BRPI0517398B1 - proteína isolada jak2, sequência nucleotídica, vetor de clonagem e/ou de expressão viral, sondas ou iniciadores, oligonucleotídeo, métodos ex vivo ou in vitro para determinar a presença ou a ausência da variante g1849t do gene jak2, anticorpo monoclonal, hibridoma, kit, sirna, processos in vitro permitindo determinar a inibição específica de jak2 v617f, de triagem, utilização de sirna, e, composição - Google Patents

proteína isolada jak2, sequência nucleotídica, vetor de clonagem e/ou de expressão viral, sondas ou iniciadores, oligonucleotídeo, métodos ex vivo ou in vitro para determinar a presença ou a ausência da variante g1849t do gene jak2, anticorpo monoclonal, hibridoma, kit, sirna, processos in vitro permitindo determinar a inibição específica de jak2 v617f, de triagem, utilização de sirna, e, composição Download PDF

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Abstract

PROTEÍNA ISOLADA, SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA, VETOR, CÉLULA DE MAMÍFERO, ANIMAL TRANSGÊNICO NÃO HUMANO, SONDAS OU INICIADORES, MÉTODOS PARA DETERMINAR A PRESENÇA OU A AUSÊNCIA DA VARIANTE G1849T DO GENE JAK2, PARA DETECTAR A PRESENÇA OU A AUSÊNCIA DA VARIANTE JAK2 V617F, ANTICORPO MONOCLONAL, HIBRIDOMA, KIT, SIRNA, PROCESSOS PERMITINDO DETERMINAR A INIBIÇÃO ESPECÍFICA DE JAK2 V617F, DE TRIAGEM, PARA A IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS MEDICAMENTOS, UTILIZAÇÃO DE SIRNA, E, COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se à variante V617F da proteína tirosina cinase JAK2, a referida variante sendo responsável pela poliglobulia de Vaquez. A invenção refere-se igualmente a um método de diagnóstico em primeira intenção da eritrócitos e da trombocitoses permitindo as relacionar com as síndromes mieloproliferativas ou à detecção nas síndromes mieloproliferativas da variante JAK2 V617F permitindo reclassificar as mesmas em um novo grupo nosológico e à identificação de inibidores específicos e de SiRNA.

Description

[0001] A presente invenção refere-se ao variante V617F da proteína tirosina quinase JAK2, o referido variante sendo responsável pela poliglobulia de Vaquez. A invenção refere-se igualmente a um método de diagnóstico em primeira intenção do eritrocitose e da trombocitose que permite os unir síndromes mieoloproliferativas ou a detecção nas síndromes mieoloproliferativas do variante JAK2 V617F que permitem reclassificá-los em um novo grupo nosológico e a identificação de inibidores específicos e de siRNA.
[0002] A poliglobulia de Vaquez (Policitemia Vera ou PV) é uma síndrome mieoloproliferativa crônica, associando uma pliglobulia verdadeira e, frequentemente, uma trombocitose e uma hiperleucocitose. Trata-se de uma doença adquirida, clonal, da célula cepa hematopoiética. Os progenitores hematopoiéticos de PV são capazes de formar colônias eritroblásticas na ausência de eritropoiétina (Epo), chamadas “colônias espontâneas”. Uma hipersensibilidade dos progenitores eritroblásticos de PV a vários outros fatores de crescimento foi demonstrada igualmente: Interleucina-3 (IL-3), Granulocyte Macrophage-Stimulating Factor (GM - CSF), Stem CeIl Factor (SCF), e Insuline Like Growth Factor (IGF-I). Várias equipes se interessaram pela fisiopatologia da PV, mas a anomalia molecular à origem da doença continua desconhecida até os dias de hoje (H. Pahl, 2000).
[0003] A hipersensibilidade dos progenitores de PV a várias citocinas conduz a procurar anomalias que tocam as vias transdução do sinal comuns aos receptores às citocinas. A existência de um marcador molecular jamais foi evidenciada na PV, mas sendo dadas as similitudes entre a PV e as outras síndromes mieoloproliferativas, em particular o LMC, parece provável que mecanismos moleculares próximos desses iuzidos por Bcr-Abl sejam responsável pela vantagem de proliferação do clone maligno e de sua diferenciação terminal. Esta hipótese foi confirmada recentemente em duas síndromes mieoloproliferativas raras, as síndromes mieoloproliferativas associadas a uma translocação que implica a região cromossômica 8p11 que induz uma ativação constitutiva do receptor do FGF e a síndrome hipereosinofílica, na qual uma deleção cromossômica críptica conduz a um gene quimérico PDGFRα-FIP1L1. Nos dois casos, as anomalias moleculares são a origem de proteínas de fusão que têm uma atividade tirosina quinase constitutiva.
[0004] Na PV, não foi encontrada anomalia citogenética recorrente, ainda que uma deleção 20q for detectado em 10 a 15% dos dos pacientes, e uma perda de heterozigotia em 9p em cerca de 30% dos casos (Kralovics, 2002). Entretanto, estas anomalias não são específicas da doença.
[0005] Nas células de PV que apresentam uma independência à Epo, pesquisas foram empreendidas sobre a via do receptor da Epo (R-Epo). Muito primeiramente, o receptor é normal tanto no plano estrutural quanto funcional (Hess e al., 1994; Le Couedic e al.; 1996; Means e al., 1989). A fosfatase SHP-1 que defosforila R-Epo e JAK2 ao final da estimulação pela Epo, é normalmente expressa ao nível RNA e protéico (Andersson e al., 1997; Asimakopoulos e al., 1997). Mais a jusante na sinalização de R-Epo, uma ativação anormal de STAT5 foi pesquisada nos polinucleares(PNN) de pacientes que apresentam uma PV sem eencontrar anomalia. Em contrapartida, uma fosforilação constitutiva de STAT3 foi destacada nos PNN de 4 casos de PV em 14 estudados (Roder, 2001). Por fim, a expressão da proteína anti- apoptótica bcl-xl, alvo transcricional de STAT5, foi estudado em imuno-histoquimia e citometria de fluxos (Silva e al., 1998). Assim foi mostrado que bcl-xl estaria hiperexprimida nos eritroblastos de PV e notadamente a um estado mais maduro onde esta proteína não é normalmente mais exprimida. Na poliglobulia de Vaquez, os principais critérios diagnósticos são até agora clínicos (critérios do PVSG; Pearson, 2001). O diagnóstico biológico repousa essencialmente sobre a realização das culturas de progenitores eritróides na ausência de Epo (detecção das colônias endôgenas). Em função da expertise necessária para sua boa realização, e a importância do “tempo-técnico” gasto, este exame não está disponível em todos os centros, e é confiável apenas quando é realizado por um laboratório experiente. Além disso, o teste necessita de ser realizado sobre células medulares retiradas do paciente para uma boa sensibilidade, o que é não inofensivo para o paciente.
[0006] Por técnicas de hibridação subtrativa, uma equipe alemã clonou um gene hiperexprimido nos PNN de PV, denominado PRV1 (Policitemia Rubra Vera 1) (Temerinac e al., 2000). A proteína PRV-1 pertence à superfamília dos receptores de superfície uPAR. A hiperexpressão do RNAm codificante para PRV-I nos polinuclearesde PV é facilmente detectável por RT-PCR em tempo real, e constitui um marcador da doença de descoberta recente, sem papel fisiopatológico. Entretanto, os estudos recentemente publicados mostram que não é nem muito sensível nem muito específico.
[0007] Spivak JL e al., em 2003 (“Chronic myeloproliferative disorders.”; Hematology; 2003; 200 24.) descreve alguns marcadores da PV. Os mRNA do antígeno neutrofila NBI/CD177 são sobrexpremidos em granulócitos de pacientes PV. Este marcador não parece entretanto um meio confiável para detectar as PV, certas doenças que não apresentam esta sobrexpressão ou este sobrexpressão que pode ser observada em pacientes atingidos de síndromes mieoloproliferativas além da Poliglobulia deVaquez. Uma expressão diminuída do receptor a trombopoietina, Mp1, sobre as plaquetas é igualmente encontrada na PV. Embora esta anomalia predomine na PV é encontrada em outras síndromes mieoloproliferativas. Além disso, trata-se de um exame difícil de realizar que pode ser efetuado apenas em laboratórios especializados. Assim, não existe no estado da técnica nenhum método que permita um diagnóstico confiável da PV. Além disso, os únicos tratamentos disponíveis não são específicos. Trata-se de flebotomia para manter o hematócrito nos limites do normal, ou o emprego de agentes citotóxicoss, ou ainda do IFN.
[0008] No quadro da presente invenção, não somente descobrimos uma mutação no gene JAK2 em cerca de 90% dos pacientes testados mas estabelecemos igualmente que esta mutação é responsável por uma ativação constitutiva desta tirosina quinase e demonstrado que a sua inibição permite bloquear a proliferação e a diferenciação espontâneas dos eritroblastos de PV.
[0009] JAK2 pertencente à família do Janus Quinases (JAKs), que agrupa várias tirosinas quinases intracitoplásmicas: JAKl, JAK2, JAK3 e TYK2. As proteínas JAK são implicadas na sinalização intracelular de numerosos receptores membranares que não têm atividade tirosina quinase intrínseca, como certos membros da superfamília dos receptores às citocinas e em particular o receptor à Epo (R-Epo). A proteína JAK2 é codificada por um gene que comporta 23 exons. O DNA complementar tem um tamanho de 3500 pares de bases, e codifica para uma proteína de 1132 ácidos aminados (130 kD) (Figura 1). Identificamos por PCR e sequenciamento uma mutação pontual adquirida e clonal no exon 12 de JAK2 em quase 90% dos pacientes atingidos de PV. O Codon 617 “GTC”, codificando normalmente uma Valine (V), é mutado em “TTC”, codificando uma Fenilalanina (F). Esta mutação V617F não é encontrada nos 25 testemunhas ou pacientes atingidos por poliglobulia secundária testados. Em contrapartida ela é encontrada em 40% dos trombocitemias essenciais e em 50% das mielofibroses embora esta mutação defina um novo quadro de síndrome mieoloproliferativa como Bcr-Abl definiu a leucemia mieloide crônica.
[0010] Para estudar se o variante da invenção JAK2 V617F poderia ser detectada eficazmente com instrumentos largamente conhecidos classicamente utilizados nos laboratórios de diagnóstico em hematologia, analisamos 119 amostras que provêm de pacientes com uma suspeita de doença mieloproliferativa. Mostramos que JAK2 V617F era detectado eficazmente pelas tecnologias LightCycler® e TaqMan®, estes últimos sendo um pouco mais sensíveis que o sequenciamento. Estimamos em seguida o valor de detecção de JAK2 V617F como teste de diagnóstico em primeira intenção em 88 pacientes com taxas de hematócritos superiores a 51%, e mostramos que a mutação correspondia ao diagnóstico de PV de acordo com os critérios WHO (R = 0,879) e PVSG (R = 0,717), com um valor preditivo positivo de 100% no contexto da eritrocitose. Com base nestes dados, propomos que a detecção de JAK2 V617F em granulócitos seja considerada como um teste de diagnóstico em primeira intenção nos pacientes com uma eritrocitose, evitando por consequência a realização de uma medida da massa de glóbulos vermelhos, de um procedimento de medula óssea e de uma análise in vitro da formação de colônias eritróides endógenas. Esta detecção poderá também ser estendida em primeira intenção ao conjunto das síndromes mieoloproliferativas ou para sua suspeita. Esta detecção será particularmente maior nas trombocitoses crônicas para as quais não existem testes biológicos seguros para afirmar uma síndrome mieoloproliferativa. Ela será igualmente um exame importante no diagnóstico das mielofibroses e frente a quadros clínicos associados à tromboses de etiologia indeterminada.
[0011] Assim, a invenção traz pela primeira vez um instrumento de diagnóstico e abre o caminho ao tratamento orientado da PV e igualmente das síndromes mieoloproliferativas associados a esta mutação. Mais especificamente, propomos a detecção da mutação JAK2 V617F como teste de diagnóstico em primeira intenção no quadro da eritrocitose, o que permite evitar a quantificação da massa de glóbulos vermelhos e das células endógenas eritróides (EEC) de um teste da medula óssea na maioria dos pacientes e as trombocitoses crônicas o que permitirá evitar uma longa pesquisa etiológica.
