzugsweise 100 nM aufweisen, umfassen.
  • Dieses Verfahren kann außerdem einen negativen Selektionsschritt der vorstehend erwähnten Moleküle, die eine IC50 für JAK2 unter 5 µM oder 1 µM aufweisen, umfassen.
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein in vitro-Screening, wie vorstehend beschrieben, in welchem man durch Immunpräzipitation die Inhibition der Phosphorylierung von JAK2 V617F bestimmt.
  • Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein in vitro-Screening an CD34+-JAK2 V617F-Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich ohne Erythropoietin (EPO) zu differenzieren. Solche Zellen werden aus Patienten, die an der Vaquez-Polyzythämie leiden, isoliert. Die CD34+-JAK2 V617F-Zellen können in einem Medium, welches SCF und IL-3 umfasst, in Kultur genommen werden. Die Verbindungen werden zu dem Kulturmedium hinzugesetzt und man bestimmt die Fähigkeit der Zellen, zu proliferieren und sich zu 36+/GPA–-Zellen zu differenzieren. Man wählt die Verbindungen aus, für welche eine Verringerung der Anzahl von 36+/GPA–-Klonen beobachtet wird. So bezieht sich die Erfindung auf das obige Screeningverfahren mittels primärer CD34+-JAK2 V617F-Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich ohne Erythropoietin (EPO) zu differenzieren, oder auf Zelllinien, die durch die Einführung der Variante JAK2 V617F faktorunabhängig geworden sind. Die gleiche Art von Assay kann an Knochenmarkskulturen vom Typ CFU-E in halbfestem Medium ausgeführt werden und es kann direkt die Verbindung hinsichtlich der Inhibition der spontanen Vermehrung der Kolonien getestet werden.
  • Man kann gleichfalls eine jegliche oben beschriebene Säugetier-Zelllinie, welche rekombinantes JAK V617F exprimiert, einsetzen.
  • Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf ein Verfahren zur Identifizierung von Arzneimittelkandidaten, welches die Schritte umfasst, welche darin bestehen, Verbindungen an ein nicht-humanes transgenes Tier, welches JAK2 V617F exprimiert, wie weiter oben beschrieben, zu verabreichen, wobei das Tier die Vaquez-Polyzythämie reproduziert und/oder an einem myeloproliferativen Syndrom, das mit dem Vorhandensein von JAK2 V617F in Zusammenhang steht, erkrankt ist, um die Wirkung der Verbindung zu bestimmen, und die Arzneimittelkandida ten auszuwählen, für welche man eine Verringerung oder eine Blockierung der Proliferation und der spontanen Differenzierung der Erythroblasten von Vaquez-Polyzythämie oder eine Verringerung der mit dem Vorhandensein von JAK2 V617F in Zusammenhang stehenden Zellproliferation beobachtet.
  • Insbesondere wird dieses Verfahren mit einer K-in JAK2 V617F-Maus oder einer K-in JAK2 V617F-Ratte, wie oben beschrieben, ausgeführt.
  • Unter diesen Verbindungen kann man beispielsweise die oben erwähnten siRNAs, welche das mutierte Exon 12 von JAK2 als Ziel haben, insbesondere siRNAs, welche die Sequenz SEQ ID No. 3, 4 oder ferner die Sequenz SEQ ID No. 11, welche das mutierte Nukleotid t1849 umfasst, zum Ziel haben, aufführen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung der oben beschriebenen siRNAs oder ddRNAis und der Verbindungen, welche spezifisch JAK2 V617F inhibieren, für die Herstellung eines Arzneimittels. Das Arzneimittel ist insbesondere bestimmt für die Behandlung von Blutkrebserkrankungen, insbesondere der myeloproliferativen Syndrome, welche die Vaquez-Polyzythämie, die essentielle Thrombozythämie, die myeloide Splenomegalie oder primitive Myelofibrose und die chronische myeloische Leukämie (CML) umfassen. Das Arzneimittel ist gleichfalls für die Behandlung von anderen malignen Hämopathien bestimmt, welche mit der Mutation JAK2 V617F in Zusammenhang stehen und gegebenenfalls von soliden Tumoren, Karzinomen, Melanomen und Neuroblastomen, die JAK2 V617F exprimieren.
  • Für die Folge der Beschreibung und für die Beispiele wird auf die Figuren, deren Legende nachfolgend angegeben ist, verwiesen.
  • Legenden
  • 1: Entdeckung der Schlüsselrolle von JAK2 bei der PV
    Im Grundzustand ist JAK2 an die Box 1 in nicht-phosphoryliertem Zustand gebunden. Die Bindung an EPO modifiziert die Konformation des Rezeptors und erlaubt die Transphosphorylierung von JAK2, welche im Gegenzug die intrazytoplasmatischen Reste von EPO-R phosphoryliert und so die verschiedenen positiven (→) oder negativen (⫞) Effektoren der Signaltransduktion rekrutiert.
  • 2: Entwicklung einer Modellkultur von CD34+-Vorläuferzellen von PV, die sich ohne Erythropoietin differenzieren können.
    • 2A – Kultur mit EPO, SCF und IL-3
    • 2B – Kultur ohne EPO.
  • 3: Die Inhibition der JAK-STAT-, Pi3-K- und Src-Kinase-Wege verhindert die spontane erythroide Differenzierung.
  • 4: Protokoll der Inhibition von JAK2 in den Vorläuferzellen von PV.
  • 5: Ergebnisse der Inhibition von JAK2 in den Vorläuferzellen von PV.
    • 5A – Verringerung des Klonbildungsvermögens der 36+/gpa-. Kultur Tag 1-Tag 6 in SCF-IL3, Elektroporation Tag 5, Selektion Tag 6 (morpho/36+/gpa-). Methyl-SCF allein. Zählung am Tag 13 (Tag 7 nach Selektion).
    • 5B – Struktur von JAK2 mit der Mutation V617F (Exon 12).
  • 6: Genotypisierungsanalysen der SNP, um die Mutation JAK2 V617F in der genomischen DNA mit den LightCycler®- und TaqMan®-Techniken nachzuweisen.
    • A und B: Nachweis der Mutation durch die LightCycler®-Fusionsanalysenkurve mit den FRET-Hybridisierungssonden. A: Es sind Experimente mit verschiedenen Verdünnungen von HEL-DNA in TF-1-DNA aufgeführt. Der Peak JAK2 V617F (57°C) ist noch in einer Verdünnung von 1% nachweisbar. B: Es sind Ergebnisse, die von Proben von repräsentativen Patienten stammen, dargestellt (#1: homozygot; #2: heterozygot; #3: schwach; #4: nicht mutiert).
