ES2295241T3 - Procedimiento y medio de deteccion/identificacion de microorganismos con actividad esterasica. - Google Patents
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Abstract
Medio de detección/identificación de microorganismos con actividad esterásica, del tipo de los que comprenden especialmente un medio (M) de reacción y al menos un sustrato (S) de esterasa cromógeno o fluorógeno; basándose esencialmente esta detección/identificación en la puesta en evidencia de la actividad esterasa, caracterizado porque: * está en forma de líquido estable o gel listo para usar; * comprende: o -A- al menos un agente solubilizante y estabilizante elegido del grupo que comprende: o los ésteres de sorbitano y de ácido(s) graso(s) (ESAG), o las sales biliares, o y sus mezclas; o -B- al menos un activador selectivo seleccionado del grupo que comprende: * los compuestos de fórmula (I): en la que: * R es un alquilo lineal o ramificado, preferiblemente de C1- C30; * X es un halógeno, preferiblemente Na; * los derivados poliéteres no iónicos, preferiblemente los de fórmula (II): N es un número entero comprendido entre 2 y 15 (de media = 10); * y sus mezclas; * -C- y eventualmente almenos un disolvente.
Description
Procedimiento y medio de
detección/identificación de microorganismos con actividad
esterásica.
El campo de la invención es el del análisis
microbiológico por vía bioquímica, y en particular la detección y
la identificación de cepas de microorganismos mediante siembra de
medios de reacción, en particular de medios nutritivos. Éstos
últimos comprenden sustratos cromógenos o fluorógenos susceptibles
de reaccionar con las enzimas específicas de las cepas buscadas,
produciendo una coloración o una fluorescencia de cada colonia en
cuestión.
El marco de la presente exposición se interesa
más particularmente en la detección/identificación de
microorganismos con actividad esterásica, y más especialmente en
bacterias del género Salmonella.
Este género Salmonella es el más
importante de la familia de las enterobacterias responsables en el
hombre de diversas infecciones (fiebre tifoidea, intoxicación
alimenticia). Las salmonelas presentan esterasas no específicas que
pueden hidrolizar sustratos sintéticos cromógenos, por ejemplo
indigogénicos o sustratos fluorógenos.
La detección/identificación de salmonelas, y más
generalmente de microorganismos con actividad esterásica, se
realiza clásicamente sobre medios con gel agar o líquidos de
aislamiento, que permiten la detección/identificación de las
colonias que se sospecha que son microorganismos con actividad
esterasa, especialmente las salmonelas. La siembra de tales medios
se realiza mediante remojo de dicho medio en la muestra analizada o
mediante contacto de la muestra con el medio.
Los microorganismos con actividad esterásica, en
particular las salmonelas, presentan en su patrimonio enzimático
esterasas que rompen los enlaces éster de los sustratos presentes en
el medio y que liberan así la parte cromógena o fluorógena activada
de dichos sustratos. Resulta una coloración o una fluorescencia que
revela la hidrólisis, y por tanto la presencia de microorganismos o
de colonias de microorganismos diana.
Para poder realizar pruebas rutinarias de gran
envergadura, es necesario que los medios de detección/identificación
sean estables y permitan simplificar al máximo los procedimientos
de detección/identificación correspondientes, limitando las
manipulaciones. Además, es importante que los procedimientos
ofrezcan una alta sensibilidad (intensidad de coloración o de
fluorescencia), así como una especificidad de primer orden. La
velocidad de revelado de las colonias sospechosas es igualmente un
parámetro fundamental de estos tipos de medios y procedimientos de
detección/identificación de microorganismos con actividad
esterásica.
Sin embargo, se sabe que los sustratos de
esterasa presentan problemas de compatibilidad con los medios de
cultivo para microorganismos con actividad esterasa. Además, tales
sustratos de esterasa no son estables en el tiempo, lo que induce
una disminución de la sensibilidad con respecto a la actividad
esterasa al prolongarse el tiempo de conserva-
ción.
ción.
Además, sería igualmente importante disponer de
aditivos, por una parte, que confieran a esta clase de medios una
translucidez en el estado no sembrado (lectura de crecimiento no
perturbada) así como una selectividad con respecto a ciertas cepas,
y por otra parte, que promuevan la actividad enzimática útil como
revelador (coloración más
completa).
completa).
En este contexto, la patente
FR-2 697 028 da a conocer un medio de cultivo para
la puesta en evidencia de salmonelas que comprende un sustrato de
esterasa cromógeno constituido por un éster del ácido caprílico con
un resto indol (caprilato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo),
así como un detergente elegido de entre las sales biliares
(desoxicolato de sodio). Este cromógeno y esta sal biliar están
contenidos en un medio nutritivo que permite el crecimiento de
salmonelas. Según las enseñanzas del documento FR 2 697 028, la sal
biliar se añade directamente al medio selectivo en el que ya se
encuentra incluido el sustrato de esterasa.
Un inconveniente relacionado con el uso de sales
biliares se debe al hecho de que éstas últimas son materias primas
de origen animal, lo que conlleva una cierta variabilidad de la
calidad.
Además, los resultados en cuanto a la actividad
biológica pueden perfeccionarse.