[0012] Descrição da invenção
[0013] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a proteína isolada JAK2 (Janus quinase 2), em particular a proteína Homo sapiens Janus quinase 2 (NCBI acecession number NM_004972; GI: 13325062), compreendendo uma mutação sobre o ácido aminado 617 (codon 617 do DNAc a contar do ATG), mais particularmente a mutação V617F, a seguir designado variante JAK2 V617F, tal como foi apresentada à SEQ ID No 1 abaixo:
[0014] SEQ ID No 1 (V617F Homo sapiens Janus quinase 2 ou JAK2 V617F)
[0015] MGMACLTMTEMEGTSTSSIYQNGDISGNANSMKQIDPVLQVYLYHSLGK SEADYLTFPSGEYVAEEICIAASKACGITPVYHNMFALMSETERIWYPPNHVFHIDES TRHNVLYRIRFYFPRWYCSGSNRAYRHGISRGAEAPLLDDFVMSYLFAQWRHDFV HGWIKVPVTHETQEECLGMAVLDMMRIAKENDQTPLAIYNSISYKTFLPKCIRAKIQD YHILTRKRIRYRFRRFIQQFSQCKATARNLKLKYLINLETLQSAFYTEKFEVKEPGSG PSGEEIFATIIITGNGGIQWSRGKHKESETLTEQDLQLYCDFPNIIDVSIKQANQEGSN ESRWTIHKQDGKNLEIELSSLREALSFVSLIDGYYRLTADAHHYLCKEVAPPAVLENI QSNCHGPISMDFAISKLKKAGNQTGLYVLRCSPKDFNKYF LTFAVERENVIEYKHCLITKNENEEYNLSGTKKNFSSLKDLLNCYQMETVRSDNIIFQ FTKCCPPKPKDKSNLLVFRTNGVSDVPTSPTLQRPTHMNQMVFHKIRNEDLIFNESL GQGTFTKIFKGVRREVGDYGQLHETEVLLKVLDKAHRNYSESFFEAASMMSKLSHK HLVLNYGVCF617CGDENILVOEFVKFGSLDTYLKKNKNCINILWKLEVAKQLAWAMH FLEENTLIHGNVCAKNILLIREEDRKTGNPPFIKLSDPGISITVLPKDILQERIPWVPPE CIENPKNLNLATDKWSFGTTLWEICSGGDKPLSALDSQRKLQFYEDRHQLPAPKWA ELANLINNCMDYEPDFRPSFRAIIRDLNSLFTPDYELLTENDMLPNMRIGALGFSGAF EDRDPTQFEERHLKFLQQLGKGNFGSVEMCRYDPLQDNTGEWAVKKLQHSTEEH LRDFEREIEILKSLQHDNIVKYKGVCYSAGRRNLKLIMEYLPYGSLRDYLQKHKERID HIKLLQYTSQICKGMEYLGTKRYIHRDLATRNILVENENRVKIGDFGLTKVLPQDKEY YKVKEPGESPIFWYAPESLTESKFSVASDVWSFGWLYELFTYIEKSKSPPAEFMRMI GNDKQGQMIVFHLIELLKNNGRLPRPDGCPDEIYMIMTECWNNNVNQRPSFRDLAL RVDQIRDNMAG
[0016] A invenção visa igualmente equivalentes desta proteína mutada em posição 617 em outros mamíferos, por exemplo os JAK2 V617F em outros mamíferos como o rato (NM_031514), o porco, o camundongo (NM_008413)... bem como variáveis da SEQ ID No 1 que comportam além disso uma ou várias modificações que não afetam a atividade e a estrutura 3D do variante.
[0017] A invenção traz igualmente sobre uma sequência nucléotidica codificante para a SEQ ID No 1, de preferência a SEQ ID No 2 (sequência do gene humano JAK2 com codon TTC no lugar de GTC sobre codon 617 (mutação g/t em posição 1849, adiante designado por G1849T, a partir do ATG que marca o início da tradução).
[0018] Esta sequência pode se encontrar em um vector viral ou plasmídico ou ainda um DNA nu sob o controle de um promotor eficaz nas células de mamíferos. A invenção estende-se então a um vetor que exprime a proteína JAK2 V617F.
[0019] O vetor da invenção pode ser um vetor de clonagem e/ou de expressão e pode ser utilizado para transfectar uma célula hospedeira, notadamente uma célula de mamífero, de preferência uma célula progenitora CD34+ humana.
[0020] Animal transgênico modelo da PV e outras síndromes mieoloproliferativas
[0021] A invenção traz igualmente sobre um animal transgênico não humano que exprima JAK2 V617F recombinante. Este animal pode de preferência ser um camundongo ou um rato. Os ratos ou camundongos transgênicos que servem de modelo podem ser obtidos por qualquer método correntemente utilizado pelo especialista, notadamente um Knock-in (inserção marcada visada de uma sequência) por recombinação homóloga ou recombinação dirigida com o sistema Cre-LoxP ou FLP-FRT nas células ES. De acordo com um modo preferido de realização da invenção, a célula transgênica de acordo com a invenção é obtida por marcação gênica («gene targeting») do variante JAK2 G1849T ao nível de um ou vários sequências do genoma da célula hospedeira. Mais precisamente, o transgene é inserido de maneira estável por recombinação homóloga ao nível de sequências homólogas no genoma da célula hospedeira. Quando trata-se de obter uma célula transgênica para produzir um animal transgênico, a célula hospedeira é de preferência uma célula cepa embrionária (célula ES) (Thompson e al., 1989). A marcação gênica representa a modificação dirigida de um locus cromossômico por recombinação homóloga com uma sequência de DNA exógena que tem uma homologia de sequência com a sequência endógena orientada. Distinguem-se diferentes tipos de marcação genética. Aqui, a marcação gênica pode ser utilizada mais particularmente para substituir o gene JAK2 selvagem pelo gene variante JAK2 G1849T ou qualquer outro variante geneticamente similar. Neste caso, a marcação gênica é chamada “Knock-in” (K-in). Alternativamente, a marcação gênica pode ser utilizada para diminuir ou destruir a expressão de JAK2 selvagem e depois para introduzir o gene do variante de JAK2. Trata-se então de marcação gênica chamada “Knock-Out” (KO) (ver Bolkey e al., 1989). A célula de acordo com a invenção caracteriza-se pelo fato de que o transgene é integrado de maneira estável no genoma da referida célula, e pelo fato de que sua expressão é controlada pelos elementos de regulação do gene endógeno. Por integração de maneira estável, pretende-se significar a inserção do transgene no DNA genômico da célula de acordo com a invenção. O transgene assim inserido é transmitido em seguidam à descendência celular. A integração do transgene é realizada a montante, a jusante ou no meio do gene endógeno alvo JAK2. Facultativamente, um ou vários genes de seleção positiva ou negativa podem ser utilizados. Pode-se também utilizar regiões de DNA de homologia com o locus alvo, de preferência ao número de dois, situado de um lado ao outro da porção do gene portador ou um lado ao outro da sequência completa a inserir. Por “regiões de DNA de homologias”, pretende-se designar duas sequências de DNA que, após um alinhamento ótimo e após comparação, são idênticas por habitualmente pelo menos cerca de 90% a 95% dos nucleotídeos e, de preferência, pelo menos cerca de 98 a 99,5% nucleotídeos. O alinhamento ótimo das sequências para a comparação pode ser realizado através por meio do algoritmo de homologia local de Smith e de Waterman (1981), através do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970), através do método de investigação de similaridade de Pearson e Lipman (1988), por meio de programas de computador que utilizam estes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computador Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Muito embora pouco mais de 14 Pb homólogos a 100% sejam suficientes para realizar a recombinação homóloga nas bactérias e nas células de mamífero, porções de sequências homólogas mais longas são preferidas (em geral estas porções fazem pelo menos 2000 Pb, de preferência pelo menos 5.000 Pb para cada porção de sequência homóloga). Vantajosamente, a sequência JAK do variante é inserida no conjunto dos elementos que asseguram uma regulação do tipo endógeno, ou seja um conjunto que compreende pelo menos o promotor, das sequências reguladoras (realçadores, silenciadores, isoladores), os sinais de terminação do gene JAK endógeno.
[0022] De acordo com um modo de realização particular, o transgene JAK G1849T compreende pelo menos a sequência codificante, um cassete de seleção positiva enquadrada ou não de sítios-específicos à ação dos recombinases, por exemplo um cassete Lox/Néo-TK/Lox ou lox/Néo/lox ou FRT/Néo-TK/FRT ou FRT/Néo/FRT que podem estar igualmente presentes na posição 5’ da referida sequência, e caracterizado pelo fato de que um cassete de seleção negativa que contém por exemplo o ou os genes DTA e/ou TK está pelo menos presente em uma das extremidades do transgene. O transgene da presente invenção é de preferência derivado diretamente de uma sequência de DNA exógena presente naturalmente em uma célula animal. Esta sequência de DNA sob forma nativa pode ser modificada por exemplo por inserção de sítios de restrição necessários à clonagem e/ou por inserção de sítios de recombinação sítio específicos (sequências lox e flp).
[0023] Para esse efeito, o variante JAK2 G1849T pode ser clonado em um vetor de clonagem que permite assegurar sua propagação em uma célula hospedeira, e/ou facultativamente em um vetor de expressão para assegurar a expressão do transgene. As tecnologias do DNA recombinante utilizadas para a construção do vetor de clonagem e/ou de expressão de acordo com a invenção são conhecidas do especialista. As técnicas padrão são utilizadas para a clonagem, o isolamento do DNA, a amplificação, e a purificação; as reações enzimáticas que implicam o DNA ligase, o DNA polimerase, as endonucleases de restrição são efetuadas de acordo com as recomendações do fabricante. Estas técnicas e as outras são realizadas geralmente de acordo com Sambrook e al., 1989). Os vetores incluem plasmídeos, os cosmídeos, os bacteriófagos, os retrovírus e outros vírus animais, os cromossomos artificiais, como os YAC, BAC, HAC e outros vetores análogos.
[0024] Os métodos para gerar células transgênicas de acordo com a invenção são descritos em Gordon e al., 1989. Diversas técnicas para transfectar células de mamíferos foram reexaminadas por Keon e al., 1990. O transgene de acordo com a invenção, facultativamente compreendido em um vetor linearizado ou não, ou sob a forma de fragmento de vetor, pode ser introduzido na célula hospedeira pelos métodos padrão como por exemplo a microinjeção no núcleo (US 4.873.191), a transfeção por precipitação ao fosfato de cálcio, a lipofeção, a eletroporação (Lo, 1983), o choque térmico, a transformação com polímeros catiônicos (PEG, polybrène, DEAE- Dextran...), ou ainda a infecção viral (Van der Putten e al., 1985).
[0025] Quando as células forem transformadas pelo transgene, elas podem ser cultivadas in vitro ou ainda ser utilizadas para produzir animais transgênicos não humanos. Após transformação, as células são semeadas sobre uma camada nutritiva e/ou em um meio apropriado. As células que contêm a construção podem ser detectadas utilizando um meio seletivo. Após um tempo suficiente para deixar as colônias ativar, estas últimas são recuperadas e analisadas para determinar se um acontecimento de recombinação homóloga e/ou uma integração da construção são produzidos. Para realizar a triagem dos clones susceptíveis de satisfazer à recombinação homóloga, marcadores positivos e negativos, ainda chamados genes de seleção, podem ser inseridos no vetor recombinação homólogo. Diferentes sistemas de seleção das células que realizaram o acontecimento de recombinação homóloga foram descritos (para exame US 5.627.059). O referido gene de seleção positiva de acordo com a invenção de preferência é escolhidos dentre os genes de resistência aos antibióticos. Dentre os antibióticos, podem-se citar de maneira não exaustiva a neomicina, tetraciclina, a ampicilina, a canamicina, a fleomicina, a bleomicina, a higromicina, o choranfenicol, a carbenicilina, a geneticina, a puromicina. Os genes de resistência correspondentes a estes antibióticos são conhecidos do especialista; a título de exemplo, o gene de resistência à neomicina torna as células resistentes à presença do antibiótico G418 no meio de cultura. O gene de seleção positivo pode igualmente ser selecionado entre o gene HisD, o agente seletivo correspondente sendo o histidinol. O gene de seleção positivo pode igualmente ser selecionado entre o gene da guanina-fosforibosil-transferase (GpT), o agente seletivo correspondente à xantina. O gene de seleção positivo pode igualmente ser selecionado entre o gene do hipoxantina-fosforibosil-transferase (HPRT), o agente seletivo correspondente sendo a hipoxantina. O ou os marcadores de seleção utilizados para permitir identificar os acontecimentos de recombinação homóloga podem afetar em seguida a expressão gênica, e podem ser eliminados, se necessário, pelo emprego de recombinases sítio específicos tal o recombinase Cre específica dos sítios Lox (Sauer, 1994; Rajewsky e al, 1996; Sauer, 1998) ou FLP específico dos sítios FRT (Kilby e al, 1993).
