KR101203003B1 - 진성 적혈구증가증에 있는 jak2 돌연변이의 확인 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질-티로신 키나제 JAK2의 V617F 변이체에 관한 것으로서, 상기 변이체는 바퀘즈 폴리글로불리아의 원인이 된다. 또한, 본 발명은 척수증식성 질환과 관련이 있는 적혈구증가증 및 혈소판증가증의 맨 먼저 고려되어야 하는 진단 방법, 또는 새로운 질병분류학적 그룹으로 재분류되도록 하는 척수증식성 질환의 JAK2 V617F 변이체의 검출, 및 특이적 저해제 및 siRNA의 확인에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단백질-티로신 키나제 JAK2의 V617F 변이체에 관한 것으로서, 상기 변이체는 바퀘즈 폴리글로불리아(Vaquez Polyglobulia)의 원인이 된다. 또한, 본 발명은 척수증식성(myeloproliferative) 질환과 관련이 있는 적혈구증가증(erythrocytosis) 및 혈소판증가증(thrombocytosis)의 맨 먼저 고려되어야 하는 진단 방법, 또는 새로운 질병분류학적 그룹으로 재분류되도록 하는 척수증식성 질환의 JAK2 V617F 변이체의 검출, 및 특이적 저해제 및 siRNA의 확인에 관한 것이다.
바퀘즈 폴리글로불리아(진성 적혈구증가증 또는 PV)는 진성 직혈구증가증, 및 종종 혈소판증가증 및 과다백혈구증가증(hyperleukocytosis)과 관련이 있는 만성 척수증식성 질환이다. 이는 클론성, 후천성 조혈성 줄기세포 질환이다. PV의 조혈성 전구체(progenitor)는 에리트로포이에틴(Epo)의 부재하에 적아세포(erythroblast) 콜로니를 형성할 수 있으며, "자발성 콜로니"로 불린다. 몇 개 의 다른 성장인자에 대한 PV 적아세포 전구체의 과민감성은 다음과 같다: 인터루킨-3(IL-3), 과립구 대식세포-촉진 인자(GM-CSF), 줄기세포 인자(SCF) 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1). 여러 연구팀에서는 PV의 생리병리학(physiopathology)에 관심을 가졌으나, 질병 초기의 분자적 이형(anomaly)은 지금까지도 알려지지 않은 채로 남아 있다(H.Pahl, 2000).
몇 개의 사이토카인에 대한 PV 전구체의 과민감성은 사이토카인 수용체에 대해 공통적인 신호 전달 과정과 관련이 있는 비정상성을 연구하도록 유도한다. 분자 마커(marker)의 존재는 PV에서는 전혀 증명되지 않았지만, 다른 척수증식성 질환, 특히 CML과 PV 간의 유사성은 있으며, 이의 분자 메커니즘이 악성 클론 증식과 이의 말단 돌연변이의 유력한 원인이 되는 Ber-Abl에 의해 유도되는 것과 밀접한 관련이 있을 가능성이 있다. 이 가설은 최근에 두 개의 희귀한 척수증식성 질환 즉, FGF 수용체의 구조적 활성을 유도하는 8p11 염색체 부위를 포함하는 전좌와 관련이 있는 척수증식성 질환 및 크립틱 염색체 결실이 키메라 유전자 PDGFRα-FIP1L1을 유발하는 과다호산백혈구증식성(hypereosinophilic) 질환에서 확인되었다. 이 두 경우에 분자적 이형은 구조적 티로신 키나제 활성을 갖는 융합 단백질의 원인이 된다.
PV에서, 재발성 세포유전학적 이형(anomaly)은 발견되지 않았으며, 심지어는 20q 결실이 환자의 10 내지 15%에서 검출되었고, 환자의 약 30%에서는 9p에서 이형접합적 결실이 검출되었다(Kralovics, 2002). 그러나, 이러한 이형은 상기 질병에 대해 특이적이지는 않다.
PV 세포가 Epo-의존적이지 않기 때문에, 연구는 Epo 수용체(R-Epo)의 경로에 대해 수행되었다. 먼저, 상기 수용체는 구조적 및 기능적으로 모두 정상적이다(Hess et al, 1994; Le Couedic et al, 1996; Means et al, 1989). Epo 촉진이 끝날 때 R-Epo 및 JAK2를 탈인산화시키는 SHP-1 포스파타제는 RNA 및 단백질 레벨에서 정상적으로 발현된다(Andersson et al, 1997; Asimakopoulos et al, 1997). R-Epo 신호전달의 후반 하류(downstream)에서는 PV를 나타내는 환자의 PNN (polynuclear neutrophilis)에서 비정상적인 STAT5 활성이 밝혀졌고, STAT3의 구조적 인산화는 14명의 피검자 중에서 4명의 PV 환자에 있는 PNN에서 발견되었다(Roder, 2001). 마지막으로, STAT5의 전사적 표적인 항-아폽토시스(apoptosis) 단백질인 bcl-xl의 발현이 면역조직학 및 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 연구되었다(Silva et al, 1998). bcl-xl이 PV 적아세포에서 과발현되며, 특히 상기 단백질이 정상적으로는 더 이상 발현되지 않는 훨씬 더 성숙한 단계에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
현재까지 바퀘즈 폴리글로불리아에 있는 최고의 진단 항목은 임상이다(PVSG criteria: Pearson, 2001). 생물학적 진단은 Epo의 부재하에 적혈구의 전구체를 배양하는 것에 필수적으로 기초한다(내인성 콜로니의 검출). 적절한 수행을 위한 전문적 기술이 필요하고 상당한 "테크니션타임(techniciantime)"이 요구되기 때문에, 이러한 테스트는 모든 경우에 유용하지는 않으며, 숙련된 실험실에서 수행될 때에만 신뢰성이 있다. 아울러, 테스트는 높은 민감성을 얻기 위해 환자로부터의 수질 세포를 필요로 하지만, 이는 환자에게는 귀찮은 과정이다.
감법(subtraction) 혼성화 기술을 이용함으로써, 독일 연구팀에서는 PRV1 (Polycythemia Rubra vera 1)이라 불리는 PV의 PNN에서 과발현된 유전자를 클로닝하였다(Temerinac et al, 2000). PRV-1 단백질은 uPAR 표면 수용체의 수퍼패밀리에 속한다. PV 다핵성 호중성 백혈구(polynuclear neutrophil)에 있는 PRV-1을 코딩하는 mRNA의 과발현은 실시간 RT-PCR에 의해 쉽게 검출될 수 있으며; 생리병리학적 기능을 가지고 있지 않은 최근에 밝혀진 질병 마커를 형성한다. 그러나, 최근에 공개된 연구에서는 이것이 매우 민감하거나 매우 특이적이지 않음을 보여준다.
스피박 등의 문헌(Spivak J L et al, 2003, "Chronic myeloproliferative disorders"; Hematology, 2003; 200 24)에서는 특정 PV 마커에 대해 기술한다. 호중성 백혈구 항원 NBI/CD177의 mRNAs는 PV 환자의 과립구에서 과발현되어 있다. 이 마커는 PV를 검출하는데 있어서 믿을만한 수단으로 보이지 않는데, 그 이유는 어떤 환자는 이러한 과발현을 나타내지 않거나 또는 이러한 과발현이 바퀘즈 폴리글로불리아보다는 척수증식성 질환을 겪고 있는 환자에서 관찰되기 때문이다. 혈소판 상에 있는 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 수용체 Mp1의 감소된 발현도 PV에서 발견되었다. 비록 이러한 비정상이 PV에서 유력하게 나타나지만, 다른 척수증식성 질환에서도 나타난다. 아울러, 이는 수행하기 힘들고 고도로 숙련된 실험자에서만 수행될 수 있는 테스트이다.
따라서, 당업계에는 PV를 믿을만하게 진단할 수 있는 방법이 존재하지 않는다. 아울러, 유일한 이용가능한 치료조차도 특이적이지 않다. 이들은 정상적인 수준 내에서 헤마토크릿(hematocrit)을 유지하기 위한 정맥절개(phlebotomy)와 연 관이 되어 있거나, 세포독성 시약 또는 IFN의 사용과 연관되어 있다.
본 발명에서, 본 발명자들은 테스트된 환자의 약 90%에서 JAK2 유전자의 돌연변이를 발견했을 뿐만 아니라, 이러한 돌연변이가 티로신 키나제의 구조적 활성을 위해 필요하다는 사실을 발견했으며, 이의 저해가 PV 적아세포의 자연적 증식 및 분화를 차단하도록 한다는 것을 보였다.
JAK2는 여러 개의 세포질내 티로신 키나제와 함께 그룹을 이루는 야누스 키나제(JAKs) 패밀리에 속한다: JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2. JAK 단백질은 사이토카인 수용체, 보다 구체적으로는 Epo 수용체(R-Epo)의 수퍼패밀리의 일부와 같이, 내인성 티로신 키나제 활성을 갖지 않는 많은 막 수용체의 세포내 신호와 관련이 있다. JAK2 단백질은 23개의 엑손을 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. 상보적 DNA의 크기는 3,500 염기쌍이며 1,132 아미노산 단백질(130 kD)을 코딩한다(도 1). PCR과 시퀀싱을 이용하여, 본 발명자들은 PV 환자의 거의 90%에서 발견되는 JAK2의 엑손 12 내의 클론성, 후천적 점 돌연변이를 확인하였다. 정상적으로 발린(V)을 코딩하는 "GTC" 617 코돈이 페닐알라닌(F)을 코딩하는 "TTC"로 돌연변이되었다. 상기 V617F 돌연변이는 테스트된 25명의 대조군 또는 2차 폴리글로불리아에 걸린 환자에서는 확인되지 않았다. 반면, 특발성(essential) 혈소판증가증의 40% 및 골수섬유증의 50%에서는 확인되었는데, 이는 이러한 돌연변이가 Bcr-Abl 한정된 만성 골수성 백혈병과 같은 새로운 척수증식성 질환 구조를 정의함을 의미한다.
본 발명의 변이체인 JAK2 V617F가 혈액학 진단 실험실에서 광범위하게 사용되는 기기를 이용해 유효하게 검출될 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 척수증식성 질환을 겪는 것으로 추정되는 환자로부터 119개의 샘플을 분석하였다. 본 발명자들은 JAK2 V617F가 시퀀싱보다 조금 더 민감한 LightCycler® 및 TaqMan® 기술에 의해 효과적으로 검출됨을 확인하였다. 이후, 본 발명자들은 처음에 언급한 진단 테스트로 헤마토크릿 레벨이 51% 이상인 88명의 환자에서 JAK2 V617F의 검출 값을 추정하였으며, 적혈구증가증의 경우 돌연변이가 100%의 양성 예측 값을 갖는 WHO 규범(criteria)(R=0.879) 및 PVSG 규범(R=0.717)에 따른 PV 진단에 부합한다는 것을 나타내었다. 이러한 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 과립구에 있는 JAK2 V617F의 검출이 적혈구증가증이 있는 환자에서 맨 먼저 고려되어야 하는 진단 테스트로 간주되어야 하며, 이로 인해 적혈구 중량의 측정, 골수 방법 및 내인성 적혈구 콜로니 형성의 시험관내 분석을 수행하지 않아도 됨을 제시한다. 또한, 이러한 검출은 모든 척수증식성 질환 또는 이의 예측되는 존재에 대해 맨 먼저 고려되어야 한다. 이러한 검출은 척수증식성 질환을 확인하기 위한 어떠한 생물학적 테스트도 존재하지 않는 만성 혈소판증식증에 있어서 특히 중요할 것이다. 또한, 이는 골수섬유증의 진단 및 확인되지 않은 병인의 혈전증에 걸린 임상적 상황에 있어서 중요한 테스트가 될 것이다.
따라서, 본 발명은 최초로 PV 및 이의 돌연변이와 관련이 있는 척수증식성 질환의 진단 기술을 제공하며, 이를 표적 치료하기 위한 방법을 열었다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 적혈구증가증에 맨 먼저 시도되어야 하고, 대부분의 환자 및 만성 적혈구증가증에서 적혈구 중량 및 내인성 적혈구 콜로니(EEC)의 정량뿐만 아니라 골수 테스트를 하지 않아도 되게 함으로써 병인을 오랫동안 찾지 않아도 되게 하는 진단 테스트로서 JAK2 V617F 돌연변이의 검출을 제안한다.
따라서, 첫 번째 특징에 따라, 본 발명은 분리된 단백질 JAK2 (Janus Kinase 2)에 관한 것으로서, 구체적으로는 아미노산 617(cDNA의 ATG로부터 시작했을 때 코돈 617)의 돌연변이, 보다 구체적으로는 V617F 돌연변이를 포함하는 호모사피엔스 야누스 키나제 2 단백질(NCBI, 기탁 번호 NM_004972; GI:13325062)에 관한 것이며, 이하 하기 서열번호 1로 표시되는 바와 같은 돌연변이체 JAK2 V617F로 명명한다:
또한, 본 발명은 다른 포유동물에 있는 617 위치의 돌연변이된 단백질 동등체(equivalent), 예를 들면 래트(rat)(NM_031514), 돼지, 마우스(NM-008413) 포유동물 내의 JAK2 V617F, 및 변이체의 3D 구조 및 활성에 영향을 주지 않는 하나 이상의 변화를 포함하는 서열번호 1의 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열번호 2(번역 시작을 표시하는 ATG로부터 시작해 코돈 617 상에 위치하는 GTC 대신에 TTC 코돈(1849 위치에서의 g/t 돌연변이, 이하 'G1849T'라 함)을 갖는 인간 JAK2 유전자 서열)에 관한 것이다.
상기 서열은 바이러스 또는 플라스미드 벡터, 또는 포유동물 세포 내의 유효한 프로모터의 조절 하에 있는 네이키드(naked) DNA에서 발견될 수 있다. 따라서, 본 발명은 JAK2 V617F 단백질을 발현하는 벡터로도 확장된다.
본 발명의 벡터는 클로닝 및/또는 발현 벡터일 수 있으며, 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간 CD34+ 전구체 세포를 전달감염(transfect)시키기 위해 사용될 수 있다.