    • C: Nachweis der Mutation durch spezifische TaqMan®-Allelamplifizierung. Es sind Versuche von HEL-DNA-Verdünnung (HEL von 100 bis 1%: leere Quadrate; TF-1-Zellen: leere Kreise) und einige Proben von repräsentativen Patienten dargestellt (schwarze Kreuze). #a: homozygote Patienten; #b: heterozygote Patienten; #c: schwacher Patient; #d: nicht-mutierte Patienten.
  • 7: Diagnosekarte oder -diagramm, vorgeschlagen für die Diagnose einer Erythrozytose (d. h. eines Hämatokrit-Prozentsatzes über 51%).
  • Die Anzahl von betroffenen Patienten in jedem Schritt der Karte bzw. des Diagramms ist neben jedem Index (n) aufgetragen, wobei nur die Patienten, von denen alle klinischen Daten vorlagen, hier aufgelistet sind (n = 81). Der Nachweis von JAK2 V617F als Diagnosetest in erster Intention ersparte es 58/81 Patienten, sich anderen Untersuchungen unterziehen zu müssen, um ein myeloproliferatives Syndrom vom Typ PV zu diagnostizieren.
  • 8 und 9: Die Expression von V617F Jak2 in HEL-Zellen ist 24 h nach der Behandlung mit spezifischer siRNA JAK2 V617F jak2 (siRNA #1, 3 und 4) verringert.
    • 0 bis 6: Mit den siRNAs V617F Jak2 behandelte (1 bis 6) oder nicht behandelte (0) HEL-Zellen.
    • C+: 293HEK-Zellen, transfiziert mit dem Vektor V617F Jak2 RV.
    • C–: 293HEK.
  • 10: Das Expressionsniveau von WT Jak2 in K562-Zellen ist 24 h nach einer Behandlung mit für Jak2 V617 spezifischer siRNA nicht verändert.
    • Je: Mit den WT Jak2-siRNAs behandelte K562-Zellen
    • 0 bis 6: Mit den V617F Jak2-siRNAs behandelte K562-Zellen.
    • C–: 293HEK (keine Expression von JAK2).
  • Beispiel 1: Identifizierung der Mutation JAK2 V617F in 39/43 Patienten.
  • Die Entwicklung eines Zellkulturmodells von pathologischen Vorläuferzellen und die Verwendung von biochemischen Inhibitoren haben es uns erlaubt, zu ermitteln, dass die JAK2-SPAT5-, PI3-Kinase- und Src-Kinase-Wege für die von EPO unabhängige Differenzierung der Vorläuferzellen von PV notwendig sind (Ugo et al., 2004). Diese Ergebnisse haben uns in unse rer Hypothese bestärkt, gemäß welcher die primäre molekulare Läsion, die der PV zugrunde- liegt, eine Anomalie eines Schlüsselproteins sein musste, die zu der Deregulation eines Signalweiterleitungswegs führt, wie eine Mutation einer Tyrosinkinase, die jener eine konstitutive Aktivität verleiht. Gleichwohl ist es die Untersuchung von 43 Patienten, die an der Vaquez-Polyzythämie erkrankt sind, die es erlaubt hat, die Schlüsselrolle des Proteins JAK2 zu identifizieren, welches das am weitesten oben in diesen verschiedenen Signalweiterleitungswegen befindliche Protein ist und welches den Signalweiterleitungswegen der Zytokinrezeptoren, für welche Reaktionsanomalien bei der PV beschrieben worden sind, gemein ist. Wir haben die Beteiligung des Kinaseproteins JAK2 an der Pathophysiologie der PV durch 3 ergänzende Ansätze untersucht:
    • – einen funktionalen Ansatz (Inhibition von JAK2 in den PV-Zellen durch RNA-Interferenz);
    • – einen genomischen Ansatz (Sequenzierung der 23 Exons des Gens) und
    • – einen biochemischen Ansatz mit der Untersuchung einer Phosphorylierungsanomalie von JAK2, welche einer konstitutiven Aktivierung zugrunde liegt.
  • Das eingesetzte biologische Material stammt von an Polyglobulie erkrankten Patienten, die ihre Zustimmung erteilt hatten, und entspricht den Resten von Probennahmen, die in Diagnoseabsicht vorgenommen worden und am Laboratoire Central d'Hématologie de l'Hotel Dieu erfolgt waren, und aus therapeutischen Aderlassen.
  • 1.1 Funktionelle Untersuchung
  • Die Untersuchung der Funktion von JAK2 in den Erythroblasten von Patienten, die an Vaquez-Polyzythämie erkrankt sind, erfolgte, indem Erythroblasten von PV durch eine Elektroporation mit einer für die JAK2-Sequenz spezifischen siRNA (AMBION, Huntingdon, England), welche als Ziel eine auf dem Exon 15 der mRNA von JAK2 gelegene Sequenz erkennt, transduziert wurden. Wir haben gezeigt, dass die Inhibition von JAK2 das Klonbildungsvermögen und die „spontane" Differenzierung der Vorläuferzellen von PV in Abwesenheit von EPO stark verringerte. Die normalen erythroblastischen Vorläuferzellen, die mit der JAK2-siRNA transfiziert worden sind, haben ein klonogenes (klonbildendes) Potential, welches bezogen auf die Kontroll-siRNA um 70% verringert ist, was die Wirksamkeit der Transfektion mit der JAK2-siRNA bestätigt. Bei der PV wurden die Wirkungen der Inhibition von JAK2 in den erythroblastischen Vorläuferzellen in einem Kulturmodell ohne EPO untersucht, was erlaubte, die Zellen des malignen Klons zu untersuchen. Wir haben das klonogene Potential, die Apoptose und die Differenzierung der erythroblastischen Vorläuferzellen von PV nach Transfektion durch eine JAK2-siRNA verglichen mit einer Kontroll-siRNA verglichen. Die Untersuchung des Klonbildungsvermögens der ohne EPO kultivierten Vorläuferzellen von PV zeigt eine sehr deutliche Verringerung der Anzahl von Kolonien nach JAK2-siRNA-Transfektion bezogen auf die Kontroll-siRNA. Die durchflusszytometrische Analyse der Apoptose dieser Zellen zeigt eine signifikante Erhöhung der Apoptose in den durch die JAK2-siRNA transfizierten Zellen verglichen mit der nicht relevanten siRNA (70 gegenüber 53%). Die Untersuchung der Wirkungen der JAK2-siRNA auf die Differenzierung (Erfassung des Glycophorins A, nachgewiesen mittels Durchflusszytometrie), zeigt lediglich einen geringen Unterschied zwischen den durch die JAK2-siRNA transfizierten Vorläuferzellen gegenüber der Kontroll-siRNA.