Por otro lado, este medio de cultivo no ofrece
todas las garantías deseables en cuanto a la estabilidad del
sustrato de esterasa. De hecho, resulta que éste último no es
completamente miscible con el medio de cultivo. Está claro que esto
perjudica a la calidad de los resultados obtenidos en el plano de la
sensibilidad y de la rapidez.
Debe observarse igualmente que el medio de
cultivo según el documento FR 2 697 028 se presenta en forma de
polvo. Esto obliga al usuario a realizar una operación de
reconstitución previa del medio líquido o gelificado. Esta
limitación resulta de la falta de estabilidad de los sustratos de
esterasa puestos en práctica.
Además, el medio con gel agar preparado según
las enseñanzas del documento FR 2 697 028 no es translúcido. Esto
conlleva el riesgo de poner en peligro la lectura de las
coloraciones asociadas a las eventuales colonias de bacterias
diana.
Finalmente, en la página 3, líneas
17-23 de este documento, se indica que los
detergentes aniónicos comercializados con la marca Tergitol® por
UNION CARBIDE (alquilsulfato de Na) no permiten poner en evidencia
una colora-
ción.
ción.
La solicitud de patente PCT
WO-92/17607 se refiere a un medio de detección para
salmonelas que contiene TERGITOL® 4 (sulfato hidrogenado de
7-etil-2-metil-4-undecilo
o su sal de sodio). Se supone que este aditivo mejora la
selectividad del medio de detección con respecto a gérmenes
distintos a las salmonelas (especialmente inhibición del
crecimiento de Proteus spp). La concentración de TERGITOL® 4
puede variar de 2 ml/l a 30 ml/l en el medio de cultivo a base de
gel agar-xilosa-lisina. Según este
documento, la detección de salmonelas se basa en parte en un
principio de crecimiento selectivo por competición. Además, este
medio no contiene sustratos de esterasa cromógenos o
fluorógenos.
La solicitud PCT WO-99/41409 se
refiere a sustratos de esterasa cromógenos para la detección de
salmonelas. Se propone según este documento poner en práctica un
compuesto cromógeno que reacciona con una esterasa/lipasa
específica del género Salmonella y que tiene una afinidad por
los ésteres de ácido graso de C8. El compuesto cromógeno del que se
trata comprende un anión y un catión de fórmula: [ácido
4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolinio-1-(propan-3-il-carboxílico]^{+},
^{-}[bromuro o cloruro].
Más precisamente, los sustratos puestos en
práctica son ésteres de C8, por ejemplo, catión carboxilato. Además,
el procedimiento según el documento WO 99/41409 describe la puesta
en práctica de éster de sorbitano y de ácidos grasos
(preferiblemente, ácido monoláurico: TWEEN® 20). Estos productos se
emplean como detergente en una proporción de 2 g por litro de medio
para mejorar la transparencia del medio antes de la siembra y la
coloración de las colonias diana para el sustrato de esterasa
cromógeno específico mencionado anteriormente. El Triton® X100 y el
Niaproof® 8 (=Tergitol® 8) son parte de los detergentes mencionados
en ese documento, entre una pluralidad de otros detergentes. No se
facilita ningún ejemplo de medio que contenga Triton® X100 o
Niaproof® 8 (=Tergitol® 8).
En cualquier caso, los medios dados a conocer en
el documento WO 99/41409 no se presentan como que procuran una
mejora de la selectividad, ni de la especificidad de los sustratos
enzimáticos contenidos en el medio de detec-
ción.
ción.
En tal entorno técnico, uno de los objetivos
esenciales de la presente invención es proporcionar un medio de
detección/identificación de microorganismos con actividad
esterásica, que está constituido de tal manera que se optimiza la
sensibilidad del análisis, es decir, que la intensidad de la
coloración que revela la presencia de microorganismos diana es la
más fuerte posible (promoción de la actividad esterasa).
Otro objetivo esencial de la presente invención
es proporcionar un medio de detección/identificación de
microorganismos con actividad esterásica, que es perfectamente
translúcido antes de la siembra por la muestra que va a
analizarse.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar un medio de detección/identificación de microorganismos
con actividad esterásica, que comprende un sustrato de esterasa
cromógeno o fluorógeno y que es estable en la conservación
(intensidad de las coloraciones de revelado mantenida a un nivel
máximo al menos durante varias
semanas).
semanas).
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar un medio de detección/identificación de microorganismos
con actividad esterásica, que no se presenta en forma de polvo seco
que debe regenerarse con un líquido para reconstituir un medio
líquido o gelificado, sino que existe directamente en formas listas
para su uso.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar un medio de detección/identificación de microorganismos
con actividad esterásica, que es económico, especialmente debido a
que comprende cantidades reducidas de sustrato de esterasa
cromógeno o fluorógeno, que tiene la particularidad de ser
costoso.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar un medio de detección/identificación de microorganismos
con actividad esterásica, en particular de enterobacterias
gram^{-}, por ejemplo salmonelas, de bacterias gram^{+} o de
levaduras.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar un procedimiento de obtención del medio de
detección/
identificación anteriormente mencionado que es sencillo de poner en práctica y económico.
identificación anteriormente mencionado que es sencillo de poner en práctica y económico.