PV
및 다른 척수증식성 질환의 형질전환 동물 모델
본 발명은 재조합 JAK2 V617F를 발현하는 비-인간 형질전환 동물에 관한 것이다. 상기 동물은 마우스 또는 래트인 것이 바람직하다. 모델로서 사용될 수 있는 형질전환 래트 또는 마우스는 당업계에서 통상적으로 사용되는 어떠한 방법에 의해서도 얻어질 수 있으며, 바람직하게는 ES 세포에 있는 Cre-LoxP 또는 FLP-FRT 시스템을 사용한 상동성 재조합 또는 직접 재조합에 의한 낙-인 방법(Knock-in method, 서열의 표적 삽입)에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 형질전환 세포는 숙주세포 게놈의 하나 이상의 서열에 있는 JAK2 G1849T 변이체의 유전자 표적에 의해 얻어질 수 있다. 더욱 구체적으로, 형질전환 유전자는 숙주세포의 게놈에 있는 상동 서열에서의 상동성 재조합에 의해 안정한 방법으로 삽입될 수 있다. 형질전환 동물을 생산하기 위한 관점에서 형질전환 세포를 얻는 것이 바람직할 때, 숙주 세포는 바람직하게는 태아 줄기세포(ES cell)이다(Thompson et al, 1989). 유전자 타겟팅은 표적 내재 서열과 서열 상동성을 갖는 외부 DNA 서열을 이용한 상동성 재조합을 함으로써 염색체 위치(locus)를 직접 변형시키는 것이다. 유전자 타겟팅에는 여러 타입이 있다. 본 발명에서, 유전자 타겟팅은 바람직하게는 유전자 변이체 JAK2 G1849T 또는 임의의 다른 유전적으로 유사한 변이체에 의해 야생형 JAK2 유전자를 대체시키는데 사용될 수 있다. 이 경우, 유전자 타겟팅은 "낙-인(Knock-in)"(K-in)으로 불린다. 다른 한편으로, 유전자 타겟팅은 JAK2 변이체의 유전자를 삽입하기 위해 야생형 JAK2의 발현을 감소시키거나 소멸시키는데 사용될 수 있다. 이러한 것은 "낙-아웃(knock-out)" 유전자 타겟팅(KO)이라 불린다(Bolkey et al, 1989 참조). 본 발명의 세포는 상기 세포의 게놈에 안정적으로 삽입되는 형질전환유전자(transgene)로 특징되며, 이의 발현이 내인성 유전자의 조절 부위에 의해 조절된다. 안정적인 삽입은 형질전환 유전자를 본 발명의 세포의 게놈 DNA 내로 삽입하는 것을 의미한다. 이렇게 삽입된 형질전환 유전자는 후대 세포로 전달된다. 형질전환 유전자의 삽입은 표적 JAK2 내인성 유전자의 상류(upstream), 하류 또는 중심에서 이루어진다. 선택적으로, 하나 이상의 양성 또는 음성 선별 유전자가 사용될 수 있다. 또한, 표적 위치, 바람직하게는 삽입되는 완전한 유전자의 리포터 유전자 부위 또는 다른 말단 부위에 위치한 두 개 모두를 가진 DNA 상동 부위를 사용하는 것이 가능하다. "DNA 상동성 부위"는 최적의 정열 및 비교를 한 뒤에, 두 개의 DNA 서열이 일반적으로는 뉴클레오티드의 적어도 약 90 내지 95%, 바람직하게는 뉴클레오티드의 적어도 98 내지 99.5%에 대해 동일한 것을 의미한다. 비교하기 위한 최적의 서열 정열은 스미스-워터맨 로컬 호몰로지 알고리즘(Smith-Waterman local homology algorithm, 1981), 니들맨-운크 로컬 호몰로지 알고리즘(Neddleman-Wunsch local homology algorithm, 1970), 피어슨과 립맨의 유사 검색 방법(1988), 또는 이러한 알고리즘을 이용한 컴퓨터 소프트웨어(위스콘신 유전자 소프트웨어 패키지, 유전자 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, W1에 있는 GAP, BESTFIT, BLASTP, BLAST N, FASTA 및 TFASTA)를 이용해 수행된다. 비록, 100% 상동성을 갖는 매우 작은 14 bp 만으로도 박테리아 및 포유동물 세포에서 상동성 재조합을 수행하기에 충분하지만, 더 긴 상동 서열 부위도 바람직하다(일반적으로 이러한 부위의 크기는 상동 서열의 각 부위에 대해 적어도 2,000 bp이며, 바람직하게는 적어도 5,000 bp이다). 유용하게도, JAK 변이체 서열은 내인성 타입 조절을 지키는 인자의 그룹, 즉 적어도 내인성 JAK 유전자의 프로모터, 조절 서열(enhancers, silencers, insulators) 및 종결 신호를 포함하는 그룹 내에 삽입된다.
한 특정한 구현예에 따르면, 상기 형질전환 유전자 JAK G1849T는 적어도 상기 코딩 서열, 및 상기 리콤비나제의 작용에 대해 특이적인 위치에 의해 플랭크되거나 되지 않으며, 상기 서열의 5' 위치에 존재할 수 있는, 예를 들면 Lox/Neo-TK/Lox 카세트 또는 lox/Neo/lox 또는 FRT/Neo-TK/FRT 또는 FRT/Neo/FRT 카세트와 같은 양성 선별 카세트를 포함하며, 예를 들면 상기 DTA 및/또는 TK 유전자 또는 유전자들을 포함하는 음성 선별 카세트는 상기 형질전환 유전자의 말단 중 하나에 적어도 존재하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 형질전환 유전자는 바람직하게는 동물 세포에 원래 존재하는 외인성 DNA 서열로부터 직접 유래된다. 상기 자연 형의 DNA 서열은 예를 들면 클로닝하기 위해 필요한 제한효소 부위의 삽입 및/또는 위치-특이적 재조합 부위(lox 및 flp 서열)의 삽입을 통해 변형될 수 있다.
이러한 목적을 위해, JAK2 G1849T 변이체는 숙주 세포에서 증식할 수 있게 하는 클로닝 벡터, 및/또는 선택적으로는 형질전환 유전자를 발현시킬 수 있게 하는 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 본 발명의 클로닝 벡터 및/또는 발현 벡터를 만드는데 사용되는 재조합 DNA 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 표준 기술은 제조사의 방침에 따라 클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제; DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는 효소적 반응을 하는데 사용된다. 이러한 기술과 다른 것들은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al, 1989)에 따라 일반적으로 수행된다. 이러한 벡터들은 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 레트로바이러스 및 다른 동물 바이러스, YAC, BAC, HAC 및 다른 유사 벡터와 같은 인조 염색체를 포함한다.
본 발명의 형질전환 세포를 제조하기 위한 방법은 고돈 등의 문헌(Gordon et al, 1989)에 개시되어 있다. 포유동물 세포를 전달감염시키기 위한 다양한 기술이 케온 등의 문헌(Keon et al, 1990)에 검토되어 있다. 선형화되거나 비-선형화된 벡터에 선택적으로 포함되거나, 또는 벡터 절편의 형태로 존재하는 본 발명의 형질전환 유전자는, 예를 들면 핵으로의 미세주입(미국 특허 제4,873,191호), 칼슘 포스페이트 침전에 의한 전달감염, 리포펙션, 전기충격(electroporation)(Lo, 1983), 열충격, 양이온성 폴리머(PEG, polybrene, DEAE-Dextran)를 이용한 형질도입 또는 바이러스 감염(Van der Putten et al, 1985)과 같은 표준 방법을 이용해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다.
형질전환 유전자에 의해 세포가 형질전환되면, 이들은 시험관내(in vitro)에서 배양될 수 있으며, 또는 비-인간 형질전환 동물을 생산하는데 사용될 수도 있다. 형질전환 후에, 세포들은 영양층 및/또는 적합한 배지에 접종(seed)된다. 상기 구조체(construct)를 포함하는 세포들은 선별 배지를 이용해 검출될 수 있다. 콜로니가 성장하기에 충분한 시간이 지난 후에 이들이 수집되며, 상동성 재조합 및/또는 구조체의 삽입이 일어났는지 여부를 확인하기 위해 분석된다. 상동성 재조합을 만족하는 클론들을 선별하기 위하여, 양성 및 음성 마커들-이들은 선별 유전자로도 불림-가 상동성 재조합 벡터에 삽입될 수 있다. 상기 상동성 재조합 사건을 생성하는 세포들을 선별하기 위한 다른 시스템이 개시되어 있다(미국 특허 제5,627,059호 참조). 본 발명의 상기 양성 선별 유전자는 바람직하게는 항생제-내성 유전자 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 항생제 중에서, 비-제한적인 리스트로는 네오마이신, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신, 플레오마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 클로람페니콜, 카베니실린, 제네티신, 퓨로마이신을 포함한다. 이러한 항생제에 대한 내성 유전자들은 당업자에게 알려져 있다; 예를 들면, 네오마이신에 대한 내성 유전자는 배양 배지 내에 있는 G418 항생제의 존재 하에서도 세포가 내성을 띄게 만든다. 또한, 양성 선별 유전자는 대응되는 선별 제제가 히스티디놀(histidinol)인 HisD 유전자 중에서 선택될 수 있다. 또한, 양성 선별 유전자는 대응되는 선별 제제가 잔틴(xanthine)인 구아닌-포스포리보실-트랜스퍼라제(GpT) 유전자 중에서 선택될 수 있다. 또한, 양성 선별 유전자는 대응되는 선별 제제가 하이폭산틴(hypoxanthine)인 하이폭산틴-포스포리보실-트랜스퍼라제 유전자(HPRT) 중에서 선택될 수 있다. 선별 마커 또는 상동성 재조합을 확인하게 하는데 사용되는 마커는 그 결과로서 유전자 발현에 영향을 줄 수 있으며, 필요하다면 Lox 위치에 특이적인 Cre 리콤비나제(Sauer, 1994; Rajewsky et al, 1996; Sauer, 1998) 또는 FRT 위치에 특이적인 FLP 리콤비나제(kilby et al, 1993)와 같은 특정 위치 리콤비나제를 이용하여 제거할 수 있다.
양성 콜로니, 즉 적어도 하나의 상동성 재조합 사건이 일어난 세포를 포함하는 콜로니는 서던 블롯 분석 및/또는 PCR 기술에 의해 확인된다. 본 발명의 형질전환 동물의 분리된 세포 또는 세포에 존재하는, 형질전환 유전자에 상응하는 mRNA의 발현 레벨은 노던 블로팅, 인 시투(in situ) 혼성 분석, RT-PCR을 포함하는 기술에 의해 검출될 수 있다. 또한, 형질전환 유전자를 발현하는 세포 또는 동물 조직은 리포터 단백질에 대해 상응하는 단백질을 이용해 확인될 수 있다. 이후, 양성 세포들은 배아 취급(handling) 과정, 구체적으로는 상동성 재조합에 의해 변형된 세포의 배반포로의 주입을 수행하는데 사용될 수 있다.
마우스의 경우에 있어서, 배반포는 4 내지 6주령의 과배란된 암컷으로부터 얻어진다. 상기 세포들은 트립신 처리되며, 상기 변형된 세포들은 배반포의 할강에 주입된다. 주입 후, 배반포는 가임신된 암컷의 자궁 돌기로 삽입된다. 이후, 상기 암컷은 정상 임신기간이 다 차게 되고, 출산된 자손들은 상기 구조체를 포함하는 돌연변이 세포의 존재를 확인하기 위해 분석된다. 신생아 배아 세포 및 배반포 세포 또는 ES 세포간의 표현형의 차이는 키메라 신생아를 검출하는 것을 가능하게 한다. 이후, 키메라 신생아는 성체가 될 때까지 키운다. 키메라 또는 키메라성 동물은 세포의 오직 일부분이 변형된 게놈을 포함하는 동물이다. 변형된 유전자 또는 유전자들을 갖는 키메라 동물들은 일반적으로 이형 또는 동형 자손을 얻기 위해 서로간 또는 야생형 동물과 교배된다. 이후, 이형 수컷 및 암컷은 동형 동물을 생산하기 위해 교배된다. 달리 표시하지 않는 한, 본 발명의 비-인간 형질전환 동물은 생식 세포의 뉴클레오티드 서열에 안정적인 변화가 있는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 비-인간 형질전환 세포는 핵의 전달을 위한 핵 공여 세포(donor cell) 또는 핵 전달자로 사용될 수 있다. 핵 전달은 성체 또는 태아 척추동물의 살아있는 공여 세포로부터 유사 종 또는 다른 종의 핵제거된 수여 세포(receiver cell)의 세포질로 핵을 전달하는 것을 의미한다. 전달된 핵은 양모로 전달되어 태아와 신생아를 생산하게 하거나, 또는 배양액 내의 내부 세포 덩어리(inner cell mass)를 생산하는데 사용될 수도 있다. 다른 핵 클로닝 기술이 사용될 수 있으며; 이들은 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만 다음의 특허 출원에 의해 수행될 수 있다: WO 95/17500, WO 97/07668, WO 97/07669, WO 98/30683, WO 99/01163 및 WO 99/37143.
따라서, 본 발명은 JAK2 V617F를 코딩하는 재조합 서열을 포함하는 비-동물 형질전환 동물로도 확장된다. 이들 동물들은 동형 또는 이형일 수 있다(JAK2 V617F/JAK V617F 또는 JAK2 V617F/JAK2). 구체적으로, 상기 동물들은 바퀘즈 폴리글로불리아 뿐만 아니라 JAK2 V617F에 의해 유도되는 임의의 척수증식성 질환을 재생산한다. 따라서, 이들은 티로신 키나제 저해제를 기능적으로 스크리닝하기 위해, 특히 JAK2 V617F에 특이적인 저해제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
바이러스 벡터(레트로바이러스 또는 렌티바이러스 또는 그 외)를 주입하는 것을 포함하는 다른 대안은, 조혈 줄기 세포, 전구체 세포 또는 ES 세포에 있는 JAK2 V617F 변이체를 발현할 수 있으며, 또한 바퀘즈 폴리글로불리아 또는 다른 척수증식성 질환 모델을 만들 수 있다.
진단 수단
세 번째 특징에 따르면, 본 발명은 척수증식성 질환을 겪거나 이와 유사한 증세를 보이는 동물, 구체적으로는 폴리글로불리아를 가지고 있으며 바퀘즈 폴리글로불리아, 혈소판증가증 및/또는 골수섬유증의 증상을 가진 것으로 의심되는 환자의 JAK2 V617F 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 진단 수단에 관한 것이다.
이 경우, 본 발명은 상기에서 기술한 서열번호 2의 서열에 있는 돌연변이의 존재 및 부재를 검출하기 위한 프라이머와 프로브에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 12번 엑손의 적어도 10, 12, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 연속되는 뉴클레오티드(예를 들면, 10 내지 30 뉴클레오티드 또는 10 내지 25 뉴클레오티드) 또는 예를 들면 10 내지 30개 뉴클레오티드 중에서 돌연변이된 t1849 뉴클레오티드를 포함하는 하기 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 포함하는 분리된 핵산에 관한 것이다.
서열번호 3
밑줄 친 서열은 위치 1849에 있는 돌연변이에 특이적인 프로브 또는 프라이머의 디자인을 포함하는 상류 또는 하류의 예를 나타낸다(서열번호 4).
