CN103547920B - 分析受试者的血液样品存在疾病标记物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分析受试者的血液样品中的疾病标记物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：a）从所述血液样品中的去核血细胞中提取核酸以提供去核血细胞提取的核酸部分；以及，b）分析所述去核血细胞提取的核酸部分中的疾病标记物的存在，其中，所述疾病标记物是所述受试者的细胞的基因中的疾病特异性的突变；或者，其中所述疾病标记物是所述受试者的细胞的基因的疾病特异性的表达谱。

Description

分析受试者的血液样品存在疾病标记物的方法

技术领域

本发明属于医学诊断领域，特别属于疾病诊断和监控领域。本发明涉及用于检测疾病的标记物、用于检测疾病的方法及用于确定疾病治疗有效性的方法。

背景技术

在临床实践中，非常需要能够在疾病的最早期检测到疾病、能够预测疾病的发展及能够实现为患者量身定制的疗法。特别是肿瘤病（癌症）的早期检测对确保疾病的有利治疗起到关键作用。尽管医学研究有很多发展，但癌症仍然是在世界范围内导致死亡的主要原因。当患者寻求治疗时，他们通常显示出远处转移灶的症状，这意味着太频繁地发生太晚检测到癌症的事件。

肺癌、前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌是最常见的肿瘤，且为了辅助外科切除、放射治疗、化学治疗或其它已知的治疗方法采取适当的补救措施，需要一种快速简单的方法用于癌症的早期诊断。用于癌症的良好诊断方法的可用性对于评定患者对治疗响应，或评定由于在原发位置或转移灶重新生长所带来的复发也是很重要的。

目前已知几种类型的癌症标记物，例如致癌基因产物、生长因子和生长因子受体、血管生成因子、蛋白酶、附着因子和肿瘤抑制基因产物等，且这几种类型的癌症标记物不仅认为对早期诊断是必需的，而且对以下诊断也是必需的：差别诊断患有不确定临床畸形的患者，例如用于区分良性畸形和恶性畸形；用于预测患有确定恶性肿瘤的特定患者对治疗所选择的疗法响应的可能性；且用于提供关于人类或动物受试者中患恶性肿瘤的风险、恶性肿瘤的存在或恶性肿瘤的未来行为。目前，通过肿瘤或癌症标记物的检测来检测和诊断癌症的能力是普遍感兴趣的领域，因而需要有在患者样本中识别新的且更多的癌症标记物的可再现且可靠的方法。

成胶质细胞瘤是人类中最常见且攻击性最强的类型的原发性脑肿瘤，这种疾病难以诊断，且甚至更难以治疗，这部分是因为阻碍治疗试剂递送和阻碍潜在的重要诊断标记物检测的血脑屏障。用于成胶质细胞瘤的诊断标记物是可获得的，但对肿瘤组织自身是特异性的，且需要肿瘤样品。

需要改善的筛选和检测方法以在早期阶段检测癌症和追踪疾病的发展。在癌症的情况中，我们处于如下状态：我们不仅需要检测肿瘤，还需要在它到达不能恢复的点（其中治疗变成缓解性治疗而不是治愈性治疗）之前检测到它。处于风险的人们以及患有复发性癌症的患者应被全面监控。另外，由于肿瘤可能对不同疗法有不同响应，因此患者的分级变得很重要。

使用肿瘤活检的遗传分析已经允许识别对癌症诊断以及显现患者分级策略有用的很多突变。但是，目前肿瘤遗传的弱点是对肿瘤活检的需要，而肿瘤活检常常是不可能从患者中解剖的。另外，活检的使用是静态的，且不允许随着时间对肿瘤的进展或复发进行遗传监控。此外，很多肿瘤是不均匀的，而导致这样的肿瘤活检出现潜在的假阳性或假阴性的遗传特征。

最近，循环的肿瘤细胞用于肿瘤进展或复发的诊断和监控的应用示出血液作为肿瘤来源的材料、特别是以细胞形式的组织碎片的来源的应用。但是循环的肿瘤细胞的应用对大部分癌症是无效的。

Calverley等（Clinical and Translational Science卷3,第5期,2010）公开了在转移的肺癌中血小板的基因表达的下调。作者识别出200个基因显示出在健康人和患者之间的差异表达。据作者所称，血小板的蛋白质组被反映在血小板的转录物组中。如被测量的基因表达与来自巨核细胞的基因相关联。但并没有公开当测试凝血细胞时测量了来源于除巨核细胞之外的其它细胞的RNA/DNA，且没有示出来源于其它细胞的循环的RNA/DNA可以被凝血细胞摄入。

通常，疾病标记物被定义为如下的化合物：当与正常的健康受试者相比时，所述化合物的浓度在来自患病患者的生物流体中被改变，优选升高，且所述化合物随后被用作指示疾病的标记物化合物。但是，由于缺少合适的技术已经妨碍了特异化合物、例如蛋白质在各种体液中作为疾病（诸如癌症）标记物的识别。

在除了癌症之外的其它疾病的情况中，也可获得难以检测到的标记物。这妨碍了疾病的早期诊断。

Lood等（Blood卷116,第11期,2010）公开了在患有SLE的患者的血小板中IFN-I调节的基因的基因表达升高。作者猜测IFNα影响巨核细胞中的基因表达，导致血小板中IFN-I调节的蛋白的水平升高。因此，来自巨核细胞的基因表达与SLE或血管疾病相关。但并没有公开来自患病细胞的RNA/DNA可以被血小板摄入。

本发明旨在克服现有技术中的问题，即不是所有的疾病组织或疾病类型（例如肿瘤）均产生循环的患病细胞（例如循环的肿瘤细胞）。本发明还旨在克服用于检测疾病（诸如癌症）的蛋白标记物难以检测的问题。另外，本发明旨在提供不需要活检且允许对患者全面监控的方法。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种分析受试者的血液样品中的疾病标记物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：a）从所述血液样品中的去核血细胞、优选凝血细胞中提取核酸以提供去核血细胞提取的核酸部分；以及，b）分析所述去核血细胞提取的核酸部分中的疾病标记物的存在；其中，所述疾病标记物是所述受试者的成核细胞的基因中的疾病特异性的突变；或者，其中所述疾病标记物是所述受试者的成核细胞的基因的疾病特异性的表达谱。

人们惊奇地发现，来自成核细胞的核酸存在于去核血细胞、诸如凝血细胞中。这可能是成核细胞将核酸排入血流中，然后这些被排出的核酸从血流中被去核细胞（诸如凝血细胞）摄入，或者以某一其它转运方式将来自成核细胞的核酸转移至去核血细胞。本发明人第一次实现了疾病标记物可用于从去核血细胞提取的核酸以识别来自成核细胞的疾病。

在本发明的方法的优选实施方式中，所述去核血细胞提取的核酸部分包括来源于成核细胞的核酸。在本发明及其实施方式的优选实施方式中，所述去核血细胞提取的核酸部分不是巨核细胞来源的核酸或巨核细胞来源的RNA，即要检测的核酸部分不是巨核细胞系或巨核细胞基因组来源的核酸部分。

本文所使用的术语“去核血细胞”指缺乏细胞核的细胞。该术语包括红细胞和凝血细胞。在本发明的各方面中，去核细胞的优选实施方式是凝血细胞。术语“去核血细胞”优选地不包括由于错误的细胞分裂所导致的缺乏细胞核的细胞。

本文所使用的术语“成核细胞”指具有细胞核的细胞。该术语包括体细胞、生殖细胞和干细胞，且可包括来自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、甲状腺、神经组织、结缔组织、血液、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤组织的细胞。成核细胞优选是来自患病组织的细胞。在优选实施方式中，上述成核细胞不是巨核细胞。

因此，本发明通常旨于分析已经从具有细胞核的细胞被转移至没有细胞核的细胞的核酸，其中，所述没有细胞核的细胞可以容易地从血流中分离，且包含来自成核细胞的核酸。

术语“细胞核”指在真核细胞中发现的膜包围的细胞器，该细胞器包含以染色体形式组织的大部分的细胞遗传物质。在这些染色体内的基因是细胞的核基因组。细胞核的内部包含很多亚核体，该亚核体含有包括RNA的核仁，包括RNA的核仁主要参与包括RNA的核糖体的装配。在核仁中产生后，核糖体被输出至细胞质，他们在细胞质中翻译mRNA。

去核血细胞提取的核酸部分优选是指包括染色体DNA、核糖体RNA、核仁RNA和/或信使RNA的部分。

如本文所使用的，且特别是在短语“成核细胞的基因中的突变”中，术语“基因”指成核（体）细胞的任意的核酸序列，包括染色体的核酸序列和染色体外的核酸序列，优选为细胞核的核酸序列，且可包括转录的和非转录的序列以及核糖体RNA序列，最优选地是被转录成RNA的染色体序列。

在本发明的方法的优选实施方式中，所述疾病特异性的突变位于染色体基因中。

在另一优选实施方式中，所述基因不是来自去核血细胞的基因。在另一优选实施方式中，所述基因不是来自巨核细胞的基因。在又一优选实施方式中，所述基因不是CD109。

在本发明的方法的优选实施方式中，所述疾病特异性的表达谱是染色体基因的表达谱。特别是在来自成核细胞的染色体基因中的mRNA存在于凝血细胞中。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述核酸是核糖核酸（RNA），更优选地是信使核糖核酸（mRNA）。

在本发明的方法的优选实施方式中，所述核酸不是mtDNA。因此，线粒体核酸优选不是本发明的一方面。

在根据本发明的分析血液样品的方法的另一优选实施方式中，分析所述去核血细胞提取的核酸部分中的疾病标记物的存在的所述步骤b）包括：

i）使用至少一个核酸突变特异性的扩增引物或探针，通过反转录酶的聚合酶链式反应扩增来选择性扩增所述突变；或者

ii）通过反转录酶的聚合酶链式反应扩增来选择性扩增多个mRNA，以确定编码所述mRNA的染色体基因的表达水平，从而提供所述基因的表达谱且将所述表达谱与参照谱进行对比。

上述血液样品优选在体外。

在本发明的方法的优选实施方式中，上述疾病选自由癌症、自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病、神经性障碍和心血管疾病所组成的组中。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病选自由自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病、神经性障碍和心血管疾病所组成的组中。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病是癌症。

在本发明的方法的又一优选实施方式中，所述癌症是实体肿瘤癌症，优选选自结肠、胰腺、脑、膀胱、乳腺、前列腺、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、甲状腺、神经组织、上皮组织、淋巴结、骨、肌肉和皮肤。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是癌症。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是血管疾病。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是系统性红斑狼疮。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是镰刀状细胞疾病。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是阿尔茨海默氏疾病（Alzheimer’s disease）。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是与病态巨核细胞功能相关的疾病。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病不是与病态血小板功能相关的疾病。

上述在优选实施方式中被放弃的实施方式可以以任何组合相结合。

在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述疾病选自由自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病和神经性障碍所组成的组中。

在本发明的各方面的优选实施方式中，自身免疫性疾病选自由胃酸缺乏自身免疫活动性慢性肝炎（Achlorhydra Autoimmune Active Chronic Hepatitis）、急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质脑炎、阿狄森氏病（Addison's Disease）、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗-GBM/TBM肾炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征（Antisynthetase syndrome）、多发性关节炎（polyarticular Arthritis）、特异反应性过敏（Atopic allergy）、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生性综合征、自身免疫性周围神经疾病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫多内分泌腺综合征、自身免疫性孕酮皮炎、自体免疫性血小板减少性紫癜（Autoimmunethrombocytopenic purpura）、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病（Balo disease）/巴洛同心性硬化、贝切特氏综合征（Bechets Syndrome）、柏格氏症（Berger's disease）、毕氏脑炎（Bickerstaff's encephalitis）、布劳综合征（Blau syndrome）、大疱性类天疱疮（BullousPemphigoid）、卡斯尔曼病（Castleman's disease）、乳糜泻病（Celiac disease）、查格斯氏病（Chagas disease）、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、慢性复发性多病灶性骨髓炎、慢性莱姆病（Chronic lyme disease）、慢性阻塞性肺病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、乳糜泻病（Coeliac Disease）、耳蜗前庭综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症（Complement component2deficiency）、颅动脉炎、CREST综合征、克朗氏病（Crohns Disease）、库欣综合征（Cushing's Syndrome）、皮肤白细胞破碎性血管炎（Cutaneous leukocytoclastic angiitis）、Dego's病、德尔肯氏病（Dercum's disease）、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、发散性皮肤系统硬化症（Diffuse cutaneous systemicsclerosis）、德雷斯勒综合征（Dressler's syndrome）、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位、附着点炎相关关节炎（Enthesitis-related arthritis）、嗜酸性筋膜炎、嗜酸细胞性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症（Essentialmixed cryoglobulinemia）、伊凡综合征（Evan's syndrome）、进行性骨化性纤维发育不良、纤维组织肌痛/纤维肌炎、纤维性肺泡炎（Fibrosing aveolitis）、胃炎、胃肠道类天疱疮（Gastrointestinal pemphigoid）、巨细胞性动脉炎、血管球性肾炎、古德帕斯丘综合征（Goodpasture's syndrome）、格氏病（Graves'disease）、吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barrésyndrome）、桥本脑炎（Hashimoto's encephalitis）、乔本氏甲状腺炎（Hashimoto'sthyroiditis）、溶血性貧血、过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura）、妊娠疱疹、化脓性汗腺炎、休斯综合征（Hughes syndrome）、低γ球蛋白血症、特发性炎症脱髓鞘疾病（Idiopathic Inflammatory Demyelinating Diseases）、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎症性脱髓鞘性多神经病（Inflammatorydemyelinating polyneuopathy）、间质性膀胱炎、肠易激综合征（IBS）、幼年特发性关节炎、幼年型类风湿关节炎、川崎氏病（Kawasaki's Disease）、兰伯特-伊顿肌无力综合征（Lambert-Eaton myasthenic syndrome）、白细胞分裂性脉管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、线性IgA疾病、路格里克氏病（Lou Gehrig's Disease）、狼疮状肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征（Majeed syndrome）、梅尼埃尔氏病（Ménière's disease）、显微镜下多血管炎、米-费综合征（Miller-Fisher syndrome）、混合性结缔组织病、硬斑病、穆-哈二氏病（Mucha-Habermann disease）、韦二氏综合征（Muckle-Wells syndrome）、多发性骨髓瘤、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、嗜眠发作（Narcolepsy）、视神经脊髓炎、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮（Occular cicatricial pemphigoid）、眼阵挛-肌阵挛综合征（Opsoclonusmyoclonus syndrome）、奥德甲状腺炎、复发性风湿病、PANDAS、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、帕-罗二氏综合征（Parry Romberg syndrome）、特纳氏综合征（Parsonnage-Turner syndrome）、睫状体扁平部炎（Pars planitis）、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周脑脊髓炎（Perivenous encephalomyelitis）、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病（Progressive inflammatory neuropathy）、牛皮癣、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生失调症、拉斯姆森脑炎（Rasmussen's encephalitis）、雷诺现象（Raynaudphenomenon）、复发性多软骨炎、莱特尔氏病（Reiter's syndrome）、不宁腿综合症、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、风湿热（Rheumatoid fever）、类肉状瘤病、精神分裂症、施密特综合征（Schmidt syndrome）、施尼茨勒综合征（Schnitzler syndrome）、巩膜炎、硬皮病、肖格伦综合征（syndrome）、脊椎关节病、粘血综合征、斯蒂尔病（Still's Disease）、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎（SBE）、苏萨克氏综合征（Susac's syndrome）、急性发热性嗜中性皮病（Sweet syndrome）、西德纳姆舞蹈、交感性眼炎、高安氏动脉炎（Takayasu's arteritis）、颞动脉炎、托洛萨-亨特综合征（Tolosa-Hunt syndrome）、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病（Undifferentiatedspondyloarthropathy）、脉管炎、白癫风、韦格纳肉牙肿（Wegener's granulomatosis）、威尔逊氏综合征（Wilson's syndrome）和威斯科特-奥尔德里奇综合征（Wiskott-Aldrichsyndrome）所组成的组中。