[0026] As colônias positivas, ou seja que contêm células nas quais pelo menos um acontecimento de recombinação homóloga é produzido são identificadas por uma análise por southern blotting e/ou por técnicas de PCR. A taxa de expressão, nas células isoladas ou as células do animal transgênico de acordo com a invenção, do RNAm que corresponde ao transgene pode igualmente ser determinada por técnicas que compreendem a análise por northern blotting, a análise por hibridação in situ, por RT - PCR. Igualmente as células ou tecidos animais que exprimem o transgene podem ser identificados utilizando um anticorpo dirigido contra a proteína portadora. As células positivas podem em seguida serem utilizadas para realizar as manipulações sobre o embrião e notadamente a injeção das células modificadas por recombinação homóloga nos blastócitos.
[0027] No que se refere ao camundongo, os blastócitos são obtidos a partir de fêmeas superovuladas de 4 a 6 semanas. As células tripsinadas e as células modificadas são injetadas no blastocelo do blastócito. Após a injeção, os blastócitos são introduzidos na tuba uterina de fêmeas pseudográvidas. Deixa-se em seguida as fêmeas irem até o fim e os resultados obtidos são analisados para determinar a presença de células mutantes que possuem a construção. A análise fenótipa diferente entre as células do embrião recém-nascido e as células do blastócito ou as células ES permite detectar os recém-nascidos quiméricos. Os embriões quiméricos são em seguida levados até a idade adulta. As quimeras ou animais quiméricos são animais nos quais somente uma subpopulação de células possui um genoma alterado. Os animais quiméricos que apresentam o gene ou os genes modificados, em geral são cruzados entre si ou com um animal de tipo selvagem a fim de obter uma descendência heterozigota ou homozigota. Os heterozigotos machos e fêmeas são cruzados em seguida para gerar animais homozigotos. A menos que seja indicado, o animal transgênico não humano de acordo com a invenção compreende mudanças estáveis da sequência nucleotídica das células da linhagem germinal.
[0028] De acordo com um outro modo de realização da invenção, a célula transgênica não humana de acordo com a invenção pode servir de célula doadora de núcleo no quadro de uma transferência de núcleo ou transferência nuclear. Por transferência nuclear, entende-se designar a transferência de núcleo de uma célula viva doadora de vertebrado, de um organismo adulto ou no estado fetal, no citoplasma de uma célula recebedora enucleada da mesma espécie ou de uma espécie diferente. O núcleo transferido é reprogramado para dirigir o desenvolvimento dos embriões clonados que podem em seguida serem transferidos nas fêmeas portadoras para produzir os fetos e recém-nascidos, ou utilizados para produzir células da massa celular interna em cultura. Diferentes técnicas de clonagem nuclear são susceptíveis de serem utilizadas; dentre estas, convém citar de maneira não exaustiva essas que são o objeto dos pedidos de patente WO 95/17500, WO 97/07668, WO 97/07669, WO 98/30683, WO 99/01163 e WO 99 37143.
[0029] Assim, a invenção se estende do mesmo modo a um animal transgênico não humano que compreende uma sequência recombinante codificante para JAK2 V617F. Estes animais podem ser homozigotos ou heterozigotos (JAK2 V617F / JAK2 V617F ou JAK2 V617F / JAK2).
[0030] Estes animais reproduzem notadamente a poliglobulia de Vaquez, mas igualmente qualquer síndrome mieoloproliferativa induzida por JAK2 V617F. Eles permitem então realizar uma triagem funcional de inibidores tirosina quinase, notadamente uma triagem de inibidores específicos de JAK2 V617F.
[0031] Uma alternativa pode consistir em injetar um vetor viral (retro vírus ou lentivirus ou outros) capaz de exprimir o variante JAK2 V617F em células cepas hematopoiéticas, células progenitoras ou células ES para igualmente realizar modelos de poliglobulia de Vaquez ou outras síndromes mieoloproliferativas. Instrumentos de diagnóstico
[0032] Em um terceiro aspecto, a invenção visa os instrumentos de diagnóstico que permitam detectar a presença ou a ausência da mutação JAK2 V617F em um mamífero atingido ou susceptível de apresentar uma síndrome mieoloproliferativa, notadamente nos pacientes que mostram uma poliglobulia ou nos quais se suspeita que apresentem os sintomas da poliglobulia de Vasquez, trombocitemias e/ou os mielofibroses.
[0033] A esse respeito, a invenção refere-se às iscas e sondas que permitem detectar a presença ou a ausência da mutação na sequência SEQ ID No 2 descrita acima.
[0034] Mais particularmente, a invenção tratou de um ácido nucléico isolado que tem uma sequência de pelo menos 10, 12, 15, 20, 30, 40 ou ainda 50 nucleotídeos consecutivos (por exemplo de 10 a 30 nucleotídeos ou de 10 a 25 nucleotídeos) do exon 12 ou da sequência SEQ ID No 3 ou 4 abaixo e compreendendo o nucleotídeo com mutação t1849, por exemplo de 10 a 30 nucleotídeos.SEQ ID No 3
[0035] Ctcatatgaaccaaatggtgtttcacaaaatcagaaatgaagatttgatatttaatgaaagccttggcca aggcacttttacaaagatttttaaaggcgtacgaagagaagtaggagactacggtcaactgcatgaaacagaagttct tttaaaagttctggataaagcacacagaaactattcagagtctttctttgaagcagcaagtatgatgagcaagctttctca caagcatttggttttaaattatggagtatgtt1849tctgtggagacgagaatattctggttcaggagtitgtaaaatttggatc actagatacatatctgaaaaagaataaaaattgtataaatatattatggaaacttgaagttgctaaacagttggcatggg ccatgcattttctagaagaaaacacccttattcatgggaatgtatgtgccaaaaatattctgcttatcagagaagaagac aggaagacaggaaatcctcctttcatcaaacttagtgatcctgg cattagtattacagttttgccaaaggacattcttcaggag
[0036] A sequência sublinhada designa um exemplo de zonas a montante ou a jusante que permite o desenho de sondas ou de iscas específicas da mutação em posição 1849 (SEQ ID No 4).
[0037] Exemplo de diferentes começos e sondas preferidas da invenção:
[0038] EM DNA, ISCAS DE PCR:
[0039] JAK2EXON12-PCRF SENTIDO 5’-GGGTTTCCTCAGAACGTTGA-3’ ( 54804-54823) (SEQ ID No 5)
[0040] JAK2EXON12-PCRR ANTI-SENTIDO5’-TTGCTTTCCTTTTTCACAAGA-3’ (55240- 55260) (SEQ ID No 6)
[0041] EM DNA, ISCAS DE SEQUENCIAMENTO:
[0042] JAK2EXON12SEQF SENTIDO 5’-CAGAACGTTGATGGCAGTTG-3’(54813-54832) (SEQ ID No 7)
[0043] JAK2EXON12SEQR ANTI-SENTIDO 5’-TGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTT-3’(55207-55233) (SEQ ID No 8)
[0044] EM CDNA, ISCAS DE PCR E SEQUENCIAMENTO:
[0045] SENTIDO 5’-CAACCTCAGTGGGACAAAGAA-3’ (1386-1407) (SEQ ID No 9)
[0046] ANTI-SENTIDO 5’-GCAGAATATTTTTGGCACATACA-3’(2019-2041) (SEQ ID No 10)
[0047] SONDAS SNPS e DETECÇÃO DE MUTAÇÃO e SIRNA (1829-1870):
[0048] TTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGAGAATATTC (SEQ IDNo 11)
[0049] GENOTIPAGEM sobre LightCycler (DNA de PNN ou de medula)
[0050] Oligo “S” (sentido) GGCAGAGAGAATTTTCTGAAC (SEQ ID No 15)
[0051] Oligo “R” (antisentido) GCTTTCCTTTTTCACAAGATA (SEQ ID No 16)
[0052] Sensor wt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA 3’-FL (SEQ ID No 17)
[0053] Anchor JAK2 5’-LC Red640AAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCT 3’- PH (SEQ ID No 18)
[0054] GENOTIPAGEM sobre LightCycler (por exemplo cDNA de plaquetas)
[0055] cJAK2F GCACACAGAAACTATTCAGAGTC (SEQ ID No 19)
[0056] cJAK2S AGCAGCAAGTATGATGAGC (SEQ ID NO 20)
[0057] cJAK2A CTAGTGATCCAAATTTTACAAACT (SEQ ID No 21)
[0058] cJAK2R GTTTAGCAACTTCAAGTTTCC (SEQ ID NO 22)
[0059] Sensor wt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA3’-FL (SEQ ID No 23)
[0060] Anchor JAK2 5’-LC Red640AAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCT3’-PH (SEQ ID No 24)
[0061] GENOTIPAGEM pela tecnologia Taqman (por exemplo sobre DNA de células mononucleares de Medula Óssea).
[0062] Reconhecimento por sondas fluorescentes específicas de alelo e DNA simples filamento.
[0063] Reação de PCR
[0064] Sequência dominate sentido: AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT (SEQID No 25)
[0065] Sequência dominate antisentido: AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT (SEQ ID No 26)
[0066] Reportar 1 Sequência (VIC) : TCTCCACAGACACATAC (SEQ ID No 27)Reportar 2 Sequência (FAM) : TCCACAGAAACATAC (SEQ ID No 28)
[0067] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um método de diagnóstico in vitro ou ex vivo que permite detectar a presença ou a ausência de mutação JAK2 V617F em uma amostra.
[0068] Testes com os ácidos nucléicos da invenção
[0069] Em um primeiro modo de realização, o variante G1849T (que corresponde à mutação JAK2 V617F) pode ser detectado por análise da molécula de ácido nucléico do gene JAK2. No quadro da presente invenção, se entende por “ácido nucléico” um RNAm, o DNA genômico ou o DNAc derivado do RNAm.
[0070] A presença ou a ausência do ácido nucléico do variante G1849T pode ser detectada por sequenciamento, por amplificação e/ou hibridação com uma sonda e iscas específicas, como descrito acima: sequência derivada dos SEQ ID No 3 ou 4 e SEQ ID No 5 a 11 ou ainda SEQ ID No 15 a 24.
[0071] A invenção propõe então um método ex vivo ou in vitro para determinar a presença ou a ausência do variante G1849T do gene JAK2 em uma amostra de um paciente atingido de PV ou susceptível de desenvolver uma PV ou qualquer outra síndrome mieoloproliferativa, notadamente do etrocitose, trombocitemias e mielofibroses, compreendendo:a) a obtenção de uma amostra de ácido nucléico do paciente,b) a detecção da presença ou a ausência do variante Gl 849T do gene JAK2 na referida amostra de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que a presença do variante G1849T é uma indicação de PV ou qualquer outra síndrome mieoloproliferativa.
[0072] A amostra de ácido nucléico pode ser obtida a partir de qualquer fonte celular ou biópsia de tecido. Estas células devem ser de origem hematopoiética e podem ser obtidas a partir de sangue circulante, de tecido hematopoiético ou qualquer líquido contaminado em células sanguíneas. O DNA pode ser extraído utilizando qualquer método conhecido do estado da técnica, tais como os métodos descritos em Sambrook e al. (1989). O RNA pode igualmente ser isolado, por exemplo a partir de tecidos obtidos durante uma biópsia, utilizando métodos padrão bem conhecidos do especialista, como a extração pelo guanidíotiofenato-fenol-clorofórmio.