본 발명의 다른 바람직한
프라이머
및
프로브의
예
DNA
상의
PCR
프라이머
:
JAK2EXON12-PCRF 센스 5'-GGGTTTCCTCAGAACGTTGA-3' (54804-54823)(서열번호 5)
JAK2EXON12-PCRR 안티센스 5'-TTGCTTTCCTTTTTCACAAGA-3' (55240-55260)(서열번호 6)
DNA
상의 시퀀싱
프라이머
:
JAK2EXON12SEQF 센스 5'-CAGAACGTTGATGGCAGTTG-3' (54813-54832)(서열번호 7)
JAK2EXON12SEQR 안티센스 5'-TGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTT-3' (55207-55233) (서열번호 8)
cDNA
상의
PCR
및 시퀀싱
프라이머
:
센스 5'-CAACCTCAGTGGGACAAAGAA-3' (1386-1407)(서열번호 9)
안티센스 5'-GCAGAATATTTTTGGCACATACA-3' (2019-2041)(서열번호 10)
SNPS
프로브
및 돌연변이의 검출 및
siRNA
(1829-1870):
TTTTAAATTATGGAGTATGTGTCTGTGGAGACGAGAATATTC
LightCycler
상의
지노타이핑
(
PNN
또는 골수의
DNA
):
올리고 "S" (센스) GGCAGAGAGAATTTTCTGAAC (서열번호 15)
올리고 "R" (안티센스) GCTTTCCTTTTTCACAAGATA (서열번호 16)
센서 wt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA 3'FL (서열번호 17)
앵커 JAK2 5'-LC Red640AAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCT 3'-PH (서열번호 18)
LightCycler
상의 지노타이핑(예를 들면, 혈소판의
cDNA
)
cJAK2F GCACACAGAAACTATTCAGAGTC (서열번호 19)
cJAK2S AGCAGCAAGTATGATGAGC (서열번호 20)
cJAK2A CTAGTGATCCAAATTTTACAAACT (서열번호 21)
cJAK2R GTTTAGCAACTTCAAGTTTCC (서열번호 22)
센서 wt GTCTCCACAGACACATACTCCATAA3'-FL (서열번호 23)
앵커 JAK2 5'-LC Red640AAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCT3'-PH (서열번호 24)
TaqMan
기술을 이용한
지노타이핑
(예를 들면, 골수 단핵구 세포의
DNA
상).
알릴(allele) 및 단일가닥 DNA에 특이적인 형광 프로브를 이용한 확인.
PCR 반응
프라이머 서열 센스: AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT (서열번호 25)
프라이머 서열 안티센스: AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT (서열번호 26)
리포터 1 서열(VIC): TCTCCACAGACACATAC (서열번호 27)
리포터 2 서열(FAM): TCCACAGAAACATAC (서열번호 28)
다른 특징에 따르면, 본 발명은 샘플 내에 있는 JAK2 V617F의 존재 또는 부재를 검출하는 시험관내 또는 생체외(ex vivo) 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 핵산을 이용한 테스트
첫 번째 구현예에 따라, G1849T 변이체(JAK2 V617F 돌연변이에 상응함)는 JAK2 유전자의 핵산 분자 분석에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "핵산"은 mRNA, 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 유도된 cDNA를 의미한다.
G1849T 변이체 핵산의 존재 또는 부재는 상기에 기술한 바와 같은 서열번호 3 또는 서열번호 4 및 서열번호 5 내지 서열번호 11, 또는 추가로 서열번호 15 내지 서열번호 24로부터 유도되는 서열과 같은 특이적 프로모터 및 특이적 프라이머를 이용하여 시퀀싱, 증폭 및/또는 혼성화함으로써 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명은 PV를 앓고 있거나, 또는 PV 또는 임의의 다른 골수증식성 질환, 특히 적혈구증식증, 혈소판증식증 및 골수섬유증으로 진행되는 환자로부터 얻은 샘플 내에 있는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 결정하는 생체외 또는 시험관내 방법을 제시하며, 상기 방법은
a) 환자로부터 핵산 샘플을 얻는 단계; 및
b) 상기 핵산 샘플 내에 있는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 G1849T 변이체의 존재가 PV 또는 임의의 다른 골수증식성 질환을 나타내는 것을 특징으로 한다.
핵산 샘플은 임의의 세포 근원 또는 조직 생검(biopsy)으로부터 얻을 수 있다. 이러한 세포들은 조혈성 기원의 하나이며, 순환하는 혈액, 조혈성 조직 또는 혈액 세포로 오염된 임의의 유체로부터 얻어질 수 있다. DNA는 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al, 1998)에 개시된 방법과 같은 당해 분야의 임의의 공지된 방법을 사용하여 추출될 수 있다. 또한, RNA도 분리될 수 있는데, 예를 들면 생검하는 동안 얻어진 조직으로부터, 구아니디움티오페네이트-페놀-클로로포름에 의한 추출과 같이, 당업자에게 잘 공지된 표준 방법을 사용해 얻어질 수 있다.
JAK2 유전자의 G1849T 변이체는 RNA 또는 DNA 샘플에서 검출될 수 있으며, 바람직하게는 증폭 후에 검출될 수 있다. 예를 들면, 분리된 RNA는 돌연변이된 위치에 특이적이거나, 돌연변이, 예를 들면 엑손 12 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함하는 부위의 증폭을 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 RT-PCR 처럼, 증폭 후에 역전사될 수 있다. "올리고뉴클레오티드"라는 표현은 본 명세서에서 적어도 10, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드, 바람직하게는 100 이하의 뉴클레오티드의 핵산을 나타내며, 이는 JAK2의 게놈 DNA, cDNA 또는 mRNA에 혼성화될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 방사능, 형광 또는 효소적 표지와 같은 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용해 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 사용되는 프로브 및 프라이머는 1849 위치의(전사 시작을 표시하는 ATG로부터 숫자를 셀 때) 뉴클레오티드의 근처에 있는 JAK2 유전자 부위에 대해 특이적으로 혼성화한다.
상기에서 설명된 방법에서, 핵산은 대립형질 돌연변이의 검출 전에 PCR 증폭될 수 있다. 대립형질 돌연변이 검출 방법은 예를 들면 다음 문헌에 개시되어 있다; "Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Second Edition, Sambrook, Fritsh and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 및 Laboratory Protocols for Mutation Detection, Ed. U. Landegren, Oxford University Press, 1996, and PCR 2nd edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited 1997.
이러한 관점에서, 증폭 단계 다음에 검출 단계를 혼합하는 것은 찾아진 변이체의 존재 또는 부재와 관련이 있는 샘플 간의 식별을 가능하게 한다.
이러한 목적에 적합한 다른 기술로는 유럽특허 제 1 186 672호에 개시되어 있는 것과 같은 DNA 시퀀싱, SSCP, DGGE, TGGE 혼성에 의한 시퀀싱, 헤테로듀플렉스 분석, CMC, 효소적 미스매치 절단, 혼성 기초의 고형상 혼성, DNA 칩, Taqman™ 혼성 상(phase) 용액(미국 특허 제5,210,015호 및 미국 특허 제5,487,972호) 및 RFLP 기술이 있다.
검출은 FRET, 발광 퀀칭(quenching), 극성화된(polarised) 발광, 화학발광, 전기-화학발광, 방사능 및 비색법과 같은 다른 대안 방법을 이용해 수행될 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 사용된 샘플은 혈액 또는 임의의 다른 체액 또는 개체로부터 얻어진 조직이 될 수 있다. 핵산 추출 및 증폭 단계 후에, 상기에 기술된 프라이머를 이용한 PCR이 신호 검출을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 상기 프라이머에 의한 증폭 단계, 전술한 G1849T 돌연변이 부위에 상응하는 서열에 대해 매우 엄격한(stringency) 조건 하에서 혼성화하는 적어도 하나의 프로브, 바람직하게는 두 개의 프로브를 이용한 이후의 혼성화 단계, 및 상기 프로브의 표지자에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명은 구체적으로는 PV를 앓거나, PV 또는 임의의 다른 척수증식성 질환으로 진행되는 환자 샘플에 있는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 확인하는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체, 구체적으로는 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 23 및 서열번호 24에 특이적인 것 또는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)의 사용에 의해 상기 핵산 샘플에 있는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, G1849T 변이체의 존재는 PV 또는 임의의 다른 척수증식성 질환을 나타내는 것을 특징으로 한다.
SNP의 사용에 의한 이러한 검출은 알릴의 식별을 가능하게 하는 Taqman® 테크놀로지를 이용해 수행될 수 있으며, 이 방법은 단일 가닥 DNA 상의 JAK2의 알릴 1849에 특이적인 형광 프로브에 의한 인식, PCR 반응(5' 엑소뉴클레아제 활성을 가진 폴리머라제를 이용한), 혼성화된 SNP의 알릴에 특이적인 형광 방출의 검출, 종료점(end point) 발광의 판독(돌연변이된 동형, 이형 및 정상 DNA의 클러스터를 보여주는 이미지를 얻음)에 의한 유전자형의 확인을 포함한다.
돌연변이 단백질
JAK2
V617F
의 검출
다른 구현예에 따르면, 변이체는 JAK2 단백질 내에서 직접 검출될 수 있다.
이러한 목적에서, 본 발명은 PV 또는 임의의 다른 척수증식성 질환, 특히 적혈구증가증, 혈소판증가증 및 골수섬유증을 앓고 있거나 진행하고 있는 환자 유래 샘플 내의 상기 JAK2 V617F 변이체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 생체외 또는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계; 및
b) 상기 JAK2 V617F 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로 구성되며, 상기 변이체의 존재는 PV 또는 임의의 다른 척수증식성 질환을 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 JAK2 V617F 변이체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다.
보다 구체적으로, 개체로부터 얻어진 샘플은 JAK2 단백질의 V617F 변이체에 특이적인 항체, 예를 들면 V617F 변이체 및 비-돌연변이 JAK2 단백질(및 모든 다른 단백질) 간을 구분할 수 있는 항체와 접촉할 수 있다.
본 발명의 항체는 단일클론성 또는 다클론성 항체, 단쇄 또는 이중쇄, 키메라 또는 인간화된 항체 또는 항원 결합 절편[인간 절편, 인간 F(ab')2 및 F(v)]에 상응하는 당업계에 공지된 부분(portion)을 포함하는 면역글로불린 분자의 부분이 될 수 있다.
이러한 항체는 면역결합될 수 있으며, 예를 들면 독소 또는 마커와 결합될 수 있다.
다클론성 항체를 얻는 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 상기 항체는 전-면역 혈청을 얻기 위해 미리 준비한 흰색 뉴질랜드 토끼에 JAK2 V617F 변이체를 피하 주입함으로써 얻어질 수 있다. 항원은 6개의 다른 부위에 각 부위당 100 ㎕까지 주입될 수 있다. 첫 번째 주입하기 2주 전에 토끼를 준비하며, 이후 동일한 항원을 6주에 약 3회로 주기적으로 주입해 자극시킨다. 이후, 각 주입 후 10일 마다 혈청 샘플을 얻는다. 이후, 항체를 포획(capture)하는 JAK2 V617F 단백질을 이용한 친화 크로마토그래피에 의해 혈청으로부터 다클론성 항체가 정제된다.
단일클론성 항체는 높은 특이성으로 인해 다클론성 항체에 비해 더 바람직하다.
상기 단일클론성 항체를 얻는 방법은 JAK2 V617F 변이체가 야생형 JAK2 단백질과 다른 3D 구조를 갖는다는 것을 알고 있는 당업자가 수행할 수 있는 범위내에 있다. "단일클론성 항체"라는 표현은 항원의 에피토프(epitope)만을 인식할 수 있는 항체를 의미한다.
단일클론성 항체는 포유동물, 예를 들면 마우스, 래트 또는 다른 포유동물을 정제된 JAK2 V617F 변이체로 면역화시킴으로써 얻어질 수 있다. 항체를 생산하는 면역화된 포유동물 세포가 분리되며, 골수종 또는 이형-골수종 세포와 융합시켜 혼성 세포(하이브리도마)를 생산한다.
단일클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 항체의 생산 원천(source)으로 사용될 수 있다. 면역화를 포함하지 않는 항체를 생산하기 위한 기술도 본 발명과 관련이 있다. 예를 들면, "파지 디스플레이" 기술이 있다.
JAK2 V617F 변이체에 대한 항체는 어떤 경우에는 야생형 JAK2 단백질과 교차 반응하는 것으로 보여질 수 있다. 만약 이러한 경우라면, V617F 변이체에 특이적인 항체의 선별이 필요하다. 이 경우, 예를 들면 야생형 JAK2와 교차 반응을 보여주는 항체를 포획하는 야생형 JAK2 단백질을 이용하는 친화 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 JAK2 V617F 변이체를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 및 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 주(line)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 샘플에 있는 JAK2 V617F 변이체의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 상기 항체를 이용하는 ELISA 테스트에 관한 것이다.
항체를 사용하기 위한 하나의 대안은 예를 들면 특정한 분자의 인식을 가능하게 하는 분자 클래스인 햅타머(haptamer)를 준비하고 확인하는 것을 포함한다.
햅타머는 높은 친화도와 특이도로 임의의 표적 분자 클래스를 실질적으로 인식할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고펩타이드이다.
키트
다른 특징에 따르면, 본 발명은 환자가 바퀘즈 폴리글로불리아 또는 JAK2 V617F 변이체와 관련이 있는 다른 척수증식성 질환을 겪고 있는지 여부를 확인하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 JAK2 유전자에 있는 G1849T 돌연변이의 존재 또는 부재를 특이적으로 검출하기 위해 상기에서 정의한 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 포함한다.
또한, 상기 키트는 PCR 증폭을 위한 열 저항성 폴리머라제, 증폭 및/또는 혼성화 단계를 위한 하나 이상의 용액, 및 마커를 검출하기 위한 임의의 시약을 포함한다.
다른 구현예에 따르면, 상기 키트는 상기 정의된 바와 같은 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 키트는 혼성화 또는 고형 캐리어(carrier) 상에서의 면역학적 반응에 적합한 임의의 시약도 포함한다.
본 발명의 방법 및 검출 키트는 헤마토크릿 레벨이 51% 보다 높게 나타나는 환자의 일부-집단에 대해 유용하게 사용된다. 본 발명의 방법 및 키트는 450,000 이상의 혈소판 수치를 나타내는 환자의 일부-집단에 대해서도 유용하게 사용된다.
본 발명의
siRNA
네 번째 특징에 따르면, 본 발명은 위치 617에서 돌연변이된 JAK2, 보다 구체적으로는 JAK2 V617F의 발현을 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 이상 감소시킬 수 있는 siRNAs에 관한 것이다. 이러한 siRNA는 리포펙션, 형질도입 또는 전기충격에 의해 세포 또는 조직 내로 주입될 수 있다. 이들은 JAK2 V617F를 코딩하는 mRNA를 특이적으로 파괴함으로써 치료학적 적용을 가능하게 하며, 구체적으로는 바퀘즈 폴리글로불리아의 치료를 가능하게 하는데 사용될 수 있다. siRNA는 미국 특허 제60/068562호(CARNEGIE)에 기술되어 있다. 상기 RNA는 이중가닥(ds) 구조를 가진 부위를 갖는 것을 특징으로 한다. 저해는 표적 서열, 즉 적어도 25개 염기를 포함하고 표적 유전자의 부위에 대해 동일한 RNA ds 부위 중 한 가닥의 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적이다. RNA ds 부위의 다른 가닥의 뉴클레오티드 서열은 첫 번째 가닥의 서열 및 표적 유전자 부위에 대해 상보적이다. 또한, 국제출원 공개공보 WO 02/44321 (MIT/MAX PLANCK INSTITUTE)에서는 이중 가닥 RNA(또는 유사한 타입의 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드)의 각 가닥이 19 내지 25 뉴클레오티드 길이를 가지며, 유전자의 기능을 확인하고 세포 또는 몸 전체에서의 이런 기능을 조절 하기 위해 RNA 인터페이스 과정을 통해 표적 유전자의 전사후 발현을 특이적으로 저해할 수 있음을 개시한다. 마지막으로, 공개공보 WO 00/44895 (BIOPHARMA)는 시험관내에서 진핵 세포에 있는 표적 유전자의 발현을 저해하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 두 개의 분리된 단일 가닥 RNA로부터 형성된 dsRNA는 세포 내로 삽입되고, 표적 유전자에 대해 상보적인 부위를 갖는 dsRNA의 한 가닥은 적어도 25개의 연속적인 뉴클레오티드 쌍을 갖는 상보적 부위인 것을 특징으로 한다. 당업자라면 본 발명의 siRNA를 준비하기 위해 문헌에 포함된 내용을 참조할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 약 15 내지 30 뉴클레오티드, 19 내지 25 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 G1849T 돌연변이를 포함하는 서열번호 3의 서열에 대해 상보적(가닥 1)이고 동질적(가닥 2)인 약 19 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 RNA에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA는 3' 말단에 디뉴클레오티드 TT 또는 UU를 포함할 수 있다.