在本发明的各方面的其它优选实施方式中，所述皮肤疾病选自由痤疮样疹（Acneiform eruptions），自身炎症综合征（Autoinflammatory syndromes），慢性起泡（Chronic blistering），粘膜的症状（Conditions of the mucous membranes），皮肤附属器官的症状（Conditions of the skin appendages），皮下脂肪的症状（Conditions ofthe subcutaneous fat），先天异常，结缔组织疾病（如真皮纤维和弹性组织的异常），真皮和皮下生长，皮炎（包含特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、脓疱性皮炎和脂溢性皮炎），色素沉着紊乱，药疹（Drug eruptions），内分泌相关的皮肤，嗜酸性皮肤病（Eosinophilic），表皮痣，赘生物（neoplasms），囊肿，红斑（Erythemas），遗传性皮肤病，感染相关的皮肤病，苔藓样疹，淋巴相关的皮肤病，黑色素痣和赘生物（包含黑色素瘤），单核细胞相关的皮肤病和巨噬细胞相关的皮肤病，粘蛋白增多症（Mucinoses），神经皮肤综合征（Neurocutaneous），非感染性免疫缺陷相关的皮肤病，营养相关的皮肤病，丘疹鳞屑角化过度（Papulosquamoushyperkeratotic）（包含掌跖角化病（Palmoplantar keratodermas）），妊娠相关的皮肤病，搔痒症，牛皮癣，反应性嗜中性皮肤病（Reactive neutrophilic），顽固的掌跖喷发（Recalcitrant palmoplantar eruptions），由代谢中的错误所导致的皮肤病，由物理因素所导致的皮肤病（包含电离辐射诱发的皮肤病），荨麻疹和血管性水肿，脉管相关的皮肤病所组成的组中。

在本发明的各方面的其它优选实施方式中，所述内分泌疾病选自由肾上腺失调症、葡萄糖代谢失调症、甲状腺失调症、钙稳态失调症和代谢性骨疾病、垂体腺失调症及性激素失调症所组成的组中。

在本发明的各方面的其它优选实施方式中，所述眼疾病选自由H00-H06眼睑、泪腺系统和泪道的失调症，H10-H13结膜的失调症，H15-H22巩膜、角膜、虹膜和睫状体失调症，H25-H28晶状体失调症，H30-H36脉络膜和视网膜失调症（包含H30脉络膜视网膜炎、H31脉络膜的其它失调症、H32在归类到别处的疾病中的脉络膜视网膜失调症、H33视网膜脱离和断裂、H34视网膜血管闭塞、H35其它视网膜失调症及H36在归类到别处的疾病中的视网膜失调症），H40-H42青光眼，H43-H45玻璃体和玻璃球失调症，H46-H48视神经和视觉通路失调症，H49-H52眼球外肌、双眼的运动、适应和折射失调症，H53-H54.9视力障碍和失明，及H55-H59眼及附属器管的其它失调症所组成的组中。

在本发明的各方面的其它优选实施方式中，所述神经性障碍选自由辨重障碍、获得性癫痫性失语、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不良、失认症、艾卡迪综合征（Aicardi syndrome）、亚历山大病（Alexander disease）、异手综合征、感觉异侧、阿尔珀斯病（Alpers'disease）、交叉性肢体瘫痪、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧束硬化症（见运动神经元疾病）、无脑、天使综合征、血管瘤病、缺氧症、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形（Arnold-Chiari malformation）、动静脉畸形、共济失调性毛细血管扩张症、注意缺陷性多动障碍、听觉处理障碍、自主机能障碍、背痛、巴藤病（Batten disease）、贝切特氏病（Behcet's disease）、贝耳麻痹（Bell's palsy）、良性特发性眼睑痉挛、良性颅内高压、双侧定额多小脑回、宾斯万格病（Binswanger's disease）、睑痉挛、布洛克-苏兹贝格综合征（Bloch-Sulzberger syndrome）、臂丛神经损伤、脑脓肿、脑损伤、脑创伤、脑瘤、布朗-塞卡尔综合征（Brown-Séquard syndrome）、卡纳万病（Canavandisease）、腕管综合征、灼性神经痛、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、中央核性肌病、头部失调症（Cephalic disorder）、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、大脑性巨人症、脑性麻痹、脑血管炎、颈椎狭窄、腓骨肌萎缩征、阿齐畸形（Chiari malformation）、舞蹈病、慢性疲乏综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病（CIDP）、慢性疼痛、科勒二氏综合征（CoffinLowry syndrome）、昏迷、复杂区域疼痛综合征、压缩神经病、先天性两侧面瘫、皮质基底变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克罗伊茨费尔特-雅各布病（Creutzfeldt-Jakob disease）、累积创伤失调、库欣综合征（Cushing's syndrome）、巨细胞包涵体病（Cytomegalic inclusionbody disease）（CIBD）、巨细胞病毒感染、丹迪-沃克综合征（Dandy-Walker syndrome）、道森疾病（Dawson disease）、德摩西埃综合征（De Morsier's syndrome）、克隆普克氏麻痹（Dejerine-Klumpke palsy）、德热里纳-索塔斯病（Dejerine-Sottas disease）、睡眠时相延迟综合征、痴呆、皮肌炎、发育性运用障碍、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、Dravet综合征、家族性自主神经功能异常、计算困难、书写困难、诵读困难、肌张力障碍、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、大便失禁、癫痫、欧勃氏麻痹（Erb's palsy）、红斑性肢痛病、特发性震颤、法布里病（Fabry's disease）、法尔综合征（Fahr's syndrome）、昏厥、家族性痉挛性麻痹、高热惊厥（Febrile seizures）、菲希尔综合征（Fisher syndrome）、弗里德赖希氏共济失调（Friedreich's ataxia）、纤维肌痛、戈谢病（Gaucher's disease）、格斯塔曼综合征（Gerstmann's syndrome）、巨细胞性动脉炎、巨细胞性包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、灰质异位、吉兰-巴雷综合征、HTLV-1相关的脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病（Hallervorden-Spatz disease）、头损伤、头痛、半面痉挛、遗传性痉孪性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、平山综合症（Hirayama syndrome）、前脑无裂畸形、亨廷顿病（Huntington's disease）、积水性无脑、脑积水、皮质醇增生症、缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿植烷酸贮积病、婴儿瑞福森氏疾病（Infantile Refsum disease）、婴儿痉挛症、炎性肌病、颅内囊肿、颅内压增高、朱伯特综合征（Joubert syndrome）、卡拉克综合征（Karak syndrome）、卡恩斯-塞尔综合征（Kearns-Sayre syndrome）、甘乃迪病（Kennedy disease）、金斯布林纳综合征（Kinsbournesyndrome）、克利佩尔-费尔综合征（Klippel Feil syndrome）、克拉伯病（Krabbedisease）、库格尔贝格-韦兰德病（Kugelberg-Welander disease）、库鲁病（Kuru）、拉福拉病（Lafora disease）、兰伯特-伊顿肌无力综合征（Lambert-Eaton myasthenicsyndrome）、伴发癫痫的获得性失语（Landau-Kleffner syndrome）、延髓外侧（瓦伦堡）综合征、学习障碍、利氏病（Leigh's disease）、伦-加斯托二氏综合征（Lennox-Gastautsyndrome）、莱施-奈恩综合征（Lesch-Nyhan syndrome）、脑白质营养不良、路易体痴呆症、无脑回畸形、闭锁综合征、路格里克氏病（Lou Gehrig's disease）（参见运动神经元病）、腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄、莱姆病（Lyme disease）-神经系统后遗症、马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease）（3型脊髓小脑共济失调）、巨脑、视物显大症、巨脑症、梅-罗综合征（Melkersson-Rosenthal syndrome）、美尼尔氏病（Menieres disease）、脑膜炎、门克斯病（Menkes disease）、异染性脑白质营养不良、头小畸型、视物显小症、偏头痛、米费综合征（Miller Fisher syndrome）、小中风（Mini-stroke）（短暂性脑缺血发作）、线粒体肌病、默比乌斯综合征、单肢肌萎缩（Monomelic amyotrophy）、运动神经元病、运动技能障碍、烟雾病、粘多糖贮积病、多发性脑梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、肌痛性脑脊髓炎（Myalgic encephalomyelitis）、重症肌无力、髓鞘破坏弥漫性硬化症（Myelinoclastic diffuse sclerosis）、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌小管性肌病、先天性肌强直、嗜眠发作（Narcolepsy）、神经纤维瘤病、恶性精神抑制药综合征、AIDS的神经表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元移位异常、尼曼-皮克病、非24小时睡眠-觉醒综合征、非言语型学习障碍、奥沙利文-麦克劳德综合征（O'Sullivan-McLeod syndrome）、枕神经痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征（Ohtahara syndrome）、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼球斜视痉挛综合征、视神经炎、直立性低血压、过度使用综合、持续后像、感觉异常、帕金森氏症、先天性肌强直病、副肿瘤性疾病（Paraneoplastic diseases）、阵发性发作（Paroxysmal attacks）、帕-罗二氏综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病（Pelizaeus-Merzbacher disease）、周期性麻痹、周围神经病、持续性植物状态、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病（Pick'sdisease）、神经挟捏、垂体肿瘤、PMG、脊髓灰质炎、多小脑回、多肌炎、脑穿通、小儿麻痹症后期综合症、疱疹后神经痛（PHN）、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、普拉德-威利综合征（Prader-Willi syndrome）、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、进行性面部偏侧萎缩、进行性多灶性白质脑病、进行性核上麻痹、假性脑瘤、狂犬病、拉姆齐-亨特综合征（Ramsay-Huntsyndrome）（I型和II型）、拉斯姆森脑炎（Rasmussen's encephalitis）、反射神经血管营养不良、雷夫叙姆病（Refsum disease）、重复性运动失调、重复性压力损伤、腿多动综合征、逆转录病毒相关的脊髓病、蕾特氏综合症（Rett syndrome）、雷依氏综合征（Reye'ssyndrome）、节律性运动障碍、龙贝里综合征（Romberg syndrome）、舞蹈病、山霍夫氏病（Sandhoff disease）、精神分裂症、弥漫性轴周性脑炎（Schilder's disease）、脑裂、感觉统合失调、视隔发育不良（Septo-optic dysplasia）、受震动婴儿综合征、带状包疹（Shingles）、夏-德综合征（Shy-Drager syndrome）、肖格纶综合征（syndrome）、睡眠呼吸暂停、昏睡病、饱食（Snatiation）、索托斯综合征（Sotos syndrome）、痉挛状态、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、斯-里-奥三氏综合征（Steele-Richardson-Olszewski syndrome）、僵人综合征、中风、斯-韦综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉粥样硬化性脑病、表面铁沉积病、西登哈姆氏舞蹈病（Sydenham'schorea）、晕厥、联觉、脊髓空洞症、跗管综合征、迟发性运动障碍、骶管囊肿（Tarlov cyst）、泰-萨克斯病（Tay-Sachs disease）、颞动脉炎、破伤风、脊髓栓系综合征、肌强直性白内障、胸廓出口综合征、三叉神经痛（Tic Douloureux）、托德瘫痪（Todd's paralysis）、图雷特综合症（Tourette syndrome）、中毒性脑病、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛（Trigeminal neuralgia）、热带痉挛性截瘫、锥虫病、结节性脑硬化、希林二氏病（Von Hippel-Lindau disease）、威流斯科脑脊髓炎（Viliuisk Encephalomyelitis）、瓦伦伯格氏综合征（Wallenberg's syndrome）、沃尼克-霍夫曼症（Werdnig-Hoffman disease）、韦斯特综合征、挥鞭样损伤（Whiplash）、威廉斯综合征、威尔逊病（Wilson's disease）和赵韦格氏综合征（Zellweger syndrome）所组成的组中。