Otro objetivo esencial de la presente invención
es proporcionar un procedimiento de detección/identificación de
cepas con actividad esterásica que es fácil de poner en práctica
(pruebas rutinarias), que es económico (cantidad de reactivo,
manipulación, mano de obra, velocidad...) que es fiable, sensible,
específico y reproducible.
Estos objetivos, entre otros, se logran por la
presente invención que se refiere en primer lugar a un medio de
detección/identificación de microorganismos con actividad
esterásica, del tipo de los que comprenden especialmente un medio
(M) de reacción (en particular un medio de cultivo) y al menos un
sustrato (S) de esterasa cromógeno o fluorógeno; basándose esta
detección/identificación esencialmente en la puesta en evidencia de
la actividad esterasa, caracterizado porque:
\global\parskip0.970000\baselineskip
- \ding{71}
- está en forma estable líquida o de gel lista para usar;
- \ding{71}
- comprende:
- \medcirc
- -A- al menos un agente solubilizante y estabilizante elegido del grupo que comprende:
- \circ
- los ésteres de sorbitano y de ácido(s) graso(s) (ESAG),
- \circ
- las sales biliares,
- \circ
- y sus mezclas;
- \medcirc
- -B- al menos un activador selectivo seleccionado del grupo que comprende:
- \sqbullet
- los compuestos de fórmula (I):
- \quad
- en la que:
- \bullet
- R es un alquilo lineal o ramificado, preferiblemente de C1-C30;
- \bullet
- X es un halógeno, preferiblemente Na;
- \ding{71}
- los derivados poliéteres no iónicos, preferiblemente los de fórmula (II):
- \quad
- N es un número entero comprendido entre 2 y 15 (de media = 10);
- \ding{71}
- y sus mezclas;
- \medcirc
- -C- y eventualmente al menos un disolvente.
El medio según la invención presenta la ventaja
de ofrecer coloraciones particularmente intensas de las colonias de
microorganismos diana con actividad esterasa. Esto facilita
enormemente la lectura y la interpretación de los resultados.
Resulta igualmente interesante observar que este
medio no favorece el crecimiento de los microorganismos que no
tienen una actividad esterasa. Esta especificidad es totalmente
beneficiosa para el análisis.
Resulta igualmente ventajoso que este medio esté
listo para usar y se presente en forma líquida o semilíquida (gel)
sin que ello suponga ningún problema en cuanto a la estabilidad. De
hecho, los sustratos de esterasa presentes en este medio y por
tanto conocidos por su tendencia a la degradación relativamente
rápida, se estabilizan gracias a la presencia de los aditivos A, B
y eventualmente C.
Estos aditivos inducen otra ventaja que es que
permiten una excelente disolución de los sustratos de esterasa
tradicionalmente resistentes a su disolución. Esto permite obtener
medios de detección/identificación translúcidos antes de la
siembra. La lectura de los resultados colorados o fluorescentes
resulta de este modo más fácil.
Finalmente, estos aditivos A, B y eventualmente
C son poco costosos y permiten una simplificación de la puesta en
práctica y una disminución de la cantidad de sustratos de esterasa
utilizada (estabilización). Resulta una ganancia económica
segura.
Es mérito de los inventores el haber
seleccionado esta clase particular de activadores B específicos y
haberlos asociado a los agentes (A) solubilizantes (por ejemplo los
ESAG o las sales biliares). De hecho, proporcionan de manera
sorprendente e inesperada propiedades de actividad biológica, de
sensibilidad, de fiabilidad, de especificidad, de estabilidad, de
selectividad y de translucidez totalmente beneficiosas en el
análisis microbiológico por vía bioquímica según la invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.940000\baselineskip
Según una característica notable de la
invención, el medio de detección/identificación al que se refiere se
obtiene mediante mezclado de al menos una disolución madre de
sustrato (S) en el disolvente (C) y agente (A) solubilizante,
añadida a al menos una parte de los constituyentes del medio (M) de
reacción con el promotor B.
De hecho parece importante según la invención
solubilizar el sustrato (S) de esterasa en el disolvente C, en
presencia de uno o varios agentes (A). A continuación se incorpora
esta mezcla sustrato (S)/(C)/(A) en al menos una parte del medio M
de cultivo, que se presenta, preferiblemente, en forma gelificada en
sobrefusión. Ha podido constatarse que esta característica
operativa permite una optimización de los resultados ventajosos
producidos por los medios según la invención. El aditivo (B) se
incorpora preferiblemente a continuación en el medio, tal como se
detallará a continuación en el presente documento.
Según la invención, el promotor (B) selectivo es
un producto de fórmula (I) en la que R corresponde a un radical
tetradecilo (Tergitol® o Niaproof® 4) o a un radical
2-etilhexilo (Tergitol® o Niaproof® 8). El promotor
(B) selectivo puede ser igualmente un éter de
mono-p-iso-octilfenilo
y de polietilenglicol de fórmula:
N es un número entero comprendido entre 2 y 15
(de media = 10). Estos productos se comercializan con las marcas
TRITON X- 100®, TRITON X- 114®, TRITON X- 405®.