많은 프로그램이 본 발명의 siRNA를 디자인하기 위해 이용가능하다:
- "siSearch 프로그램" at:
http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.6.html
(Improved and automated prediction of effective siRNA", Cham1 AM, Wahlesdelt C and Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical research Communications, 2004).
- "SiDirect" at:
http://design.rnai.jp/sidirect/index.php
(Direct: highly effective, target-specific siRNA design software for mammalian RNA interference, Yuki Naito et al, Nucleic Acids Res, Vol.32, No Web Server Issue ⓒ Oxford University Press, 2004).
- 하기 주소에 있는 앰비온(Ambion)에 의한 "siRNA 표적 파인더"
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_tools.html.
- 하기 주소에 있는 MIT의 화이트헤드(Whitehead) 생물의학 연구소에 의한 "siRNA 디자인 툴"
http://jura.wi.mit.edu/pubint/http://iona.wi.mit.edu/siRNAext/.
다른 프로그램의 리스트는 다음과 같다:
- http://web.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAs.htm
특히:
http://athena.bioc.uvic.ca/cgi-bin/emboss.pl?_action=input&_app=sima
예를 들면, 서열 TATGGAGTATGTT1849TCTGTGGAGA (서열번호 12)에 대한 센스 siRNA는 UGGAGUAUGUUUCUGUGGAdTdT(서열번호 13)이고, 안티센스 siRNA는 UCCACAGA AACAUACUCCAdTdT(서열번호 14)이다.
보다 구체적인 구현예에서, 상기 기술된 본 발명의 siRNAs는 JAK2 V617F의 발현을 감소시키고, 심지어는 특이적으로 차단하며, 야생형 JAK2의 발현이 가능하게 할 만큼 적게 영향을 주는 능력에 대해 테스트되고 선별된다. 예를 들면, 본 발명은 JAK2 V617F의 발현의 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상을 감소시키고, 야생형 JAK2의 50%, 25%, 15%, 10% 또는 5% 이하, 또는 심지어 1% 이하를 감소시키거나 감소시키지 않게 하는 siRNAs에 관한 것이다.
예를 들면, 본 발명의 siRNA는 아래에 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다:
- UGGAGUAUGUUUCUGUGGA (서열번호 29)
- GGAGUAUGUUUCUGUGGAG (서열번호 30)
- GAGUAUGUUUCUGUGGAGA (서열번호 31)
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 특허 공개공보 WO 01/70949호(Benitec)에 개시된 일반적 방식이지만 JAK2 V617F를 특이적으로 표적하는 것과 같은 ddRNAi 분자에 관한 것이다. 본 발명의 ddRNAi는 JAK2 V617F를 코딩하는 서열의 연장을 가능하게 하고, (ⅰ) 서열번호 3 또는 11과 유사한 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)에 정의 된 서열에 상보적인 서열; (ⅲ) 상기 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 분리하는 인트론을 포함하며; 세포 또는 조직에 있는 이러한 구조체의 전달은 JAK2 V617F의 발현을 변화시킬 수 있는 RNA를 생산한다.
또한, 본 발명은 동물 내에 있는 JAK2 V617F의 발현을 차단, 지연 또는 감소시킬 수 있는 유전자 구조체를 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물에 관한 것이다. 상기 유전적으로 변형된 동물을 생산하기 위한 방법은 공개공보 WO 04/022748(Benitec)에 개시되어 있다.
스크리닝 방법
다섯 번째 특징에 따르면, 본 발명의 대상은 JAK2 V617F에 특이적인 저해제를 스크리닝하기 위한 방법이다.
"특이적 저해제"는 JAK2 상의 IC50/JAK2 V617F 상의 IC50의 비율이 5, 10, 25 이상이거나 심지어는 50 이상인 화합물을 의미한다. 예를 들면, 이 화합물은 JAK2 V617F 상의 IC50이 1 μM 미만, 바람직하게는 100 nM이지만, JAK2 상의 IC50은 5 μM 또는 10 μM 이상이다.
본 발명의 방법은 본 발명의 단백질, 상기 단백질을 포함하는 막 분획, 상기 단백질 또는 상기에 언급한 바와 같은 비-인간 형질전환 동물을 발현하는 세포를 이용하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 화합물에 의한 JAK2 V617F의 특이적인 저해를 확인하는 테스트에 관한 것이며, 이는 상기에 기술된 JAK2 V617F 단백질, JAK2 V617F를 포함하는 막 분획 또는 JAK2 V617F를 발현하는 세포를 이용하여 JAK2 V617F의 특이적인 고정 및/또는 저해를 고정 및 검출하기에 적합한 조건 하에서 하나 이상의 화합물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 방법은 야생형 JAK2 상으로의 고정을 측정하는 방법을 포함한다.
상기 방법은 몇 개 분자의 연속적인 테스트로 구성되며, JAK2 V617F에 대한 IC50이 1 μM 이하, 바람직하게는 100 nM인 분자를 선별하는 선별 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 JAK2에 대한 IC50이 5 μM 이하 또는 1 μM인 상기-언급된 분자의 음성 선별 단계를 포함한다.
본 발명은 면역침전이 JAK2 V617F의 저해된 인산화를 확인하는데 사용된, 상기 기술한 바와 같은 시험관내 스크리닝에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 에리트로포이에틴(Epo) 없이 분화할 수 있는 CD34-JAK2 V617F 전구체 세포 상에서의 생체내 스크리닝에 관한 것이다. 상기 세포는 바퀘즈 폴리글로불리아에 걸린 환자로부터 분리된다. CD34-JAK2 V617F 세포는 SCF 및 IL-3을 포함하는 배양 배지에 놓여질 수 있다. 화합물이 배양 배지에 첨가되고, 세포의 증식 능력이 측정되며, 36+/GPA-세포로의 분화 능력도 측정된다. 선별된 화합물은 36+/GPA-클론에서의 감소가 관찰된 것이다. 따라서, 본 발명은 에리트로포이에틴(Epo) 없이 분화할 수 있는 일차 CD34+ JAK V617F 전구체 세포를 이용하거나 JAK2 V617F 변이체의 도입을 통해 인자 비의존적이 되는 세포주를 이용하는 상기 스크리닝 방법에 관한 것이다. 유사한 형태의 테스트가, 자발적 콜로니 성장의 저해와 관련이 있는 화합물을 직접 테스트하는 반-고형 배지에서 CFU-E 타입 골수 배양으로 수행될 수 있다.
또한, 재조합 JAK V617F를 발현하는 상기에 기술된 임의의 포유동물 세포주를 이용하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은 후보 의학적 산물을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 바퀘즈 폴리글로불리아를 재생성하고 및/또는 JAK2 V617F의 존재와 연관된 척수증식성 질환을 갖는, JAK2 V617F를 발현하는 상기에서 언급된 바와 같은 비-인간 형질전환 동물에 화합물을 투여하는 단계, 및 화합물의 효과를 확인하고, 바퀘즈 폴리글로불리아에서 적아세포의 증식 및 자발적인 분화를 감소 또는 차단하거나, JAK2 V617F의 존재와 관련이 있는 세포 증식의 감소를 초래하는 것으로 보이는 후보 의학적 산물을 선별하는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 JAK2 V617F K-in 마우스 또는 JAK2 V617F K-in 래트를 이용해 수행된다.
이러한 화합물들 중에서는, 예를 들면 상기에 기술된 바와 같은 JAK2의 돌연변이된 엑손 12를 표적으로 하는 siRNA, 보다 구체적으로는 돌연변이된 t1849 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 11의 서열을 표적으로 하는 siRNA도 언급된다.
본 발명의 또 다른 특징은 상기 언급된 siRNAs 또는 ddRNAi, 및 JAK2 V617F를 특이적으로 저해하여 의학적 산물을 생산하는 화합물의 용도에 관한 것이다. 상기 의학적 산물은 구체적으로는 혈액암, 특히 바퀘즈 폴리글로불리아, 특발성 혈소판증가증, 골수성 비장비대증 또는 미발달(primitive) 골수섬유증 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 척수증식성 질환을 치료하기 위해 고안된다. 또한, 상기 의학적 산물은 JAK2 V617F 돌연변이와 관련이 있는 다른 악성 혈구세포증(hemopathy), 선택적으로는 JAK2 V617F를 발현하는 고형 종양, 암종, 흑색종 및 신경아세포종을 치료하기 위해 고안된다.
명세서의 나머지 부분 및 실시예를 위하여, 참조로서 도면에 대한 설명이 하기에 기술된다:
도 1은 PV 환자에 있는 JAK2의 핵심 기능의 발견을 나타낸 것이다. 기저 상태에서, JAK2는 비-인산화 상태에 있는 박스 1에 고정된다. Epo로의 결합은 수용체의 형태를 변화시키고, JAK2의 트랜스인산화를 가능하게 하며, 이것은 다시 Epo-R의 세포질내 잔기를 인산화시켜서, 신호 전달시 상이한 양성(->) 또는 음성(-|) 이펙터(effector)를 모집(recruit)한다.
도 2는 에리트로포이에틴-의존적인 PV CD34+ 전구체의 배양 모델 디자인을 나타낸 것이다.
2의 A - Epo, SCF 및 IL-3로 배양
2의 B - Epo 없이 배양
도 3은 JAK-STAT, Pi3-K 및 Src 키나제 경로의 저해가 적혈구의 분화를 억제하는 것을 보여준다.
도 4는 PV 전구체에서의 JAK2 저해 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 5는 PV 전구체에서의 JAK2 저해 결과를 나타낸 것이다.
5의 A - 36+/gpa-의 클로닝 능력의 감소. SCF-IL3에서 D1-D6 배양, D5 전기충격, D6 분류(sorting)(morpho/36/gpa-).
메틸 SCF 단독. D13 (D7 포스트-분류)에서의 계수.
5의 B - V617F 돌연변이(엑손 12)를 가진 JAK2의 구조.
도 6은 LightCycler® 및 TaqMan® 기술을 이용한, 게놈 DNA 내의 JAK2 V617F 돌연변이를 검출하기 위한 SNP의 유전자형 분석을 나타낸 것이다.
A 및 B: FRET 혼성화 프로브를 이용한 LightCycler®의 융합 분석 커브에 의한 돌연변이의 검출. A: DNA TF-1에 있는 HEL DNA의 다양한 희석을 이용한 실험이 나타나 있다. 피크 JAK2 V617F(57°)는 1% 희석에서 여전히 검출된다. B: 표시된 환자 샘플의 결과(#1: 동형접합; #2: 이형접합; #3: 경증; #4: 비-돌연변이됨).
C: TaqMan® 알릴 특이적 증폭에 의한 돌연변이의 검출. HEL DNA의 희석을 이용한 실험(HEL 100에서 1%: 빈 정사각형; TF-1 세포: 빈 원) 및 소량의 표시된 환자 샘플이 나타나 있음(검은색 교차). #a: 동형접합 환자; #b: 이형접합 환자; #c: 경증 환자; #d: 비-돌연변이 환자.
도 7은 적혈구증가증을 진단하기 위한 제안된 진단 데이터시트(즉, 51% 이상의 헤마토크릿 레벨)를 나타낸 것이다.
데이터시트의 각 단계에 있는 것으로 여겨지는 환자의 수는 다음의 각 아이템(n)에 대해 기록되어 있으며, 이들 환자만이 여기에 리스트된 모든 임상적 데이터를 보여준다(n=81). 맨 먼저 고려되어야 하는 진단 테스트로서 JAK2 V617F의 검출은 PV 타입 척수증식성 질환을 진단하기 위한 다른 연구를 수행함으로써 58/81 환자를 예방하게 되었다.
도 8 및 도 9는 HEL 세포에 있는 V617F Jak2의 발현이 siRNA 특이적 JAK2 V617F Jak2(siRNA #1, 3 및 4)로 처리하고 난 24시간 후에 감소한 것을 보여준다.
0 내지 6: siRNA V617F Jak2로 처리(1 내지 6) 또는 비-처리된(0) HEL 세포.
C+: V617F Jak2RV 벡터로 전달감염된 293HEK 세포.
C-: 293 HEK.
도 10은 K562 세포에서 발현된 WT Jak2 발현 레벨이 Jak2 V617F에 특이적인 siRNA로 처리하고 난 24시간 후에도 변하지 않은 채로 유지되는 것을 보여준다.
Je: siRNA WT Jak2로 처리된 K562 세포.
0 내지 6: siRNA V617F Jak2로 처리된 K562 세포.
C-: 293HEK (JAK2 비 발현).
실시예
1: 39/43
환자에서의
JAK2
V617F
돌연변이의 확인
병리학적 전구체 세포 배양 모델의 디자인 및 생화학적 억제제의 이용은 본 발명자들이 JAK2-STAT5, P13 키나제 및 Src 키나제 경로가 PV 전구체의 Epo-비의존적인 분화에 필요하다는 것을 확신하도록 하였다(Ugo et al 2004). 상기 결과는 지속적인 활성을 일으키는 티로신 키나제의 돌연변이와 마찬가지로 PV를 초래하는 1차적인 분자적 손상이 신호 경로의 탈조절(deregulation)을 이끄는 핵심 단백질의 이형이 될 수 있다는 본 발명자들의 가설을 재보증하였다. 그럼에도 불구하고, 이들 다른 신호 경로의 최상류에 위치하는 단백질로서, PV에서 반응 이형이 보고되어 있는 사이토카인 수용체의 신호 경로에서 공통적인 JAK2 단백질에 의해 행해지는 주된 역할을 확인하는 것이 가능하게 만든 것은 바퀘즈 폴리글로불리아를 앓고 있는 43명의 환자들에 대한 연구에서 이다. 본 발명자들은 2가지 상보적인 접근을 취하면서 PV의 생리병리학에 있어서의 JAK2 단백질 키나제의 연관성을 조사하였다.
- 기능적 접근(간섭 RNA에 의한 PV 세포에서의 JAK2의 억제)
- 게놈적 접근(상기 유전자의 23개 엑손의 시퀀싱)
- 지속적인 활성의 원인인 JAK2 인산화 이형을 찾기 위한 생화학적 접근.
사용된 생물학적 물질은 폴리글로불리아를 앓고 있는 동의된 환자로부터 유래되었고, 진단 목적으로 취해진 샘플의 잔기와 대응하며, 호텔 디에우(Hotel Dieu) 중앙 혈뇨학(haematology) 연구실 또는 치료 사혈(phlebotomy)로 보냈다.