在本发明的各方面的其它优选实施方式中，所述心血管疾病选自由动脉瘤、心绞痛（Angina）、动脉粥样硬化、脑血管意外（中风）、脑血管疾病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾、心肌梗塞（心脏病发作）和周围性血管疾病所组成的组中。

在本发明的各方面的其它优选实施方式中，所述心血管疾病不是系统性红斑狼疮。

在另一方面中，本发明提供了一种使用根据本发明的分析血液样品的方法诊断受试者中的疾病的方法。因此，在本发明的方法的另一优选实施方式中，根据本发明的所述分析血液样品的方法是诊断受试者中疾病的方法的一部分，且其中，所述疾病标记物在所述去核血细胞提取的核酸部分中的存在是所述受试者患有所述疾病的指示。

在另一方面中，本发明提供了一种用于确定受试者中疾病治疗的功效的方法，包括以下步骤：

在第一时间点，使用根据本发明的分析血液样品的方法，分析受试者的血液样品中的疾病标记物的存在，从而提供作为所述受试者中的所述疾病标记物的水平的第一值；

在第二时间点（早于或晚于所述第一时间点，优选晚于所述第一时间点），使用根据本发明的分析血液样品的方法，分析所述受试者的血液样品中的疾病标记物的存在，从而提供作为所述受试者中的所述疾病标记物的水平的第二值，其中所述受试者已经在所述第一时间点和所述第二时间点之间经过疾病治疗；以及

对比所述第一值和所述第二值，以确定所述疾病治疗在所述受试者中的功效。

技术人员应理解在第一时间点之前的治疗，及随后在第二（更晚的）时间点的测量（在这些时间点之间没有发生任何疾病治疗）被包括在本发明的各方面中，用于确定疾病治疗的功效。

在另一方面中，本发明提供了一种用于确定疾病阶段的方法。为了确定疾病的阶段，有利地使通过本发明的方法确定的疾病标记物的值与疾病阶段相关联。然后，将疾病标记物的单一测量与一个或多个参照值相对比，以获得疾病阶段的指示。

在另一方面中，本发明提供了一种用于确定受试者中的疾病阶段的方法，包括以下步骤：

使用根据本发明的分析受试者的血液样品中的疾病标记物的存在的方法，分析受试者的血液样品中的疾病标记物的存在，从而提供作为所述受试者中的所述疾病标记物的水平的测试值；

提供用于所述疾病标记物的水平的参照值，其中，所述参照值与疾病的特定阶段相关；以及

对比所述测试值和所述参照值，以确定所述疾病在所述受试者中的阶段。

在又一方面中，本发明提供了一种适用于实施如上所述的本发明的方法的部件的试剂盒，所述试剂盒包括包装材料，所述包装材料包括以下物质中的至少一种：

用于容纳从血液样品中分离出的去核血细胞、优选凝血细胞的容器；

用于从所述去核血细胞中提取核酸的试剂；

用于例如通过反转录酶聚合酶链式反应扩增，从提取自所述去核血细胞的核酸中选择性扩增如上所述的疾病特异性标记物的试剂，所述疾病特异性标记物诸如受试者的成核细胞的基因中的疾病特异性的突变或来自所述受试者的成核细胞的核酸的疾病特异性的表达谱；以及

用于实施如上所述的本发明的方法的印刷的说明书或电子说明书；

所述试剂盒进一步包括：

用于所述疾病标记物的参照，其中所述参照指示所述疾病标记物在所述去核血细胞提取的核酸部分中的存在或不存在。

在根据本发明的试剂盒的优选实施方式中，所述参照是用于健康对照受试者或患有疾病的对照受试者的去核血细胞中包括所述疾病特异性突变的核酸水平的参照值；或者，其中，所述参照是例如用于多个mRNA在来自健康对照受试者或来自患有疾病的对照受试者的去核血细胞中的参照表达谱。

在根据本发明的试剂盒的另一优选实施方式中，所述试剂或说明书选自颗粒或荧光标记物标记的抗去核血细胞的抗体（优选荧光标记物标记的抗凝血细胞的抗体），用于基于珠子的去核血细胞分离（优选凝血细胞分离）的说明书、用于去核血细胞（优选凝血细胞）的FACS分选的说明书、用于通过离心回收去核血细胞（优选凝血细胞）的说明书或非去核血细胞组分（优选非凝血细胞组分）的阴性选择的说明书。

在又一方面中，本发明提供了一种用于诊断疾病的装置，所述装置包括支撑物及至少一种用于特异性确定至少一种核酸突变体在受试者的去核血细胞样品中的水平和/或活性的试剂，所述试剂附着至所述支撑物；以及，具有计算机可执行指令的计算机可读的介质，所述计算机可执行指令用于实施如上所述的本发明的方法。

在根据本发明的装置的优选实施方式中，所述至少一种试剂是寡核苷酸探针或测序引物。

在根据本发明的装置的优选实施方式中，所述装置包括侧向流动装置、浸量尺或筒状物，用于在去核血细胞提取的核酸和至少一个核酸突变特异性扩增的引物或寡核苷酸探针之间进行核酸杂交反应，或在去核血细胞提取的核酸和多个基因特异性扩增的引物或寡核苷酸探针之间进行核酸杂交反应，用于提供疾病特异性的基因表达谱。

附图说明

图1：示出了使用安捷伦科技有限公司（Agilent Bioanalyzer Picochip）分析的RNA表达谱，其中X轴上为RNA的长度（核苷酸的数量），且Y轴上为RNA的量（以荧光单位表示）。这里描述了来自血清部分中的微泡的RNA（1A）、来自血浆部分中的微泡的RNA（1B）或来自凝血细胞的RNA（1C）。图中示出：1）RNA存在于血清和血浆中的微泡中及凝血细胞中；2）与从血清样品中分离的微泡相比，从血浆样品中分离的微泡包含较少的RNA；以及，3）从血浆样品分离的凝血细胞包括各种大小的RNA，包含相对长RNA链（＞200个核苷酸（nt），且甚至＞1000个核苷酸）的重要部分。

图2：示出了在来自患脑瘤的患者的凝血细胞中发现的肿瘤来源的遗传物质的研究结果。采用来自患者（P1～P14）的血液样品（全血管（血清（S））和抗凝血的EDTA血液（血浆（P））。来自血浆管中，通过离心方案收集凝血细胞（T）。从健康的个体（C1～C6）收集凝血细胞作为对照。在图2中用X指示一些缺乏血清样品的患者，且在图2中用SP指示一些具有合并的血清和血浆样品的患者。使用巢式PCR用于RNA检测，可以在15位成胶质细胞瘤患者中的4位（27%）（P4、P5、P9、P10）的凝血细胞中检测到突变的EFGRvIII（V3）。这与发表的文献一致，在该发表的文献中在20%的高等级神经胶质瘤发现了突变的EFGRvIII（Liu等2005）。这些实验确实为原理提供了证据，即凝血细胞通过肿瘤来源的核酸的识别可用作用于诊断癌症的生物标记物的来源。

图3：（A）使用PKH67绿色荧光染料标记U87神经胶质瘤来源的微泡，且该U87神经胶质瘤来源的微泡与分离的血小板一起孵育。在微泡存在和不存在的情况下孵育15min和60min后，洗涤血小板且进行PKH67荧光的FACS分析。另外，血小板被染色且通过共聚焦显微镜进行分析，以确定微泡的摄入。在不同的条件下与微泡孵育之后，从RNase处理的血小板中分离RNA。进行RT-PCR以检测EFGRvIII的RNA。MV/MVEFGRvIII：从U87/U87-EFGRvIII细胞中分离的微泡。（B）从来自健康对照受试者或神经胶质瘤患者的血小板中分离RNA，且进行RT-PCR分析。对应的神经胶质瘤组织活检作为对照。PC=U87-EGFRvIII的RNA；NC=H20；nd=未确定的；*指示阳性信号。（C）对（B）中的RNA进行基因表达阵列分析。左图示出最高的30（top-30）个神经胶质瘤生物标记物的热图。右图描述了最高的10个RNA的单独的表达水平。虚线=BG（背景）。

图4：从来自健康对照受试者（n=8）和前列腺癌患者（n=12）的血小板中分离RNA且进行PCA3、PSA和GAPDH的RT-PCR分析。*指示弱阳性。

图5：示出用于检测图3C中示出的基因的探针序列。

具体实施方式

如在本文中所使用的，术语“癌症”指由致癌性转化的细胞增殖所导致的疾病或失调症。“癌症”应包含任意一种或多种大范围的良性或恶性肿瘤，包含那些能够例如经由淋巴系统和/或血流侵袭生长且穿过人体或动物体或其部分转移的那些肿瘤。尽管本发明的目的尤其在于恶性肿瘤和实体癌症的诊断或检测，但如在本文中所使用的，术语“肿瘤”包含良性和恶性肿瘤或实体肿块。癌症进一步包含（但并不限于）癌、淋巴瘤或肉瘤，例如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、尿道癌、子宫癌、急性淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病（Hodgkin's disease）、小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤（如成胶质细胞瘤），和软组织肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤和腺癌。在本发明各方面的优选实施方式中，血小板癌是被放弃的。

如在本文所使用的，术语“癌症来源的（cancer-derived）”指起源于癌症或癌症细胞。

术语“癌症来源的核酸”应理解为指示受试者中的癌症的任意核酸，具体地且在大部分实施方式中指指示癌症中存在的突变基因的突变的DNA或RNA，该突变基因由受试者的癌症细胞表达或存在于受试者的癌症细胞中，且该突变基因的核酸序列相对于健康的对照受试者的正常基因是被改变的。术语“癌症来源的核酸”还应包含：（i）在癌症细胞中（而不是在正常健康（非癌症）细胞中）产生、表达或存在的核酸，或该核酸的产生或表达相对正常细胞被癌症细胞或在癌症细胞中改变（升高或降低）；或者（ii）在正常细胞中（而不是被癌症细胞或在癌症细胞中）产生、表达或存在的核酸。因此，核酸不需要是具有突变序列的突变核酸，但可以是具有野生型（非癌症）序列的正常核酸，但该核酸在癌症细胞中的表达谱或表达水平相对于正常细胞是被改变的。在一个优选实施方式中，癌症来源的核酸是对癌症特异性的突变的核酸（DNA、cDNA或RNA），优选是RNA转录物。在另一个非常优选的实施方式中，癌症来源的核酸是指示为癌症来源的或癌症特异性的核酸表达谱（如本文所详细描述的）。

如本文所使用的，术语“癌症标记物”特别指癌症标记基因或癌症标记基因表达谱。如本文所使用的，术语“癌症标记基因”指其序列或表达水平（单独或与其它基因结合）与癌症或癌症预后（prognosis）相关的基因。该相关性可涉及基因的表达升高或降低，这反映在所述基因的RNA表达产物在可从凝血细胞中获得的核酸部分中存在的升高或降低。例如，基因的表达可以指示癌症，或者基因表达的缺失可与癌症患者中的不良预后相关。在前列腺癌AMACR的情况中，PCA3和PSA是适合的癌症标记物。在结肠直肠癌的情况中，KRAS突变是适合的癌症标记物。在肺癌的情况中，EGFR突变是适合的癌症标记物。在黑色素瘤的情况中，BRAF突变是适合的癌症标记物。在神经胶质瘤的情况中，EGFRvIII突变是适合的癌症标记物。其它适合的癌症标记物可以来源于如本文所提供的表1和表2中，或来源于实例或附图中。技术人员应理解在本发明的各个方面和实施方式中可以利用很多其它的癌症标记物。

如本文所使用的，术语“癌症的阶段”指癌症发展水平的定性或定量的评定。用于确定癌症阶段的标准包含（但并不限于）肿瘤的大小，肿瘤是否已经散布到身体的其它部位，以及癌症已经散布到的位置（例如在身体的相同器官或区域内，或至另一器官）。

在术语“癌症来源的”、“癌症标记物”、“癌症标记基因”和/或“癌症的阶段”中的术语“癌症”可概括为术语“疾病”（如对癌症的定义），因为对癌症的定义通常可适用于本文所述的所有疾病。