Preferiblemente, el ESAG (A) se selecciona del
grupo que comprende:
- \ding{71}
- Monolaurato de sorbitano polioxietilenado que comprende 20 motivos de óxido de etileno (O.E), (TWEEN® 20);
- \ding{71}
- Monopalmitato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 40);
- \ding{71}
- Monoestearato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 60);
- \ding{71}
- Triestearato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 65);
- \ding{71}
- Monooleato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 80);
- \ding{71}
- Sesquioleato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 83);
- \ding{71}
- Trioleato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 85);
- \ding{71}
- y sus mezclas.
Los productos seleccionados anteriormente
(ésteres de sorbitano) se utilizan ampliamente en la industria
alimenticia y en la industria cosmética como emulsionantes no
iónicos, pero hasta ahora nunca se habían empleado en medios de
detección/identificación microbiológicos, como solubilizantes con
respecto a sustratos de esterasa, no susceptibles de reaccionar con
lipasas y diferentes de los ésteres de sales de carboxilato.
Los "equilibrios
hidrófilo-lipófilo" (HLB) de los ESAG
anteriormente mencionados son respectivamente: 8,6; 6,7; 4,7; 2,1;
4,3; 3,7; 1,8.
En el caso en el que los microorganismos
buscados son bacterias gram^{+} y/o levaduras, la concentración
en agente (B), expresada en ml por litro de medio (que comprende
especialmente: A, B, C, M, S) es tal que:
- \quad
- 1.10^{-4} \leq [B] \leq 10,
- preferiblemente
- 1.10^{-3} \leq [B] \leq 5,
- y aún más preferiblemente
- 1.10^{-2} \leq [B] \leq 2.
En el caso en el que los microorganismos
buscados son bacterias gram^{-}, la concentración en agente (B),
expresada en ml por litro de medio (que comprende especialmente: A,
B, C, M, S) es tal que:
- \quad
- 1.10^{-2} \leq [B] \leq 100,
- preferiblemente
- 1.10^{-1} \leq [B] \leq 30,
- y aún más preferiblemente
- 1 \leq [B] \leq 25.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El uso de esta combinación sinérgica
(B)/(A)/preferiblemente (C), facilita la puesta en evidencia de la
actividad esterasa en los microorganismos diana. Permite mejorar la
selectividad del medio y la detección de la actividad esterasa de
los microorganismos diana esterasa^{+} (por ejemplo
Salmonella), sin perjudicar la expresión de otras
actividades enzimáticas que podrían utilizarse eventualmente para la
puesta en evidencia de otros microorganismos diana considerados
(\beta-galactosidasa^{+} o
\beta-glucosidasa^{+}).
Sin querer quedar limitado por la teoría, se
supone que en esta combinación sinérgica, el compuesto (B) tiene
una acción que favorece la penetración de los sustratos de esterasa
cromógenos o fluorógenos o la excreción de enzimas a través de las
membranas de las células de los microorganismos diana, por ejemplo
de las salmonelas, aunque éstos últimos se hayan solubilizado bien
gracias a la acción de (A). Esto mejora la accesibilidad de estos
sustratos esterasa^{+}. En consecuencia, puede disminuirse la
cantidad de sustratos puestos en práctica y obtener una ventaja
económica segura.
Refiriéndose al sustrato (S) de esterasa
cromógeno o fluorógeno, se selecciona ventajosamente del grupo que
comprende:
- \medcirc
- los ésteres de ácido(s) graso(s) y de indoxilo y derivados, preferiblemente los ésteres de ácido(s) graso(s) de C6-C11 y de indoxilo, y aún más preferiblemente los ésteres de ácido(s) graso(s) de C8-C9 y de indoxilo eventualmente halogenados;
- \medcirc
- los ésteres de ácido(s) graso(s) y de quinona/antraquinona y derivados, preferiblemente los ésteres de áci-do(s) graso(s) de C6-C11 y de antraquinona, y aún más preferiblemente los ésteres de ácido(s) graso(s) de C8-C9 y de dihidroxiantraquinona (alizarina);
- \medcirc
- los ésteres de ácido(s) graso(s) y de hidroxicumarina y derivados;
- \medcirc
- los ésteres de ácidos graso y de fluoresceína y derivados;
- \medcirc
- y sus mezclas.
Como ejemplos de sustratos de ésteres cromógenos
derivados de indol, puede mencionarse el nonanoato de
5-bromo-3-indolilo,
el nonanoato de
6-cloro-3-indolilo o
el decanoato de
5-bromo-3-indolilo.
A título de ejemplos de sustratos de esterasa
cromógenos derivados de la antraquinona, puede mencionarse la
alizarina y el octanoato de 2-alizarina.
El disolvente (C) es un agente auxiliar de la
solubilización del sustrato de esterasa cromógeno o fluorógeno.
Completa igualmente la acción del agente (A) solubilizante. Por
tanto se trata preferiblemente de un constituyente del medio según
la invención.
Según una disposición ventajosa de ésta última,
el disolvente (C) se selecciona del grupo que comprende:
- \sqbullet
- alcoholes, preferiblemente metanol, etanol, metoxietanol;
- \sqbullet
- amidas, preferiblemente dimetilformamida (DMF);
- \sqbullet
- disolventes azufrados, preferiblemente dimetilsulfóxido (DMSO);
- \sqbullet
- y sus mezclas.