[0073] O variante G1849T do gene JAK2 pode ser detectado em uma amostra de RNA ou de DNA, de preferência após amplificação. Por exemplo, o RNA isolado pode ser submetido a uma transcrição-inversa em seguida a uma amplificação, tais como uma reação RT-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos específicos do sítio com mutação ou que permitem a amplificação da região que contém a mutação, por exemplo o exon 12 ou a sequência SEQ ID No 3 ou 4. A expressão “oligonucleotídeo” é utilizada aqui para designar um ácido nucléico de pelo menos 10, de preferência entre 15 e 25 nucleotídeos, de preferência inferior a 100 nucleotídeos, e que é capaz de se hibridar ao DNA genómico de JAK2, ao DNAc ou ainda ao RNAm.
[0074] Os oligonucleotídeos da invenção podem ser marcados de acordo com qualquer técnica conhecida pelo especialista, como marcadores radioativos, fluorescentes ou enzimáticos. Um oligonucleotídeo marcado pode ser utilizado como sonda para detectar a presença ou a ausência do variante G1849T do gene JAK2. Assim, as sondas e iscas úteis de acordo com a invenção são estas que se hibridam especificamente na região do gene JAK2 perto do nucleotídeo em posição 1849 (numeração a partir do ATG que marca o início da transcrição).
[0075] No método explicitado acima, os ácidos nucléicos podem ser amplificados por PCR antes da detecção da variação alélica. Os métodos para a detecção da variação alélica são descritos por exemplo em “Molecular Cloning - A Laboratory Manual” Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) e Laboratório Protocols for Mutation Detection, ED por U. Landegren, Oxford University Press, 1996 e PCR, 2.a edição por Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.
[0076] A esse respeito, é possível combinar uma etapa de amplificação seguida por uma etapa de detecção que permite discriminar as amostras em função da presença ou a ausência do variante do procurado.
[0077] Diferentes técnicas adaptadas para esse efeito são apresentadas em EP 1.186.672, tais como o sequenciamento de DNA, o sequenciamento por hibridação SSCP, DGGE, TGGE, a análise heteroduplex, CMC, a segmentação enzimática de não coincidência “hybridization based solid phase hybridization", os chips com DNA (DNA Chips), solution phase hybridization TaqmanTM (US 5.210.015 e US 5.487 972)”, bem como a técnica RFLP.
[0078] A detecção pode ser realizada utilizando diferentes métodos alternativos: FRET, fluorescência quenching, fluorescência polarizada, quimioluminescência, electroquimiluminescência, radioatividade e método colorimétrico.
[0079] O método de acordo com a invenção pode incluir ou excluir as etapas que consistem em obter a amostra e a extrair o ácido nucléico da referida amostra.
[0080] Como indicado acima, a amostra utilizada pode ser o sangue ou de qualquer outro líquido corporal ou tecido obtido de um indivíduo. Após as etapas de extração e purificação do ácido nucléico, a amplificação PCR através das iscas descritas acima pode ser utilizada para melhorar a detecção do sinal.
[0081] Assim, o método de acordo com a invenção pode compreender a etapa de amplificação por meio das referidas iscas, seguida por uma etapa de hibridação com pelo menos uma sonda, de preferência duas sondas que se hibridam em condição de forte estringência às sequências que correspondem à região da mutação G1849T mencionada acima e a detecção do sinal produzido pelos marcadores das referidas sondas.
[0082] Por exemplo, a invenção visa mais particularmente um método in vitro para determinar a presença ou a ausência do variante G1849T do gene JAK2 em uma amostra de um paciente atingido de PV ou susceptível de desenvolver uma PV ou qualquer outra síndrome mieoloproliferativa que compreende a detecção da presença ou a ausência do variante G1849T do gene JAK2 na referida amostra de ácido nucléico através de um ou vários SNP (Single nucleotide polymorphism) específico da mutação G1849T do gene JAK2, notadamente as SEQ ID No 17, 18 ou ainda 23 e 24; caracterizado pelo fato de que a presença do variante G1849T é uma indicação de PV ou qualquer outra síndrome mieoloproliferativa.
[0083] Esta detecção através de SNPs pode ser empregada pela Tecnologia TaqMan® que permite uma discriminação alélica. Essencialmente, este método consiste no reconhecimento por sondas fluorescentes específicas do alelo 1849 de JAK2 sobre DNA simples filamento e compreende uma reação PCR (com um polimerase com atividade 5’ exonucleásica), a detecção da emissão de fluorescência específica de alelo dos SNP híbridados, a determinação do genótipo por leitura da fluorescência em ponto final (obtenção de uma imagem que mostra os clusters de DNA com mutação homozigoto, heterozigoto e normal).
Detecção da proteína com mutação JAK2 V617F
[0084] De acordo com um outro modo de realização, o variante pode ser detectado diretamente na proteína JAK2.
[0085] Para esse efeito, a invenção visa um método ex vivo ou in vitro para detectar a presença ou a ausência do variante JAK2 V617F em uma amostra de um paciente atingido ou susceptível de desenvolver a PV ou qualquer outra síndrome mieoloproliferativa, notadamente o etrocitose, trombocitemias e mielofibroses, compreendendo:a) a obtenção de uma amostra do paciente,b) a detecção da presença ou a ausência do variante JAK2 V617F, caracterizado pelo fato de que a presença do referido variante é uma indicação da PV ou de qualquer outra síndrome mieoloproliferativa.
[0086] O referido variante JAK2 V617F pode ser detectado por qualquer método adequado conhecido do estado da técnica.
[0087] Mais particularmente, uma amostra, obtida de um indivíduo, pode ser colocada em contato com um anticorpo específico do variante V617F da proteína JAK2, por exemplo um anticorpo que é capaz de fazer a distinção entre o variante V617F e a proteína JAK2 sem mutação (e de qualquer outra proteína).
[0088] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais, simples cadeia ou dupla cadeia, anticorpos quiméricos, humanizados ou porções de moléculas de imunoglobulina que compreendem as porções conhecidas do estado da técnica como correspondente aos fragmentos de ligação ao antígeno [fragmento humano, humano, F(ab’)2 e F(v)].
[0089] Estes anticorpos podem immnoconjugados, por exemplo com uma toxina ou um marcador.
[0090] Os protocolos para a obtenção de anticorpos policlonais são bem conhecidos do especialista. Tipicamente, tais anticorpos podem ser obtidos pela administração do variante JAK2 V617F por injeção subcutânea em coelhos brancos da Nova Zelândia que de antemão foram preparados para obter um soro pré-imune. Os antígenos podem ser injetados até a 100 μl por sítio a 6 diferentes sítios. Os coelhos são preparados duas semanas antes da primeira injeção e depois periodicamente estimulados pelo mesmo antígeno, cerca de três vezes a cada seis semanas. Uma amostra de soro então é obtida dez dias após cada injeção. Os anticorpos policlonais são em seguida purificados do soro por cromatografia de afinidade utilizando a proteína JAK2 V617F para capturar os anticorpos.
[0091] Os anticorpos monoclonais são preferidos aos anticorpos policlonais devido à sua elevada especificidade.
[0092] A obtenção de tais anticorpos monoclonais está ao alcance do especialista, sabendo que o variante JAK2 V617F apresenta uma estrutura 3D diferente da proteína JAK2 selvagem. A expressão “anticorpo monoclonal” significa um anticorpo que é capaz de reconhecer somente um epitopo de um antígeno.
[0093] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por imunização de um mamífero, por exemplo um camundongo, um rato, ou outros mamíferos com o variante JAK2 V617F purificado. As células do mamífero imunizado que produzem os anticorpos são isoladas e fundidas com células mielomas ou heteromielomas para produzir células híbridas (hibridomas).
[0094] As células de hibridomas que produzem o anticorpo monoclonal são utilizadas como fontes para a produção do anticorpo. As técnicas de geração de anticorpos que não implicam uma imunização são igualmente visadas pela invenção. Trata-se por exemplo da tecnologia “phage display”.
[0095] Os anticorpos dirigidos contra o variante JAK2 V617F podem em certos casos apresentar uma reação cruzada com a proteína JAK2 selvagem. Se isso for o caso, uma seleção dos anticorpos específicos do variante V617F é necessária. A esse respeito, pode-se utilizar por exemplo uma cromatografia de afinidade com a proteína JAK2 selvagem para capturar os anticorpos que apresentariam uma reação cruzada com JAK2 selvagem.
[0096] Assim, a invenção visa um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente o variante JAK2 V617F bem como as linhagens de hibridomas que produzem.
[0097] A invenção traz igualmente sobre um teste ELISA por meio do referido anticorpo para detectar a presença ou a ausêncio do variante JAK2 V617F em uma amostra.
[0098] Uma alternativa à utilização dos anticorpos pode consistir por exemplo na preparação e a identificação de haptâmeros que são classes de moléculas que permitem um reconhecimento molecular específico.
[0099] Os haptâmeros são oligonucleotídeos ou oligopeptídeos que podem virtualmente reconhecer qualquer classe de moléculas alvo com uma alta afinidade e especificidade.
[0100] Kits
[0101] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a kits para determinar se um paciente é atingido pela poliglobulia de Vasquez ou qualquer outra síndrome mieoloproliferativa que implica o variante JAK2 V617F.
[0102] O kit da invenção pode compreender uma ou várias sondas ou iscas tais como definidas acima para a detecção específica da presença ou a ausência da mutação G1849T no gene JAK2.
[0103] O kit pode igualmente compreender uma polimerase termoresistente para a amplificação PCR, uma ou várias soluções para a amplificação e/ou a etapa de hibridação, assim como qualquer reagente que permite a detecção do marcador.
[0104] Em um outro modo de realização, o kit compreende um anticorpo tal como foi definido acima.
[0105] Os kits da invenção podem conter além disso qualquer reagente adaptado à hibridação ou a reação imunológica sobre suporte sólido.
[0106] O método e o kit de detecção são vantajosamente praticados para a subpopulação de pacientes que apresentam uma taxa de hematócritos superior a 51%. O método e o kit de detecção são igualmente praticados vantajosamente para a subpopulação de pacientes que apresentam uma taxa de plaquetas superior a 450.000.
[0107] siRNA da invenção
[0108] Em um quarto aspecto, a invenção traz igualmente sobre siRNA que permite diminuir além de 50%, 75%, 90% ou 95% ou ainda além de 99% a expressão de JAK2 com mutação em posição 617, em particular de JAK2 V617F. Estes siRNA podem ser injetados nas células ou tecidos por lipofeção, transdução, ou electroporação. Eles permitem destruir especificamente o RNAm codificante para JAK2 V617F que implica numerosas aplicações terapêuticas possíveis, notadamente o tratamento pela poliglobulia de Vaquez.
[0109] SiRNA são descritos em US 60/068562 (CARNEGIE). O RNA é caracterizado pelo fato de que possui uma região com uma estrutura duplo filamento (db). A inibição é específica da sequência orienta, a sequência nucléotidica de um filamento da região db do RNA que compreende pelo menos 25 bases e sendo idêntica à porção do gene alvo. A sequência nucleotídica do outro filamento da região db do RNA é complementar à do primeiro filamento e à porção do gene alvo. Além disso, o pedido WO 02/44 321 (MIT/MÁXIMO PLANCK INSTITUTE) descreve um RNA duplo filamento (ou oligonucleotídeos de mesma natureza sintetizados quimicamente) cujo cada filamento tem um comprimento de 19 a 25 nucleotídeos e que é capaz de inibir especificamente a expressão pós transcripcional de um gene alvo por um processo de interferência RNA a fim de determinar a função de um gene e a fim de modular esta função em uma célula ou um organismo. Por fim, WO 00/44895 (RIBOPHARMA) traz sobre um processo de inibição da expressão de um gene alvo dado em uma célula eucariote in vitro, no qual um RNAdb formado de dois RNA simples de filamentos separados é introduzido na célula, um filamento do RNAdb que apresenta uma região complementar do gene alvo caracterizado pelo fato de que a região complementar apresenta menos 25 pares de nucleotídeos sucessivos. O especialista poderá se referir ao ensino contido nestes documentos para a preparação dos siRNA da presente invenção.
[0110] Mais especificamente, a invenção traz sobre RNA duplo filamento cerca de 15 a 30 nucleotídeos, 19 a 25 nucleotídeos, ou de preferência cerca de 19 nucleotídeos de longo complementares (filamento 1) e idênticos (filamento 2) à sequência SEQ ID No 3 que compreende a mutação G1849T. Estes siRNA da invenção podem comportar além disso um dinucleotídeo TT ou UU à extremidade 3’.