  • Die Ergebnisse der zellulären Untersuchungen haben folglich gezeigt, dass JAK2 bei der von EPO unabhängigen Differenzierung der erythroiden Vorläuferzellen von PV notwendig war. Die ersten Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen (Immunpräzipitation) zeigen eine länger andauernde Phosphorylierung von JAK2 nach Zytokin-Deprivation der erythroiden Vorläuferzellen von PV bezogen auf normale Zellen.
  • 1.2 Genomische Untersuchung von JAK2
  • Die PCR an den 23 Exons ist an einem normalen Individuum ausgehend von genomischer DNA entwickelt worden. Dann haben wir drei an PV erkrankte Patienten untersucht, nachdem wir die genomische DNA von in vitro nach Zellkultur erhaltenen erythroiden Zellen extrahiert hatten. Wir haben eine in dem Exon 12 von JAK2 gelegene Punktmutation identifiziert, die bei 2 der 3 getesteten Patienten vorhanden war. Diese Mutation betrifft die Base Nr. 1849 der kodierenden Sequenz [Nummerierung beginnend bei dem ATG], GenBank NM_004972), transformiert das Codon 617 des JAK2-Proteins (V617F).
    • • Normales Codon 617: gtc codiert ein Valin (V)
    • • Mutiertes Codon 617: ttc codiert ein Phenylalanin (F).
  • Wir haben dank der im Internet veröffentlichten Datenbanken verifiziert, dass es sich nicht um einen bekannten Polymorphismus handelte.
  • Wir haben dann die Kohorte vergrößert. Bis zum heutigen Tag wurde die Mutation bei 39 an PV erkrankten Patienten von den 43 getesteten Fällen gefunden. Keine Vergleichsperson (15 getestete Fälle) oder Patient, der an sekundärer Polyglobulie litt (18 getestete Fälle), erwies sich als Träger der Mutation.
  • Ergebnisse der Sequenzierung bei den Patienten
    • • 39 mutiert/43 PV getestet (90%)
    • • 2/3 Heterozygote
    • • 13/39 „Homozygote", was 30% der Fälle entspricht (gleicher Anteil wie der Heterozygotie-Verlust in 9p).
  • Kontrollen
    • • 0 Fälle mutiert von 33 getesteten Vergleichspersonen
    • – Darunter 15 normale Individuen
    • – Und 18 sekundäre Polyglobulien (keine spontanen Kolonien).
  • Die Entdeckung dieser Anomalie von JAK2 erklärt die Überempfindlichkeit gegenüber zahlreichen Wachstumsfaktoren, die an der PV beteiligt ist (EPO, TPO, IL-3, IL-6, GM-CSF, Insulin). Tatsächlich ist JAK2 ein Protein, das an den Signalweiterleitungswegen der Rezeptoren dieser Zytokine beteiligt ist.
  • Außerdem ist die Assoziierung von JAK2 mit R-EPO singulär darin, dass JAK2 an R-EPO auf konstitutive Weise gebunden ist: die Assoziation JAK2/R-EPO, die im Golgi-Apparat beginnt, ist für die Prozessierung von R-EPO an der Membran der Erythroblasten notwendig. Eine Anomalie von JAK2, welche Modifizierungen der Assoziation von JAK2 mit R-EPO zugrunde liegt, könnte folglich das Vorherrschen der medullären Hyperplasie bei der erythroblastischen Linie erklären, wohingegen dieses Protein an zahlreichen Signalweiterleitungswegen beteiligt ist. Außerdem haben Moliterno und Koll. (Moliterno et al., 1998; Moliterno und Spivak, 1999) einen Mangel an Membran-Expression von mp1, der mit einem Glycosylierungsmangel verbunden ist, nachgewiesen. Es ist möglich, dass JAK2 in Analogie zu R-EPO für die Prozessierung von c-mp1 erforderlich ist. Die Anomalie von JAK2 könnte dann den Mangel an Membran-Expression von c-mp1, der bei der PV gefunden wird, erklären.
  • JAK2 bindet sich an R-EPO über ihre proximale Domäne im Bereich einer sehr stark konservierten Domäne, der Box2. In Abwesenheit einer Stimulation durch EPO ist JAK2 konstitutiv an R-EPO gebunden, aber in einer nicht-phosphorylierten und folglich nicht aktiven Form. Nach Stimulation des Rezeptors durch EPO phosphorylieren sich die beiden JAK2-Moleküle, dann phosphorylieren sie R-EPO, was die Rekrutierung, dann die Phosphorylierung von anderen an der Signaltransduktion beteiligten Proteinen, wie der Proteine STAT5, Grb2, PI3K, erlaubt. Das Protein JAK2 weist wie alle JAKs eine funktionelle Kinase-Domäne (JH1), eine Pseudokinase-Domäne ohne Tyrosinkinaseaktivität (JH2) und mehrere konservierte Domänen (JH3–JH7), die für Mitglieder der Familie der JAKs charakteristisch sind, auf. Die Domäne JH2 scheint an der Regulation der Tyrosinkinase-Aktivität von JAK2 beteiligt zu sein. Nach den verfügbaren Daten aus der Proteinkartierung von JAK2 (Lindauer, 2001) liegt die Aminosäure 617 in dieser Domäne JH2 und nach Modellierungsuntersuchungen in einer Region, welche für die Regulation der Kinase-Aktivität besonders wichtig ist.
  • Über das pathophysiologische Interesse an dieser Entdeckung (Verständnis der Mechanismen der Unabhängigkeit von den Zytokinen, Einteilung der verschiedenen SMP) hinaus ermöglicht der Nachweis dieser Mutation bei einem Patienten erstmals einen Test, welcher erlaubt, die Diagnose zu bestätigen. Im Rahmen einer diagnostischen medizinischen Maßnahme könnte die Untersuchung der Mutation von JAK2 an den polynuklearen Blutzellen, die zu dem malignen Klon gehören, erfolgen.
  • Die Erfindung ermöglicht gleichfalls die Entwicklung einer spezifischen Behandlung vom Typ eines für das mutierte Protein spezifischen Kinase-Inhibitors oder einer Gentherapie.
  • Beispiel 2: Nachweis der Mutante JAK2 V617F für die Diagnose von Erythrozytose in erster Intention
  • 2.1 PATIENTEN, MATERIALIEN UND METHODEN
  • Vergleich der Sequenzierung und von zwei Genotypisierungstechniken von SNP für den Nachweis von JAK2 V617F
  • Zellen des Patienten
  • Es wurden 119 Proben mit Verdacht auf MPD (d. h. von Erythrozytose, von Thrombozytose, von Hyperleukozytose) analysiert: 58 Blutproben wurden in der Aussicht gewonnen und 61 Archivproben von Knochenmark wurden retrospektiv analysiert.