En la práctica, los disolventes utilizados son
el metanol, el DMF y el DMSO.
De manera aún más preferida, la asociación (A) =
TWEEN®20, (B) = NIAPROOF® 4 o TERGITOL® 4 y disolvente (C) =DMSO,
parece ser totalmente eficaz en el medio de detección/identificación
según la invención.
En el plano ponderal, resulta totalmente
ventajoso, según la invención, que la proporción de agente
(A):disolvente (C) esté comprendida entre 20:80 y 80:20,
preferiblemente entre 30:70 y 70:30, y aún más preferiblemente
corresponde a 40:60 o a 60:40.
Siempre en el plano cuantitativo, es preferible
que la concentración en agente [A] en el medio se defina tal como
sigue (en % en peso):
- \ding{71}
- 0,1 \leq [A] \leq 10,
- \ding{71} preferiblemente
- 0,5 \leq [A] \leq 5,
- \ding{71} y aún más preferiblemente
- 1,5 \leq [A] \leq 3,5.
Refiriéndose al sustrato (S) de esterasa
cromógeno, las cantidades puestas en práctica son tales que su
concentración en el medio se define tal como sigue (en mg/l):
- \ding{71}
- 50 \leq [sustrato] \leq 1000,
- \ding{71} preferiblemente
- 100 \leq [sustrato] \leq 800,
- \ding{71} y aún más preferiblemente
- 200 \leq [sustrato] \leq 600.
A propósito del medio de cultivo (M) presente en
el medio detección/identificación, puede precisarse que se
selecciona del grupo que comprende:
- los medios selectivos de tipo Mac Conkey,
Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud
gentamicina-cloramfenicol, preferiblemente el medio
Mac Conkey,
- los medios no selectivos de tipo Columbia +/-
sangre, tripticasa de soja, gelosa nutritiva, Sabouraud,
preferiblemente el medio Columbia.
En la práctica, el experto en la técnica elegirá
el medio de cultivo (M) en función de los microorganismos diana,
según criterios perfectamente conocidos y al alcance del experto en
la técnica.
Sin que sea limitativo, resulta que el medio
según la invención está particularmente adaptado a la
detección/identifi-
cación de bacterias del género Salmonella. En ese caso, se elegirá por ejemplo el medio de Mac Conkey como medio de cultivo.
cación de bacterias del género Salmonella. En ese caso, se elegirá por ejemplo el medio de Mac Conkey como medio de cultivo.
Además, el medio según la invención puede
contener otros aditivos eventuales tales como por ejemplo: uno o
varios otros sustratos enzimáticos por ejemplo cromógenos o
fluorógenos, peptonas, uno o varios factores de crecimiento,
hidratos de carbono, uno o varios agentes selectivos, tampones,
gelificantes.
El medio según la invención se presenta en forma
de líquido o de gel listo para su uso, es decir, listo para la
siembra en tubo, frasco o placas Petri.
El medio según la invención puede conservarse
durante varias semanas a 4ºC en sus recipientes y en forma líquida
o de gel.
Según otro de sus aspectos, la presente
invención se refiere igualmente a un procedimiento de obtención del
medio tal como se definió anteriormente caracterizado porque
consiste esencialmente en:
- \ding{71}
- preparar al menos una disolución madre del sustrato (S) de esterasa cromógeno o fluorógeno en el disolvente C y de al menos un agente A solubilizante,
- \ding{71}
- añadir esta disolución al medio (M) de cultivo,
- \ding{71}
- incorporar el detergente (B) y otros aditivos eventuales a la mezcla S + A + C + M,
y homogeneizar el
conjunto.
La preparación de la disolución madre se realiza
de manera separada incorporando sucesivamente el disolvente (C), el
sustrato (S) y el agente (A) (eventualmente con aditivos). Los
productos y las cantidades utilizadas son tal como se definieron
anteriormente. Tras la homogeneización, se añade la disolución madre
al medio (M) de cultivo gelificado sometido a sobrefusión y
previamente regenerado en agua. Puede tratarse igualmente de un
medio líquido no gelificado, tal como por ejemplo un caldo
nutritivo.
Tras mezclar el medio (M) de cultivo y la
disolución madre se obtiene el medio de detección líquido o
gelificado listo para sembrarse.
Según otro más de sus aspectos, la invención
tiene igualmente por objetivo un procedimiento de
detección/identifi-
cación de cepas esterasa^{+} (por ejemplo salmonelas) que consiste en:
cación de cepas esterasa^{+} (por ejemplo salmonelas) que consiste en:
- \medcirc
- sembrar el medio de detección/identificación tal como se definió anteriormente como producto en sí mismo o como producto obtenido mediante el procedimiento igualmente descrito anteriormente, con la muestra susceptible de contener los microorganismos que van a analizarse,
- \medcirc
- incubar el medio sembrado en condiciones apropiadas conocidas por el experto en la técnica,
- \medcirc
- y leer e interpretar las coloraciones o fluorescencias de las colonias que se desarrollan tras la incubación, por ejemplo en la estufa a 37ºC; revelando estas coloraciones o fluorescencias la hidrólisis del sustrato de esterasa cromógeno o fluorógeno por los microorganismos diana.