[0111] Numerosos programas estão disponíveis para o desenho dos siRNA da invenção:-“siSearch Program” emhttp://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_l.6.html (“Improved and automated prediction of effective siRNA”, Chalk AM, Wahlesdelt C, and Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004).“SiDirect” em http://design.rnai.jp/sidirect/index.php (Direct: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference, Yuki Naito et al, Nucleic Acids Res, Vol. 32, No. Web Server issue © Oxford University Press 2004).- “siRNA Target Finder” de Ambion no endereço http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_tools.htmlO “siRNA design tool” do Whitehead Institute of Biomedical Research do MIT no endereçohttp://jura.wi.mit.edu/pubint/http://iona.wi.mit.edu/siRNAext/
[0112] Outros programas estão listados em:http://web.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAs.htm, notadamentehttp://athena.bioc.uvic.ca/cgi-bin/emboss.pl?_action=input&_app=sirna
[0113] Por exemplo, para a sequência TATGGAGTATGTT1849TCTGTGGAGA (SEQ ID NO 12), o siRNA sentiop é UGGAGUAUGUUUCUGUGGAdTdT (SEQ ID No 13) e o siRNA antisentio é UCCACAGAAACAUACUCCAdTdT (SEQ ID No 14).
[0114] Em um modo de realização particular, os siRNA da invenção descritos acima são testados e selecionados por sua capacidade de reduzir, ver bloquear especificamente a expressão de JAK2 V617F afectando o menos possível a expressão de JAK2 selvagem. Por exemplo, a invenção visa siRNA que permitem uma diminuição superior a 80%, 90%, 95% ou 99% da expressão de JAK2 V617F e nenhuma diminuição ou uma diminuição inferior a 50%, 25%, 15%, 10% ou 5% ou ainda inferior a 1% de JAK2 selvagem.
[0115] Por exemplo, os siRNA da invenção podem ser selecionados no grupo constituído de:-UGGAGUAUGUUUCUGUGGA(SEQ ID No 29) -GGAGUAUGUUUCUGUGGAG(SEQ ID No 30) -GAGUAUGUUUCUGUGGAGA (SEQ ID No 31)
[0116] Em um outro modo de realização, a invenção refere-se a uma molécula ddRNAi tal como foi descrita de maneira genérica no pedido WO 01/70949 (Benitec) mas que alveja especificamente JAK2 V617F. O ddRNAi da invenção permite a extinção da sequência codificante para JAK2 V617F e compreende (i) uma sequência idêntica à SEQ ID No 3, 4 ou 11; (ii) uma sequência complementar à sequência definida em (i); (iii) um intron que separa as referidas sequências (i) e (ii); a introdução desta construção em uma célula ou um tecido que produz um RNA capaz de alterar a expressão de JAK2 V617F.
[0117] A invenção traz igualmente sobre um animal não humano geneticamente modificado que compreende uma ou várias células que contêm uma construção genética capaz de bloquear, retardar ou reduzir a expressão de JAK2 V617F no animal. O método de produção de tal animal geneticamente modificado é apresentado em WO 04/022748 (Benitec).
Métodos de triagem
[0118] Em um quinto aspecto, a invenção tem por objeto um método de triagem de inibidores específicos de JAK2 V617F.
[0119] Por “inibidores específicos", propõe-se designar compostos que apresentam um ratio IC50 sobre JAK2/IC50 sobre JAK2 V617F superior a 5, 10, 25, ou ainda 50. Por exemplo, o composto possui um IC50 JAK2 V617F inferior a 1 μM, de preferência 100 nM enquanto que possui um IC50 JAK2 superior a 5 μM ou 10 μM.
[0120] Este método pode ser empregado com ajuda da proteína da invenção, de uma fração membranária que compreende a referida proteína, de uma célula que exprime a referida proteína ou ainda um animal transgênico não humano tal como descreve acima.
[0121] Assim, a invenção traz sobre um teste que permite determinar a inibição específica de JAK2 V617F por um ou vários compostos que compreendem as etapas que consistem em colocar em contato um ou vários compostos com a proteína JAK2 V617F descrita acima, uma fração membranária que compreende JAK2 V617F ou ainda uma célula que exprime JAK2 V617F descrita acima em condições apropriadas para uma fixação e uma detecção da fixação específica e/ou a inibição de JAK2 V617F.
[0122] Este processo pode compreender além disso uma medida da fixação sobre JAK2 selvagem. Este processo pode igualmente consistir em uma sucessão de testes de várias moléculas e compreende uma etapa de seleção das moléculas que apresentam uma IC50 para JAK2 V617F inferior a 1 μM, de preferência 100 nM.
[0123] Este processo pode compreender além disso uma etapa de seleção negativa das moléculas mencionadas acima que possuem um IC50 para JAK2 inferiores a 5 μM ou 1 μM.
[0124] A invenção traz sobre uma triagem in vitro tal como descrito acima na qual se determina por imunoprecipitação a inibição da fosforilação de JAK2 V617F.
[0125] A invenção traz igualmente sobre uma triagem in vivo sobre células progenitoras CD34+ JAK2 V617F que são capazes de se diferenciar sem eritropoietina (Epo). Tais células isoladas de pacientes atingidos pela poliglobulia de Vaquez. As células CD34+ JAK2 V617F podem ser colocadas em cultura em um meio que compreende o SCF e IL-3. Os compostos são ajuntados no meio de cultura e se determina a capacidade das células a proliferar e a se diferenciar em células 36+/GPA -. Selecionam-se os compostos para os quais uma diminuição do número de clones 36+/GP A - é observada. Assim, a invenção traz sobre o método de triagem acima através de células primárias progenitoras CD34+ JAK2 V617F que são capazes de se diferenciar sem eritropoietina (Epo) ou sobre linhagens celulares que tem se tornado fator independentes por introdução do variante JAK2 V617F. O mesmo tipo de ensaio pode ser realizado sobre culturas de medula de tipo CFU-E em meio semi-sólido e testado diretamente o composto sobre a inibição do crescimento espontâneo das colônias.
[0126] Pode-se igualmente utilizar qualquer linhagem celular de mamífero descrita acima que exprima JAK V617F recombinante.
[0127] A invenção traz igualmente sobre um método para a identificação de candidatos medicamentos que compreendem as etapas que consistem em administrar compostos a um animal transgênico não humano que exprime JAK2 V617F como descreve acima, o referido animal que reproduz a poliglobulia de Vasquez e/ou sendo atingido de uma síndrome mieoloproliferativa associada à presença de JAK2 V617F, para determinar o efeito do composto e selecionar os candidatos medicamentos para os quais se observa uma diminuição ou um bloqueio da proliferação e a diferenciação espontâneas dos eritroblastos de poliglobulia de Vaquez ou uma diminuição da proliferação celular associado a presença de JAK2 V617F.
[0128] Mais particularmente, este método é realizado com um camundongo K-in JAK2 V617F ou rato K-in JAK2 V617F tal como um foi descrito acima.
[0129] Dentre estes compostos, pode-se citar, por exemplo, os siRNA que alvejam o exon 12 com mutação de JAK2 mencionados acima, em particular os siRNA que orientam a sequência SEQ ID No 3, 4 ou ainda a sequência SEQ ID No 11 que compreende o nucleotídeo com mutação t1849.
[0130] Um outro aspecto da invenção traz sobre a utilização do SiRNA ou ddRNAi descritos acima, e compostos que inibem especificamente JAK2 V617F para a fabricação de um medicamento. O referido medicamento é destinado notadamente ao tratamento de câncer do sangue, em particular as síndromes mieoloproliferativas que compreendem a poliglobulia de Vasquez, a trombocitenia essencial, a esplenomegalia mieloede ou mielofibrose primitiva e a leucemia mieloide crônica (LMC). O referido medicamento é igualmente destinado ao tratamento das outras hemopatias malignas; associadas à mutação JAK2 V617F, e dependendo do caso de tumores sólidos, carcinomas, melanomas e neuroblastomos, que exprimem JAK2 V617F.
[0131] Para a sequência da descrição e para os exemplos, referir-se-á às figuras cuja legenda é indicada abaixo.
Legendas
[0132] Figura 1: Descoberta do papel chave de JAK2 na PV
[0133] No estado basal, JAK2 é fixado sobre o box 1 ao estado não fosforilado. A ligação com EPO altera a conformação do receptor e permite a transfosforilação de JAK2 que em retorno fosforila os resíduos intracitoplásmicos de EPO-R e recruta assim os diferentes efetores positivos (->) ou negativos (-|) transdução do sinal.
[0134] Figura 2: Desenvolvimento de um modelo de cultura de progenitores CD34+ de PV que podem se diferenciar sem eritropoietina.
[0135] 2A - cultura com Epo, SCF e IL-3
[0136] 2B - cultura sem Epo.
[0137] Figura 3: A inibição das vias JAK-STAT, Pi3-K e Src quinase impede a diferenciação eritroIde espontânea.
[0138] Figura 4: Protocolo de inibição de JAK2 nos progenitores de PV.
[0139] Figura 5: Resultados da inibição de JAK2 nos progenitores de PV.
[0140] 5A - Diminuição da capacidade de clonagem do 36+/gpa - Cultura J1-J6em SCF-IL3, eletroporação J5 tri J6 (morpho/36+/gpa-).
[0141] Metil SCF sozinho. Conta à J1 3 (J7 póst tri)
[0142] 5B - Estrutura de JAK2 com a mutação V617F (exon 12)
[0143] Figura 6: Análises de genotipagem dos SNP para detectar a mutação JAK2 V617F no DNA genômico com as tecnologias LightCycler® e TaqMan®
[0144] A e B: Detecção da mutação pela curva de análise de fusão de LightCycler® com as sondas de hibridação FRET. A: Experiências com diversas diluições de DNA HEL no DNA TF-1 são representadas. O pico JAK2 V617F (57°) é ainda detectável a uma diluição de 1%. B: Resultados provenientes de amostras de pacientes representativos são representados (# 1: homozigoto; #2: heterozigoto; #3: fraco; #4: sem mutação).
[0145] C: Detecção da mutação por amplificação específica de alelo TaqMan®. Experiências de diluição de DNA HEL (HEL de 100 a 1%: quadrados vazios; células TF-1: círculos vazios) e algumas amostras de pacientes representativos são representadas (cruzes pretas). #a: dos pacientes homozigotos; #b: pacientes heterozigotos; # c: paciente fraco; # d: pacientes sem mutações.
[0146] Figura 7: Ficha de diagnóstico proposta para o diagnóstico de uma eritrocitose (ou seja, uma taxa de hematócritos superior a 51%).
[0147] O número de pacientes referidos a cada etapa da ficha é escrito ao lado de cada artigo (n), sozinhos os pacientes que tiveram todos os dados clínicos listados aqui (n = 81). A detecção de JAK2 V617F como teste de diagnóstico em primeira intenção teria evitado a 58/81 pacientes de terem outras investigações para diagnosticar uma síndrome mieoloproliferativa de tipo PV.
[0148] Figuras 8 e 9: A expressão de V617F Jak2 nas células HEL é diminuída 24 horas após o tratamento ao siRNA específico de JAK2 V617F Jak2 (siRNA # 1, 3 e 4).
[0149] 0 a 6: Células HEL tratadas (1 a 6) ou não tratados (0) com os siRNA V617FJak2.
[0150] C+: Células 293HEK transfectadas com o vetor V617F Jak2 RV.
[0151] C-: 293HEK.
[0152] Figura 10: O nível de expressão de WT Jak2 nas células K562 não é alterado 24 horas após um tratamento ao siRNA específico de Jak2 V617.
[0153] Je: Células K562 tratadas com os siRNA WT Jak2.
[0154] 0 a 6: Células K562 tratadas com os siRNA V617F Jak2.
[0155] C-: 293HEK (nenhuma expressão de JAK2).
[0156] Exemplo 1: Identificação da mutação JAK2 V617F em 39/43 pacientes.