  • Es wurden die peripheren Granulozyten isoliert unter Verwendung einer Dichtegradientenmethode gemäß den Anweisungen des Herstellers (Eurobio, Frankreich). Es wurden die mononukleären Zellen des Knochenmarks durch die Verwendung einer FicoII-Gradientenzentrifugation isoliert. Die genomische DNA wurde mit Standardprozeduren extrahiert. Um die Empfindlichkeit der LightCycler®- und TaqMan®-Techniken zu ermitteln, wurde die von einer homozytogen Probe mit einem minimalen Rest an Wildtyp-Allel stammende DNA in normaler DNA reihenverdünnt.
  • Zelllinien
  • Es wurden Reihenverdünnungen von DNA (1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01) der humanen Erythroleukämie-Zelllinie (HEL), die homozygot mutiert (JAK2 V617F) war, in DNA der Zelllinie TF-1 (nicht-mutiert) als positive Standardkontrollen eingesetzt. Die Zelllinien vermehrten sich in MEM-alpha-Medium (Invitrogen), welches mit fötalem Kälberserum angereichert war.
  • Nachweis der Mutation durch Analyse der LightCycler®-Fusionskurve mit FRET-Hybridisierungssonden
  • Es wurden Primer und Sonden ersonnen, um die Zielsequenz des Exons 12 von JAK2 zu amplifizieren und um damit zu hybridisieren. Die Position des Mutationsorts (1849G/T) wurde durch eine 3' mit Fluorescein markierte Donor-Einfang („Capture")-Sonde und die benachbart gelegene, mit LightCycler® Red 640 (LCRed640) an ihrem 5'-Ende markierte Akzeptor-Verankerungssonde, und deren 3'-Ende zur Vermeidung der Verlängerung phosphoryliert worden war, abgedeckt. Die Amplifizierung und die Analyse der Fusionskurve wurden an dem LightCycler®-Instrument (Roche Diagnostics, Meylan, Frankreich) ausgeführt. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 20 µl unter Verwendung von 10 ng DNA, 14 µl LightCycler FastStart DNA Master-Mischung, 3 mM MgCl2, 0,2 µM Primern, 0,075 µM von jeder Sonde. Kurz zusammengefasst, wurden die Proben 10 min auf 95°C erwärmt und einer Amplifizierung durch PCR von 45 Zyklen (10 s bei 95°C, 10 s bei 53°C, 15 s bei 72°C) folgten ein Denaturierungsschritt bei 95°C während 10 s, zwei Hybridisierungsschritte bei 63°C und 45°C während jeweils 30 s und einer Fusionskurve, die sich in dem Bereich zwischen 45 und 70°C befand (0,1°C/s). Die Analyse mittels des LightCycler®-Programms erfolgte durch die graphische Darstellung der Kurve der Ableitung der Fluoreszenz nach der Temperatur [2(dF12/F11)/dt) gegen T]. Die mutierten und WT-Peaks wurden bei 57 bzw. 63°C beobachtet.
  • Nachweis der Mutation durch spezifische Amplifizierung eines Allels durch TaqMan®
  • Es wurden zwei Primer ersonnen, um ein Produkt von 92 bp, welches den SNP an der Position 1849 umfasste, zu amplifizieren. Es wurden zwei fluorogene MGB-Sonden mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen, einem Ziel in Bezug auf das WT-Allel und einem Ziel in Bezug auf dasjenige, das mutiert war, ersonnen. Die Genotypisierung wurde in Platten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung der auf der TaqMan®-PCR basierenden Methode ausgeführt. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 12,5 µl unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA, 6,25 µl TaqMan® Universal Master Mix und 0,31 µl 40X Assays-on-Demand SNP Genotyping Assay Mix (Applied Biosystems). Die Platte wurde 10 min auf 95°C erwärmt, gefolgt von 40 Zyklen von Denaturierung bei 92°C während 15 s und einer Basenpaarbildung/Verlängerung bei 60°C während 1 min. Die Thermocyclisierung erfolgte mittels des 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Die Analyse erfolgte mit dem Programm SDS Version 1.3. Die Genotypisierung der Allelunterscheidung am Endpunkt erfolgte durch visuelle Inspektion einer Kurve der Fluoreszenz (Rn), welche von der WT-Sonde stammte, gegenüber der Rn der mutierten JAK2, erzeugt ausgehend von der Ablesung der Fluoreszenz nach der PCR.
  • Patienten mit einer Erythrozytose und Sammeln von Proben
  • Wir haben 88 Patienten mit Hämatokrit-Prozentsätzen über 51% zum Zeitpunkt der Diagnose vor irgendeiner Behandlung ausgewertet und das Vorhandensein der WHO- und PVSG-Kriterien untersucht. Der Wert von 51% wurde für das obere Ende des Normalbereichs für den Prozentsatz des Hämatokrits (Pearson TC et al., A Polycythemia Vera Updated: Diagnosis, Pathobiology, and Treatment. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program.) 2000: 51 bis 68) beibehalten. Die Knochenmarkszellen wurden für Quantifizierungen von Klonogenen gewonnen und die überschüssigen Zellen wurden für die Extraktion von DNA gesammelt. In verschiedenen Laboratorien wurde das Serum-Erythropoietin (EPO) gemessen und es wurde in der Folge berichtet, dass es niedrig, wenn es unterhalb des unteren Werts des Normalbereichs von jedem Labor liegt, normal oder erhöht war. Die peripheren Granulozyten, die von denselben Patienten stammten, wurden gereinigt, wie zuvor beschrieben, da Blutproben von jedem Zeitpunkt zur Verfügung standen. Die Knochenmarks- und Blutproben wurden gesammelt, nachdem man nach Aufklärung eine Einwilligung erhalten hatte.
  • Quantifizierungen der EEC
  • Die in vitro-Quantifizierungen des auf EPO ansprechenden Charakters der erythroiden Zellen wurden allesamt in dem gleichen Labor (Hotel Dieu, Paris) mit einer Plasma-Gerinnsel-Kulturtechnik, wie zuvor beschrieben (Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoetin in a Patient with pure red-cell aplasia. N. Engl. J. Med. 1996; 334; 630 bis 633), ausgeführt.
  • Statistische Analyse
  • Die Korrelation der Marker erfolgte unter Verwendung des Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten (R).