如本文所使用的，术语“疾病来源的”指来源于疾病或患病细胞。

术语“疾病来源的核酸”应理解为指示受试者中的疾病的任意核酸，具体地且在大部分实施方式中指指示在疾病中存在的突变基因的突变的DNA或RNA，该突变基因由受试者的患病细胞中表达或存在于受试者的患病细胞中，且该突变基因的核酸序列相对于健康的对照受试者的正常基因是被改变的。术语“疾病来源的核酸”应理解为包含：（i）在患病细胞中（而不是在正常健康（非患病）细胞中）产生、表达或存在的核酸，或该核酸的产生或表达相对正常细胞被患病细胞或在患病细胞中被改变（升高或降低）；或者（ii）在正常细胞中（而不是被患病细胞或在患病细胞中）产生、表达或存在的核酸。因此，该核酸不需要是具有突变序列的突变核酸，但可以是具有野生型（非疾病）序列的正常核酸，但该核酸在患病细胞中的表达谱或表达水平相对于正常细胞是被改变的。在一个优选实施方式中，疾病来源的核酸是对疾病特异性的突变的核酸（DNA、cDNA或RNA），优选是RNA转录物。在另一个非常优选的实施方式中，疾病来源的核酸是指示为疾病来源或疾病特异性的核酸表达谱（如本文所详细描述的）。在一优选实施方式中，疾病来源的核酸不包含癌症来源的核酸。在又一优选实施方式中，疾病来源的核酸不包含脉管疾病来源的核酸，和/或系统性红斑狼疮来源的核酸。在一优选实施方式中，疾病来源的核酸不包含镰刀状细胞疾病来源的核酸。在一优选实施方式中，疾病来源的核酸不包含阿尔茨海默氏疾病来源的核酸。在本发明一优选实施方式及其实施方式中，疾病来源的核酸不包含CD109核酸。在本发明及其实施方式的优选实施方式中，疾病来源的核酸不包含巨核细胞来源的核酸。在本发明及其实施方式的优选实施方式中，疾病来源的核酸不包括源自与病态巨核细胞和/或血小板功能相关的疾病的核酸。

如本文所使用的，术语“疾病标记物”特别指疾病标记基因或疾病标记基因表达谱。如本文所使用的，术语“疾病标记基因”指其序列或表达水平（单独或与其它基因结合）与疾病或疾病预后相关的基因。该相关性可涉及基因的表达升高或降低，这反映在所述基因的RNA表达产物在可从凝血细胞中获得的核酸部分中存在的升高或降低。例如，基因的表达可以指示疾病，或者基因表达的缺失可与疾病患者中的不良预后相关。在一优选实施方式中，所述疾病标记基因不是CD109基因。

如本文所使用的，术语“疾病的阶段”指疾病发展水平的定性或定量的评定。用于确定疾病阶段的标准包含（但并不限于）疾病是否已经散布到身体的其它部位，以及疾病已经散布到的位置（例如在身体的相同器官或区域内，或至另一器官）。

如本文所使用的，术语“疾病”可以指癌症、自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病、神经性障碍和心血管疾病。

如本文所使用的，术语“疾病”可以指自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病、神经性障碍和/或心血管疾病。

如本文所使用的，术语“疾病”可以指自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病和/或神经性障碍。

如本文所使用的，在一些优选实施方式中，术语“疾病”可以不是指：癌症、心血管疾病、系统性红斑狼疮、镰刀状细胞疾病、阿尔茨海默氏疾病，与病态血小板功能相关的疾病，和/或与病态巨核细胞功能相关疾病。

因此，可以使用本发明的手段和方法检测除了癌症之外或不是癌症的疾病，这样疾病包括例如下面的自身免疫性疾病：胃酸缺乏自身免疫活动性慢性肝炎、急性播散性脑脊髓炎、急性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗-GBM/TBM肾炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、多发性关节炎、特异反应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生性综合征、自身免疫性周围神经疾病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫多内分泌腺综合征、自身免疫性孕酮皮炎、自体免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病/巴洛同心性硬化、贝切特氏综合征、柏格氏症、毕氏脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、卡斯尔曼病、乳糜泻病、查格斯氏病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、慢性复发性多病灶性骨髓炎、慢性莱姆病、慢性阻塞性肺病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、乳糜泻病、耳蜗前庭综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅动脉炎、CREST综合征、克朗氏病、库欣综合征、皮肤白细胞破碎性血管炎、Dego's病、德尔肯氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、发散性皮肤系统硬化症、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位、附着点炎相关关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸细胞性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、伊凡综合征、进行性骨化性纤维发育不良、纤维组织肌痛/纤维肌炎、纤维性肺泡炎、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞性动脉炎、血管球性肾炎、古德帕斯丘综合征、格氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本脑炎、乔本氏甲状腺炎、溶血性貧血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、化脓性汗腺炎、休斯综合征、低γ球蛋白血症、特发性炎症脱髓鞘疾病、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、包涵体肌炎、炎症性脱髓鞘性多神经病、间质性膀胱炎、肠易激综合征（IBS）、幼年特发性关节炎、幼年型类风湿关节炎、川崎氏病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白细胞分裂性脉管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、线性IgA疾病、路格里克氏病、狼疮状肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃尔氏病、显微镜下多血管炎、米-费综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆-哈二氏病、韦二氏综合征、多发性骨髓瘤、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、嗜眠发作、视神经脊髓炎、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、眼阵挛-肌阵挛综合征、奥德甲状腺炎、复发性风湿病、PANDAS、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、帕-罗二氏综合征、特纳氏综合征、睫状体扁平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病、牛皮癣、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生失调症、拉斯姆森脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、莱特尔氏病、不宁腿综合症、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、风湿热、类肉状瘤病、精神分裂症、施密特综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、肖格伦综合征、脊椎关节病、粘血综合征、斯蒂尔病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎（SBE）、苏萨克氏综合征、急性发热性嗜中性皮病、西德纳姆舞蹈、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、脉管炎、白癫风、韦格纳肉牙肿、威尔逊氏综合征和威斯科特-奥尔德里奇综合征。

除了上述疾病之外，本发明的各方面还可应用于以下皮肤病的预后和诊断：痤疮样疹，自身炎症综合征，慢性起泡，黏膜的症状，皮肤附属器官的症状，皮下脂肪的症状，先天异常，结缔组织疾病（如真皮纤维和弹性组织的异常），真皮和皮下生长，皮炎（包含特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、脓疱性皮炎和脂溢性皮炎），色素沉着紊乱，药疹，内分泌相关的皮肤，嗜酸性皮肤病，表皮痣,赘生物，囊肿，红斑，遗传性皮肤病，感染相关的皮肤病，苔藓样疹，淋巴相关的皮肤病，黑色素痣和赘生物（包含黑色素瘤），单核细胞相关的皮肤病和巨噬细胞相关的皮肤病，粘蛋白增多症，神经皮肤综合征，非感染性免疫缺陷相关的皮肤病，营养相关的皮肤病，丘疹鳞屑角化过度（包含掌跖角化病），妊娠相关的皮肤病，搔痒症，牛皮癣，反应性嗜中性皮肤病，顽固的掌跖喷发，由代谢中的错误所导致的皮肤病，由物理因素所导致的皮肤病（包含电离辐射诱发的皮肤病），荨麻疹和血管性水肿，脉管相关的皮肤病。

除了上述疾病之外，本发明的各方面还可应用于以下内分泌疾病的预后和诊断：肾上腺失调症，葡萄糖代谢失调症，甲状腺失调症，钙稳态失调症和代谢性骨疾病，垂体腺失调症，及性激素失调症。

除了上述疾病之外，本发明的各方面还可应用于以下眼病的预后和诊断：H00-H06眼睑、泪腺系统和泪道的失调症，H10-H13结膜的失调症，H15-H22巩膜、角膜、虹膜和睫状体失调症，H25-H28晶状体失调症，H30-H36脉络膜和视网膜失调症（包含H30脉络膜视网膜炎、H31脉络膜的其它失调症、H32在归类到别处的疾病中的脉络膜视网膜失调症、H33视网膜脱离和断裂、H34视网膜血管闭塞、H35其它视网膜失调症及H36在归类到别处的疾病中的视网膜失调症），H40-H42青光眼，H43-H45玻璃体和玻璃球失调症，H46-H48视神经和视觉通路失调症，H49-H52眼球外肌、双眼的运动、适应和折射失调症，H53-H54.9视力障碍和失明，及H55-H59眼及附属器管的其它失调症。

除了上述疾病之外，本发明的各方面还可应用于以下神经性障碍的预后和诊断：辨重障碍、获得性癫痫性失语、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不良、失认症、艾卡迪综合征、亚历山大病、异手综合征、感觉异侧、阿尔珀斯病、交叉性肢体瘫痪、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧束硬化症（见运动神经元疾病）、无脑、天使综合征、血管瘤病、缺氧症、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形、动静脉畸形、共济失调性毛细血管扩张症、注意缺陷性多动障碍、听觉处理障碍、自主机能障碍、背痛、巴藤病、贝切特氏病、贝耳麻痹、良性特发性眼睑痉挛、良性颅内高压、双侧定额多小脑回、宾斯万格病、睑痉挛、布洛克-苏兹贝格综合征、臂丛神经损伤、脑脓肿、脑损伤、脑创伤、脑瘤、布朗-塞卡尔综合征、卡纳万病、腕管综合征、灼性神经痛、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、中央核性肌病、头部失调症、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、大脑性巨人症、脑性麻痹、脑血管炎、颈椎狭窄、腓骨肌萎缩征、阿齐畸形、舞蹈病、慢性疲乏综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病（CIDP）、慢性疼痛、科勒二氏综合征、昏迷、复杂区域疼痛综合征、压缩神经病、先天性两侧面瘫、皮质基底变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克罗伊茨费尔特-雅各布病、累积创伤失调、库欣综合征、巨细胞包涵体病（CIBD）、巨细胞病毒感染、丹迪-沃克综合征、道森疾病、德摩西埃综合征、克隆普克氏麻痹、德热里纳-索塔斯病、睡眠时相延迟综合征、痴呆、皮肌炎、发育性运用障碍、糖尿病神经病变、弥漫性硬化、Dravet综合征、家族性自主神经功能异常、计算困难、书写困难、诵读困难、肌张力障碍、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、大便失禁、癫痫、欧勃氏麻痹、红斑性肢痛病、特发性震颤、法布里病、法尔综合征、昏厥、家族性痉挛性麻痹、高热惊厥、菲希尔综合征、弗里德赖希氏共济失调、纤维肌痛、戈谢病、格斯塔曼综合征、巨细胞性动脉炎、巨细胞性包涵体病、球形细胞脑白质营养不良、灰质异位、吉兰-巴雷综合征、HTLV-1相关的脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病、头损伤、头痛、半面痉挛、遗传性痉孪性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、平山综合症、前脑无裂畸形、亨廷顿病、积水性无脑、脑积水、皮质醇增生症、缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿植烷酸贮积病、婴儿瑞福森氏疾病、婴儿痉挛症、炎性肌病、颅内囊肿、颅内压增高、朱伯特综合征、卡拉克综合征、卡恩斯-塞尔综合征、甘乃迪病、金斯布林纳综合征、克利佩尔-费尔综合征、克拉伯病、库格尔贝格-韦兰德病、库鲁病、拉福拉病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、伴发癫痫的获得性失语、延髓外侧（瓦伦堡）综合征、学习障碍、利氏病、伦-加斯托二氏综合征、莱施-奈恩综合征、脑白质营养不良、路易体痴呆症、无脑回畸形、闭锁综合征、路格里克氏病（参见运动神经元病）、腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄、莱姆病-神经系统后遗症、马查多-约瑟夫病（3型脊髓小脑共济失调）、巨脑、视物显大症、巨脑症、梅-罗综合征、美尼尔氏病、脑膜炎、门克斯病、异染性脑白质营养不良、头小畸型、视物显小症、偏头痛、米费综合征、小中风（短暂性脑缺血发作）、线粒体肌病、默比乌斯综合征、单肢肌萎缩、运动神经元病、运动技能障碍、烟雾病、粘多糖贮积病、多发性脑梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、肌痛性脑脊髓炎、重症肌无力、髓鞘破坏弥漫性硬化症、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌小管性肌病、先天性肌强直、嗜眠发作、神经纤维瘤病、恶性精神抑制药综合征、AIDS的神经表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元移位异常、尼曼-皮克病、非24小时睡眠-觉醒综合征、非言语型学习障碍、奥沙利文-麦克劳德综合征、枕神经痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼球斜视痉挛综合征、视神经炎、直立性低血压、过度使用综合、持续后像、感觉异常、帕金森氏症、先天性肌强直病、副肿瘤性疾病、阵发性发作、帕-罗二氏综合征、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、周期性麻痹、周围神经病、持续性植物状态、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经挟捏、垂体肿瘤、PMG、脊髓灰质炎、多小脑回、多肌炎、脑穿通、小儿麻痹症后期综合症、疱疹后神经痛（PHN）、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、普拉德-威利综合征、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、进行性面部偏侧萎缩、进行性多灶性白质脑病、进行性核上麻痹、假性脑瘤、狂犬病、拉姆齐-亨特综合征（I型和II型）、拉斯姆森脑炎、反射神经血管营养不良、雷夫叙姆病、重复性运动失调、重复性压力损伤、腿多动综合征、逆转录病毒相关的脊髓病、蕾特氏综合症、雷依氏综合征、节律性运动障碍、龙贝里综合征、舞蹈病、山霍夫氏病、精神分裂症、弥漫性轴周性脑炎、脑裂、感觉统合失调、视隔发育不良、受震动婴儿综合征、带状包疹、夏-德综合征、肖格纶综合征、睡眠呼吸暂停、昏睡病、饱食、索托斯综合征、痉挛状态、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、斯-里-奥三氏综合征、僵人综合征、中风、斯-韦综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉粥样硬化性脑病、表面铁沉积病、西登哈姆氏舞蹈病、晕厥、联觉、脊髓空洞症、跗管综合征、迟发性运动障碍、骶管囊肿、泰-萨克斯病、颞动脉炎、破伤风、脊髓栓系综合征、肌强直性白内障、胸廓出口综合征、三叉神经痛、托德瘫痪、图雷特综合症、中毒性脑病、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性截瘫、锥虫病、结节性脑硬化、希林二氏病、威流斯科脑脊髓炎、瓦伦伯格氏综合征、沃尼克-霍夫曼症、韦斯特综合征、挥鞭样损伤、威廉斯综合征、威尔逊病和赵韦格氏综合征。