[0157] O desenvolvimento de um modelo de cultura celular dos progenitores patológicos e a utilização de inibidores bioquímicos permitiu-nos estabelecer que as vias JAK2- STAT5, PI3 quinase, e Src quinases são necessárias à diferenciação independente da Epo dos progenitores de PV (Ugo e al., 2004). Confortamos estes resultados na nossa hipótese segundo a qual a lesão molecular primária à origem da PV deveria ser uma anomalia de uma proteína chave que conduz a desregulação de uma via de sinalização, como uma mutação tirosina quinase que lhe confere uma atividade constitutiva. No entanto, é o estudo de 43 pacientes atingidos pela poliglobulia de Vaquez que permitiu identificar o papel chave da proteína JAK2, que é a proteína situada mais a montante nestas diferentes vias de sinalização, e que é comum às vias de sinalização dos receptores às citocinas para as quais anomalias de resposta foram descritas na PV. Estudamos a implicação da proteína quinase JAK2 na fisiopatologia da PV por 3 abordagens complementares:- uma abordagem funcional (inibição de JAK2 nas células de PV por RNA interferência),- uma abordagem genômica (sequenciamento dos 23 exons do gene), e- uma abordagem bioquímica à procura de uma anomalia fosforilação de JAK2 à origem de uma ativação constitutiva.
[0158] O material biológico utilizado provém de pacientes consentidores atingidos pela poliglobulia e corresponde aos resíduos de retiradas realizadas visando diagnóstico endereçados ao Laboratoire Central d’Hématologie de l’Hotel Dieu, e com sangrias terapêuticas.
a) Estudo funcional
[0159] O estudo da função de JAK2 nos eritroblastos de pacientes atingidos pela poliglobulia de Vaquez foi realizado transduzindo por electroporação eritroblastos de PV com um siRNA específico da sequência JAK2 (AMBION, Huntingdon, Inglaterra) que reconhece como alvo uma sequência situada sobre o exon 15 do RNAm de JAK2. Mostramos que a inibição de JAK2 diminuiria fortemente a capacidade de clonagem e a diferenciação “espontânea” dos progenitores de PV na ausência de Epo. Os progenitores eritroblásticos normais transfectados com o siRNA JAK2 têm um potencial clonogênico diminuído de 70% em relação ao siRNA controle este que confirma a eficácia da transfeção com o siRNA JAK2. Na PV, os efeitos da inibição de JAK2 nos progenitores eritroblásticos foram estudados em um modelo de cultura sem Epo, permitindo estudar as células do clone maligno. Comparamos o potencial clonogênico, o apoptose e a diferenciação dos progenitores eritroblásticos de PV após transfecção por um siRNA JAK2 comparado a um siRNA controle. O estudo do potencial clonogênico dos progenitores de PV cultivados sem Epo mostra uma nítida diminuição do número de colônias após transfecção do siRNA JAK2 em relação ao siRNA controle. O estudo em citometria de fluxos do apoptose destas células mostra um aumento significativo do apoptose nas células transfectadas pelo siRNA JAK2 comparadas ao siRNA não relevante (70 versus 53%). O estudo dos efeitos do siRNA JAK2 sobre a diferenciação (aquisição do Glicofhorina A detectada em citometria de fluxos), mostra apenas uma ligeira diferença entre os progenitores transfectados pelo siRNA JAK2 versus o siRNA controle.
[0160] Os resultados dos estudos celulares mostraram então que JAK2 seria necessário para a diferenciação independente da Epo dos progenitores eritróides de PV. Os primeiros resultados dos estudos bioquímicos (imunoprecipitação) mostram uma fosforilação de JAK2 mais prolongada após deprivação em citocinas dos progenitores eritróides de PV em relação às células normais.
a) Estudo genômico de JAK2
[0161] A PCR sobre os 23 exons foi destacada sobre um sujeito normal a partir de DNA genômico. E depois estudamos 3 pacientes atingidos de PV após extração do DNA genômico de células eritróides obtidas in vitro após cultura celular.
[0162] Identificou-se uma mutação pontual situada no exon 12 de JAK2, presente em 2 dos 3 pacientes testados. Esta mutação toca a base n°1849 da sequência codificante ([numeração que inicia em ATG], GenBank NM_004972) transforma o codon 617 da proteína JAK2 (V617F).• Codon 617 normal: código ctc para uma Valina (V)• Codon 617 com mutação: código ttc para uma Fenilalanina (F)
[0163] Verificou-se graças às bases de dados publicadas na Internet que não se tratava de um polimorfismo conhecido.
[0164] Aumentou-se em seguida a amostragem. No momento, a mutação foi encontrada nos 39 pacientes atingidos de PV sobre os 43 casos testados. Nenhuma testemunha (15 casos testados) ou paciente atingido por poliglobulia secundária (18 casos testados) encontrou-se portador da mutação.
[0165] Resultados do sequenciamento nos pacientes• 39 com mutação/ 43 PV testados (90%)• 2/3 heterozigotos• 13/39 “homozigotos” seja 30% dos casos (mesma proporção que a perda de heterozigotia em 9p)
[0166] Controles - 0 caso com mutação em 33 testemunhas testadas- dos quais 15 sujeitos normais- e 18 poliglobulias secundárias (nada de colônias espontâneas)
[0167] A descoberta desta anomalia de JAK2 explica a hipersensibilidade a numerosos fatores de crescimento implicado na PV (Epo, TPO, IL-3, IL-6, GM-CSF, insulina). Com efeito, JAK2 é uma proteína implicada nas vias de sinalização dos receptores destas citocinas.
[0168] Além disso, a associação de JAK2 com R-Epo é singular naquila que JAK2 está fixado à R-Epo de maneira constitutiva: a associação JAK2/R-Epo iniciada no aparelho de Golgi, é necessário ao processamento de R-Epo à membrana dos eritroblastos. Uma anomalia de JAK2 à origem de modificações da associação de JAK2 com R-Epo poderia então explicar a predominância da hiperplasia medular sobre a linhagem eritroblástica, enquanto que esta proteína implica em numerosas em vias de sinalização. Além disso, Moliterno e coll (Moliterno e al., 1998; Moliterno e Spivak, 1999) destacaram um defeito de expressão de membrana de mp1, ligado a um defeito de glicosilação. É possível que JAK2 seja, por analogia com R-Epo, necessário ao tratamento de c-mp1. A anomalia de JAK2 poderia então explicar o defeito de expressão membranária de c-mp1, encontrado na PV.
[0169] JAK2 se liga à R-Epo sobre seu domínio proximal ao nível de um domínio bastante conservado, a Box2. Na ausência de estimulação pela Epo, JAK2 é constitutivamente fixado à R-Epo, mas sob forma não fosforilada então não ativa. Após estimulação do receptor pela Epo, as duas moléculas JAK2 fosforilante, e depois fosforilam R-Epo, o que permite o recrutamento e depois a fosforilação das outras proteínas implicadas na transdução do sinal, como as proteínas STAT5, Grb2, PI3K. A proteína JAK2 apresenta, como todos os JAKs, um domínio quinase funcional (JH1), um domínio pseudoquinase sem atividade tirosina quinase (JH2), e vários domínios conservados (JH3-JH7), características dos membros da família do JAKs. O domínio JH2 parece implicado na regulação da atividade tirosina quinase de JAK2. De acordo com os dados disponíveis de cartografia protéica de JAK2 (Lindauer, 2001), o ácido aminado 617 está situado neste domínio JH2, e de acordo com estudos de modelização, em uma região particularmente importante para a regulação da atividade quinase.
[0170] Para além do interesse fisiopatológico desta descoberta (compreensão dos mecanismos de independência às citocinas, desmembramento dos diferentes SMP), a evidenciação da mutação em um paciente oferece pela primeira vez um teste que permite afirmar o diagnóstico. Em uma diligência médica diagnóstica, a investigação da mutação de JAK2 poderá se fazer sobre polinucleares sanguíneos, que pertencem ao clone maligno.
[0171] A invenção oferece igualmente o destaque de um tratamento específico, de tipo inibidor de quinase específico da proteína com mutação, ou terapêutica gênica.
[0172] Exemplo 2: Detecção do mutante JAK2 V617F para o diagnóstico da eritrocitose em primeira intenção
2.1 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS
[0173] Comparação do sequenciamento e duas técnicas de genotipagem de SNP para a detecção de JAK2 V617F
Células do paciente
[0174] Analisou-se 119 amostras com suspeita de MPD (ou seja de eritrocitose, trombocitose, hiperleucocitose): 58 amostras sanguíneas foram recolhidas em perspectiva e 61 amostras de arquivo de medula óssea foram analisadas retrospectivamente.
[0175] Isolou-se os granulócitos periféricos utilizando um método de gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante (Eurobio, França). Isolou-se as células mononucleares da medula óssea pela utilização de uma centrifugação com gradiente de Ficoll. O DNA genômico foi extraído com procedimentos padrão. Para estabelecer a sensibilidade das tecnologias LightCycler® e TaqMan®, o DNA que provém de uma amostra homozigoto com o alelo de tipo selvagem residual mínimo, foi diluído em série no DNA normal.
Linhagens celulares
[0176] Utilizou-se diluições de DNA em série (1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01) da linhagem celular de eritroleucimia humana (HEL) com mutação de modo homozigoto (JAK2 V617F), no DNA de linhagem celular TF-1 (sem mutação) como controles positivos padrão. As linhagens celulares foram impedidas no meio MEM-alpha (Invitrogen) enriquecido com o soro fetal de vitelo.
[0177] Detecção da mutação por análise da curva de fusão de LightCycler® com sondas de hibridização FRET
[0178] Cconcebeu-se iscas e sondas para amplificar e hibridar-se à sequência alvo do exon 12 de JAK2. A posição do sítio de mutação (1849G/T) estava coberta por uma sonda captor doadora marcada com fluoresceína em 3’ e a sonda de ancoragem receptora adjacente marcada com LightCycler® Red 640 (LCRed640) em sua extremidade 5’, e a sua extremidade 3’ fosforilada para evitar a extensão. A amplificação e a análise da curva de fusão foram empregadas sobre o instrumento de LightCycler® (Roche Diagnostics, Meylan, France). O volume reacional final era de 20 μl utilizando 10 ng de DNA, 14 μl de mistura LightCycler FastStart DNA Master, 3 mM MgCl2, 0,2 μM de iscas, 0,075 μM de cada sonda. Resumidamente, as amostras foram aquecidas a 95°C durante 10 minutos e uma amplificação por PCR de 45 ciclos (10 segundos a 95°C, 10 segundos a 53°C, 15 segundos a 72°C) foi seguida por por uma etapa de desnaturação a 95°C durante 10 segundos, duas etapas de hibridação a 63°C e 45°C durante 30 segundos cada uma e uma curva de fusão que se situa no domínio compreendido entre 45 e 70°C (0,1°C/sec). A análise sobre o programa LightCycler® foi realizada pelo traçado da curva da derivada da fluorescência em relação à temperatura [2(dF12/F11)/dT) versus T]. As pics com mutações e WT foram respectivamente observados a 57 e 63 °C.
[0179] Detecção da mutação por amplificação específica de um alelo por TaqMan®
[0180] Duas iscas foram concebidos para amplificar um produto de 92 Pb que engloba o SNP para a posição 1849. Duas sondas MGB fluorogênicas foram concebidas com diferentes corantes fluorescentes, um orientado para o alelo WT e orientado para este com mutação. Realizou-se a genotipagem nas placas com 96 pontos, utilizando o método baseado no TaqMan® PCR. O volume reacional final era de 12,5 μl utilizando 10 ng de DNA genômico, 6,25 μl de TaqMan® Universal Master Mix e 0,31 μl de 40X Assays-on-Demand SNP Genotyping Assay Mix (Applied Biosystems). A placa foi aquecida a 95°C durante 10 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 92°C durante 15 segundos e um emparelhamento/extensão a 60°C durante 1 minuto. O termociclagem foi realizado sobre o 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). A análise foi efetuada com o programa SDS versão 1.3. A genotipagem da discriminação alélica em ponto final foi realizada por inspeção visual de uma curva da fluorescência (Rn) que provém da sonda WT contra Rn da JAK2 com mutação gerada a partir da leitura da fluorescência pós-PCR.