  • 2.2 ERGEBNISSE
  • Durchführbarkeit und Empfindlichkeit der auf der PCR basierenden Genotypisierungstechniken für den Nachweis der Mutation JAK2 V617F
  • Um die Effizienz der Sequenzierung, der LightCycler®- und Taqman®-Techniken zum Nachweis der Mutation JAK2 V617F auszuwerten, haben wir deren Vorhandensein in 119 Proben, welche von Patienten mit einem Verdacht auf MPD stammten, unter Verwendung der 3 Techniken parallel untersucht. Die Mutation JAK2 V617F wurde effektiv in 83/119 Proben nachgewiesen und 35 Proben wiesen die Mutation anhand von keiner der 3 Techniken auf. In nur einer Probe hat die Sequenzierung versagt, die Mutation nachzuweisen, die durch die beiden LightCycler®- und Taqman®-Techniken detektiert wird, was dementsprechend nahelegt, dass diese letzteren empfindlicher sein könnten.
  • Um die Empfindlichkeit der Technik auszuwerten, haben wir zwei unterschiedliche Verfahren eingesetzt: wir haben Reihenverdünnungen der DNA der auf homozygote Weise mutierten HEL-Zelllinie in der DNA der nicht mutierten Zelllinie TF-1 und Reihenverdünnungen der genomischen DNA, welche von einem für die Mutation JAK2 V617F homozygoten Patienten stammte, in normaler DNA getestet. Die Sequenzierung hat versagt, das mutierte Allel in einer Konzentration unter 5% DNA der Zelllinie HEL, verdünnt in DNA der Zelllinie TF-1, und in einer Konzentration unter 10% der DNA des auf homozygote Weise mutierten Patienten, verdünnt in normaler DNA, nachzuweisen. Die Empfindlichkeit der LightCycler®- und Taqman®-Techniken war äquivalent, leicht höher als die Sequenzierung, wobei sie 0,5 bis 1% der DNA der Zelllinie HEL, verdünnt in der DNA der Zelllinie TF-1 (6), und 2 bis 4% der DNA eines auf homozygote Weise mutierten Patienten, verdünnt in normaler DNA, erreichte.
  • Charakteristiken der Patienten mit einer Erythrozytose zum Zeitpunkt der Diagnose
  • Die hauptsächlichen Charakteristiken von 88 Patienten mit Hämatokrit-Prozentsätzen über 51% zum Zeitpunkt der Diagnose sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Charakteristiken der Patienten
    WHO-Kriterium PVSG-Kriterium WHO- und PVSG-Kriterien
    PV Idiopathische Erythrozytose PV Idiopathische Erythrozytose Sekundäre Erythrozytose Ht > 50%, aber keine AE
    n = 61 n = 11 n = 45 n = 21 n = 5 n = 3
    Verhältnis der Geschlechter (männlich/ weiblich) 38/23 11/0 28/17 18/3 4/1 3/0
    Mittleres Alter (Bereich) 61 (23 bis 92) 57 (24 bis 81) 58 (23 bis 92) 60 (53 bis 81) 65 (55 bis 77) 48,6
    Mittlere Ht (%) +/– σ 59 +/– 4,6 54,6 +/– 1,44 59,2 +/– 4,5 57,8 +/– 4,2 55,8 +/– 3,1 53,3 –/– 0,8
    Mittelwert Hb (g/dl) +/– σ 19,2 +/– 1,39 18,3 +/– 0,34 19,3 +/– 1,41 19 +/– 1,0 18,9 +/– 0,8 18,6 +/– 0,5
    Mittlere WBC (× 108) +/– σ 12,2 +/– 4,4 7,0 +/– 2,5 13,5 +/– 4,9 8,2 +/– 2,5 8,8 +/– 1,9 6,6 +/– 0,4
    Mittlere Thrombozytenzahl (× 108) +/– σ 463 +/– 148 212 +/– 38 503 +/– 149 245 +/– 60,4 212 +/– 29 175 +/– 19
    Splenomegalie 16/55 0/11 14/39 0/21 0/5 0/3
    Vorhandensein von EEC 59/60 1/11 43/44 11/21 0/5 0/3
    Niedriges EPO-Niveau 39/47 2/8 27/33 10/17 0/3 1/1
    Normales EPO-Niveau 8/47 6/8 6/33 7/17 3/3 0/1
    Zytogenetische Anomalien 7/32 0/3 6/23 0/7 n. b. 0/1
    JAK2 V617F positiv 57/61 0/11 43/45 8/21 0/5 0/3
  • 88 Patienten mit Hämatokrit-Prozentsätzen über 51% sind gemäß den PVSG- und WHO-Kriterien in vier Gruppen diagnostiziert worden: Vasquez-Erkrankung (PV), idiopathische Erythrozytose, sekundäre Erythrozytose und „keine absolute Erythrozytose" (keine AE), wenn der Messwert der Masse der roten Blutkörperchen nicht erhöht war. Bei 8 Patienten konnte keinerlei definierte Diagnose erstellt werden, denn einige klinische Daten standen nicht zur Verfügung. Ht: Hämatokrite; Hb: Hämoglobin; WBC: Leukozytenzahlen; EEC: endogene erythroide Kolonien; EPO: Erythropoietin; σ: Standardabweichung. Die Patienten konnten in 4 hauptsächliche Gruppen jeweils gemäß den WHO-Kriterien (Pierre R. et al., Herausgeber. World Health Organization Classification of Tumours; Pathology and Genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2001: 32 bis 34) und den PVSG-Kriterien (Pearson TC, Messinezy M. The diagnostic criteria of polycythaemia rubra vera. Leuk Lymphoma 1996: 22 Suppl. 1: 87 bis 93) eingeteilt werden: 61 bis 45 Patienten mit der Diagnose PV, 5 mit einer sekundären Erythrozytose, 11 bis 21 mit einer idiopathischen Erythrozytose und 3 ohne absolute Erythrozytose (Masse von roten Blutkörperchen normal). Die klinischen Daten waren für 7 Patienten unvollständig, was erklärt, warum die Diagnose von PV weder mit den WHO-Kriterien noch mit denjenigen vom PVSG-Typ bestätigt werden konnte. Aufgrund der Unterschiede zwischen den Kriterien A1 der beiden Klassifizierungen konnten 6 Patienten, bei denen keinerlei Messwert für die Masse der roten Blutkörperchen vorlag, in die WHO-Klassifizierung und nicht in diejenige vom PVSG-Typ eingestuft werden. Ein Patient zeigte zugleich eine Hypoxie und eine Bildung von EEC, was folglich die Diagnose schwierig macht. Bei 35 Patienten wurde eine zytogenetische Analyse ausgeführt; unter 32 PV-Patienten (gemäß dem WHO-Kriterium) hatten 7 zytogenetische Anomalien: 5 mit einer Trisomie 9, 1 mit 7q- und 1 mit zusätzlichem Material auf dem Chromosom 18.