Finalmente, la invención se refiere igualmente
al uso en una composición que comprende un agente A tal como se
definió anteriormente como activador selectivo, de al menos un
producto (B) seleccionado del grupo que comprende:
\sqbullet los compuestos de fórmula (I):
en la
que:
- \medcirc
- R es un alquilo lineal o ramificado, preferiblemente de C1-C30;
- \medcirc
- X es un halógeno, preferiblemente Na;
\ding{71} los derivados poliéteres no iónicos,
preferiblemente los de fórmula (II):
N es un número entero comprendido entre 2 y 15
(de media = 10);
\ding{71} y sus mezclas.
Los ejemplos que siguen permitirán comprender
mejor la invención y constatar todas sus ventajas así como sus
diversas variantes de realización y de puesta en práctica.
Ejemplo
1
El sustrato de esterasa sometido a prueba es el
nonanoato de
5-bromo-3-indolilo.
Se realiza una disolución madre de sustrato a 40 g/l en una mezcla
del 40% de dimetilsulfóxido y el 60% de Tween® 20. Se añade un
volumen suficiente a un medio Mac Conkey (sin rojo neutro) en
sobrefusión para obtener una concentración en sustrato de 500
mg/l.
Entonces se separa este medio en cinco medios,
en cada uno de ellos se añade una concentración definida de
Tergitol® 4 (véase la tabla a continuación). Se sembraron
microorganismos procedentes de la colección del solicitante en este
medio mediante aislamiento en tres cuadrantes a partir de una
suspensión a 0,5 McFarland. Se incubaron las placas a 37ºC durante
48 horas. Se examinaron visualmente las colonias formadas tras 24 y
48 horas de incubación. Se observó la coloración de estas colonias
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 1 a continuación:
A una concentración comprendida entre 2 y 16
ml/l, y más precisamente entre 4 y 8 ml/ 1, el Tergitol® 4 aumenta
de manera significativa la intensidad de coloración de las cepas
bacterianas que presentan una actividad esterasa. La concentración
más eficaz depende de las cepas y también del efecto buscado. Para
ciertas cepas parece incluso posible aumentar aún más esta
concentración.
Ejemplo
2
El sustrato de esterasa sometido a prueba es el
nonanoato de
5-bromo-3-indolilo.
Se realiza una disolución madre de sustrato a 25 g/l en metanol con
adición de 5 g/l de sales biliares. Se añade un volumen suficiente
a un medio Mac Conkey (sin rojo neutro) en sobrefusión para obtener
una concentración en sustrato de 500 mg/l.
Entonces se separa este medio en cinco medios,
en cada uno de los cuales se añade una concentración definida de
Tergitol® 4 (véase la tabla a continuación). Se sembraron
microorganismos procedentes de la colección del solicitante en este
medio mediante aislamiento en tres cuadrantes a partir de una
suspensión a 0,5 McFarland. Se incubaron las placas a 37ºC durante
48 horas. Se examinaron visualmente las colonias formadas tras 24 y
48 horas de incubación. Se observó la coloración de estas colonias
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 2 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
A una concentración comprendida entre 2 y 16
ml/l, y más precisamente entre 4 y 8 ml/l, el Tergitol® 4 aumenta
de manera significativa la intensidad de coloración de cepas
bacterianas que presentan una actividad esterasa. La concentración
más eficaz depende de las cepas. Estos resultados muestran
claramente que el efecto de Tergitol® 4 sobre la actividad esterasa
no depende del modo de uso del sustrato.
Ejemplo
3
El sustrato de esterasa sometido a prueba es el
nonanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
Se realiza una disolución madre de sustrato a 40 g/l en un mezcla
de un 40% de dimetilsulfóxido y un 60% de Tween® 20. Se añade un
volumen suficiente a un medio Mac Conkey (sin rojo neutro) en
sobrefusión para obtener una concentración en sustrato de 250
mg/l.
Entonces se separa este medio en seis medios, en
cada uno de los cuales se añade una concentración definida de
Tergito® 4 (véase la tabla a continuación). Se sembraron
microorganismos procedentes de la colección del solicitante en este
medio mediante aislamiento en tres cuadrantes a partir de una
suspensión a 0,5 McFarland. Se incubaron las placas a 37ºC durante
48 horas. Se examinaron visualmente las colonias formadas tras 24 y
48 horas de incubación. Se observó la coloración de estas colonias
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 3 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La elección de concentraciones en Tergitol® 4
muy inferiores a las sometidas a prueba en los ejemplos anteriores
estuvo dictada por el tipo de cepas sometidas a prueba. De hecho, se
trata de bacterias gram positivas o bien de levaduras; ahora bien,
a concentraciones muy importantes en Tergitol 4 este tipo de cepas
no pueden desarrollarse en un medio de cultivo.
De la misma manera que en los ejemplos
anteriores, es posible observar un efecto positivo de Tergitol® 4
sobre la expresión de la actividad esterasa de los microorganismos
sometidos a prueba. Este efecto es variable de una especie
bacteriana a otra. La elección de una concentración en Tergitol® 4
depende también de la especie. De manera general, las
concentraciones eficaces para las bacterias gram positivas y las
levaduras son muy inferiores a las utilizadas para las bacterias
gram negativas. No obstante, a las concentraciones sometidas a
prueba es posible observar un ligero impacto positivo sobre la
coloración de las bacterias gram negativas sometidas a prueba en
este
ejemplo.
ejemplo.