[0181] Pacientes com uma eritrocitose e coleta de amostras
[0182] Avaliou-se 88 pacientes com taxas de hematócritos superiores a 51%, durante o diagnóstico, antes de qualquer tratamento, e estudamos a presença dos critérios WHO e PVSG. O valor de 51% foi retido para a extremidade superior do domínio normal para a taxa do hematócrito (Pearson TC e al., A Polycythemia Vera Updated: Diagnosis, Pathobiology, and Treatment. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program.) 2000: 51 a 68). As células da medula óssea foram recolhidas para dosagens clonogênicas e as células excedentes foram recolhidas para a extracção de DNA. Mediu-se a eritropoiétina sérica (Epo) em diferentes laboratórios, e ele é, então, relatada como sendo baixa quando está abaixo do valor inferior do domínio normal de cada laboratório, normal ou elevada. Os granulócitos periféricos que provêm dos mesmos pacientes foram purificados como descrito precedentemente, as amostras sanguíneas de cada tempo estavam disponíveis. As amostras de medula óssea e de sangue foram recolhidas depois que se obteve um consenso crítico.
Dosagens de EEC
[0183] As dosagens in vitro do caráter resposta eritroide à Epo foram todas realizadas no mesmo laboratório (Hôtel Dieu, Paris) com uma técnica de cultura de plasma-coágulo, como descrito precedentemente (Casadevall N, Dupuy E, Molho- Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoietin in a patient with purê red-cell aplasia. N. Engl. J. Med. 1996; 334: 630 a 633).
Análise estatística
[0184] A correlação dos marcadores foi realizada utilizando o coeficiente de linhas Spearman (R).
2.2 RESULTADOS
[0185] Exequibilidade e sensibildade das técnicas de genotipagem baseadas na PCR para a deteção da mutação JAK2 V617F
[0186] Para avaliar a eficácia do senquenciamento, das tecnologias LightCycler® e Taqman® para detectar a mutação JAK2 V617F, pesquisamos sua presença em 119 amostras provenientes de pacientes com suspeita de MPD, utilizando-se 3 técnicas em paralelo. A mutação JAK2 V617F foi eficazmente detectada em 83/119 amostras, e 35 amostras não apresentavam a mutação por nenhuma das técnicas. Em somente uma amostra, o sequenciamento fracassou em detectar a mutação revelada pelas tecnologias LightCycler® e Taqman®, sugerindo assim que essas últimas possam ser mais sensíveis.
[0187] Para avaliar a sensibilidade da técnica, utilizamos dois métodos diferentes: testamos diluições em série de DNA da linhagem celular HEL com mutação de maneira homozigoto no DNA da linhagem celular TF-1 sem mutação, e diluições em série de DNA genômico proveniente de um paciente homozigoto para a mutação JAK2 V617F no DNA normal. O sequenciamento fracassou em detectar o alelo com mutação sob 5% de DNA de linhagem celular HEL diluído no DNA de linhagem celular TF-1, e sob 10% de DNA do paciente com mutação de maneira homozigoto diluído no DNA normal. A sensibilidade das técnicas LightCycler® e Taqman® seria equivalente, de modo ligeiramente superior ao sequenciamento, que atinge 0,5 a 1% de DNA da linhagem celular HEL diluída no DNA da linhagem celular TF-1 (figura 6), e 2 a % de DNA de um paciente com mutação de maneira homozigoto diluído no DNA normal.
[0188] Características dos pacientes com uma eritrocitose no momento do diagnóstico
[0189] As características principais de 88 pacientes com taxas de hematócritos superiores a 51%, no momento do diagnóstico, estão resumidos nas tabela 1. Tabela 1: Características dos pacientes
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[0190] 88 pacientes com taxas de hematócritos superiores a 51% foramdiagnósticos de acordo com os critérios PVSG e WHO, em quatro grupos: doença de Vasquez (PV), eritrocitose idiopático, eritrocitose secundária e “nada de eritrocitose absoluta” (nada de AE) quando a medida da massa dos glóbulos vermelhos não foi aumentada. 8 pacientes não poderam ter nenhum diagnóstico definido, pois alguns dados clínicos não estavam disponíveis. Ht: hematócritos; Hb: hemoglobina; WBC: glóbulos brancos sanguíneos, EEC: colônias eritroides endógenos; EPO: eritropoietina; o: afastamento tipo. Os pacientes puderam ser separadas em 4 grupos principais, respectivamente de acordo com os critérios WHO (Pierre R. et al., éditeurs. World Health Organization Classification of Tumors; Pathology and Genetics of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press; 2001: 32 a 34) e PVSG (Pearson TC, Messinezy M. The diagnostic criteria of polycythaemia rubra vera. Leuk Lymphoma 1996: 22 Suppl 1: 87 a 93): 61 a 45 pacientes com o diagnóstico de PV, 5 com uma eritrocitose secundária, 11 a 21 com uma eritrocitose idiopática e 3 sem eritrocitose absoluta (massa dos glóbulos vermelhos normais). Os dados clínicos estavam incompletos em 7 pacientas, que explica porque o diagnóstico de PV não poderia ser afirmado seja com os critérios WHO seja com esses PVSG. Em função das diferenças entre os critérios A1 das duas classificações, 6 pacientes que não tiveram nenhuma medida de massa de glóbulos vermelhos, puderam ser classificados na clasificação WHO e nada nesta PVSG. Um paciente teve ao mesmo tempo uma hipoxia e uma formação de EEC, tornando consequentemente o diagnóstico difícil. Uma análise citogenètica foi realizada em 35 pacientes; dentre 32 pacientes PV (de acordo com o critério WHO), 7 tiveram anomalias citogenéticas: 5 com uma trisomia 9, 1 com 7q- e 1 com material suplementar no cromossomo 18.
[0191] A presença de JAK2 V617F corresponde aos critérios PVSG e WHO de PV
[0192] JAK2 V617F estava presente em 43/45 (96%) pacientes diagnosticados como PV de acordo com os critérios PVSG e em 57/61 (93%) pacientes diagnósticados com os critérios WHO (tabela 1). Entretanto, 8/29 pacientes classificados como não PV de acordo com a classificação PVSG apresentaram a mutação, enquanto que nenhum dos 19 pacientes não PV do WHO; esses 8 pacientes foram considerados IE com os critérios PVSG e PV com esses WHO. Nenhum dos pacientes diagnosticados SE nem este com uma massa de glóbulos vermelhos normal (“nada de AE”) não tiveram mutação. A presença ou ausência de JAK2 V617F corresponde assim ao diagnóstico positivo de PV em 76/80 pacientes (95%, R=0,879, p<0,0001) se se utilizam os critérios WHO e em 64/74 pacientes (86,5%, R=0,717, p<0,0001) com os critérios PVSG. Além disso, pois nenhum dos pacientes diagnosticados como não PV com os critérios WHO tiveram a mutação, a detecção de JAK2 V617F tem um valor preditivo de 100% no contexto da eritrocitose absoluta.
[0193] Alguns autores (Mossuz P. e al., Diagnostic value of serum erythropoietin level in patients with absolute erythrocitosis. Haematologica 2004; 89: 1194 a 1198) consideram a medida do nível de Epo sérico como um teste de diagnóstico em primeira intenção para os pacientes com uma eritrocitose absoluta, com uma especificidade de 97% e um valor preditivo de 97,8% para o diagnóstico de PV, se o nível de Epo está abaixo do valor inferior do domínio normal. No nosso estudo, a correlação entre o nível de Epo e o diagnóstico de PV de acordo com os critérios WHO e PVSG foi observada respectivamente em 50/61 (82%, R = 0,488, p = 0,0002) e 39/56 (70%, R = 0,358, p = 0,0067) pacientes. Comparamos em seguida o nível de Epo sérica na presença ou na ausência de V617F JAK2 e achou que 52/68 dos pacientes (76%, R = 0,416, p = 0,0004) tinham uma correlação adequada.
[0194] A presença da mutação JAK2 V617F corresponde à capacidade de formar EEC. Três equipes diferentes mostraram que linhagens celulares dependentes da Epo transfectadas com JAK2 V617F eram independentes bem como hipersensíveis à Epo para seu crescimento, imitando assim a independência e a hipersensibilidade dos progenitores eritróides descritos na PV. Consequentemente, emitimos a hipótese que os pacientes que trazem JAK2 V617F apresentariam também uma formação de EEC. Dentre os 20 pacientes com uma eritrocitose que não tivesse nenhuma formação de EEC, apresentaria a mutação, levantando a pergunta do valor preditivo positivo da detecção de JAK2 V617F; no entanto, ainda que este doente não apresentasse nenhum EEC, preencheria numerosos critérios WHO e PVSG positivos, que lhe permitem ser classificado como PV nas duas classificações. Este paciente deveria consequentemente ser considerado como uma “falso negativo aos EEC” antes do que como um “falso positivo para JAK2”. Dentre os 67 pacientes que tinham EEC, 62 levavam a mutação JAK2 V617F, 5 pacientes sem mutação utilizando técnicas sensíveis para a detecção. Dentre estes 5 pacientes, 4/5 e 2/5 podiam ser classificados no grupo PV, respectivamente de acordo com os critérios WHO e PVSG. No total, os 87 dos pacientes analisados, a presença ou a ausência da mutação JAK2 V617F correspondiam à capacidade ou a incapacidade de formar EEC em 81/87 dos pacientes (93,1%, R = 0,824, p <0,0001).
[0195] A presença da mutação JAK2 V617F nas células mononucléaires da medula óssea (BMMC) corresponde à sua presença em granulócitos periféricos.
[0196] Para estudar se a utilização dos granulócitos do sangue periférico para detectar a mutação JAK2 V617F no momento do diagnóstico pudesse evitar a realização da dosagem sobre as células de medula óssea, comparamos os resultados obtidos por um ou outro dos métodos de sequenciamento, de LightCycler® e de TaqMan® em 50 pacientes (incluindo 35 PV, 8 SE e 8 outros suspeitos de MPD) dos quais ao mesmo tempo as amostras de medula óssea e de sangue periférico estavam disponíveis no momento do diagnóstico. Todos os casos (34 com mutação, 16 sem mutação), a mutação foi detectada de maneira idêntica.
[0197] III - Conclusão
[0198] Propomos assim uma nova ficha de diagnóstico de PV onde a detecção de JAK2 V617F nos granulócitos com técnicas sensíveis é a primeira etapa no diagnóstico de uma eritrocitose, exceto no caso uma eritrocitose secundária evidente (figura 7). Esta atitude tem inúmeras vantagens: evita a realização de uma medida da massa dos glóbulos vermelhos isotópicos, que nem sempre está disponível e cujo resultado é às vezes sujeito à controvérsia. Pode também evitar um aspirant de medula óssea e a realização das dosagens de EEC que tomam tempo e não são ainda padronizadas. Diminui drasticamente o custo do diagnóstico positivo de PV, pois somente os pacientes com taxas de hematócritos superiores a 51% e negativos para JAK2 V617F deveriam ter todas as investigações que são efetuadas realmente para caracterizar uma eritrocitose. Ainda que a detecção única de JAK2 V617F no contexto do eritrocitose sustente o diagnóstico de PV, a realização de uma biópsia de medula óssea pode ainda ser útil, pois ela pode mostrar sinais de mielofibrose ou a presença de células blásticas, afirmando consequentemente a transformação leucêmica da PV. No entanto, parece-nos que uma biópsia de medula óssea deveria ser realizada no contexto de um estudo eventual, com uma análise citogenética.
[0199] Também detectou-se JAK2 V617F em 30% dos ET, 50% dos IMF e alguns MPD raros s não caracterizados, definindo consequentemente um novo grupo de MPD com diferentes apresentações clínicas. As razões destas diferenças são ainda desconhecidas e é ainda muito cedo para agrupar estas doenças uma única entidade mieloproliferativa com uma causa fisiopatológica comum e diferentes fenótipos. Estudos eventuais clínicos precisos caracterizariam mais precisamente os sinais comuns entre PV, ET, IMF e outros MPD raros que trazem JAK2 V617F, especialmente em fins de eritrocitose absoluta, de nível de Epo, mielofibrose e as anomalias citogenéticas. Considera-se assim utilizar a detecção de JAK2 V617F como instrumento inicial no diagnóstico hiperleucocitose crônico, a trombocitose e a eritrocitose. A presença de JAK2 V617F permitirá não somente uma nova definição de um grupo de MPD, mas será tão certamente a base para o desenvolvimento de terapêuticas orientadas específicas.