  • Das Vorhandensein von JAK2 V617F entspricht den PVSG- und WHO-Kriterien von PV
  • JAK2 V617F war in 43/45 (96%) Patienten, bei denen PV gemäß den PVSG-Kriterien diagnostiziert wurde, und in 57/61 (93%) Patienten, bei denen die Diagnose mit den WHO-Kriterien erstellt wurde, vorhanden (Tabelle 1). Gleichwohl wiesen 8/29 Patienten, die gemäß der PVSG-Klassifizierung als nicht-PV eingestuft wurden, die Mutation auf, im Gegensatz zu keinem der 19 nicht-PV-Patienten der WHO; diese 8 Patienten wurden mit den PVSG-Kriterien als IE und mit jenen der WHO als PV angesehen. Keiner der mit SE diagnostizierten Patienten noch jener mit einer normalen Masse an roten Blutkörperchen („keine AE") hatte die Mutation. Das Vorhandensein oder Fehlen von JAK2 V617F entspricht so der positiven Diagnose von PV bei 76/80 Patienten (95%, R = 0,879, p < 0,0001), wenn man die WHO-Kriterien verwendet, und bei 64/74 Patienten (86,5%, R = 0,717, p < 0,0001) mit den PVSG-Kriterien. Da außerdem keiner der Patienten, die mit den WHO-Kriterien als nicht-PV diagnostiziert worden waren, die Mutation hatte, hat der Nachweis von JAK2 V617F einen Vorhersagewert von 100% im Kontext der absoluten Erythrozytose.
  • Einige Autoren (Mossuz P. et al., Diagnostic value of serum erythropoietin level in patients with absolute erythrocytosis. Haematologica 2004; 89: 1194 bis 1198) sehen die Messung der EPO-Serumkonzentration als einen Diagnosetest in erster Intention für die Patienten mit einer absoluten Erythrozytose mit einer Spezifität von 97% und einem Vorhersagewert von 97,8% für die PV-Diagnose, wenn die EPO-Konzentration unterhalb des unteren Werts des Normalbereichs liegt, an. In unserer Untersuchung wurde die Korrelation zwischen der EPO-Konzentration und der PV-Diagnose gemäß den WHO- und PVSG-Kriterien bei 50/61 (82%, R = 0,488, p = 0,0002) bzw. 39/56 (70%, R = 0,358, p = 0,0067) Patienten beobachtet. Wir haben dann die EPO-Serumkonzentration in Gegenwart oder in Abwesenheit von V617F JAK2 verglichen und es wurde festgestellt, dass 52/68 Patienten (76%, R = 0,416, p = 0,0004) eine adäquate Korrelation aufwiesen.
  • Das Vorhandensein der Mutation JAK2 V617F entspricht der Fähigkeit, EEC zu bilden. Drei unterschiedliche Gruppen haben gezeigt, dass von EPO abhängige Zelllinien, die mit JAK2 V617F transfiziert worden sind, unabhängig wie auch überempfindlich gegenüber EPO hinsichtlich ihrer Vermehrung waren, wodurch die Unabhängigkeit und die Überempfindlichkeit der erythroiden Vorläuferzellen, die bei der PV beschrieben werden, nachgeahmt werden. Folglich haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Patienten, die JAK2 V617F tragen, auch eine Bildung von EEC zeigten. Unter den 20 Patienten mit einer Erythrozytose, die keinerlei Bildung von EEC aufwiesen, wies einer die Mutation auf, was die Frage des positiven Vorhersagewerts des Nachweises von JAK2 V617F aufwirft; indessen, selbst wenn dieser Patient keinerlei EEC aufwies, erfüllte er zahlreiche positive WHO- und PVSG-Kriterien, was es erlaubte, diesen in den beiden Klassifizierungen als PV einzustufen. Dieser Patient musste folglich vielmehr als ein „falsches Negativergebnis bei den EEC" als ein „falsches positives Ergebnis hinsichtlich JAK2" angesehen werden. Unter den 67 Patienten, die EEC aufwiesen, trugen 62 die Mutation JAK2 V617F, wobei 5 Patienten bei Verwendung der empfindlichen Techniken für den Nachweis keine Mutation aufwiesen. Unter diesen 5 Patienten konnten 4/5 bzw. 2/5 in die PV-Gruppe gemäß den WHO- bzw. PVSG-Kriterien eingestuft werden. In der Gesamtheit der 87 analysierten Patienten entsprach das Vorhandensein oder das Fehlen der Mutation JAK2 V617F dem Vermögen oder dem Unvermögen, EEC zu bilden, in 81/87 Patienten (93,1%, R = 0,824, p < 0,0001).
  • Das Vorhandensein der Mutation JAK2 V617F in den mononuklearen Zellen des Knochenmarks (BMMC) entspricht seinem Vorhandensein in den peripheren Granulozyten.
  • Um zu untersuchen, ob die Verwendung der Granulozyten des peripheren Bluts, um die Mutation JAK2 V617F zum Diagnosezeitpunkt nachzuweisen, die Ausführung der Quantifizierung an den Knochenmarkszellen vermeiden könnte, haben wir die Ergebnisse, die durch das eine oder andere der Verfahren von Sequenzierung, LightCycler® und TaqMan® erhalten worden sind, bei 50 Patienten (einschließlich 35 PV, 8 SE und 8 andere Verdachtsfälle von MPD), von denen zugleich Proben von Knochenmark und von peripherem Blut zum Diagnosezeitpunkt zur Verfügung standen, verglichen. In allen Fällen (34 mutierte, 16 nicht mutierte) wurde die Mutation auf identische Weise nachgewiesen.
  • III. Schlussfolgerung
  • Wir schlagen so ein neues Diagnosediagramm von PV vor, worin der Nachweis von JAK2 V617F in den Granulozyten mit empfindlichen Techniken der erste Schritt bei der Diagnose einer Erythrozytose bis auf den Fall einer evidenten sekundären Erythrozytose ist (7). Diese Einstellung hat mehrere Vorteile: sie vermeidet die Ausführung einer Messung der Masse der isotopischen roten Blutkörperchen, die nicht immer zur Verfügung steht und deren Ergebnis manchmal Anlass zu Kontroversen gibt. Sie kann auch eine Knochenmarksaspiration und die Ausführung von quantitativen Bestimmungen von EEC, die Zeit benötigen und nicht gut standardisiert sind, vermeiden. Sie verringert die Kosten der positiven Diagnose von PV drastisch, denn nur die Patienten mit Hämatokrit-Prozentsätzen über 51% und die negativ hinsichtlich JAK2 V617F sind, müssen sich allen Untersuchungen unterziehen, die tatsächlich ausgeführt werden, um eine Erythrozytose zu charakterisieren. Auch wenn der Nachweis von JAK2 V617F allein in dem Kontext der Erythrozytose die Diagnose von PV tragen wird, kann eine Knochenmarksbiopsie noch nützlich sein, denn sie kann Anzeichen von Myelofibrose oder das Vorhandensein von blastischen Zellen zeigen, was folglich die leukämische Transformation der PV bestätigt. Gleichwohl erscheint uns, dass eine Knochenmarksbiopsie in dem Kontext einer etwaigen Untersuchung mit einer zytogenetischen Analyse ausgeführt werden müsste.