1.1 기능적 연구
바퀘즈 폴리글로불리아 환자의 적아세포에서의 JAK2의 기능 연구는 JAK2 mRNA의 15번 엑손 상에 위치한 표적 서열을 인식하는 JAK2 서열에 특이적인 siRNA (AMBION, Huntingdon, England)를 PV 적아세포에 형질전환시키기 위해 전기충격을 사용하여 수행하였다. 본 발명자들은 JAK2를 억제하면 Epo의 부재시에 클로닝 능력 및 PV 전구체의 "자발적" 분화가 감소된다는 것을 보였다. siRNA JAK2로 전달감염된 정상 적아세포 전구체는 클론형성 잠재력(clonogenic potential)이 대조군 siRNA와 비교할 때 70% 감소한 것을 보여주며, 이것은 siRNA JAK2 전달감염의 효능을 확인해 준다. PV에서, 적아세포 전구체에서 JAK2 억제 효과는 Epo가 제거된 배 지 모델에서 연구되었으며, 이것은 악성 클론의 세포를 연구하는 것을 가능하게 한다. 본 발명자들은 siRNA JAK2로 전달감염시킨 후에 대조군 siRNA에 대한 PV 적아세포 전구체의 클론형성 잠재력, 아폽토시스 및 분화를 비교하였다. Epo 없이 배양된 PV 전구체의 클론형성 잠재력 연구는 대조군 siRNA와 비교할 때 siRNA JAK2의 전달감염 후에 콜로니의 수가 매우 현저하게 줄어든다는 것을 보여준다. 이들 세포의 아폽토시스의 유세포분석은 비-해당 siRNA와 비교할 때 siRNA JAK2로 전달감염된 세포의 아폽토시스가 현저하게 증가한 것을 보여준다(70% 대 53%). 분화에 대한 siRNA JAK2의 효과 연구에서만 siRNA JAK2로 전달감염된 전구체와 대조군 siRNA 사이에 약간의 차이를 보인다.
따라서, 세포 연구 결과는 JAK2가 PV 적혈구 전구체의 Epo-비의존적 분화에 필요하다는 것을 보여준다. 초기 생화학적 연구(면역침전) 결과는 보통 세포와 비교할 때 PV 적혈구 전구체 사이토카인이 제거된 후 JAK2가 더 많이 인산화된다는 것을 보여준다.
1.2
JAK2
의 게놈 연구
23번 엑손에 대한 PCR이 정상 개체의 게놈 DNA 상에서 세팅되었다. 이후, 본 발명자들은 세포 배양 후 시험관내에서 얻은 적혈구 세포로부터 게놈 DNA를 추출한 후 PV를 앓고 있는 3명의 환자들을 조사하였다.
본 발명자들은 테스트한 3명의 환자 중 2명에게 존재하는 JAK2의 12번 엑손내에 위치한 점 돌연변이를 확인하였다. 상기 돌연변이는 코딩 서열의 1849번째 염기(ATG에서 번호가 시작됨, 진뱅크 NM_004972)에 해당하며, JAK2 단백질의 코돈 617을 변형시킨다(V617F).
- 정상 617 코돈: 발린(V)을 코딩하는 gtc
- 돌연변이된 617 코돈: 페닐알라닌을 코딩하는 ttc
인터넷에 공개된 데이터베이스를 이용하여, 본 발명자들은 알려지지 않은 다형성(polymorphism)인 것을 확인하였다.
이후, 본 발명자들은 코호트(cohort)를 확대하였다. 지금까지 상기 돌연변이는 테스트한 43명 가운데 PV를 갖는 39명의 환자에서 발견되었다. 대조군(15명 테스트) 또는 2차 폴리글로불리아를 갖는 환자(18명 테스트)는 상기 돌연변이를 갖지 않는 것으로 나타났다.
환자에서의
시퀀싱 결과
- 39 돌연변이/테스트된 43 PV(90%)
- 2/3 이형접합체(heterozygote)
- 13/39 "동형접합체", 즉 증례의 30%(9p에서의 이형접합성(heterozygosity)의 상실과 동일한 비율)
대조군
- 테스트한 33명의 대조군에서 1명의 돌연변이 증례
- 15명의 정상 개체 및 18명의 2차 폴리글로불리아 포함(자발적 콜로니 없음)
이러한 JAK2 이형의 발견은 PV에 관여하는 많은 성장 인자(Epo, TPO, IL-3, IL-6, GM-CSF, 인슐린)에 대한 과민성(hypersensitivity)을 설명한다. 실제로, JAK2는 이들 사이토카인 수용체의 신호 경로에 관여하는 단백질이다.
또한, JAK2와 R-Epo의 연관성은, JAK2가 E-Epo에 지속적으로 결합되어 있다는 점에서 특별하다: 골지체에서 시작되는 상기 JAK2/R-Epo 연관성은 적아세포 막에서의 R-Epo의 가공을 위해 필요하다. 따라서, JAK2와 R-Epo를 연관시키는 변형의 원인이 되는 JAK2 이형은 적아세포주 상의 수질 과형성 우세함(medullary hyperplasia predominance)을 설명할 수 있으며, 반면 상기 단백질은 많은 신호 경로에 관여하고 있다. 또한, 몰리테르노 등(Moliterno et al, 1998; Moliterno and Spivak, 1999)은 글리코실화 결함과 관련이 있는 mp1의 잘못된 막 발현을 증명하였다. R-Epo와 유추함으로써 JAK2가 c-mpl의 가공에 필요하다는 것이 가능하다. 이후, JAK2의 이형은 PV에서 발견되는 c-mpl의 막 발현 부재를 설명할 수 있다.
JAK2는 그의 가까운쪽 도메인인 매우 보존된 도메인 Box2에서 R-Epo와 결합한다. Epo 자극이 없을 때, JAK2는 지속적으로 비인산화된 형태로 R-Epo와 결합하고 있으며, 따라서 비활성이다. Epo에 의해 상기 수용체가 자극되면, 상기 2개의 JAK2 분자는 인산화되고, 따라서 R-Epo를 인산화시켜서 STAT5, Grb2, P13K 단백질과 같은 신호 전달에 관여하는 다른 단백질의 인산화 모집을 가능하게 한다. 상기 JAK2 단백질은 모든 JAK와 마찬가지로 JAK 패밀리 멤버의 특징인 기능적 키나제 도메인(JH1), 티로신 키나제 활성이 없는 유사-키나제 도메인(JH2) 및 몇 개의 보존적 도메인(JH3-JH7)을 갖고 있다. 상기 JH2 도메인은 JAK2의 티로신-키나제 활성 조절에 관여하는 것으로 보인다. 이용가능한 JAK2 단백질 맵핑 데이터(Lindauer, 2001)에 따르면, 아미노산 617은 상기 JH2 도메인에 위치하며, 모델링 연구 결과 키나제 활성 조절에 특히 중요한 영역에 위치한다.
이러한 발견의 생리병리학적 관심(사이토카인-비의존적인, 다른 SMP의 고장(breakdown) 메카니즘의 이해) 이상으로, 환자에서의 이러한 돌연변이의 증거는 처음으로 진단을 확인할 수 있는 테스트를 제공한다. 의학적인 진단의 관점에서, JAK2 돌연변이에 대한 연구는 상기 악성 클론에 속하는 다핵성 호중성 백혈구에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 돌연변이 단백질에 특이적인 키나제 억제 타입의 특이적인 치료의 결정, 또는 유전자 치료를 제공한다.
실시예
2.
적혈구증가증의
맨 먼저 고려되어야 하는 진단을 위한
JAK2
V617F
돌연변이체의 검출
2.1. 환자, 물질 및 방법
시퀀싱과
JAK2
V617F
검출을 위한
SNP
유전자형의 2가지 기술 간의 비교
환자의 세포
MPD로 의심되는 119개의 샘플을 분석하였다(즉, 적혈구증가증, 혈소판증가증, 과다백혈구증가증). 원근 분석(perspective analysis)을 위해 58개 샘플을 취하였고, 61개의 골수의 문서 샘플을 회고적으로(retrospectively) 분석하였다.
말초 과립구를 제조사(Eurobio, France)의 지침에 따라 밀도 기울기 방법을 이용하여 분리하였다. 단핵구 세포는 피콜 밀도 기울기 원심분리를 이용하여 골수 로부터 분리하였다. 게놈 DNA는 표준 방법에 따라 추출하였다. LightCycler® 및 Taqman® 기술의 민감성을 결정하기 위하여, 최소 잔류 야생형 알릴을 갖는 동형접합체 샘플 유래의 DNA를 정상 DNA에서 연속적으로 희석시켰다.
세포주
표준 양성 대조군인 TF-1 세포주(비-돌연변이) DNA 내에서 동형접합체 방식으로 돌연변이된(JAK2 V617F) 인간 적백혈병(erythroleukaemia) 세포주(HEL) 유래의 연속적인 DNA 희석액(1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01)을 사용하였다. 상기 세포주는 우태아혈청(fetal calf serum)이 첨가된 MEM-알파 배지(Invitrogen)에서 성장시켰다.
LightCycler
와
FRET
혼성화
프로브의
융합 커브 분석에 의한 돌연변이의 검출
JAK2의 12번 엑손의 표적 서열을 증폭 및 혼성화하기 위한 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 상기 돌연변이 부위(1849G/T)의 위치는 3'에 형광 표지된 공여 포획(donor capture) 프로브로 커버하였고, 인접한 억셉터 앵커(acceptor anchor) 프로브는 그 5' 말단에 LightCycler® 레드 640(LCRed640)으로 표지하였다: 그 3' 말단은 연장(extension)을 피하기 위해 인산화시켰다. 융합된 커브의 증폭 및 분석은 LightCycler® 장치(Roche Diagnostics, Meylan, France) 상에서 수행하였다. 최종 반응 부피는 20 ㎕ 였으며, 10 ng의 DNA, 14 ㎕의 LightCycler FastStart DNA Master 혼합물, 3 mM의 MgCl2, 0.2 μM의 프라이머, 0.075 μM의 각각의 프로브를 사용하였다. 간략하게 말하면, 상기 샘플을 95℃에서 10분간 가열하였고, 45회 PCR 증폭(95℃에서 10초, 53℃에서 10초, 72℃에서 10초)한 후, 95℃에서 10초, 63℃ 및 45℃에서 각각 30초간 2회의 혼성화 단계 및 45℃ 및 70℃(0.1℃/초) 사이에 놓여있는 도메인에 위치하는 융합 커브를 수행하였다. 온도에 대해 상기 형광 유도체의 커브를 그림으로써(2(dF12/F11)/dt) 대 T) LightCycler® 프로그램 분석을 수행하였다. 돌연변이 피크 및 WT은 각각 57℃ 및 63℃에서 관찰되었다.
TaqMan
을 이용한
알릴의
특이적인 증폭에 의한 돌연변이의 검출
1849 위치에서의 SNP를 포함하는 92 bp의 산물을 증폭하기 위해 2개의 프라이머를 디자인하였다. 하나는 WT 알릴을 표적으로 하고 다른 하나는 돌연변이 알릴을 표적으로 하며, 상이한 형광 발색제를 갖는 2개의 형광 MGB 프로브를 디자인하였다. 유전자형 분석은 Taqman® PCR에 기초한 방법을 이용하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 최종 반응 부피는 12 ㎕ 였으며, 10 ng의 게놈 DNA, 6.25 ㎕의 TaqMan® Universal Master 혼합물 및 0.31 ㎕의 40X Assays-on-Demand DNP 유전자형 분석 혼합물(Applied Biosystems)을 사용하였다. 상기 플레이트를 95℃에서 10분간 가열하였고, 이후 92℃에서 15초 및 60℃에서 1분간 매칭/연장을 40회 변성하였다. 열순환(theremocycling)은 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems) 상 에서 수행하였다. SDS 프로그램 버전 1.3을 이용하여 분석을 수행하였다. 종료점 알릴 식별의 유전자형은 PCR 후 형광 판독으로부터 생성된 돌연변이 JAK2의 형광 커브(Rn)에 대한 WT 프로브로부터 유래된 Rn의 시각 테스트에 의해 수행하였다.
적혈구증가증을
갖는 환자 및 샘플 수집
본 발명자들은 어떤 형태의 치료도 하기 전인 진단 시점에서의 헤마토크릿 레벨이 51% 이상인 88명의 환자들을 평가하였으며, 본 발명자들은 WHO 및 PVSG 규범의 존재를 연구하였다. 51% 수치는 헤마토크릿 레벨에서의 정상 범위의 상한값으로 선택하였다(Pearson TC et al, Polycythemia Vera Updated: Diagnosis, Pathobiology and Treatment. Hematology (AM. Soc. Hematol. Educ. Program.) 2000: 51-68). 클론형성 분석을 위해 골수 세포를 수집하였고, DNA 추출을 위해 과량의 세포를 수집하였다. 혈청 에리트로포이에틴(Epo)은 다른 실험실에서 측정하였으며, 따라서 각 실험실에서의 정상 도메인의 낮은 값 이하일 때 낮음으로 보고하였고, 정상 및 높음도 마찬가지다. 동일한 환자로부터 유래된 말초 과립구를 전술한 방법대로 정제하였고, 매번 혈색 샘플을 이용하였다. 골수 및 혈액 샘플은 동의를 받은 후 수집하였다.
EEC
분석
적혈구 Epo-반응의 시험관내 분석은 모두 종래 공지된 방법(Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoietin in a patient with pure red-cell aplasia. N. Engl. J. Med. 1996; 334: 630-633)에 따라 혈장-응고 배양 기술을 이용하여 동일한 실험 실(Hotel Dieu, Paris) 내에서 수행하였다.
통계학적 분석
마커들간의 상관관계는 스피어만 랭크 상관관계 계수(R)를 이용하여 만들었다.
2.2. 결과
돌연변이
JAK2
V617F
의 검출을 위한
PCR
에 기초한 유전자형 기술의 실행가능성(
feasibility
) 및 민감성
JAK2 V617F 돌연변이의 검출을 위한 시퀀싱, LightCycler® 및 Taqman® 기술의 효능을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 상기 3가지 기술을 나란히 사용하여 MPD를 갖는 것으로 추정되는 환자로부터 취한 119개의 샘플에서 그 존재를 조사하였다. 상기 JAK2 V617F 돌연변이는 83/119 샘플에서 효율적으로 검출되었고, 35개의 샘플은 3가지 기술 중 어디에서도 돌연변이로 나타나지 않았다. 단지 하나의 샘플에서만 시퀀싱이 다른 2가지 기술인 LightCycler® 및 Taqman®에 의해 밝혀진 돌연변이를 검출하는데 실패했는데, 이것은 후자가 더 민감할 수 있음을 제시한다.