[0200] Exemplo 3: Os siRNA específicos da mutação V617F JAK2 inibem V617F JAK2 mas não JAK2 WT.
[0201] Os siRNA 1, 3 e 4 correspondentes à SEQ ID No 25 27 inibema a proteína com mutação V617F JAK2 expressa pela linhagem HEL sem inibir a proteína selvagem JAK2 expressa pela linhagem K562. Os resultados são reportados nas figuras 8, 9 e 10. REFERÊNCIAS - Andersson, P., LeBlanc, K., Eriksson, B. A., and Samuelsson, J. (1997). No évidence for an altered mRNA expression or protein level of haematopoietic cell phosphatase in CD34+ bone marrow progenitor cells or maduro peripheral blood cells in polycythaemia vera. Eur J Haematol 59, 310-7. - Asimakopoulos, F. A., Hinshelwood, S., Gilbert, J. G., Delibrias, C. C, Gottgens, B., Fearon, D. T., and Green, A. R. (1997). The gène encoding hematopoietic cell phosphatase (SHP-I) is structurally and transcriptionally intact in policitemia vera. Oncogene 14, 1215-22. - Casadevall, N., Vainchenker, W., Lacombe, C, Vinci, J., Chapman, J., Breton- Gorius, J., and Varet, B. (1982). Erythroid progenitors in Policitemia Vera. démonstration of their hipersensitivity to erythropoietin using serum-free cultures. Blood 59, 447-451. - Hess, G., Rosé, P., Gamm, H., Papadileris, S., Huber, C, and Seliger, B. (1994). Molecular analysis of the erythropoietin receptor System in patients with polycythaemia vera. Br J Haematol 88, 794-802. - Kralovics, R., Guan, Y., and Prchal, J. T. (2002). Acquired uniparental disomy of chromosome 9p is a fréquent stem cell defect in policitemia vera. Exp Hematol 30, 229-36. - Le Couedic, J. P., Mitjavila, M. T., Villeval, J. L., Feger, F., Gobert, S., Mayeux, P., Casadevall, N., and Vainchenker, W. (1996). Missense mutation of the erythropoietin receptor is a rare event in human erythroid malignancies. Blood 87, 1502-11. - Lindauer, K., Loerting, T., Liedl, K. R., and Kroemer, R. T. (2001). Prédiction of the structure of human Janus quinase 2 (JAK2) comprising the two carboxy-terminal domains reveals a mechanism for autoregulation. Protein Eng 14, 27-37. - Means, R. T., Krantz, S. B., Sawyer, S., and Gilbert, H. (1989). Erythropoietin receptors in policitemia vera. J Clin Invest 84, 1340. - Moliterno, A. R., Hankins, W. D., and Spivak, J. L. (1998). Impaired expression of the thrombopoietin receptor by platelets from patients with Policitemia Vera. N Engl J Med 338, 572-580. - Moliterno, A. R., and Spivak, J. L. (1999). Posttranslational processing of the thrombopoietin receptor is impaired in policitemia vera. Blood 94, 2555-61. - Pahl, H. L. (2000). Towards a molecular understanding of policitemia rubra vera. Eur J Biochem 267, 3395-401. - Pearson (2001). Evaluation of diagnostic criteria in policitemia vera. Semin Hematol. 38, 21-4. - Roder S, S. C, Meinhardt G, Pahl HL. (2001). STAT3 is constitutively active in some patients with Policitemia rubra vera. Exp Hematol 29, 694-702. - Silva, M., Richard, C, Benito, A., Sanz, C, Olalla, L, and Fernandez- Luna, J. L. (1998). Expression of Bcl-x in erythroid precursors from patients with policitemia vera. N Engl J Med 338, 564-71. - Temerinac, S., Klippel, S., Strunck, E., Roder, S., Lubbert, M., Lange, W., Azemar, M., Meinhardt, G., Schaefer, H. E., and Pahl, H. L. (2000). Cloning of PRV-I, a novel member of the uPAR receptor superfamily, which is overexpressed in policitemia rubra vera. Blood 95, 2569-76. - Ugo, V., Marzac, C, Teyssandier, L, Larbret, F., Lécluse, Y., Debili, N., Vainchenker, W., and Casadevall, N. (2004). Multiple signaling pathways are involved in erythropoietin- independant differentiation of erythroid progenitors in Polycytyhemia Vera. Experimental Hematology 32, 179-187.

Claims (33)

1. Proteína isolada JAK2 (Janus cinase 2), caracterizadaem que ela compreende uma mutação sobre o aminoácido 617, mais particularmente a mutação V617F, abaixo denominada «variante JAK2 V617F», cuja sequência é apresentada na SEQ ID No 1.
2. Sequência nucleotídica codificando para a variante JAK2 V617F tal como definida na reivindicação 1, caracterizadapelo fato de ser notadamente a sequência SEQ ID No 2 possuindo a mutação t/g em posição 1849 à partir do ATG marcando o início da transcrição.
3. Vetor de clonagem e/ou de expressão viral que é um vetor viral ou plasmídico ou sob forma de DNA nu caracterizadoem que ele compreenda sequência tal como definida na reivindicação 2 sob o controle de um promotor eficaz nas células de mamíferos.
4. Sondas ou iniciadores caracterizadas pelo fato de compreender de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos da sequência SEQ ID No 3 ou 4 e compreendendo o nucleotídeo mutado t1849
5. Sondas ou iniciadores de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de serem selecionadas das sequências SEQ ID No 5 a 11 e 12.
6. Oligonucleotídeo caracterizadopelo fato de ter pelo menos 10 nucleotídeos, em particular entre 15 e 25 nucleotídeos, capazes de hibridizar com o DNA genômico JAK2 da sequência ID No 4 compreendendo o nucleotídeo mutado t1849 ao cDNA ou ao mRNA.
7. Método ex vivo ou in vitro para determinar a presença ou a ausência da variante G1849T do gene JAK2 em uma amostra de um paciente atingido por PV ou susceptível de desenvolver uma PV ou qualquer outra síndrome mieloproliferativa, notadamente etrocitose, as hiperleucocitoses, as trombocitoses e mielofibroses, compreendendo:a) a obtenção de uma amostra de ácido nucleico do paciente,b) a detecção da presença ou da ausência da variante G1849T do gene JAK2 na referida amostra de ácido nucleico, caracterizadoem que a presença da variante G1849T é uma indicação de PV ou de qualquer outra síndrome mieloproliferativa.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadoem que ele compreende uma etapa de hibridação com pelo menos uma sonda tal como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 5.
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizadoem que ele compreende uma etapa de amplificação por reação PCR com pelo menos um par de iniciadores tal como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 5.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizadoem que ele é efetuado sobre os RNAm de um indivíduo e compreende uma reação RT-PCR.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizadoem que ele compreende uma etapa de amplificação por meio dos referidos iniciadores, seguido por uma etapa de hibridação com pelo menos uma sonda, de preferência duas sondas que se hibridizam em condição de forte estringência às sequências correspondentes à região da mutação G1849T e a detecção do sinal produzido pelos marcadores das referidas sondas, as sondas e iniciadores sendo como definidos na reivindicação 4 a 5.
12. Método ex vivo ou in vitro para detectar a presença ou a ausência da variante JAK2 V617F em uma amostra de um paciente atingido ou susceptível de desenvolver a PV ou qualquer outra síndrome mieloproliferativa compreendendo:b) a detecção da presença ou da ausência da variante JAK2 V617F em uma amostra do paciente, caracterizadoem que a presença da referida variante é uma indicação da PV ou de qualquer outra síndrome mieloproliferativa.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de compreender a colocação em contato da amostra com um anticorpo específico da variante V617F da proteína JAK2, de preferência um anticorpo capaz de fazer a distinção entre a variante V617F e a proteína JAK2 não mutada.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadoem que os anticorpos são anticorpos monoclonais ou policlonais, cadeia simples ou cadeia dupla, anticorpos quiméricos, humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno F(ab')2 e F(v).
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadoem que de trata de um teste ELISA.
16. Método de acordo com uma das reivindicações 7 a 15 caracterizadoem que ele é praticado para a sub-população de pacientes apresentando uma taxa de hematócritos superior a 51 %.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15 caracterizadoem que ele é praticado para a sub-população de pacientes apresentando uma taxa de plaquetas superior a 450,000.
18. Anticorpo monoclonal, caracterizadopelo fato de reconhecer especificamente a variante JAK2 V617F.
19. Hibridoma caracterizadapelo fato de produzir um anticorpo tal como definido na reivindicação 18.
20. Kit para detectar a variante JAK2 V617F em um tumor caracterizado pelo fato de compreender um ou vários iniciadores ou sondas como definidas na reivindicação 4 a 5 para a detecção específica da presença ou da ausência da mutação G1849T no gene JAK2.
21. Kit para determinar se um paciente é atingido pela Policitemia Vera ou qualquer outra síndrome mieloproliferativa implicando a variante JAK2 V617F, notadamente etrocitose, as hiperleucocitoses, as trombocitoses e mielofibroses, caracterizadopelo fato de compreender uma ou várias sondas ou iniciadores, como definidos na reivindicação 4 a 5 para a detecção específica da presença ou da ausência da mutação G1849T no gene JAK2.
22. Kit de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizadopelo fato de compreender, por outro lado pelo menos um elemento escolhido dentre uma polimerase termorresistente para a amplificação PCR, uma ou várias soluções para a amplificação e/ou a etapa de hibridação, assim como qualquer reativo para a detecção do marcador.
23. Kit para determinar se um paciente é atingido pela Policitemia Vera ou de qualquer outra síndrome mieloproliferativa implicando a variante JAK2 V617F, caracterizadopelo fato de compreender um anticorpo tal como definido na reivindicação 18.
24. siRNA capaz de diminuir mais de 50% ou ainda mais de 95% da expressão da variante JAK2 V617F caracterizadopelo fato de que ele possui de 19 a 25 nucleotídeos, de preferência 19 nucleotídeos de comprimento, a sequência de um primeiro filamento sendo idêntica e a sequência de um segundo filamento sendo complementar a sequência SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 ou ainda a sequência SEQ ID No 11 compreendendo o nucleotídeo mutado t1849
25. Processo in vitropermitindo determinar a inibição específica de JAK2 V617F por um ou vários compostos, caracterizadopelo fato de compreender as etapas consistindo em:a) colocar em contato um ou vários compostos com a proteína JAK2 V617F tal como definida na reivindicação 1, ou uma fração membranar compreendendo JAK2 V617F, nas condições apropriadas para uma ligação e/ou inibição e,b) uma detecção da ligação específica e/ou da inibição de JAK2 V617F.
26. Processo de triagem in vitrocaracterizadopelo fato compreender uma sucessão de testes de acordo com a reivindicação 25 de várias moléculas e uma etapa de seleção das moléculas apresentando um IC50 para JAK2 V617F inferior a 1 μM, de preferência 100 nM.
27. Processo in vitrode acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender por outro lado uma seleção negativa das moléculas que possuem um IC50 para JAK2 inferior a 5 μM ou 1 μM.
28. Processo de triagem in vitrode acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que determina-se por imunoprecipitação a inibição da fosforilação de JAK2 V617F.
29. Processo de triagem in vitrode acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que é sobre as células primárias progenitoras CD34+ JAK2 V617F que são capazes de se diferenciar sem eritropoietina (Epo) ou sobre as linhagens celulares que se tornaram fator independentes por introdução da variante JAK2 V617F.
30. Utilização de SiRNA tal como definido na reivindicação 24,caracterizadapelo fato de ser para a fabricação de um medicamento.
31. Utilização de siRNA tal como definido na reivindicação 24,caracterizadapelo fato de que é para a preparação de um medicamento para utilização no tratamento das hemopatias malignas, em particular as síndromes mieloproliferativas incluindo Policitemia Vera, trombocitemia essencial, a esplenomegalia mieloide ou mielofibrose primitiva.
32. Utilização de acordo com a reivindicação 30, caracterizadapelo fato de ser para a preparação de um medicamento para utilização no tratamento de síndromes mieloproliferativas associadas à mutação JAK2 V617F, e de outras hemopatias malignas e tumores sólidos como os carcinomas, melanomas e neuroblastomas, que expressam JAK2 V617F.
33. Composição, caracterizadapelo fato de compreender um siRNA tal como definido na reivindicação 24 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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