  • Es wurde auch JAK2 V617F bei 30% der ET, 50% der IMF und einigen seltenen, nicht charakterisierten MPD nachgewiesen, was folglich eine neue Gruppe von MPD mit unterschiedlichen klinischen Manifestationen definiert. Die Gründe für diese Unterschiede sind noch unbekannt und es ist noch zu früh, um diese Krankheiten in eine einzige myeloproliferative Gesamtheit mit einer gemeinsamen pathophysiologischen Ursache und unterschiedlichen Phänotypen umzuklassifizieren. Etwaige präzise klinische Untersuchungen würden die gemeinsamen Anzeichen zwischen PV, ET, IMF und anderen seltenen MPD, die JAK2 V617F tragen, speziell in Hinblick auf absolute Erythrozytose, auf der Ebene von EPO, von Myelofibrose und der zytogenetischen Anomalien präziser charakterisieren. Es wird so ins Auge gefasst, den Nachweis von JAK2 V617F als anfängliches Hilfsmittel bei der Diagnose der chronischen Hyperleukozytose, der Thrombozytose und der Erythrozytose einzusetzen. Das Vorhandensein von JAK2 V617F wird nicht nur eine neue Definition einer Gruppe von MPD erlauben, sondern es wird auch sicherlich die Grundlage für die Entwicklung von spezifischen zielgerichteten Therapien sein.
  • Beispiel 3: Die für die Mutation V617F JAK2 spezifischen siRNAs inhibieren V617F JAK2, nicht aber WT-JAK2.
  • Die siRNAs 1, 3 und 4, welche den SEQ ID No. 25 bis 27 entsprechen, inhibieren das mutierte Protein V617F JAK2, das durch die Linie HEL exprimiert wird, ohne das wilde JAK2-Protein, welches durch die Linie K562 exprimiert wird, zu inhibieren. Die Ergebnisse sind in den 8, 9 und 10 angegeben.
  • REFERENZEN
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    • – Casadevall, N., Vainchenker, W., Lacombe, C., Vinci, J., Chapman, J., Breton-Gorius, J., and Varet, B. (1982). Erythroid progenitors in Polycythemia Vera. demonstration of their hypersensitivity to erythropoietin using serum-free cultures. Blood 59, 447–451.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (39)

  1. Isoliertes JAK2 (Janus-Kinase 2)-Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mutation bezüglich der Aminosäure 617 umfasst, insbesondere die Mutation V617F, welche nachfolgend als „Variante JAK2 V617F" bezeichnet wird, deren Sequenz in der SEQ ID No. 1 angegeben ist, oder Äquivalente von diesem an Position 617 mutierten Protein in anderen Säugetieren.
  2. Nukleotidsequenz, welche die Variante JAK2 V617F nach Anspruch 1 kodiert, insbesondere die Sequenz SEQ ID No. 2, welche die Mutation t/g an Position 1849 ausgehend von dem ATG, welches den Beginn der Transkription bezeichnet, aufweist.
  3. Viraler, plasmidischer oder in Form von nackter DNA vorliegender Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er die Sequenz nach Anspruch 2 unter der Kontrolle eines in den Säugetierzellen wirksamen Promotors umfasst.
  4. Säugetierzelle mit Ausnahme von humanen embryonalen Stammzellen oder Keimstammzellen, welche die rekombinante Variante JAK2 V617F nach Anspruch 1 exprimiert.
  5. Transgenes, nicht-humanes Tier, welches rekombinantes JAK2 V617F nach Anspruch 1 exprimiert.
  6. Transgenes, nicht-humanes Tier nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Maus oder eine Ratte handelt, in deren Genom wenigstens die JAK2 V617F kodierende Sequenz durch homologe Rekombination oder zielgerichtete Rekombination integriert worden ist.
  7. Transgenes, nicht-humanes Tier nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass es JAK2 V617F/JAK2 V617F-homozygot oder JAK2 V617F/JAK2-heterozygot ist, wobei die Tiere die Vaquez-Polyzythämie und/oder myeloproliferative Syndrome, die durch JAK2 V617F induziert werden, reproduzieren.
  8. Sonden oder Primer, welche 10 bis 30 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz SEQ ID No. 3 oder 4 umfassen und das mutierte Nukleotid t1849 umfassen.
  9. Sonden oder Primer nach Anspruch 8, die unter den Sequenzen SEQ ID No. 5 bis 11 und 12 ausgewählt werden.
  10. Oligonukleotid von wenigstens 10 Nukleotiden, insbesondere zwischen 15 und 25 Nukleotiden, welches in der Lage ist, mit der genomischen DNA von JAK2 mit der Sequenz ID No. 4, umfassend das bezüglich tt849 mutierte Oligonukleotid, mit der cDNA oder der mRNA zu hybridisieren.
  11. Ex vivo- oder in vitro-Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante G1849T des Gens JAK2 in einer Probe von einem Patienten, der an PV leidet oder eine PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom, insbesondere Erythrozytose, Hyperleukozytosen, Thrombozytosen und Myelofibrosen, entwickeln könnte, umfassend: a) die Gewinnung einer Nukleinsäureproben des Patienten; b) den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante G1849T des Gens JAK2 in einer Nukleinsäureprobe, die von dem Patienten erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein der Variante G1849T ein Hinweis auf PV oder eines jeglichen anderen myeloproliferativen Syndroms ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Hybridisierungsschritt mit wenigstens einer Sonde nach einem der Ansprüche 8 bis 10 umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Amplifizierungsschritt durch PCR-Reaktion mit wenigstens einem Paar von Primern nach einem der Ansprüche 8 bis 10 umfasst.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es an den mRNAs von einem Individuum ausgeführt wird und eine RT-PCR-Reaktion umfasst.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Amplifizierungsschritt mittels der Primer umfasst, gefolgt von einem Schritt einer Hybridisierung mit wenigstens einer Sonde, vorzugsweise zwei Sonden, die unter hoher Stringenz mit den der Region der Mutation G1849T entsprechenden Sequenzen hybridisieren, und dem Nachweis des durch die Marker der Sonden erzeugten Signals, wobei die Sonden und Primer in Anspruch 8 bis 10 definiert sind.