Ejemplo
4
El sustrato de esterasa sometido a prueba es el
nonanoato de
5-bromo-3-indolilo.
Se realizó una disolución madre de sustrato a 40 g/l en una mezcla
de un 40% de dimetilsulfóxido y un 60% de Tween 20. Se añade un
volumen suficiente a un medio Mac Conkey (sin rojo neutro) en
sobrefusión para obtener una concentración en sustrato de 500
mg/l.
Entonces se separa este medio en ocho medios. Se
reparte directamente el primer medio en placas Petri, en un segundo
medio se añaden 8 ml/l de Tergitol® 4, en los tres siguientes se
añade Tergitol® 8 a las concentraciones de 2, 4 y 8 ml/l,
finalmente los tres últimos contienen Triton® X100 a 8, 16 y 32
ml/l. Se sembraron microorganismos procedentes de la colección del
solicitante en este medio mediante aislamiento en tres cuadrantes a
partir de una suspensión a 0,5 McFarland. Se incubaron las placas a
37ºC durante 48 horas. Se examinaron visualmente las colonias
formadas tras 24 y 48 horas de incubación. Se observó la coloración
de estas colonias así como la intensidad de esta coloración. Los
resultados se presentan en las tablas 4 y 5 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a prueba previamente diferentes
intervalos de concentraciones con el fin de estudiar el efecto de
estos compuestos sobre el crecimiento bacteriano. Se retuvieron
entonces los puntos más interesantes para este ejemplo.
En las condiciones experimentales sometidas a
prueba, el Tergito® 8 y el Triton® X100 no permiten obtener un
efecto tan marcado sobre la actividad esterasa como el observado con
Tergitol® 4.
Nota: En los ejemplos anteriores, los números
adjuntos a las cepas corresponden al número de cada cepa
referenciada en la colección del solicitante. La intensidad de
coloración corresponde a una escala arbitraria cuyo significado es
el siguiente:
- 0
- sin actividad
- 0,1
- trazas de coloración
- 0,5
- coloración muy pálida
- 1
- coloración neta de intensidad débil
- 2
- coloración completa de intensidad media
- 3
- coloración intensa
- 4
- coloración muy intensa.
Claims (15)
1. Medio de detección/identificación de
microorganismos con actividad esterásica, del tipo de los que
comprenden especialmente un medio (M) de reacción y al menos un
sustrato (S) de esterasa cromógeno o fluorógeno; basándose
esencialmente esta detección/identificación en la puesta en
evidencia de la actividad esterasa, caracterizado porque:
- \ding{71}
- está en forma de líquido estable o gel listo para usar;
- \ding{71}
- comprende:
- \medcirc
- -A- al menos un agente solubilizante y estabilizante elegido del grupo que comprende:
- \circ
- los ésteres de sorbitano y de ácido(s) graso(s) (ESAG),
- \circ
- las sales biliares,
- \circ
- y sus mezclas;
- \medcirc
- -B- al menos un activador selectivo seleccionado del grupo que comprende:
- \sqbullet
- los compuestos de fórmula (I):
- \quad
- en la que:
- \bullet
- R es un alquilo lineal o ramificado, preferiblemente de C1-C30;
- \bullet
- X es un halógeno, preferiblemente Na;
- \ding{71}
- los derivados poliéteres no iónicos, preferiblemente los de fórmula (II):
- \quad
- N es un número entero comprendido entre 2 y 15 (de media = 10);
- \ding{71}
- y sus mezclas;
- \medcirc
- -C- y eventualmente al menos un disolvente.
2. Medio según la reivindicación 1
caracterizado porque se obtiene mezclando al menos una
disolución madre de sustrato (S) en el disolvente (C) y agente (A)
solubilizante añadido a al menos una parte de los constituyentes del
medio (M) de reacción con el promotor (B).
3. Medio según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el promotor (B) selectivo es un producto
de fórmula (I) en la que R corresponde a un radical tetradecilo
(Tergitol® o Niaproof® 4) o a un radical
2-etilhexilo (Tergitol® o Niaproof® 8).
\global\parskip0.950000\baselineskip
4. Medio según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el ESAG (A) se selecciona del grupo que
comprende:
- \ding{71}
- Monolaurato de sorbitano polioxietilenado que comprende 20 motivos de óxido de etileno (O.E), (TWEEN® 20);
- \ding{71}
- Monopalmitato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 40);
- \ding{71}
- Monoestearato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 60);
- \ding{71}
- Triestearato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 65);
- \ding{71}
- Monooleato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 80);
- \ding{71}
- Sesquioleato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 83);
- \ding{71}
- Trioleato de sorbitano polioxietilenado (20 O.E), (TWEEN® 85);
y sus
mezclas.
5. Medio según la reivindicación 1,
caracterizado porque los microorganismos buscados son
bacterias gram^{+} y/o levaduras y porque la concentración de
agente B, expresada en ml por litro de medio (que comprende
especialmente: A, B, C, M, S) es tal que:
- \quad
- 1.10^{-4} \leq [B] \leq 10,
- preferiblemente
- 1.10^{-3} \leq [B] \leq 5,
- y aún más preferiblemente
- 1.10^{-2} \leq [B] \leq 2.