상기 기술의 민감성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 2가지 다른 방법을 사용하였다: 본 발명자들은 비-돌연변이 TF-1 세포주 DNA 내에서 동형접합체 돌연변이를 갖는 HEL 세포주 DNA의 순차적인 희석액과, 정상 DNA 내에서 돌연변이 JAK2 V617F에 대해 동형접합체인 환자로부터 유래된 게놈 DNA의 순차적인 희석액을 테스 트하였다. 시퀀싱은 TF-1 세포주 DNA 내에 희석된 HEL 세포주의 DNA를 5% 갖는 돌연변이 알릴, 및 정상 DNA 내에 희석된 동형접합체 돌연변이를 갖는 환자 유래 DNA를 10% 갖는 돌연변이 알릴을 검출하는데 실패하였다. LightCycler® 및 Taqman® 기술의 민감도는 동일했고, 시퀀싱보다는 약간 나았으며, TF-1 세포주의 DNA 내에 희석된 HEL 세포주 유래의 DNA는 0.5 내지 1%에 이르렀고(도 6), 정상 DNA에 희석된 동형접합체 돌연변이를 갖는 환자 유래의 DNA는 2 내지 4%에 이르렀다.
진단 시점에서
적혈구증가증을
갖는 환자의 특성
진단 시점에서 51% 이상의 헤마토크릿 레벨을 갖는 88명의 환자의 주요 특징이 표 1에 요약되어 있다.
WHO 규범 | PVSG 규범 | WHO 및 PVSG 규범 | ||||
PV n=61 |
특발성 적혈구증가증 n=11 |
PV n=45 |
특발성 적혈구증가증 n=21 |
2차 적혈구증가증 n=5 |
Hct>50% no AE n=3 |
|
성비 (남성/여성) |
38/23 | 11/0 | 28/17 | 18/3 | 4/1 | 3/0 |
평균 연령 (도메인) |
61 (23~92) |
57 (24~81) |
58 (23~92) |
60(53~81) | 65(55~77) | 48.6 |
평균 Ht(%) ±σ |
59±4.6 | 54.6±1.44 | 59.2±4.5 | 57.8±4.2 | 55.8±3.1 | 53.3±0.8 |
평균 Hb (g/㎗)±σ |
19.2±1.39 | 18.3±0.34 | 19.3±1.41 | 19±1.0 | 18.9±0.8 | 18.6±0.5 |
평균 WBC (×/109)±σ |
12.2±4.4 | 7.0±2.5 | 13.5±4.9 | 8.2±2.5 | 8.8±1.9 | 6.6±0.4 |
평균 혈소판수 (×/109)±σ |
463±148 | 212±38 | 503±149 | 245±60.4 | 212±29 | 175±19 |
Splenomegalia | 16/55 | 0/11 | 14/39 | 0/21 | 0/5 | 0/3 |
EEC의 존재 | 59/60 | 1/11 | 43/44 | 11/21 | 0/5 | 0/3 |
낮은 Epo 레벨 | 39/47 | 2/8 | 27/33 | 10/17 | 0/3 | 1/1 |
정상 Epo 레벨 | 8/47 | 6/8 | 6/33 | 7/17 | 3/3 | 0/1 |
세포유전학적 이형 |
7/32 | 0/3 | 6/23 | 0/7 | nd | 0/1 |
양성 JAK2 V617F |
57/61 | 0/11 | 43/45 | 8/21 | 0/5 | 0/3 |
51% 이상의 헤마토크릿 레벨을 갖는 88명의 환자들은 4개의 그룹으로 나누어 PVSG 및 WHO 규범에 따라 진단하였다: 바퀘즈 질환(PV), 특발성(idiopathic) 적혈구증가증, 2차 적혈구증가증 및 적혈구 중량이 증가되지 않은 것으로 측정되었을 때 "절대적인 적혈구증가증이 없음"(no AE). 8명의 환자는 몇 가지 임상적인 데이터가 이용가능하지 않았기 때문에 어떠한 명확한 진단도 하지 않았다. Hct: 헤마토크릿; Hb: 헤모글로빈; WBC: 백혈구; EEC: 내인성 적혈구 콜로니; Epo: 에리트로포이에틴; σ: 표준 편차. 상기 환자들은 WHO 규범(Pierre R et al, editors, World Health Organization Clissification of Tumors; Pathology and Genetics of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. Lyon; IARC Press: 2001: 31-34) 및 PVSG 규범(Pearson TC, Messinezy M. The diagnostic criteria of polycythaemia rubra vera. Leuk Lymphoma 1996; 22 Suppl 1: 87-93)에 따라 4가지 주된 그룹으로 나누어질 수 있었다: 61명 및 45명의 환자는 PV로 진단되었고, 5명은 2차 적혈구증가증, 11명 및 21명은 특발성 적혈구증가증 및 3명은 절대적인 적혈구증가증이 없음(정상 적혈구 질량)으로 나타났다. 상기 임상 데이터는 7명의 환자의 경우에는 불완전하였으며, 이것은 PV 진단이 WHO 규범 또는 PVSG 규범 중 어느 것으로도 확인될 수 없다는 것을 나타낸다. 상기 두 가지 분류의 A1 규범 간의 차이 때문에, 적혈구 중량을 측정하지 않은 6명의 환자는 WHO 분류로 분류될 수 있었지만 PVSG 분류로는 할 수 없었다. 1명의 환자는 산소결핍(hypoxia) 및 EEC 형성 모두를 보였으며, 이것은 진단을 어렵게 만들었다. 세포유전학적 분석을 35명의 환자에서 수행하였다; 32명의 PV 환자들(WHO 규범) 중에서, 7명은 세포유전학적 이형을 보였다: 5명은 3염색체성(trimsomy) 9, 1명은 7q- 및 1명은 염색체 18번에 추가 물질이 있었다.
JAK2
V617F
의 존재는
PV
에 대한
PVSG
및
WHO
규범에 부합한다.
JAK2 V617F는, PVSG 규범에 따르면 PV로 진단된 환자의 43/45(96%)에 존재하고, WHO 규범을 사용하면 57/61(93%)의 환자가 진단되었다(표 1). 그럼에도 불구하고, PVSG 규범에 따라 비-PV로 분류된 8/29 환자가 상기 돌연변이를 보였으며, WHO 비-PV 환자의 경우에는 아무도 없었다. SE로 진단된 환자 및 정상 적혈구 중량을 갖는 환자("no AE")는 아무도 돌연변이를 갖지 않았다. 따라서, JAK2 V617F의 존재 또는 부재는 WHO 규범에서는 양성 PV 진단된 76/80 환자(95%, R=0.879, p<0.0001), PVSG 규범에서는 64/74 환자(86.5%, R=0.717, p<0.0001)와 부합하였다.
아울러, WHO 규범에 따라 비-PV로 진단된 환자에서는 아무도 돌연변이를 보이지 않았기 때문에, JAK2 V617F의 검출은 절대적인 적혈구증가증의 맥락에서 100% 확실한 가치를 갖는다.
몇몇 저자들(Mossuz P et al, Diagnostic value of serum erythropoietin level in patients with absolute erythrocytosis. Haematologica 2004; 89; 1194-1198)은 절대적인 적혈구증가증을 갖는 환자를 위해 맨 먼저 고려되어야 하는 진단 테스트로 혈청 에리트로포이에틴 레벨 측정을 고려하고 있으며, Epo 레벨이 정상 범위의 하한 값 아래에 있다면 PV 진단에 대해 97%의 특이성과 97.8%의 예측 값을 갖는다. 본 연구에서, WHO 및 PVSG 규범에 따른 Epo 레벨과 PV 진단 사이의 상관관계는 각각 50/61(82%, R=0.488, p=0.0002) 및 39/56(70%, R=0.358, p=0.0067) 환자에서 관찰되었다. 이후, 본 발명자들은 V617F JAK2의 존재 또는 부지시의 혈청 Epo 레벨을 비교하였으며, 52/68 환자(76%, R=0.416, p=0.0004)에서 정확한 상관관계가 나타났다.
JAK2 V617F 돌연변이의 존재는 EEC를 형성하는 능력과 부합된다.
3개의 다른 팀이 JAK2 V617F로 전달감염된 Epo-의존적 세포주가 그들의 성장을 위해 Epo-비의존적 및 Epo-과민감성이고, 따라서 PV에서 개시된 적혈구 전구체의 비의존성 및 과민감성을 흉내낸다는 것을 보였다. 따라서, 본 발명자들은 더 나아가서 JAK2 V617F를 운반하는 환자들 또한 EEC 형성을 보인다는 가설을 설정하였다. EEC를 형성하지 않은 20명의 적혈구증가증 환자 가운데 1명은 상기 돌연변이를 나타내어 JAK2 V617F 검출의 양성 예측 값에 대한 의문을 제기하였다; 그러나, 상기 환자가 EEC를 나타내지 않았지만, 그/그녀는 많은 WHO 및 PVSG 양성 규범을 충족시켰고, 상기 환자는 양쪽 분류 모두에서 PV로 분류되었다. 따라서, 상기 환자는 "JAK2에 대해 위-양성"이라기보다는 "EEC에 대해 위-음성"으로 간주되어야 한다. 검출-민감성 기술을 이용할 때, EEC를 형성한 67명의 환자 가운데 62명은 JAK2 V617F 돌연변이를 운반하였고, 5명의 환자는 돌연변이되지 않았다. 상기 5명의 환자 중에서, 4/5 및 2/5는 각각 WHo 및 PVSG 규범에 따라 PV 그룹으로 분류될 수 있다. 종합하면, 분석된 87명의 환자 중에서 81/87명의 환자(93.1%, R=0.824, p<0.0001)에서 JAK2 V617F 돌연변이의 존재 또는 부재는 EEC 형성 능력 또는 무능력과 부합하였다.
골수 단핵구 세포(BMMC)에서의 JAK2 V617F 돌연변이의 존재는 말초 과립구에서의 그의 존재와 부합된다.
진단 시점에 JAK2 V617F 돌연변이를 검출하기 위해 말초 혈액의 과립구를 사용하는 것이 골수 세포의 분석을 피할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 각각의 방법에 의해 얻어진 결과를 비교하였다: 진단 시점에 골수 샘플 및 말초 혈액 샘플 모두 이용가능한 50명의 환자(35명의 PV, 8명의 SE 및 8명의 MPD 의심 포함)에 대한 시퀀싱, LightCycler® 및 TaqMan®. 모든 경우(34명 돌연변이, 16명 비-돌연변이)에 있어서, 돌연변이는 동일하게 검출되었다.
Ⅲ - 결론
따라서, 본 발명자들은, 명백한 2차 적혈구증가증인 경우(도 7)를 제외하고는, 민감한 기술을 이용하여 과립구에서 JAK2 V617F를 검출하는 것이 적혈구증가증 진단의 첫 번째 단계인 새로운 PV 진단 데이터시트를 제안한다. 이러한 접근은 몇가지 이점을 갖는다: 상기 방법은 항상 이용가능한 것이 아니고 그 결과가 때때로 논란거리가 되는 등장성 적혈구 세포의 측정을 수행해야 하는 것을 피한다. 또한, 상기 방법은 골수 절차 및 시간이 많이 걸리고 표준화가 잘 되어 있지 않은 EEC 분석을 피할 수 있다. 상기 방법은 헤마토크릿 레벨이 51% 이상이고 JAK2 V617F 음성인 환자들만이 적혈구증가증을 특징짓기 위해 실제로 수행되어야 하는 모든 조사를 수행할 필요가 있기 때문에, 양성 PV 진단 비용을 현저하게 감소시킨다. 적혈구증가증 배경에서 JAK2 V617F 검출만으로도 PV 진단을 지지할 것이지만, 골수 생검을 수행하는 것도 골수섬유증(myelofibrosis) 또는 아세포(blastic cell)의 존재에 대한 신호를 나타내어서, PV의 백혈병으로의 변환을 확인할 수 있으므로 여전히 유용할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 골수 생검은 세포유전학적 분석과 함께 선택적인 연구로 수행되어야 하는 것이라고 느낀다.
JAK2 V617F는 또한 30%의 ET, 50%의 IMF 및 소수의 드문 비-특성화된 MPD에서 검출되어, 다른 임상적 증상을 갖는 새로운 MPD 그룹으로 정의되었다. 이러한 차이에 대한 이유는 알려져 있지 않으며, 이러한 질환을 공통의 생리병리학적 원인 및 다른 표현형을 갖는 단일한 척수증식성 실재(entity)로 그룹핑하기는 여전히 너무 이르다. 이후의 정확한 임상 연구가 JAK2 V617F를 운반하는 PV, ET, IMF 및 다른 드문 MPD 사이의 공통 증상을, 특히 절대적인 적혈구증가증, Epo 레벨, 골수섬유증 및 세포유전학적 이형에 관해 보다 구체적으로 특정화할 것이다. 따라서, JAK2 V617F의 검출을 만성 과다백혈구증가증, 혈소판증가증 및 적혈구증가증의 진단을 위한 초기 도구로 사용하는 것이 계획된다. JAK2 V617F의 존재는 MPD 그룹을 새롭게 정의하도록 할 뿐만 아니라, 구체적으로 표적화된 치료를 개발하기 위한 기초를 가장 확실하게 형성할 것이다.
실시예
3.
V617F
JAK2
돌연변이에 특이적인
siRNA
는
V617F
JAK2
는 억제하지만
JAK2
WT
는 억제하지 않는다.
서열번호 25 내지 서열번호 27에 대응하는 siRNA 1, 3, 및 4는 K562 세포주에 의해 발현된 야생형(wild-type) JAK2 단백질을 억제하지 않고 HEL 세포주에 의해 발현된 돌연변이된 V617F JAK2 단백질을 억제하였다. 상기 결과는 도 8, 도 9 및 도 10에 나타나 있다.