除了上述疾病之外，本发明的各方面还可应用于以下心血管疾病的预后和诊断：动脉瘤、心绞痛、动脉粥样硬化、脑血管意外（中风）、脑血管疾病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾、心肌梗塞（心脏病发作）和周围性血管疾病。在本发明方法的优选实施方式及其实施方式中，以及本发明其它各方面的优选实施方式中，疾病或心血管疾病不是系统性红斑狼疮。

在本发明方法的优选实施方式及其实施方式中，以及本发明其它各方面的优选实施方式中，上述疾病不是选自包括癌症、心血管疾病、系统性红斑狼疮、镰刀状细胞疾病、阿尔茨海默氏疾病、与病态血小板功能相关的疾病和/或与病态巨核细胞功能相关的疾病的组中的疾病。

如本文所使用的，“核酸”包含单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限制，该核酸包括具有自然核苷酸的基本性质的已知的类似物，因为这些类似物以与自然存在的核苷酸（例如肽核酸（peptide nucleic acid））类似的方式与单链核酸杂交。

术语“RNA”指核糖核酸，编码蛋白产物或不编码蛋白产物（如miRNA，但不包括其它非编码RNA）的RNA分子。RNA由DNA模板转录出来。

如本文所使用的，术语“突变体”指由天然野生型编码序列或其亚单位（subunit）突变所产生的核酸化合物、蛋白、分子、载体或细胞。

如本文所使用的，术语“突变”指通过置换（displacement）、添加、缺失、插入、交联或其它破坏，或者通过天然编码序列（包含自然存在的剪接变体）中一个或多个核苷酸的取代，而改变天然编码序列的任意变化。突变特别提供了导致细胞变为癌症细胞的基因。这样的突变包含遗传的，及肿瘤抑制基因和/或致癌基因的获得性突变。

通过“扩增”指核酸序列的多个拷贝或与使用至少一个核酸序列作为模板的核酸序列互补的多个拷贝的构建。扩增系统包含聚合酶链式反应（PCR）系统、连接酶链反应（LCR）系统、依赖核酸序列的扩增（NASBA,Cangene公司,米西索加,安大略）、Q-Beta复制酶系统、转录依赖扩增系统（TAS）和链置换扩增（SDA）。参见例如Diagnostic MolecularMicrobiology.Principles and Applications,D.H.Persing等编辑,美国微生物学会,华盛顿特区（1993）。扩增产物被称为扩增子。

术语“杂交体（hybrid）”指由互补核苷酸之间的氢键结合所形成的双链核酸分子或双链体（duplex）。术语“杂交”或“退火（anneal）”指通过该过程核酸序列的单链通过互补核苷酸之间的氢键结合形成双螺旋片段。

术语“寡核苷酸”指通过含磷的连接体（phosphorous linkage）（例如磷酸二酯、烷基和磷酸芳基酯，磷硫酰）或非含磷的连接体（例如肽、氨基磺酸酯及其它）连接的核苷酸单体（通常为6至100个核苷酸）的短链。寡核苷酸可包含具有修饰的碱基（例如5-甲基胞嘧啶）和修饰的糖基（例如2-O’-甲基核糖基、2-O’-甲氧乙基核糖基、2’-氟代核糖基、2’-氨基核糖基等）的修饰的核苷酸。寡核苷酸可以是具有环形、支链或直链形状的双链和单链DNA及双链或单链RNA的自然存在的分子或合成的分子，且该DNA及RNA可选地包含能够形成稳定二级结构（例如茎-环结构和环-茎-环结构）的结构域。

如本文所使用的，术语“引物”指如下的寡核苷酸：能够退火至扩增目的上从而允许DNA聚合酶结合，当置于在其中合成引物延伸产物（与被诱发的核酸链互补）的条件下，即在用于聚合的核苷酸和试剂（诸如DNA聚合酶）存在下且处于适当的温度和pH下时用作引发DNA合成的点。（扩增）引物优选是单链的，用于获得扩增中的最大效率。优选地，引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在用于聚合的试剂存在下指导延伸产物的合成。引物的准确长度应取决于很多因素，包含温度和引物的来源。如在本文所使用的，“双向引物对”指在DNA扩增的领域中（诸如在PCR扩增中）通常所使用的一个正向引物和一个反向引物。

术语“探针”指单链寡核苷酸序列，该单链寡核苷酸序列能够识别目的核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列且与其形成氢键结合的双链体。

术语“严格性”或“严格的杂交条件”指影响杂交体稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。可以根据经验优化这些条件以使引物或探针与它的目的核酸序列的特异性结合最大化而非特异性结合最小化。所使用的术语包含如下条件：在该条件下，探针或引物将与它的目的序列杂交至比其它序列更高的可检测的程度（例如至少比背景高2倍）。严格条件是序列依赖性的，且在不同情况下应该是不同的。较长的序列在较高温度下特异性杂交。通常，选择严格条件为比具体序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度（T_m）低大约5℃。T_m是如下的温度：（在确定的离子强度和pH下）在该温度下大约50%的互补目的序列与完全匹配的探针或引物杂交。典型地，严格条件应是如下条件：在该条件中，盐浓度在pH为7.0～8.3时低于大约1.0M Na⁺离子、典型地为大约0.01M至1.0M的Na⁺离子浓度（或其它盐）；且温度对于短的探针或引物（例如10～50个核苷酸）至少为大约30℃，而对于长探针或引物（例如大于50个核苷酸）至少为大约60℃。严格条件还可通过添加去稳定剂（诸如甲酰胺）来实现。示例性的低严格条件或“严格性降低的条件”包含：使用在37℃下的30%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲溶液中进行杂交，且在40℃下的2×SSC中进行清洗。示例性的高严格性条件包含在37℃下的50%的甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中进行杂交，且在60℃下在0.1×SSC中进行清洗。杂交程序在本领域中是公知的，且在例如Ausubel等的CurrentProtocols in Molecular Biology（John Wiley&Sons Inc.,1994）中描述。

本文所使用的，“受试者”包含（但并不限于）哺乳动物，包含：人、非人类灵长类动物、小鼠、猪、牛、山羊、猫、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、八齿鼠、马、猴、绵羊或其它非人类哺乳动物；以及，非哺乳动物的动物，包含例如非哺乳动物类的脊椎动物（如鸟（例如鸡或鸭）或鱼）及无脊椎动物。受试者可以是经历常规健康体检的健康的动物或人类受试者。可选择地，受试者可以是处于患病风险，例如有遗传素因的受试者，具有癌症医学和/或家族史的受试者，已经遭受致癌物、职业伤害、环境伤害的受试者，和/或显示出疾病的可疑临床征象的受试者（例如大便有血或黑便、不清楚的疼痛、发汗、不清楚的发热、不清楚的体重下降至食欲不振、大便习惯的变化（便秘和/或腹泻）、里急后重（tenesmus）（不完全排便的感觉，特别是对直肠癌）、贫血和/或全身无力）。根据另一实施方式，受试者可以是诊断患有疾病的患者，且正在进行常规体检、中间治疗。

如本文所使用的，术语“凝血细胞（thrombocyte）”指血小板，即不具有含DNA的细胞核、且在哺乳动物血液中循环的小的不规则形状的细胞碎片。凝血细胞直径为2μm～3μm，且来源于前体巨核细胞的破碎。血小板或凝血细胞缺少核DNA，但他们保留了一些巨核细胞来源的mRNA作为他们直系起源的部分。凝血细胞的平均寿命是5天至9天。凝血细胞参与止血且在止血中起到关键作用，导致血凝块的形成。在本发明及其实施方式的优选实施方式中，去核的血液细胞提取的核酸部分不是巨核细胞来源的核酸或巨核细胞来源的RNA。

如本文所使用的，术语“血液”指全血（包含血浆和细胞），且包含动脉血、毛细管血和静脉血。

如本文所使用的，术语“成核细胞”优选地指巴氏腺细胞（Bartholin's glandcell）、涎腺粘液细胞、涎腺浆液性细胞、埃布纳腺细胞（Von Ebner's gland cell）、乳腺细胞、泪腺细胞、耵聍腺细胞、排泄汗腺细胞、顶泌汗腺细胞、莫尔腺（Gland of Moll cell）、皮脂腺细胞、鲍曼氏腺（Bowman's gland cell）、十二指肠腺（Brunner's gland cell）、贮精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、利特雷氏腺（Gland of Littre cell）、子宫内膜细胞、独立的杯状体细胞、胃黏膜（Stomach lining mucous cell）、胃腺酶原（Gastric glandzymogenic cell）、胃腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、潘氏细胞、II型肺细胞、克拉拉细胞、垂体前叶细胞、中间垂体细胞、大细胞性神经分泌细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺皮质细胞、莱迪希细胞（Leydig cell）、卵泡内膜细胞（Theca interna cell）、黄体细胞、球旁细胞、致密斑细胞、极周细胞、肾小球系膜细胞、血管及淋巴管内皮有孔细胞、血管及淋巴管内皮连续细胞（continuous cell）、血管及淋巴管内皮脾细胞、滑膜细胞、浆膜细胞、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜细胞、血管纹基底细胞、血管纹边缘细胞、克劳迪乌斯细胞（Cell of Claudius）、贝特彻氏细胞（Cell of Boettcher）、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞状细胞、色素睫状上皮细胞（Pigmented ciliary epithelium cell）、非色素睫状上皮细胞（Nonpigmented ciliary epithelium cell）、角膜内皮细胞、拴细胞（Peg cell）、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸纤毛细胞、输精小管的纤毛细胞、纤毛室管膜细胞（Ciliated ependymal cell）、表皮角化细胞、表皮基底细胞、角化细胞、甲床基底细胞、髓质头发轴细胞、皮质头发轴细胞、表皮的头发轴细胞、表皮毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞（External hair root sheath cell）、毛基质细胞、表面上皮细胞、基质细胞、尿路上皮细胞、听觉内耳毛细胞、听觉外毛细胞、初级感觉神经元、梅克尔细胞、嗅觉受体神经元、感光细胞、颈动脉体细胞（血液pH传感器）、毛细胞、味蕾细胞、胆碱能神经细胞、肾上腺素能神经细胞、肽能神经细胞、内柱细胞、外柱细胞、内指状细胞、外指状细胞、边缘细胞、汉森细胞、前庭器官支持细胞、味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、施旺细胞（Schwann cell）、卫星细胞、肠神经胶质细胞、星形细胞、神经元细胞、少突细胞、纺锤体神经元、前晶状体上皮细胞、含晶状体球蛋白的晶状体纤维状细胞、肝细胞、脂肪细胞、肝贮脂细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞（Kidney proximal tubule brush border cell）、亨利氏套（Loop of Henle）细段细胞、肾远曲小管细胞、肾集合管细胞、肺细胞、胰腺导管细胞、无横纹的导管细胞、导管细胞、肠刷状缘细胞、外分泌腺有条纹的导管细胞、胆囊上皮细胞、输精小管非纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细胞、成釉上皮细胞、半月面上皮细胞、尔蒂齿间上皮细胞（Organ of Corti interdental epithelial cell）、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜成纤维细胞、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、其它非上皮细胞类型的成纤维细胞、周细胞、髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞/牙质细胞、透明软骨细胞、纤维软骨细胞、弹性软骨细胞、造骨细胞/骨细胞、骨原细胞、玻璃体细胞、星状细胞、肝星状细胞、胰腺星状细胞、骨骼肌细胞、卫星细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肌上皮细胞、单核细胞、结缔组织的巨噬细胞、上皮朗格汉斯细胞、破骨细胞、树突细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞、精子、卵巢滤泡细胞、塞尔托利细胞（Sertoli cell）、胸腺上皮细胞和肾间质细胞。

靶定疗法和个性化医学严重依赖于疾病谱（profiling）和伴随诊断的发展。疾病来源的核酸的突变体可以对靶定治疗的反应具有高度预测性。但是，容易地获得易使用的高质量核酸仍然存在重要的发展障碍。血液通常含有150,000～350,000个凝血细胞（血小板）/微升，为研究和临床应用提供了高度可用的生物标记物的来源。此外，凝血细胞分离相对简单，且是血库/血液学实验室中的标准程序。由于血小板不含有细胞核，他们功能保持所需要的RNA转录物是在凝血细胞起源过程中来源于骨髓的巨核细胞。现在已经发现凝血细胞可以在循环过程中经由不同的传递机制从除了巨核细胞之外的细胞获得RNA和/或DNA。例如，肿瘤细胞释放大量遗传物质，其中一些是通过微泡以突变RNA的形式分泌的。凝血细胞在血流中循环的过程中，吸收癌症细胞和其它患病细胞分泌的遗传物质，起到用于如在上文（例如在个性化医学的情况中）所指示的癌症和其它疾病伴随诊断的引人注目的平台的作用。

在下面的实例中，示出从健康人类对照受试者中分离的血小板具有从源自人类脑瘤细胞（神经胶质瘤）的含RNA的微泡中获取RNA的能力，之后这些血小板含有肿瘤相关的RNA，在神经胶质瘤患者的情况中包含例如突变的EGFRvIII mRNA。因此，确定从神经胶质瘤患者中分离的循环的血小板含有RNA生物标记物。使用RT-PCR证实在凝血细胞中发现的突变的EGFRvIII mRNA反映出神经胶质瘤的存在。