6. Medio según la reivindicación 1,
caracterizado porque los microorganismos buscados son
bacterias gram^{-} y porque la concentración de agente B,
expresada en ml por litro de medio (que comprende especialmente: A,
B, C, M, S) es tal que:
- \quad
- 1.10^{-2} \leq [B] \leq 100,
- preferiblemente
- 1.10^{-1} \leq [B] \leq 30,
- y aún más preferiblemente
- 1 \leq [B] \leq 25.
7. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el sustrato de
esterasa cromógeno o fluorógeno se selecciona del grupo que
comprende:
- los ésteres de ácido(s) graso(s)
y de indoxilo y derivados, preferiblemente los ésteres de
ácido(s) graso(s) de C6-C11 y de
indoxilo, y aún más preferiblemente los ésteres de ácido(s)
graso(s) de C8-C9 y de indoxilo eventualmente
halogenados;
- los ésteres de ácido(s) graso(s)
y de quinona/antraquinona y derivados, preferiblemente los ésteres
de ácido(s) graso(s) de C6-C11 y de
antraquinona, y aún más preferiblemente los ésteres de
ácido(s) graso(s) de C8-C9 y de
dihidroxiantraquinona (alizarina);
- los ésteres de ácido(s) graso(s)
y de hidroxicumarina y derivados;
- los ésteres de ácidos graso y de fluoresceína
y derivados;
- y sus mezclas.
8. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el disolvente C
se selecciona del grupo que comprende:
\sqbullet alcoholes, preferiblemente metanol,
etanol, metoxietanol;
\sqbullet amidas, preferiblemente
dimetilformamida (DMF);
\sqbullet disolventes azufrados,
preferiblemente dimetilsulfóxido (DMSO);
\sqbullet y sus mezclas.
9. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque la proporción
ponderal agente (A):disolvente (C) está comprendida entre 20:80 y
80:20, preferiblemente está comprendida entre 30:70 y 70:30, y aún
más preferiblemente corresponde a 40:60 o a 60:40.
10. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque la concentración
de agente [A] en el medio se define tal como sigue (en % en
peso):
- \ding{71}
- 0,1 \leq [A] \leq 10,
- \ding{71} preferiblemente
- 0,5 \leq [A] \leq 5.
- \ding{71} y aún más preferiblemente
- 1,5 \leq [A] \leq 3,5.
\global\parskip1.000000\baselineskip
11. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque la
concentración de sustrato [S] en el medio se define tal como sigue
(en mg/l):
- \ding{71}
- 50 \leq [S] \leq 1000,
- \ding{71} preferiblemente
- 100 \leq [S] \leq 800,
- \ding{71} y aún más preferiblemente
- 200 \leq [S] \leq 600.
12. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque el medio (M) de
cultivo que comprende se selecciona del grupo que comprende:
- los medios selectivos de tipo Mac Conkey,
Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud
gentamicina-cloramfenicol, preferiblemente el medio
Mac Conkey,
- los medios no selectivos de tipo Columbia +/-
sangre, tripticasa de soja, gel agar nutritivo, Sabouraud,
preferiblemente el medio Columbia.
13. Medio según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 caracterizado porque las bacterias
que van a detectarse/identificarse son salmonelas.
14. Procedimiento de obtención del medio según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 caracterizado
porque consiste esencialmente en:
- \ding{71}
- preparar al menos una disolución madre del sustrato (S) de esterasa cromógeno o fluorógeno en el disolvente C y de al menos un agente A solubilizante,
- \ding{71}
- añadir esta disolución al medio (M) de reacción,
- \ding{71}
- incorporar el detergente (B) y otros aditivos eventuales a la mezcla S+A+C+M,
- \ding{71}
- y homogeneizar el conjunto.
15 Procedimiento de detección/identificación de
cepas con actividad esterásica caracterizado porque consiste
en:
- \ding{71}
- sembrar el medio según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o el medio obtenido mediante el procedimiento según la reivindicación 14, con la muestra susceptible de contener los microorganismos que van a analizarse, detectarse/identificarse,
- \ding{71}
- incubar el medio sembrado en condiciones apropiadas,
- \ding{71}
- y leer e interpretar las coloraciones o fluorescencias de las colonias, coloraciones o fluorescencias que revelan la hidrólisis del sustrato por los microorganismos diana.
16. Uso en una composición que comprende un
agente A tal como se definió en la reivindicación 1 y eventualmente
un disolvente, como activador selectivo, es decir, como compuesto
que favorece la penetración de los sustratos de esterasa cromógenos
o fluorógenos o la excreción de enzimas a través de las membranas
de las células de los microorganismos diana, de al menos un producto
(B) seleccionado del grupo que comprende:
\sqbullet los compuestos de fórmula (I):
en la
que:
- \bullet
- R es un alquilo lineal o ramificado, preferiblemente de C1-C30;
- \bullet
- X es un halógeno, preferiblemente Na;
\newpage
\ding{71} los derivados poliéteres no iónicos,
preferiblemente los de fórmula (II):
N es un número entero comprendido entre 2 y 15
(de media = 10);
\ding{71} y sus mezclas.
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