참고문헌
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale
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Universite de Versailles - Saint-Quentin-en-Yvelines
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<160> 31
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<210> 1
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (617)
<223> variant JAK2 V617F
<400> 1
Met Gly Met Ala Cys Leu Thr Met Thr Glu Met Glu Gly Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ser Ser Ile Tyr Gln Asn Gly Asp Ile Ser Gly Asn Ala Asn Ser Met
20 25 30
Lys Gln Ile Asp Pro Val Leu Gln Val Tyr Leu Tyr His Ser Leu Gly
35 40 45
Lys Ser Glu Ala Asp Tyr Leu Thr Phe Pro Ser Gly Glu Tyr Val Ala
50 55 60
Glu Glu Ile Cys Ile Ala Ala Ser Lys Ala Cys Gly Ile Thr Pro Val
65 70 75 80
Tyr His Asn Met Phe Ala Leu Met Ser Glu Thr Glu Arg Ile Trp Tyr
85 90 95
Pro Pro Asn His Val Phe His Ile Asp Glu Ser Thr Arg His Asn Val
100 105 110
Leu Tyr Arg Ile Arg Phe Tyr Phe Pro Arg Trp Tyr Cys Ser Gly Ser
115 120 125
Asn Arg Ala Tyr Arg His Gly Ile Ser Arg Gly Ala Glu Ala Pro Leu
130 135 140
Leu Asp Asp Phe Val Met Ser Tyr Leu Phe Ala Gln Trp Arg His Asp
145 150 155 160
Phe Val His Gly Trp Ile Lys Val Pro Val Thr His Glu Thr Gln Glu
165 170 175
Glu Cys Leu Gly Met Ala Val Leu Asp Met Met Arg Ile Ala Lys Glu
180 185 190
Asn Asp Gln Thr Pro Leu Ala Ile Tyr Asn Ser Ile Ser Tyr Lys Thr
195 200 205
Phe Leu Pro Lys Cys Ile Arg Ala Lys Ile Gln Asp Tyr His Ile Leu
210 215 220
Thr Arg Lys Arg Ile Arg Tyr Arg Phe Arg Arg Phe Ile Gln Gln Phe
225 230 235 240
Ser Gln Cys Lys Ala Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu Lys Tyr Leu Ile
245 250 255
Asn Leu Glu Thr Leu Gln Ser Ala Phe Tyr Thr Glu Lys Phe Glu Val
260 265 270
Lys Glu Pro Gly Ser Gly Pro Ser Gly Glu Glu Ile Phe Ala Thr Ile
275 280 285
Ile Ile Thr Gly Asn Gly Gly Ile Gln Trp Ser Arg Gly Lys His Lys
290 295 300
Glu Ser Glu Thr Leu Thr Glu Gln Asp Leu Gln Leu Tyr Cys Asp Phe
305 310 315 320
Pro Asn Ile Ile Asp Val Ser Ile Lys Gln Ala Asn Gln Glu Gly Ser
325 330 335
Asn Glu Ser Arg Val Val Thr Ile His Lys Gln Asp Gly Lys Asn Leu
340 345 350
Glu Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ser Phe Val Ser Leu
355 360 365
Ile Asp Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Ala His His Tyr Leu Cys
370 375 380
Lys Glu Val Ala Pro Pro Ala Val Leu Glu Asn Ile Gln Ser Asn Cys
385 390 395 400
His Gly Pro Ile Ser Met Asp Phe Ala Ile Ser Lys Leu Lys Lys Ala
405 410 415
Gly Asn Gln Thr Gly Leu Tyr Val Leu Arg Cys Ser Pro Lys Asp Phe
420 425 430
Asn Lys Tyr Phe Leu Thr Phe Ala Val Glu Arg Glu Asn Val Ile Glu
435 440 445
Tyr Lys His Cys Leu Ile Thr Lys Asn Glu Asn Glu Glu Tyr Asn Leu
450 455 460
Ser Gly Thr Lys Lys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Asp Leu Leu Asn Cys
465 470 475 480
Tyr Gln Met Glu Thr Val Arg Ser Asp Asn Ile Ile Phe Gln Phe Thr
485 490 495
Lys Cys Cys Pro Pro Lys Pro Lys Asp Lys Ser Asn Leu Leu Val Phe
500 505 510
Arg Thr Asn Gly Val Ser Asp Val Pro Thr Ser Pro Thr Leu Gln Arg
515 520 525
Pro Thr His Met Asn Gln Met Val Phe His Lys Ile Arg Asn Glu Asp
530 535 540
Leu Ile Phe Asn Glu Ser Leu Gly Gln Gly Thr Phe Thr Lys Ile Phe
545 550 555 560
Lys Gly Val Arg Arg Glu Val Gly Asp Tyr Gly Gln Leu His Glu Thr
565 570 575
Glu Val Leu Leu Lys Val Leu Asp Lys Ala His Arg Asn Tyr Ser Glu
580 585 590
Ser Phe Phe Glu Ala Ala Ser Met Met Ser Lys Leu Ser His Lys His
595 600 605
Leu Val Leu Asn Tyr Gly Val Cys Phe Cys Gly Asp Glu Asn Ile Leu
610 615 620
Val Gln Glu Phe Val Lys Phe Gly Ser Leu Asp Thr Tyr Leu Lys Lys
625 630 635 640
Asn Lys Asn Cys Ile Asn Ile Leu Trp Lys Leu Glu Val Ala Lys Gln
645 650 655
Leu Ala Trp Ala Met His Phe Leu Glu Glu Asn Thr Leu Ile His Gly
660 665 670
Asn Val Cys Ala Lys Asn Ile Leu Leu Ile Arg Glu Glu Asp Arg Lys
675 680 685
Thr Gly Asn Pro Pro Phe Ile Lys Leu Ser Asp Pro Gly Ile Ser Ile
690 695 700
Thr Val Leu Pro Lys Asp Ile Leu Gln Glu Arg Ile Pro Trp Val Pro
705 710 715 720
Pro Glu Cys Ile Glu Asn Pro Lys Asn Leu Asn Leu Ala Thr Asp Lys
725 730 735
Trp Ser Phe Gly Thr Thr Leu Trp Glu Ile Cys Ser Gly Gly Asp Lys
740 745 750
Pro Leu Ser Ala Leu Asp Ser Gln Arg Lys Leu Gln Phe Tyr Glu Asp
755 760 765
Arg His Gln Leu Pro Ala Pro Lys Trp Ala Glu Leu Ala Asn Leu Ile
770 775 780
Asn Asn Cys Met Asp Tyr Glu Pro Asp Phe Arg Pro Ser Phe Arg Ala
785 790 795 800
Ile Ile Arg Asp Leu Asn Ser Leu Phe Thr Pro Asp Tyr Glu Leu Leu
805 810 815
Thr Glu Asn Asp Met Leu Pro Asn Met Arg Ile Gly Ala Leu Gly Phe
820 825 830
Ser Gly Ala Phe Glu Asp Arg Asp Pro Thr Gln Phe Glu Glu Arg His
835 840 845
Leu Lys Phe Leu Gln Gln Leu Gly Lys Gly Asn Phe Gly Ser Val Glu
850 855 860
Met Cys Arg Tyr Asp Pro Leu Gln Asp Asn Thr Gly Glu Val Val Ala
865 870 875 880
Val Lys Lys Leu Gln His Ser Thr Glu Glu His Leu Arg Asp Phe Glu
885 890 895
Arg Glu Ile Glu Ile Leu Lys Ser Leu Gln His Asp Asn Ile Val Lys
900 905 910
Tyr Lys Gly Val Cys Tyr Ser Ala Gly Arg Arg Asn Leu Lys Leu Ile
915 920 925
Met Glu Tyr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Arg Asp Tyr Leu Gln Lys His
930 935 940
Lys Glu Arg Ile Asp His Ile Lys Leu Leu Gln Tyr Thr Ser Gln Ile
945 950 955 960
Cys Lys Gly Met Glu Tyr Leu Gly Thr Lys Arg Tyr Ile His Arg Asp
965 970 975
Leu Ala Thr Arg Asn Ile Leu Val Glu Asn Glu Asn Arg Val Lys Ile
980 985 990
Gly Asp Phe Gly Leu Thr Lys Val Leu Pro Gln Asp Lys Glu Tyr Tyr
995 1000 1005
Lys Val Lys Glu Pro Gly Glu Ser Pro Ile Phe Trp Tyr Ala Pro Glu
1010 1015 1020
Ser Leu Thr Glu Ser Lys Phe Ser Val Ala Ser Asp Val Trp Ser Phe
1025 1030 1035 1040
Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Phe Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Lys Ser
1045 1050 1055
Pro Pro Ala Glu Phe Met Arg Met Ile Gly Asn Asp Lys Gln Gly Gln
1060 1065 1070
Met Ile Val Phe His Leu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Asn Gly Arg Leu
1075 1080 1085
Pro Arg Pro Asp Gly Cys Pro Asp Glu Ile Tyr Met Ile Met Thr Glu
1090 1095 1100
Cys Trp Asn Asn Asn Val Asn Gln Arg Pro Ser Phe Arg Asp Leu Ala
1105 1110 1115 1120
Leu Arg Val Asp Gln Ile Arg Asp Asn Met Ala Gly
1125 1130
<210> 2
<211> 5097
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mutation
<222> (1849)
<223> G1849T mutation in jak2 gene
<400> 2
ctgcaggaag gagagaggaa gaggagcaga agggggcagc agcggacgcc gctaacggcc 60
tccctcggcg ctgacaggct gggccggcgc ccggctcgct tgggtgttcg cgtcgccact 120
tcggcttctc ggccggtcgg gcccctcggc ccgggcttgc ggcgcgcgtc ggggctgagg 180
gctgctgcgg cgcagggaga ggcctggtcc tcgctgccga gggatgtgag tgggagctga 240
gcccacactg gagggccccc gagggcccag cctggaggtc gttcagagcc gtgcccgccc 300
cggggcttcg cagaccttga cccgccgggt aggagccgcc cctgcgggct cgagggcgcg 360
ctctggtcgc ccgatctgtg tagccggttt cagaagcagg caacaggaac aagatgtgaa 420
ctgtttctct tctgcagaaa aagaggctct tcctcctcct cccgcgacgg caaatgttct 480
gaaaaagact ctgcatggga atggcctgcc ttacgatgac agaaatggag ggaacatcca 540
cctcttctat atatcagaat ggtgatattt ctggaaatgc caattctatg aagcaaatag 600
atccagttct tcaggtgtat ctttaccatt cccttgggaa atctgaggca gattatctga 660
cctttccatc tggggagtat gttgcagaag aaatctgtat tgctgcttct aaagcttgtg 720
gtatcacacc tgtgtatcat aatatgtttg ctttaatgag tgaaacagaa aggatctggt 780
atccacccaa ccatgtcttc catatagatg agtcaaccag gcataatgta ctctacagaa 840
taagatttta ctttcctcgt tggtattgca gtggcagcaa cagagcctat cggcatggaa 900
tatctcgagg tgctgaagct cctcttcttg atgactttgt catgtcttac ctctttgctc 960
agtggcggca tgattttgtg cacggatgga taaaagtacc tgtgactcat gaaacacagg 1020
aagaatgtct tgggatggca gtgttagata tgatgagaat agccaaagaa aacgatcaaa 1080
ccccactggc catctataac tctatcagct acaagacatt cttaccaaaa tgtattcgag 1140
caaagatcca agactatcat attttgacaa ggaagcgaat aaggtacaga tttcgcagat 1200
ttattcagca attcagccaa tgcaaagcca ctgccagaaa cttgaaactt aagtatctta 1260
taaatctgga aactctgcag tctgccttct acacagagaa atttgaagta aaagaacctg 1320
gaagtggtcc ttcaggtgag gagatttttg caaccattat aataactgga aacggtggaa 1380
ttcagtggtc aagagggaaa cataaagaaa gtgagacact gacagaacag gatttacagt 1440
tatattgcga ttttcctaat attattgatg tcagtattaa gcaagcaaac caagagggtt 1500
caaatgaaag ccgagttgta actatccata agcaagatgg taaaaatctg gaaattgaac 1560
ttagctcatt aagggaagct ttgtctttcg tgtcattaat tgatggatat tatagattaa 1620
ctgcagatgc acatcattac ctctgtaaag aagtagcacc tccagccgtg cttgaaaata 1680
tacaaagcaa ctgtcatggc ccaatttcga tggattttgc cattagtaaa ctgaagaaag 1740
caggtaatca gactggactg tatgtacttc gatgcagtcc taaggacttt aataaatatt 1800
ttttgacttt tgctgtcgag cgagaaaatg tcattgaata taaacactgt ttgattacaa 1860
aaaatgagaa tgaagagtac aacctcagtg ggacaaagaa gaacttcagc agtcttaaag 1920
atcttttgaa ttgttaccag atggaaactg ttcgctcaga caatataatt ttccagttta 1980
ctaaatgctg tcccccaaag ccaaaagata aatcaaacct tctagtcttc agaacgaatg 2040
gtgtttctga tgtaccaacc tcaccaacat tacagaggcc tactcatatg aaccaaatgg 2100
tgtttcacaa aatcagaaat gaagatttga tatttaatga aagccttggc caaggcactt 2160
ttacaaagat ttttaaaggc gtacgaagag aagtaggaga ctacggtcaa ctgcatgaaa 2220
cagaagttct tttaaaagtt ctggataaag cacacagaaa ctattcagag tctttctttg 2280
aagcagcaag tatgatgagc aagctttctc acaagcattt ggttttaaat tatggagtat 2340
gtttctgtgg agacgagaat attctggttc aggagtttgt aaaatttgga tcactagata 2400
catatctgaa aaagaataaa aattgtataa atatattatg gaaacttgaa gttgctaaac 2460
agttggcatg ggccatgcat tttctagaag aaaacaccct tattcatggg aatgtatgtg 2520
ccaaaaatat tctgcttatc agagaagaag acaggaagac aggaaatcct cctttcatca 2580
aacttagtga tcctggcatt agtattacag ttttgccaaa ggacattctt caggagagaa 2640
taccatgggt accacctgaa tgcattgaaa atcctaaaaa tttaaatttg gcaacagaca 2700
aatggagttt tggtaccact ttgtgggaaa tctgcagtgg aggagataaa cctctaagtg 2760
ctctggattc tcaaagaaag ctacaatttt atgaagatag gcatcagctt cctgcaccaa 2820
agtgggcaga attagcaaac cttataaata attgtatgga ttatgaacca gatttcaggc 2880
cttctttcag agccatcata cgagatctta acagtttgtt tactccagat tatgaactat 2940
taacagaaaa tgacatgtta ccaaatatga ggataggtgc cctagggttt tctggtgcct 3000
ttgaagaccg ggatcctaca cagtttgaag agagacattt gaaatttcta cagcaacttg 3060
gcaagggtaa ttttgggagt gtggagatgt gccggtatga ccctctacag gacaacactg 3120
gggaggtggt cgctgtaaaa aagcttcagc atagtactga agagcaccta agagactttg 3180
aaagggaaat tgaaatcctg aaatccctac agcatgacaa cattgtaaag tacaagggag 3240
tgtgctacag tgctggtcgg cgtaatctaa aattaattat ggaatattta ccatatggaa 3300
gtttacgaga ctatcttcaa aaacataaag aacggataga tcacataaaa cttctgcagt 3360
acacatctca gatatgcaag ggtatggagt atcttggtac aaaaaggtat atccacaggg 3420
atctggcaac gagaaatata ttggtggaga acgagaacag agttaaaatt ggagattttg 3480
ggttaaccaa agtcttgcca caagacaaag aatactataa agtaaaagaa cctggtgaaa 3540
gtcccatatt ctggtatgct ccagaatcac tgacagagag caagttttct gtggcctcag 3600
atgtttggag ctttggagtg gttctgtatg aacttttcac atacattgag aagagtaaaa 3660
gtccaccagc ggaatttatg cgtatgattg gcaatgacaa acaaggacag atgatcgtgt 3720
tccatttgat agaacttttg aagaataatg gaagattacc aagaccagat ggatgcccag 3780
atgagatcta tatgatcatg acagaatgct ggaacaataa tgtaaatcaa cgcccctcct 3840
ttagggatct agctcttcga gtggatcaaa taagggataa catggctgga tgaaagaaat 3900
gaccttcatt ctgagaccaa agtagattta cagaacaaag ttttatattt cacattgctg 3960
tggactatta ttacatatat cattattata taaatcatga tgctagccag caaagatgtg 4020
aaaatatctg ctcaaaactt tcaaagttta gtaagttttt cttcatgagg ccaccagtaa 4080
aagacattaa tgagaattcc ttagcaagga ttttgtaaga agtttcttaa acattgtctg 4140
ttaacatcac tcttgtctgg caaaagaaaa aaaatagact ttttcaactc agctttttga 4200
gacctgaaaa aattattatg taaattttgc aatgttaaag atgcacagaa tatgtatgta 4260
tagtttttac cacagtggat gtataatacc ttggcatctt gtgtgatgtt ttacacacat 4320
gagggctggt gttcattaat actgttttct aatttttcca tagttaatct ataattaatt 4380