肿瘤和/或疾病-标记物信息的存在并不是来自神经胶质瘤患者的血小板特有的，而是更普遍适用于如本文所述的广泛的疾病。可证明编码前列腺癌症标记物PCA3和PSA的信使RNA存在于来自前列腺癌症患者的血小板中，而这些标记物不存在于来自健康对照受试者的血小板中。

除了检测与癌症或其它疾病相关的基因突变之外，本发明人还发现基因表达阵列可用于将凝血细胞核酸样品归类为患有具体类型的（实体肿瘤）癌症或其它疾病的受试者的凝血细胞核酸样品。证实使用从健康对照受试者分离的血小板所提取的核酸或从神经胶质瘤患者分离的血小板所提取的核酸获得的mRNA表达谱明显不同。获得有区别的mRNA表达谱，且可检测最小的神经胶质瘤生物标记物标签，如图3C中对最高的30个击中（top-30hit）所示。如在图3C中所示，有区别的表达谱包括以下基因表达的显著升高：WFDC1、Kremen1、DEF4A、ARG1、FKBP5、ACRC、ENST0328043、A_32_P167111、MAP2、ECTL8、UNC13B,TP53I3、FDXR、BX119718、SORT1、PFN4、C1QTNF5、A_24_P237896、PGLYRP1、SEC14L2、BC018626、MAOB、TCN1、AMOTL1、TSP50、A_24_P927015、THC2325987、C18orf1和LIN28（这些基因名称中的一些指参照微阵列记录号，如安捷伦芯片（Agilent Chip）的寡核苷酸探针）。应理解该表达谱并不限制本发明的范围，由于技术人员公知如何使用本发明的方法为其它癌症或为通常的其它疾病获得其它适当的基因表达谱。

本发明人现在已经发现血小板含有肿瘤来源的或肿瘤相关的或疾病来源的核酸或核酸表达谱形式的癌症标记物和疾病标记物，且发现这些血小板可以用作用于如本文所确定的癌症和其它疾病的分子表达谱的诊断平台。这在个性化医学的情况中非常有用。

本发明提供了新颖的且易于使用的方法以分离用于遗传分析的循环的疾病来源的物质（例如如在本文所使用的疾病标记物）。本发明人从循环的凝血细胞中分离肿瘤来源的RNA，产生纯的RNA，从而提供从少量血液中提取高质量RNA的简单途径。凝血细胞核酸（NA）的分离及后续的分析显示对血液中循环NA的诊断敏感性显著升高。

本发明人发现在疾病患者中循环凝血细胞含有显著量的疾病来源的RNA和/或DNA。该疾病来源的RNA和/或DNA显示出关于疾病的独特的遗传信息，该遗传信息可用于确定疾病类型、疾病的程度及可能的疾病对治疗的敏感度。在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是癌症。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是脉管疾病。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是系统红斑狼疮。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是镰刀状细胞疾病。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是阿尔茨海默氏疾病。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是与病态巨核细胞功能相关的疾病。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是与病态血小板功能相关的疾病。

在上述参照的优选实施方式中，某些被放弃的疾病可以以任何方式结合在本发明的各方面中。

在本发明的方法及其实施方式的优选实施方式中，所述疾病不是选自包括癌症、心血管疾病、系统性红斑狼疮、镰刀状细胞疾病、阿尔茨海默氏疾病、与病态血小板功能相关的疾病和/或与病态巨核细胞功能相关的疾病的组中的疾病。

参与异常血小板功能的疾病可包括输血后紫癜（PTP）、输血后血小板无效（PTPR）、新生儿同种免疫性血小板减少症（NATP）、血小板减少和/或原发性血小板增多症。

在本发明的方法或实施方式的优选实施方式中，所述疾病来源的核酸不是起源自巨核细胞。明确地显示出本发明的核酸对象被来自细胞外（血浆）环境的凝血细胞吸收或积累，且不是巨核细胞系来源的。可以分析凝血细胞的RNA和/或DNA以检测特定疾病来源的RNA和/或DNA的存在，如在本文所证明的用于检测来自神经胶质瘤的EGFRvIII突变RNA的存在。

本发明描述了在去核血细胞（诸如从血液中提取的凝血细胞）内，发现从疾病起源的成核细胞来源的特定核酸转录物的方法。该途径是稳定且容易的。这归因于快速且直接的提取程序及提取的NA的质量。在临床情况内，已经在普通生物样品采集中实现（从血液样品中）提取凝血细胞，因此预见在诊所中实现该过程相对容易。

本发明提供了用于分析受试者血液中存在疾病来源的核酸的一般方法，以及使用所述一般方法在受试者中诊断疾病的方法。当本文中述及本发明的方法时，两个实施方式均被述及。

可以在包括去核血细胞的任何适合的身体样品上进行本发明的方法，诸如包括血液的组织样品，但所述样品优选是全血。

可以通过任何标准的方法（例如通过静脉抽取）获得受试者的血液样品。

并不特别限制所需血液的量。依赖于所利用的方法，技术人员应能够建立所需的样品量以进行本发明方法的各个步骤，且获得用于遗传分析的足够的NA。通常，这样的量应包括从0.01μl至100ml的体积范围。

在样品采集之后可以立即分析该身体样品。可选择地，根据本发明的方法的分析可以在储存的身体样品或其去核血细胞的储存部分（优选凝血细胞）上进行。可以使用本领域已知的方法和设备保存用于测试的身体样品或其去核血细胞的部分。在采集的去核血细胞部分中，凝血细胞优选保持失活状态（即非活跃状态）。这样，细胞完整性和疾病来源的核酸得到最好的保存。

在去核血细胞的部分是凝血细胞部分的情况下，该血小板分离的部分优选不包含贫血小板血浆或富含血小板血浆（PRP）。血小板进一步的分离对于最佳分辨率（resolution）是优选的。

可以适当地处理身体样品，例如可以纯化、或消化该身体样品，或从该身体样品中提取特异性的化合物。依赖于描述NA存在于所述样品中的去核血细胞的方法，该方法优选涉及RT-PCR，可以通过本领域技术人员已知的方法从样品中提取去核血细胞，且该提取的去核血细胞被转移至用于从中提取分析方法所需NA的任何适当的介质。可以处理受体受试者的身体样品以从中去除多余的核酸降解酶（如RNase、DNase），以防止核酸的早期破坏。

从受试者的身体样品中提取凝血细胞可以涉及任何可用的方法。在输血医学中，经常通过血浆置换收集凝血细胞。血浆置换是一种医学技术，其中供者或患者的血液经过一分离出一种具体的成分而将剩余成分返回循环系统的设备。使用专用离心机进行个别血液成分的分离。血小板去除法（plateletpheresis）（还称为凝血细胞去除法或凝血细胞提取法）是采集凝血细胞的血浆置换过程。现代自动化的血小板去除法允许血液供者给予他们的部分凝血细胞，而保留他们的红细胞和至少部分血浆。但是如本文通过血浆置换可预见的，可能提供包括凝血细胞的身体样品，常常更容易收集全血且通过离心从中分离凝血细胞部分。通常，在这样的方案中，首先通过在室温大约120×g保持大约20分钟的离心步骤从其它血细胞中分离凝血细胞以获得富含血小板血浆的部分。然后洗涤（例如在PBS-EDTA中）凝血细胞以去除血浆蛋白，且富集凝血细胞。通常在室温850～1000×g保持大约10分钟来进行洗涤步骤。可以进行进一步的富集以产生更加纯的凝血细胞部分。

血小板分离通常涉及在含有抗凝血剂柠檬酸（例如36ml柠檬酸、5mmol/lKCl、90mmol/l NaCl、5mmol/l葡萄糖、10mmol/l EDTA pH6.8）的Vacutainer管中的血液样品收集。在Ferretti等（J Clin Endocrinol Metab2002;87:2180–2184）中描述了用于血小板分离的适当的方案。该方法涉及初步离心步骤（1,300rpm/10min）以获得富含血小板血浆（PRP）。然后在抗凝集缓冲液（Tris–HCl10mmol/l;NaCl150mmol/l;EDTA1mmol/l;葡萄糖5mmol/l;pH7.4）中对血小板洗涤三次，且如上进行离心，以防止任何被血浆蛋白污染且以去除任何残余的红细胞。然后，可以进行在4,000rpm保持20min的最终离心以分离血小板。可以例如在磷酸盐缓冲盐水中洗涤血小板沉淀块。为了定量确定疾病标记物的水平，血小板膜的蛋白浓度可以用作内参。可以使用血清白蛋白作为标准，通过布拉德福（Bradford）（Anal Biochem1976;72:248–254）的方法确定这样的蛋白浓度。

在受试者的身体样品准备好及从中提取了去核血细胞之后，筛选受试者的去核血细胞以检测疾病特异性核酸的存在。如果在受试者的去核血细胞中发现疾病特异性核酸，或者如果在受试者的去核血细胞中发现的疾病特性核酸处于高于在对照受试者的未受影响的血液样品中的去核血细胞的水平，该疾病特异性核酸被认为起源于存在于受试者中的患病细胞或组织，则所述受试者被诊断为患有本文所定义的疾病。

疾病特异性核酸（RNA和/或DNA疾病标记物）被定义为起源于患病细胞，该患病细胞在与疾病相关或对疾病特异性的核酸序列中含有突变或不含有突变；且疾病特异性核酸还包含疾病来源的去核血细胞核酸，疾病来源的去核血细胞核酸相对于来自健康供体的去核血细胞中的核酸被上调或下调。因此，术语“疾病特异性核酸”和“疾病来源的核酸”在本文可互换使用。应了解可以鉴定非突变基因，且该非突变基因可以用于疾病诊断。如果特定基因在特定疾病中过表达，这些核酸可以被转移至去核血细胞中。但是，如果这些核酸已经存在于健康受试者的去核血细胞中，则可以预期在患这样的疾病的患者的去核血细胞中核酸拷贝数是增加的。因此，在本发明各方面的特定实施方式中，去核血细胞中特定基因拷贝数的量化（例如通过定量PCR或微阵列）对于检测过表达这样的基因的疾病的存在可能是有利的。优选地，疾病标记物或疾病特异性核酸不是来源于巨核细胞。在本发明或其实施方式的优选实施方式中，疾病标记物或疾病特异性核酸不是在线粒体DNA第12027位的突变体。在本发明或其实施方式的优选实施方式中，疾病标记物或疾病特异性核酸不是在线粒体DNA第11778位的突变体。在本发明或其实施方式的优选实施方式中，疾病标记物或疾病特异性核酸不是CD109基因中的突变体。在本发明或其实施方式的优选实施方式中，疾病标记物或疾病特异性核酸不是CD109基因的编码区域第2108位和/或第954位的突变体。上面任何被放弃的实施方式可以在本文的各方面中以任何组合的方式被放弃。

本发明的方法中的进一步的步骤是提供去核血细胞提取的核酸部分。这样的核酸部分随后被用于检测本文的疾病标记物。可以通过任何可用的NA提取方法获得去核血细胞提取的核酸部分。通常通过使用离液剂进行RNA提取。在从细胞或组织分离总RNA中的第一个步骤是在变性条件下破碎细胞。在1979年，Chirgwin等（Biochemistry,18[24]:5294-9,1979）设计出一种通过在具有0.1M2-巯基乙醇的4M强蛋白变性剂硫氰酸胍溶液中均质化以打开蛋白的二硫键，从而用于有效分离总RNA的方法。然后通过乙醇提取或通过经氯化铯的超离心分离RNA。在1987年，Chomczynski和Sacchi（Analytical Biochemistry,162[1]:156-9,1987）修改了该方法，以设计出使用硫氰酸胍和苯酚-氯仿的混合物的快速单步提取的程序，该方法特别用于处理大量样品或用于从小量的细胞或组织中分离RNA。任何商业的试剂盒也可用于RNA的提取，其非限制性的实例包含Ambion's RNAqueous^TM系统、Bio101'sRNaid Plus试剂盒、Bioline Ltd.'s RNAce试剂盒、CLONTECH’sRNA II和NucleoTrap mRNA试剂盒、Invitrogen Corp.’s S.N.A.P.总RNA分离试剂盒和QIAGEN'sRNeasy试剂盒。

可以通过任何可用的遗传分析技术在提取的核酸样品中检测疾病来源的核酸，该任何可用的遗传分析技术可适用于检测核酸序列的突变或对于疾病特异的核酸的表达谱。通常，可以通过选择性核酸杂交容易地检测这样的序列突变，该杂交涉及通过两条单链核酸序列彼此选择性杂交所形成的双链体核酸结构的形成。选择性杂交包含在严格杂交条件下核酸序列与特异性核酸目的序列杂交，至高于它与非目的核酸序列杂交的可检测的程度（例如至少比背景高2倍），且基本排除非目的核酸。选择性杂交的序列典型地彼此具有大约至少80%的序列一致性，优选地具有90%的序列一致性，且最优选地具有100%的序列一致性（即互补）。

可选择地，可通过测序技术（诸如DNA和RNA测序）进行疾病来源的核酸的检测。

当检测RNA中的序列突变或RNA的表达谱时，在检测其中的序列突变或定量表达量之前，该RNA优选地被转录成cDNA。

可以使用RNA依赖的DNA聚合酶（诸如来自病毒的反转录酶、反转录转座子、细菌等）将RNA反转录成cDNA。这些可具有RNase H活性，或可以使用反转录酶，该反转录酶被突变从而该反转录酶的RNase H活性被限制或不表现出来（例如MMLV-RT RNase H-）。RNA依赖的DNA合成（反转录）还可以通过突变或修改的反应条件而示出改变的核酸依赖性，且从而获得RNA依赖的DNA聚合酶的功能的酶进行。