  16. Ex vivo- oder in vitro-Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante JAK2 V617F in einer Probe eines Patienten, der an PV leidet oder PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom entwickeln könnte, umfassend: b) den Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Variante JAK2 V617F in einer Probe des Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorhandensein der Variante ein Hinweis auf PV oder ein jegliches anderes myeloproliferatives Syndrom ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, welches das Inkontaktbringen der Probe mit einem für die Variante V617F des Proteins JAK2 spezifischen Antikörper, vorzugsweise einem Antikörper, welcher in der Lage ist, zwischen der Variante V617F und dem nicht mutierten Protein JAK2 zu unterscheiden, umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper monoklonale oder polyklonale, einzelkettige oder doppelkettige Antikörper, chimäre, humanisierte Antikörper oder Antigenbindungsfragmente F(ab')2 und F(v) sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen ELISA-Test handelt.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es an der Unterpopulation von Patienten, die einen Hämatokrit-Prozentsatz über 51% aufweisen, ausgeführt wird.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es an der Unterpopulation von Patienten, die eine Thrombozytenzahl über 450000 aufweisen, ausgeführt wird.
  22. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch die Variante JAK2 V617F erkennt.
  23. Hybridom, welches einen Antikörper nach Anspruch 22 produziert.
  24. Kit zum Nachweisen der Variante JAK2 V617F in einem Tumor, umfassend einen oder mehrere Primer oder Sonden, wie in Anspruch 8 bis 10 definiert, für den spezifischen Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Mutation G1849T in dem JAK2-Gen.
  25. Kit zum Bestimmen, ob ein Patient unter der Vaquez-Polyzythämie oder einem jeglichen anderen myeloproliferativen Syndrom, an welchem die Variante JAK2 V617F beteiligt ist, insbesondere unter Erythrozytose, Hyperleukozytosen, Thrombozytosen und Myelofibrosen, leidet, umfassend eine oder mehrere Sonden oder Primer, wie in Anspruch 8 bis 10 definiert, für den spezifischen Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens der Mutation G1849T in dem JAK2-Gen.
  26. Kit nach Anspruch 24 oder 25, umfassend außerdem wenigstens ein Element, welches ausgewählt wird unter einer thermoresistenten Polymerase für die PCR-Amplifizierung, einer oder mehreren Lösungen für die Amplifizierung und/oder den Hybridisierungsschritt wie auch einem jeglichen Reagens, welches den Nachweis des Markers erlaubt.
  27. Kit zum Bestimmen, ob ein Patient unter der Vaquez-Polyzythämie oder einem jeglichen anderen myeloproliferativen Syndrom, an welchem die Variante JAK2 V617F beteiligt ist, leidet, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 22.
  28. siRNA, welche in der Lage ist, die Expression der Variante JAK2 V617F um mehr als 50% oder ferner um mehr als 95% zu verringern, dadurch gekennzeichnet, dass sie 19 bis 25 Nukleotide aufweist, vorzugsweise mit einer Länge von 19 Nukleotiden, wobei die Sequenz eines ersten Strangs identisch ist mit und die Sequenz eines zweiten Strangs komplementär ist zu der Sequenz SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 oder ferner der Sequenz SEQ ID No. 11, umfassend das mutierte Nukleotid t1849.
  29. In vitro-Verfahren, welches erlaubt, die spezifische Inhibition von JAK2 V617F durch eine oder mehrere Verbindungen zu bestimmen, welches die Schritte umfasst, welche daraus bestehen: a) eine oder mehrere Verbindungen mit dem Protein JAK2 V617F nach Anspruch 1, einer JAK2 V617F umfassenden Membranfraktion oder ferner einer JAK2 V617F exprimierenden Zelle nach Anspruch 4 unter Bedingungen, die für eine Bindung und/oder die Inhibition geeignet sind, in Kontakt zu bringen und b) einem Nachweis der spezifischen Bindung und/oder der Inhibition von JAK2 V617F.
  30. In vitro-Screeningverfahren, umfassend eine Aufeinanderfolge von Tests nach Anspruch 29 von mehreren Molekülen und einen Schritt einer Auswahl der Moleküle, die eine 1050 für JAK2 V617F unter 1 µM, vorzugsweise 100 nM aufweisen.
  31. In vitro-Verfahren nach Anspruch 30, umfassend außerdem eine negative Selektion der Moleküle, die eine IC50 für JAK2 unter 5 µM oder 1 μM aufweisen.
  32. In vitro-Screeningverfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, in welchem man durch Immunpräzipitation die Inhibition der Phosphorylierung von JAK2 V617F bestimmt.
  33. In vitro-Screeningverfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32 an primären CD34+ JAK2 V617F-Vorläuferzellen, die in der Lage sind, ohne Erythropoietin (Epo) zu differenzieren, oder an Zelllinien, die durch Einführung der Variante JAK2 V617F Faktor-unabhängig geworden sind.
  34. In vitro-Screeningverfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33 mittels einer Zelle nach Anspruch 4.
  35. Verfahren zur Identifizierung von Arzneimittelkandidaten, welches die Schritte umfasst, die daraus bestehen: a) Verbindungen an ein transgenes, nicht-humanes Tier, welches JAK2 V617F exprimiert, wie in einem der Ansprüche 5 bis 7 definiert, zu verabreichen, wobei das Tier die Vaquez-Polyzythämie reproduziert und/oder an einem myeloproliferativen Syndrom, das mit dem Vorhandensein von JAK2 V617F in Zusammenhang steht, leidet, b) die Wirkung der Verbindung zu bestimmen und die Arzneimittelkandidaten auszuwählen, für welche man eine Verringerung oder eine Blockierung der Proliferation und der spontanen Differenzierung der Erythroblasten von Vaquez-Polyzythämie oder eine Verringerung der Zellproliferation, die mit dem Vorhandensein von JAK2 V617F in Zusammenhang steht, beobachtet.
  36. Verwendung der SiRNAs nach Anspruch 29 für die Herstellung eines Arzneimittels.
  37. Verwendung nach Anspruch 36 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung von malignen Hämopathien, insbesondere der myeloproliferativen Syndrome, umfassend die Vaquez-Polyzythämie, die essentielle Thrombozythämie, die myeloische Splenomegalie oder die primitive Myelofibrose, bestimmt ist.
  38. Verwendung nach Anspruch 36 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung der mit der Mutation JAK2 V617F in Zusammenhang stehenden myeloproliferativen Syndrome und von anderen malignen Hämopathien und von soliden Tumoren, wie Karzinomen, Melanomen und Neuroblastomen, die JAK2 V617F exprimieren, bestimmt ist.
  39. Zusammensetzung, welche eine siRNA nach Anspruch 28 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
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