acttcactat acaaacaaat taagatgttc agataattga ataagtacct ttgtgtcctt 4440
gttcatttat atcgctggcc agcattataa gcaggtgtat acttttagct tgtagttcca 4500
tgtactgtaa atatttttca cataaaggga acaaatgtct agttttattt gtataggaaa 4560
tttccctgac cctaaataat acattttgaa atgaaacaag cttacaaaga tataatctat 4620
tttattatgg tttcccttgt atctatttgt ggtgaatgtg ttttttaaat ggaactatct 4680
ccaaattttt ctaagactac tatgaacagt tttcttttaa aattttgaga ttaagaatgc 4740
caggaatatt gtcatccttt gagctgctga ctgccaataa cattcttcga tctctgggat 4800
ttatgctcat gaactaaatt taagcttaag ccataaaata gattagattg ttttttaaaa 4860
atggatagct cattaagaag tgcagcaggt taagaatttt ttcctaaaga ctgtatattt 4920
gaggggtttc agaattttgc attgcagtca tagaagagat ttatttcctt tttagagggg 4980
aaatgaggta aataagtaaa aaagtatgct tgttaatttt attcaagaat gccagtagaa 5040
aattcataac gtgtatcttt aagaaaaatg agcatacatc ttaaatcttt tcaatta 5097
<210> 3
<211> 554
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(554)
<223> fragment of SEQ ID No 2 with the G1849T mutation
<400> 3
ctcatatgaa ccaaatggtg tttcacaaaa tcagaaatga agatttgata tttaatgaaa 60
gccttggcca aggcactttt acaaagattt ttaaaggcgt acgaagagaa gtaggagact 120
acggtcaact gcatgaaaca gaagttcttt taaaagttct ggataaagca cacagaaact 180
attcagagtc tttctttgaa gcagcaagta tgatgagcaa gctttctcac aagcatttgg 240
ttttaaatta tggagtatgt ttctgtggag acgagaatat tctggttcag gagtttgtaa 300
aatttggatc actagataca tatctgaaaa agaataaaaa ttgtataaat atattatgga 360
aacttgaagt tgctaaacag ttggcatggg ccatgcattt tctagaagaa aacaccctta 420
ttcatgggaa tgtatgtgcc aaaaatattc tgcttatcag agaagaagac aggaagacag 480
gaaatcctcc tttcatcaaa cttagtgatc ctggcattag tattacagtt ttgccaaagg 540
acattcttca ggag 554
<210> 4
<211> 94
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(94)
<223> fragment of SEQ ID No 3 with the G1849T mutation
<400> 4
gatgagcaag ctttctcaca agcatttggt tttaaattat ggagtatgtt tctgtggaga 60
cgagaatatt ctggttcagg agtttgtaaa attt 94
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR PRIMER (54804-54823)
<400> 5
gggtttcctc agaacgttga 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR PRIMER (55240-55260)
<400> 6
ttgctttcct ttttcacaag a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQUENCING PRIMER (54813-54832)
<400> 7
cagaacgttg atggcagttg 20
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQUENCING PRIMER (55207-55233)
<400> 8
tgaatagtcc tacagtgttt tcagttt 27
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR AND SEQUENCING PRIMER (1386-1407)
<400> 9
caacctcagt gggacaaaga a 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR AND SEQUENCING PRIME (2019-2041)
<400> 10
gcagaatatt tttggcacat aca 23
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SNPS PROBES AND DETECTION OF MUTATION AND siRNA (1829-1870)
<400> 11
ttttaaatta tggagtatgt gtctgtggag acgagaatat tc 42
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(23)
<223> Sequence comprising the G1849T mutation
<400> 12
tatggagtat gtttctgtgg aga 23
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(21)
<223> sense siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is T
<400> 13
uggaguaugu uucuguggan n 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(21)
<223> antisense siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is T
<400> 14
uccacagaaa cauacuccan n 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo "S" (sense)
<400> 15
ggcagagaga attttctgaa c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligo "R" (antisense)
<400> 16
gctttccttt ttcacaagat a 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> "Sensor wt"
<400> 17
gtctccacag acacatactc cataa 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JAK2 primer
<400> 18
aaaaccaaat gcttgtgaga aagct 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cJAK2F
<400> 19
gcacacagaa actattcaga gtc 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cJAK2S
<400> 20
agcagcaagt atgatgagc 19
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cJAK2A
<400> 21
ctagtgatcc aaattttaca aact 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cJAK2R
<400> 22
gtttagcaac ttcaagtttc c 21
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> "Sensor wt"
<400> 23
gtctccacag acacatactc cataa 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JAK2 primer
<400> 24
aaaaccaaat gcttgtgaga aagct 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of sense primer
<400> 25
aagctttctc acaagcattt ggttt 25
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of antisense primer
<400> 26
agaaaggcat tagaaagcct gtagtt 26
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of "Reporter 1" (VIC)
<400> 27
tctccacaga cacatac 17
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of "Reporter 2" (FAM)
<400> 28
tccacagaaa catac 15
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 29
uggaguaugu uucugugga 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 30
ggaguauguu ucuguggag 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 31
gaguauguuu cuguggaga 19
Claims (52)
- V617F 돌연변이 (이하, "JAK2 V617F 변이체")를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 JAK2(야누스 키나제 2) 단백질 또는 다른 포유동물에서 상기 단백질의 동등체.
- 제1항에 있어서, V617F 돌연변이는 서열번호 1로 주어지는, 단백질 또는 단백질의 동등체.
- 제2항에 따른 JAK2 V617F 변이체를 코딩하는 서열로 이루어진, 폴리뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, JAK2 V617F 변이체를 코딩하는 서열은 전사의 개시를 표시하는 ATG로부터 시작해서 1849 위치의 t/g 돌연변이를 갖는 서열번호 2의 서열인,폴리뉴클레오티드.
- 포유동물 세포에서 효과적인 프로모터의 조절 하에 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 또는 플라스미드 벡터 또는 네이키드 DNA 형태의 클로닝 및/또는 발현 벡터.
- 인간 배아줄기 세포 또는 생식 줄기 세포를 제외한, 제2항에 따른 재조합 JAK2 V617F 변이체를 발현하는 포유동물 세포.
- 제2항에 따른 재조합 JAK2 V617F 변이체를 발현하는 비-인간 형질전환 동물.
- 제7항에 있어서, 상동성 재조합 또는 직접 재조합에 의해 JAK2 V617F의 코딩 서열을 그 게놈 내에 삽입시킨 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 비-인간 형질전환 동물.
- 제7항에 있어서, JAK2 V617F/JAK2 V617F 동형접합체 또는 JAK2 V617F/JAK2 이형접합체이고, 상기 동물은 JAK2 V617F에 의해 유도되는 진성 적혈구증가증 및/또는 척수증식성 증상(syndrome)을 재생산하는 것을 특징으로 하는 비-인간 형질전환 동물.
- 서열번호 3 또는 서열번호 4 서열의 10 내지 30개의 연속하는 뉴클레오티드들을 포함하며, t1849 돌연변이된 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머.
- 서열번호 5 내지 서열번호 11 및 서열번호 12의 서열로부터 선택되며, t1849 돌연변이된 뉴클레오티드를 포함하는 프로브 또는 프라이머.
- t1849 돌연변이된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 4의 JAK2 게놈 DNA, 그 cDNA 또는 mRNA에 혼성화할 수 있는, 10개 이상의 뉴클레오티드들의 올리고뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서, 15 내지 25개의 뉴클레오티드들의, 올리고뉴클레오티드.
- 환자로부터 얻은 핵산 샘플 내에 있는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 G1849T 변이체의 존재가 진성 적혈구증가증 또는 다른 골수증식성 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는,진성 적혈구증가증을 앓고 있거나, 또는 진성 적혈구증가증 또는 다른 골수증식성 증상으로 진행되는 환자 유래의 샘플 내에 있는 JAK2 유전자의 G1849T 변이체의 존재 또는 부재를 측정하는 생체외 또는 시험관내 방법.
- 제14항에 있어서, 다른 골수증식성 증상은, 적혈구증식증, 과다백혈구증가증, 혈소판증식증 또는 골수섬유증인, 방법.
- 제14항에 있어서, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 한 쌍 이상의 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 반응에 의한 증폭 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 개체의 mRNA 상에서 수행되며, RT-PCR 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드에 의한 증폭 단계, G1849T 돌연변이 부위에 상응하는 서열에 대해 혼성화하는 하나 이상의 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화 단계, 및 상기 프로브 또는 올리고뉴클레오티드의 표지에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 프로브 및 프라이머 및 올리고뉴클레오티드는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 정의된 것임을 특징으로 하는, 방법.
- 제19항에 있어서,혼성화 단계는 두 개의 프로브를 이용하는, 방법.
- 환자의 샘플에서 JAK2 V617F 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며,상기 변이체의 존재는 진성 적혈구증가증 또는 다른 척수증식성 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는, 진성 적혈구증가증 또는 다른 척수증식성 증상을 앓고 있거나 진행하고 있는 환자 유래 샘플 내의 JAK2 V617F 변이체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 생체외 또는 시험관내 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 샘플을 상기 JAK2 단백질의 V617F 변이체에 특이적인 항체로 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 항체는 상기 V617F 변이체 및 비-돌연변이 JAK2 단백질 간을 구분할 수 있는 항체인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 항체는 단쇄 또는 이중쇄, 단일클론성 또는 다클론성 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 F(ab')2 및 F(v) 항원 결합 절편인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제24항에 있어서, ELISA 분석인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 51% 이상의 헤마토크릿 레벨을 갖는 환자의 일부-집단(subpopulation)에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 450,000 이상의 혈소판 수치를 갖는 환자의 일부-집단에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 서열목록 1의 JAK2 V617F 변이체를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체.
- 제28항에 따른 항체를 생성하는 하이브리도마.
- JAK2 유전자 내의 G1849T 돌연변이의 존재 또는 부재를 특이적으로 검출하기 위한 제10항 내지 제13항 중 어느 하나에서 정의된 하나 이상의 프라이머 또는 프로브 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 종양에서 상기 JAK2 V617F 변이체를 검출하기 위한 키트.
- JAK2 유전자 내의 G1849T 돌연변이의 존재 또는 부재를 특이적으로 검출하기 위한 제10항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에서 정의된 하나 이상의 프로브 또는 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 환자가 JAK2 V617F 변이체를 포함하는 진성 적혈구증가증 또는 다른 척수증식성 증상을 앓고 있는지 여부를 측정하기 위한 키트.
- 제31항에 있어서, 다른 척수증식성 증상은, 적혈구증가증, 과다백혈구증가증, 혈소판증가증 또는 골수섬유증인, 키트.
- 제30항에 있어서, PCR 증폭을 위한 열저항성 폴리머라제, 증폭 및/또는 혼성화 단계를 위한 하나 이상의 용액 및 표지를 검출하기 위한 시약으로부터 선택되는 하나의 요소 (element)를 추가로 포함하는, 키트.
- 제28항에 따른 항체를 포함하는, 환자가 JAK2 V617F 변이체를 포함하는 진성 적혈구증가증 또는 다른 척수증식성 증상을 앓고 있는지 여부를 측정하기 위한, 키트.
- 19 내지 25 뉴클레오티드들의 길이를 가지며, 첫 번째 사슬의 서열은 t1849 돌연변이된 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 11 중의 서열과 동일하고, 두 번째 사슬의 서열은 상기 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는, JAK2 V617F 변이체의 발현을 50% 이상 감소시킬 수 있는 siRNA.
- 제35항에 있어서, 뉴클레오티드들의 길이는 19 뉴클레오티드들인, siRNA.
- a) 하나 이상의 화합물을 제1항에 따른 JAK2 V617F 단백질, JAK2 V617F를 포함하는 막 분획물, 또는 JAK2 V617F를 발현하는 세포와 결합 및/또는 억제 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및b) JAK2 V617F의 특이적인 결합 및/또는 억제를 검출하는 단계로 이루어진 단계들을 포함하는,하나 이상의 화합물을 이용하여 JAK2 V617F의 특이적인 억제를 측정하기 위한 시험관내 방법.
- 여러 분자들의 제37항에 따른 테스트 및 JAK2 V617F에 대한 IC50이 1 μM 이하인 분자의 선별 단계를 연속적으로 포함하는 시험관내 스크리닝 방법.
- 제38항에 있어서, JAK2 V617F에 대한 IC50은 100 nM인, 시험관내 스크리닝 방법
- 제38항에 있어서, JAK2에 대한 IC50이 5 μM 또는 1 μM 이하인 분자의 음성 선별을 추가로 포함하는, 시험관내 스크리닝 방법
- 제37항에 있어서, JAK2 V617F 인산화의 억제가 면역침전에 의해 측정되는, 시험관내 방법.
- 제37항에 있어서, 에리트로포이에틴(Epo) 없이 분화할 수 있는 JAK V617F CD34+ 일차 전구체 세포, 또는 JAK2 V617F 변이체의 도입을 통해 인자-비의존적이 되는 세포주에 대한, 시험관내 방법.
- 제37항에 있어서, 제6항에 따른 세포를 이용하는, 시험관내 방법.
- a) 진성 적혈구증가증을 재생성하고 및/또는 JAK2 V617F의 존재와 연관된 척수증식성 증상을 앓는, JAK2 V617F를 발현하는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 비-인간 형질전환 동물에 화합물을 투여하는 단계; 및b) 화합물의 효과를 확인하고, 진성 적혈구증가증의 적아세포의 증식 및 분화를 감소 또는 차단하거나, 또는 JAK2 V617F의 존재와 관련이 있는 세포의 증식을 감소시키는 것이 관찰되는 약제 후보물질(medicament candidate)을 선별하는 단계로 이루어진 단계들을 포함하는, 약제 후보물질을 확인하는 방법.
- 제35항에 따른 siRNA을 이용하여 약제를 제조하기 위한 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 약제는 악성 혈구세포증의 치료에 사용하기 위한 약제인, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 약제는 진성 적혈구증가증, 특발성 혈소판증가증, 골수성 비장비대증 또는 미발달 골수섬유증을 포함하는 척수증식성 증상의 치료에 사용하기 위한 약제인, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 약제는 JAK2 V617F 돌연변이와 관련이 있는 척수증식성 증상, 및 다른 악성 혈구세포증, 및 JAK2 V617F를 발현하는 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 약제인, 방법.
- 제46항에 있어서, 고형 종양은 암종, 흑색종 및 신경아세포종인, 방법.
- 제31항에 있어서, PCR 증폭을 위한 열저항성 폴리머라제, 증폭 및/또는 혼성화 단계를 위한 하나 이상의 용액 및 표지를 검출하기 위한 시약으로부터 선택되는 하나의 요소 (element)를 추가로 포함하는, 키트.
- 19 내지 25 뉴클레오티드들의 길이를 가지며, 첫 번째 사슬의 서열은 t1849 돌연변이된 뉴클레오티드를 포함하는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 11 중의 서열과 동일하고, 두 번째 사슬의 서열은 상기 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는, JAK2 V617F 변이체의 발현을 95% 이상 감소시킬 수 있는 siRNA.
- 제51항에 있어서, 뉴클레오티드들의 길이는 19 뉴클레오티드들인, siRNA.
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