一旦RNA被反转录成cDNA，该DNA序列可以用于分析癌症特异性的突变的存在，或可以使用例如如上所述的选择性核酸杂交来确定表达谱。这样的技术在本领域中是公知的，且可包括使用对要检测的突变具有特异性的扩增引物进行选择性扩增，或使用mRNA特异性探针与核酸阵列选择性杂交。可选择地，可以使用普通引物以扩增包括可疑突变的DNA，然后可以通过使用对该突变特异的探针进行选择性核酸杂交从而在扩增子中检测该突变。通常使用在本领域有很好描述的定量杂交的方法获得表达谱，在实例中描述了该方法的示例。

原则上，可以通过使用以下方法进行本发明的方法：任何核酸扩增的方法，诸如聚合酶链式反应（PCR;Mullis1987,美国专利号4,683,195,4,683,202,en4,800,159）；或扩增反应，诸如连接酶链式反应（LCR;Barany1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193;欧洲申请号,320,308）、自主序列复制（3SR;Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878）、链置换扩增（SDA;美国专利号5,270,184,en5,455,166）、转录扩增系统（TAS;Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177）、Q-β复制酶（Lizardi等,1988,Bio/Technology6:1197）、滚环扩增（RCA;美国专利号5,871,921）、基因核酸序列的扩增（NASBA）、裂解酶片段长度多态性（Cleavase Fragment LengthPolymorphism）（美国专利号5,719,028）、等温的和嵌合引物起始的核酸扩增（ICAN）、分枝-延伸扩增方法（RAM;美国专利号5,719,028和5,942,391）或其它用于DNA扩增的适当方法。

为了扩增对一个或多个扩增引物具有少量错配的DNA，可以在降低严格性（例如使用38℃的退火温度，或存在3.5mM MgCl₂的PCR扩增）的条件下进行扩增反应。本领域技术人员应能够选择适当严格性的条件。

可以选择本文的引物为与它们的目的区域“基本”互补（即至少65%，更优选地至少80%的完全互补），该目的区域存在于每一要扩增的特异序列的不同链上。可以使用包含例如肌醇残基或不明确碱基的引物序列，或者使用当与目的序列比对时甚至包含一个或多个错配的引物。通常，认为呈现出与目的DNA寡核苷酸序列有至少65%、更优选至少80%同源性的序列适用于本发明的方法中。当使用低严格性杂交条件时，序列错配并不是关键性的。

原则上可以通过本领域任意使用的方法完成扩增产物的检测。可以使用放射性标记、抗体、发光染料、荧光染料或酶试剂直接对检测片段进行染色或标记。直接DNA染色包括例如嵌入染料（如吖啶橙、溴化乙锭、单叠氮乙锭（ethidium monoazide）或Hoechst染料）。

可选择地，可以通过将标记的dNTP碱基并入合成的DNA片段来检测DNA片段。可以与核苷酸碱基相关联的检测标记物包括例如荧光素、花青素染料或BrdUrd。

当使用基于探针的检测系统时，在本发明中使用的适当的检测程序可以例如包括酶免疫测定（EIA）形式（Jacobs等,1997,J.Clin.Microbiol.35,791795）。对于通过EIA过程的方式进行检测，在扩增反应中使用的正向引物或反向引物均可包括捕获基团（capturinggroup）如生物素基团，用于目的DNA扩增子的后续EIA检测（见下文）；其中，该生物素基团用于目的DNA的PCR扩增子在例如链霉亲和素包被的微量滴定板的孔上的固定。技术人员应理解可以使用用于在EIA形式中固定目的DNA的PCR扩增子的其它基团。

如本文所公开的，用于检测目的DNA的探针优选仅与通过DNA扩增过程扩增的至少一部分DNA序列区域结合。本领域技术人员可以基于目的DNA的核苷酸序列制备用于检测的适当的探针，而不需要如本文所阐述的过度的实验。而且，目的DNA的互补序列可以适当地在本发明的方法中被用作检测探针，前提是这样的互补链在所使用的扩增反应被扩增。

本文所使用的适当的检测过程例如包括扩增子的固定和用探针通过例如Southern印迹对其DNA序列进行探测。其它形式可以包括如上所述的EIA形式。为了方便结合的检测，特异的扩增子检测探针可以包括标记基，如荧光团、发色团、酶或放射标记物，以便方便监控探针与扩增反应的反应产物的结合。这样的标记物是本领域技术人员公知的，且包括例如异硫氰酸荧光素（FITC）、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉亲和素、生物素、地高辛、³⁵S或¹²⁵I。其它实施例对本领域技术人员是明显的。

还可以通过例如Van den Brule等（2002,J.Clin.Microbiol.40,779-787）描述的所谓的反向线印迹（RLB）测定进行检定。为了该目的，优选使用5’氨基合成RLB探针用于在例如羧基包被的尼龙膜上的后续固定。RLB形式的优点是系统的简单及其速度，因此可用于高通量样品的处理。

用于检测DNA片段的核酸探针的使用在本领域是公知的。这些过程大部分包括目的DNA与探针的杂交，然后进行杂交后的清洗。特异性通常是杂交后清洗的作用，关键因素是最终清洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可以使T_m（热解链点，即在确定的离子强度和pH下，在该温度下大约50%的互补目的序列与完全匹配的探针杂交）接近Meinkoth和Wahl的方程式（Anal.Biochem.,138:267-284(1984)）：T_m=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-500/L；其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶的百分比；%甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是以碱基对形式的杂交体的长度。对于每1%的错配T_m降低大约1℃，因此可以调节杂交和/或清洗条件以与具有期望一致性的序列杂交。例如，如果寻找到＞90%一致性的序列，可以使T_m降低10℃。通常，选择严格条件为比在限定离子强度和pH下特异性序列及其互补物的T_m低大约5℃。但是非常严格的条件可以利用在比T_m低1℃、2℃、3℃或4℃处进行杂交和/或清洗；适度的严格条件可以利用在比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃处进行杂交和/或清洗；低严格性条件可以利用在比T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃处进行杂交和/或清洗。使用该方程式、杂交和清洗组合物及所期望的T_m，本领域普通技术人员应理解固有地描述了杂交和/或清洗溶液的严格性中的变体。如果所期望的错配度使得T_m低于45℃（水性溶液）或32℃（甲酰胺溶液），则优选升高SSC浓度，以便可以使用较高温度。对核酸杂交的全面指导参见Tijssen的《生化和分子生物学实验技术-使用核酸探针的杂交（Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes）》第一部分第二章《杂交原理和核酸探针测定的策略综述（Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assays）》（Elsevier出版社，纽约(1993)），和《分子生物学实验指南（Current Protocols in Molecular Biology）》第二章（Ausubel等编辑,Greene Publishing and Wiley-Interscience出版社,纽约(1995)）。

优选选择检测探针为与由本发明的方法中的扩增反应所产生的双链DNA扩增子的其中一条链“基本”互补。优选地，探针与由目的DNA产生的扩增子的固定化的（例如生物素标记的）反义链基本互补。

允许检测探针包含与它们的目的序列存在一个或多个错配。通常，认为与目的DNA寡核苷酸序列显示至少有65%、更优选至少有80%同源性的序列适用于本发明的方法中。

因此，可以通过标准的核酸分析技术进行分析去核血细胞提取的核酸部分以确定疾病标记物是否存在的步骤。确定在所述核酸部分中所述核酸标记物的水平是否相对于未受影响血液样品存在改变应涉及对去核血细胞中疾病标记物的量的（半）定量测量。因此，用于在从去核血细胞中分离的核酸中检测疾病特异的标记物的非常优选的方案是定量反转录PCR（qRT-PCR）（Freeman等,BioTechniques26:112-125(1999)）。

如上所提到的“未受影响的血液样品”指健康对照的受试者或来自发病之前的相同受试者的去核血细胞中的疾病标记物的水平。由于去核血细胞特征和去核血细胞组分的量取决于（除了其它方面）物种和年龄，因此优选未患病的对照去核血细胞来自相同物种、年龄的受试者且来自相同的亚群（例如吸烟者/非吸烟者）。可选择地，可以从数据库和文献中获取对照数据。应理解对照样品还可以从处于特定时间点的患病受试者中获取，以分析疾病的进程。

疾病标记物包括癌症/特异突变，且癌症特异的突变可包括各种与癌症相关的已知突变。在http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/和本文的表格中提供了各种癌症的突变实例的非限制性列表。

本发明进一步提供了一种用于诊断受试者中的疾病的试剂盒，所述试剂盒包括包装材料，所述包装材料包括至少一种用于特异确定在受试者的去核血细胞样品中至少一种核酸突变体的水平和/或活性和/或核酸谱的试剂。如本文所使用的，术语“诊断”指确定疾病的存在，对疾病进行分类，确定疾病的严重性（等级或阶段），监控疾病的进程，预测疾病的结果和/或恢复的前景。

应理解，对于检测疾病来源的核酸所必需的工具可以被提供为试剂盒，诸如FDA-认可的试剂盒，所述试剂盒可以包含一种或多种单位剂型，该单位剂型包含用于通过本发明的方法检测在去核血细胞中的疾病来源的核酸的活性成分。

可选择地，试剂盒可以包括单独包装的用于收集样品的工具，及特异性扩增和/或检测的引物。

试剂盒可以同时存在用于实施本发明方法的说明书。

例如，试剂盒可以被包括在诸如浸量尺（dipstick）或筒状物（cartridge）的装置中，可选地被包括在壳体中，血液样品或分离和/或扩增的去核血细胞的核酸样品可以被应用至该装置，且该装置检测所述样品中的疾病来源或疾病特异性的核酸或核酸谱。所述装置可以包括任何能够特异性检测疾病来源的核酸的试剂。例如，所述装置可以包括结合疾病来源的核酸的一种固定化的突变特异性杂交探针或固定化的突变特异性杂交探针的组合，及用于检测结合的指示剂。在本发明的实施方式中，在装置中提供支撑物，杂交探针被可移除地或固定地附着在该支撑物上。

根据一个实施方式，所述装置可以是侧流装置，该侧流装置包括进入工具，用于使血液样品或分离的和/或扩增的去核血细胞核酸样品流入与能够检测疾病来源的核酸的试剂接触。测试装置还可以包括流动控制工具，用于确保测试正在正确地运行。这样的流动控制工具可以包括对照核酸粘合至捕获添加至样品中的检测探针的支撑物，作为证实样品流体正确流过测试装置的方法。可选择地，流动控制工具可以包括在对照区域中捕获探针，该对照区域捕获所述样品中天然存在的对照核酸或向该样品添加作为对照的对照核酸，再次指示装置中正在进行正确的流动。

另一方面，本发明提供了本发明的装置使用上文所述的任何一种方法诊断受试者体内疾病的应用。用于使用上述任何一种方法诊断受试者体内疾病的非常适用的装置包括血小板（Platelet）RNA芯片，诸如在Nagalla&Bray(2010)Blood115(1):2-3和Gnatenko等Blood115(1):7-14中描述的血小板RNA芯片。

现在将通过以下非限制性实施例的方式例示本发明。

实施例

实施例1

通过离心步骤，从4位成胶质细胞瘤患者和4位健康的供体的血液样品中分离凝血细胞。然后，使用Trizol RNA分离对凝血细胞进行RNA提取。然后，纯化的凝血细胞RNA样品被转变成cDNA，且使用标准的微阵列方案通过安捷伦（Agilent）4x44K表达微阵列分析。这样在不同的凝血细胞制品中能够作出mRNA的表达谱。

在来自健康供体的血小板中，大约8500个RNA转录产物不能被表达微阵列检测到。这些转录产物在来自健康供体的凝血细胞中存在的水平低于Agilent4x44K芯片的检测极限。因此，这样的RNA可能全部都是潜在的用于癌症诊断的标记物。在来自健康供体的凝血细胞中通过表达微阵列没有检测到的RNA中，有相当一部分的RNA在来自成胶质细胞瘤患者的凝血细胞中被检测到。表1总结了通过表达微阵列在来自成胶质细胞瘤患者的凝血细胞中被检测到，但在健康供体的凝血细胞中没有被检测到的独特的凝血细胞RNA。表1中总结了在4/4患者样品（表1A）或在3/4患者样品（表1B）中被检测到，但在4个对照样品的任何一个中均未被检测到的独特的RNA转录产物。

表1.通过表达微阵列在来自成胶质细胞瘤患者的凝血细胞中被检测到，但在健康供体的凝血细胞中没有被检测到的独特的凝血细胞RNA转录产物。

1A.在四位患者样品中的四个样品中的凝血细胞中检测到，但在来自对照样品的凝血细胞中没有检测到的转录产物。

1B.在四位患者样品中的三个样品中的凝血细胞中检测到，但在来自对照样品的凝血细胞中没有检测到的转录产物。

表2.用于各种癌症的癌症特异性的突变。

代号

基因ID

染色体带

肿瘤类型(体细胞突变)

癌症综合征

实施例2

引言

对诊断、监控及使癌症患者分等级有高预测性的诊断平台是在开发个性化医学中的关键手段。在本实施例中，证实肿瘤细胞将（突变的）RNA转移进入血小板中（体外），且示出从成胶质细胞瘤和前列腺癌患者中分离的血小板中分别包含癌症相关的RNA生物标记物EGFRvIII和PCA3和PSA。此外，基因表达阵列揭示与正常对照受试者相比，来自神经胶质瘤患者的血小板中具有不同的mRNA特征。因为血小板容易获取和分离，因此它们可以形成用于癌症伴随诊断的有吸引力的平台。

方法

血小板分离和组织切除

通过标准离心，从在包含EDTA抗凝血剂的紫帽BD Vacutainer中收集的全血中分离血小板，且通过显微分析测定质量（活性和聚集）以及纯度示出红细胞或白细胞的污染少于0.1%。接着，分离的血小板沉淀块被快速冷冻用于进一步的使用。如在其它文献中所描述的（J.Skog等,Nat Cell Biol.10(12),1470-6(2008)），在VU大学医学中心和于默奥大学进行从神经胶质瘤和前列腺癌症患者中的神经胶质瘤组织切除和全血获取。

微泡分离、标记和转移

从U87-EGFRvIII神经胶质瘤细胞中分离微泡，且如前所描述的对该微泡进行标记（J.Skog等,Nat Cell Biol.10(12),1470-6(2008)）。在U87-EGFRvIII微泡孵浴之后，洗涤血小板且使用RNAse酶处理血小板以确保EGFRvIII RNA被递送至血小板中，且因此防止RNAse介导的降解。为了进行共聚焦显微分析，血小板使用德克萨斯红缀合的麦胚凝集素染色以指示血小板的结构，且通过绿色PKH67的存在分析微泡摄入。RNA纯化。按照制造商的说明书使用miRvana（Ambion公司）或miRNeasy（Qiagen公司）的方案分离RNA。使用具有总RNAPico芯片（Agilent公司）的Bioanalyzer2100测定RNA的浓度和质量。

RT-PCR

使用下面的引物组按照之前描述的（J.Skog等,Nat Cell Biol.10(12),1470-6(2008)）方法进行EGFRvIII、PCA3、PSA和GAPDH的RT-PCR：

GAPDH引物:

正向5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,

反向5′-TCAGAAGATGGTGATGGGATTTC-3′.

PSA引物:

正向5’-ATGTGGGTCCCGGTTGTCTT-3’,

反向5’-TCCCACAATCCGAGACAGGA-3’.

巢式PCA3引物:

PCR1:

正向5’-AGTCCGCTGTGAGTCT-3’,

反向5’-CCATTTCAGCAGATGTGTGG-3’;

PCR2:

正向5’-ATCGACGGCACTTTCTGAGT-3’,

反向5’-TGTGTGGCCTCAGATGGTAA-3’.

巢式EGFRvIII引物:

PCR1:

正向5′-CCAGTATTGATCGGGAGAGC-3′,

反向5′-TGTGGATCCAGAGGAGGAGT-3′;

PCR2:

正向5′-GAGCTCTTCGGGGAGCAG-3′,

反向5′-GCCCTTCGCACTTCTTACAC-3′

基因表达阵列

在VU大学医学中心微阵列核心实验室（core facility）使用Agilent4x44K基因表达阵列进行mRNA表达阵列。使用Agilent2100生物分析仪（安捷伦（Agilent）科技有限公司）评定血小板RNA的完整性。使用Agilent低RNA投入的线性扩增试剂盒加（Low RNA InputLinear Amplification Kit Plus）(5188-5340)按照制造商的方案标记RNA样品。

简言之，扩增25ng的总RNA且使用T7-聚合酶反转录成cDNA，然后使用Cy3或Cy5标记。使用Nanodrop ND-1000分光光度计测量染料的并入。随后，使用Agilent基因表达杂交试剂盒（Gene Expression Hybridization Kit）(5188-5242)按照制造商的方案杂交cRNA。简言之，将825ng Cy3标记的cRNA与825ng Cy5标记的cRNA混合，在暗处60°C破碎30min，且在Agilent杂交室密封玻片（Hybridization Chamber Gasket Slide）（G2534-60011）上在65°C的旋转炉中杂交17h。使用Agilent微阵列扫描仪（Microarray Scanner）（G2565BA）扫描玻片。使用特制提取软件（feature extraction software）版本9.5（安捷伦科技有限公司）进行图像分析和阵列标准化。使用默认设置应用Agilent GE2-v5_95方案。

统计分析。

在具有S.A.M.分析插件的Excel（Microsoft Office2007软件包）中使用均值中心数组（median centered array）产生基因表达数据的热图（heat map）（图3C），具有固定的错误发现率<0.5%。使用Heatmap Builder v1.1软件（King等PhysiolGenomics.Sep212005;23(1):103-118））描绘最高的30个显著区别表达的基因。

结果

在本实施例中，示出从健康的人对照受试者中分离的血小板具有摄入来源于人脑肿瘤细胞（神经胶质瘤）的含RNA微泡的能力，且包含肿瘤相关的RNA，包括突变的EGFRvIII。通过FACS分析和共聚焦显微术证实在血液的血小板中PKH67标记的神经胶质瘤来源的微泡的摄入。此外，通过RT-PCR示出出现突变的EGFRvIII RNA微泡介导地从健康的对照受试者转移进入血小板。进一步地，确定从神经胶质瘤患者分离的循环的血小板包含RNA生物标记物（见图3B）。使用RT-PCR确定是否在切除的高等级神经胶质瘤组织（n=18）发现突变的EGFRvIII的mRNA，且结果与来自相同的患者的血小板和来自健康的对照受试者的血小板（n=30）进行对比。对样品进行编码，且以盲测进行RT-PCR。如前面所观察到的，18位神经胶质瘤样品中有4位（22.5%）包含EGFRvIII转录产物。显著地，可以从这4位EGFRvIII阳性患者中的3位（75%）的血小板中扩增出EGFRvIII，且没有在健康供体（n=12）的血小板中扩增出EGFRvIII，但在所有血小板样品中均检测到GAPDH的mRNA。仅在一位患者的血小板中检测到可能的假阴性信号，这可能是由于血液样品没有被充分处理。相反地，一位具有EGFRvIII阴性组织样品的患者在血小板样品中为EGFRvIII阳性，很可能是因为EGFRvIII阳性灶在高等级神经胶质瘤中的异质分布。

为了证实肿瘤相关信息的存在并不是来自神经胶质瘤患者的血小板特有的，我们报道了在来自前列腺癌患者（n=12）的血小板中编码前列腺癌标记物PCA3和PSA的mRNA的存在，以及编码这些标记物的mRNA不存在于来自健康的对照受试者（n=10）的血小板中（见图4）。最后，使用基因表达阵列确定从健康对照受试者（n=12）和神经胶质瘤患者（n=8）中分离的血小板的mRNA表达谱。获得不同的mRNA表达谱，且检测到最小的神经胶质瘤生物标记物的标识（图3C，左图）。有趣的是，几个潜在的生物标记物在对照样品中几乎不能检测到，但是它们在神经胶质瘤样品中被非常高地表达（图3C，右图）。

总之，本发明人的发现证实了血液的血小板包含肿瘤来源或肿瘤相关的RNA形式的癌症标记物，且因此血液的血小板可在个性化医学的背景中用作癌症的分子表达谱的诊断平台。

Claims (24)

1.检测疾病标记物的试剂在制造诊断试剂中的应用，所述诊断试剂在受试者体外分析受试者的血液样品中的疾病标记物的存在的方法中使用，所述方法包括以下步骤：

a)从所述血液样品中的去核血细胞中提取核酸以提供去核血细胞提取的核酸部分；以及

b)分析所述去核血细胞提取的核酸部分中的疾病标记物的存在，

其中，所述疾病标记物是所述受试者的成核细胞的基因中的疾病特异性的突变；或者

其中，所述疾病标记物是所述受试者的成核细胞的基因的疾病特异性的表达谱，

其中，所述去核血细胞提取的核酸部分不是巨核细胞来源的核酸或不是巨核细胞来源的RNA。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述去核血细胞是凝血细胞或红细胞

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述去核血细胞是凝血细胞。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述疾病选自由自身免疫性疾病、皮肤病、眼病、内分泌疾病、神经性障碍和心血管疾病所组成的组中。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述疾病不是选自包括癌症、心血管疾病、系统性红斑狼疮、镰刀状细胞疾病、阿尔茨海默氏疾病，与病态血小板功能相关的疾病，和/或与病态巨核细胞功能相关疾病的组中的疾病。

6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述去核血细胞提取的核酸部分是疾病来源的核酸。

7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述去核血细胞提取的核酸部分包括源自成核细胞的核酸。

8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述成核细胞不是巨核细胞。

9.根据权利要求1所述的应用，其中，所述疾病特异性的突变位于染色体基因中，或其中所述疾病特异性的表达谱是染色体基因的疾病特异性的表达谱。

10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述核酸是核糖核酸(RNA)。

11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述核酸是mRNA。

12.根据权利要求1所述的应用，其中，分析所述去核血细胞提取的核酸部分中的疾病标记物的存在的所述步骤b)包括：

i)使用至少一个核酸突变特异性的扩增引物或探针，通过反转录酶的聚合酶链式反应扩增来选择性扩增所述突变；或者

ii)通过反转录酶的聚合酶链式反应扩增来选择性扩增多个mRNA，以确定编码所述mRNA的染色体基因的表达水平，从而提供所述基因的表达谱且将所述表达谱与参照谱进行对比。

13.根据权利要求1所述的应用，其中，所述方法是诊断受试者中所述疾病的方法的一部分，且其中，所述疾病标记物在所述去核血细胞提取的核酸部分中的存在是所述受试者患有所述疾病的指示。

14.检测疾病标记物的试剂在制造诊断试剂中的应用，所述诊断试剂在用于确定受试者中疾病阶段或疾病治疗的功效的方法中使用，所述方法包括以下步骤：

在第一时间点，使用根据权利要求1～13中任一项所述的方法，分析受试者的血液样品中的所述疾病标记物的存在，从而提供所述受试者中的所述疾病标记物的水平的第一值；

在第二时间点，使用根据权利要求1～13中任一项所述的方法，分析所述受试者的血液样品中的所述疾病标记物的存在，从而提供所述受试者中的所述疾病标记物的水平的第二值，其中所述受试者已经在所述第一时间点和所述第二时间点之间经过了疾病治疗；以及

对比所述第一值和所述第二值，以确定在所述受试者中所述疾病治疗的功效。

15.检测疾病标记物的试剂在制造诊断试剂中的应用，所述诊断试剂在用于确定受试者中的疾病阶段的方法中使用，所述方法包括以下步骤：

使用根据权利要求1～13中任一项所述的方法，分析受试者的血液样品中的所述疾病标记物的存在，从而提供所述受试者中的所述疾病标记物的水平的测试值；

提供用于所述疾病标记物的水平的参照值，其中，所述参照值与疾病的特定阶段相关；以及

对比所述测试值和所述参照值，以确定在所述受试者中所述疾病的阶段。

16.一种适用于实施权利要求1～13中任一项所述的方法的部件的试剂盒，所述试剂盒包括包装材料，所述包装材料包括以下物质中的至少一种：

用于容纳从受试者的血液样品中分离出的去核血细胞的容器；

用于从所述去核血细胞中提取核酸的试剂；

用于通过反转录酶聚合酶链式反应扩增，从提取自所述去核血细胞的核酸中选择性扩增疾病标记物的诊断试剂，该疾病标记物是在所述受试者的成核细胞的基因中的疾病特异性的突变；以及

用于实施权利要求1～13中任一项所述的方法的印刷的说明书或电子说明书；

所述试剂盒进一步包括：

用于所述疾病标记物的参照，其中所述参照指示所述疾病标记物在所述去核血细胞提取的核酸部分中的存在或不存在，

其中，所述基因不是来自巨核细胞的基因。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述疾病标记物不是来源于巨核细胞的。

18.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述参照是用于健康对照受试者或患有所述疾病的对照受试者的凝血细胞中包括所述疾病特异性的突变的核酸水平的参照值；或者

其中，所述参照是用于多个mRNA在来自健康对照受试者或来自患有所述疾病的对照受试者的去核血细胞中的参照表达谱。

19.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述表达谱不是来源于巨核细胞的。

20.根据权利要求16所述的试剂盒，其中，所述试剂选自颗粒或荧光标记物标记的抗去核血细胞的抗体，或其中所述说明书选自用于基于珠子的去核血细胞分离的说明书、用于去核血细胞的FACS分选的说明书、用于通过离心回收去核血细胞的说明书或非去核血细胞组分的阴性选择的说明书。

21.一种用于诊断疾病的装置，所述装置包括支撑物及附着至所述支撑物的至少一种诊断试剂，所述至少一种诊断试剂用于特异性确定至少一种疾病标记物的水平和/或活性，所述疾病标记物是成核细胞的基因中的核酸突变体；以及

计算机可读的介质；

其中，所述用于诊断疾病的装置用于实施权利要求1～13中任一项所述的方法。

22.根据权利要求21所述的装置，其中，所述疾病不是与病态巨核细胞功能相关的疾病，且其中，所述核酸突变体不包括巨核细胞来源的核酸。

23.根据权利要求21或22所述的装置，其中，所述至少一种诊断试剂是寡核苷酸探针或测序引物。

24.根据权利要求21所述的装置，包括侧向流动装置、浸量尺或筒状物，用于：

在去核血细胞提取的核酸和至少一个核酸突变特异性扩增的引物或寡核苷酸探针之间进行核酸杂交反应，其中，所述核酸突变特异性的扩增引物或寡核苷酸探针对成核细胞的基因中的疾病特异性的突变具有特异性；或者

用于在去核血细胞提取的核酸和多个基因特异性扩增的引物或多个寡核苷酸探针之间进行核酸杂交反应，用于提供成核细胞的疾病特异性的基因表达谱。