ES2292753T3 - Inhibidores de quinasas n-terminales c-jun (jnk) y otras proteinas quinasas. - Google Patents

Inhibidores de quinasas n-terminales c-jun (jnk) y otras proteinas quinasas. Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula I o II: (Ver fórmula) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: cada W se selecciona independientemente entre nitrógeno o CH; R 1 , R 2 y R 3 se seleccionan independientemente entre OH, OCH3, OCH2CH3, NHCOMe, NH2, NH (grupo alifático C1 - 4), N(grupo alifático C1 - 4)2, O(CH2)2morfolin-4-ilo, O(CH2)2NH2, O(CH2)2NH(grupo alifático C1 - 4), O(CH2)2N (grupo alifático C1 - 4)2, bromo, cloro o flúor; o (Ver fórmula) R 1 y R 2 o R 2 y R 3 se toman juntos para formar R 4 es un anillo fenilo, ciclohexilo, naftilo, piridilo, pirimidinilo, triazinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, indazolilo o bencimidazolilo sustituido; donde dicho anillo está sustituido con 1-2 grupos seleccionados independientemente entre cloro, flúor, bromo, metilo, etilo, t-butilo, isopropilo, ciclopropilo, CF3, NH2, bencilo, benciloxi, OH-, metilendioxi, SO2NH2, fenoxi, O-piridinilo, SO2fenilo, nitrofenoxi, aminofenoxi, S-dimetilpirimidina, NH-fenilo, NH-metoxifenilo, piridinilo, aminofenilo, fenol, cloro-fluoro-fenilo, dimetilaminofenilo, CF3-fenilo, dimetilfenilo, clorofenilo, fluorofenilo, metoxifenoxi, clorofenoxi, etoxifenoxi o fluorofenoxi; con la condición de que: dicho compuesto sea distinto de un compuesto de fórmula III (Ver fórmula)

Description

Inhibidores de quinasas N-terminales c-Jun (JNK) y otras proteína quinasas.
Referencia cruzada para la solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 60/279.961, presentada el 29 de marzo de 2001, cuyo contenido se incorpora en este documento como referencia.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a inhibidores de proteína quinasas, especialmente quinasas N-terminales c-Jun (JNK) y la familia de quinasas Src, que son miembros de la familia de proteína quinasas activadas por mitógeno (MAP). Hay varios genes e isoformas diferentes que codifican JNK. Los miembros de la familia JNK regulan la transducción de señales en respuesta al estrés ambiental y a citoquinas proinflamatorias y se han implicado en la mediación de varios trastornos diferentes. Los miembros de la familia Src están implicados en varias enfermedades humanas. La invención también se refiere a inhibidores de la quinasa GSK3, que está implicada en la diabetes y en otros trastornos, y la quinasa CDK2 que participa en la regulación del ciclo de división celular. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los inhibidores de la invención y métodos para utilizar esas composiciones en el tratamiento y prevención de diversos trastornos.
Antecedentes de la invención
Las células de mamífero responden a estímulos extracelulares por medio de la activación de cascadas de señalización que están mediadas por miembros de la familia de proteína quinasas activadas por mitogeno (MAP), que incluye las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), las MAP quinasas p38 y las quinasas N-terminales c-Jun (JNK). Las MAP quinasas (MAPK) se activan por una diversidad de señales que incluyen factores de crecimiento, citoquinas, radiciación UV y agentes inductores de estrés. Las MAPK son serina/treonina quinasas y su activación se produce por la fosforilación doble de treonina y tirosina en el segmento Thr-X-Tyr en el bucle de activación. Las MAPK fosforilan diversos sustratos incluyendo factores de transcripción, que a su vez regulan la expresión de series específicas de genes y, de esta manera, median una respuesta específica al estímulo.
En las proteína quinasas NH_{2}-terminales c-Jun, también conocidas como JNK, se han identificado tres genes distintos, JNK1, JNK2 y JNK3, y existen al menos 10 isoformas de corte y empalme diferentes de JNK en células de mamífero [Gupta et al., EMBO J., 15:2760-70 (1996)]. Los miembros de la familia JNK se activan por citoquinas proinflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral-\alpha (TNF\alpha) y la interleuquina-1 \beta (IL-1\beta), así como por el estrés ambiental, incluyendo anisomicina, irradiación UV, hipoxia y choque osmótico [Minden et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1333:F85-F104 (1997)].
Los sustratos corriente abajo de las JNK incluyen factores de transcripción c-Jun, ATF-2, Elk1, p53 y una proteína del dominio de muerte celular (DENN) [Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2586-91 (1998)]. Cada isoforma de JNK se une a estos sustratos con diferentes afinidades, lo que sugiere una regulación de las rutas de señalización por especificidad de sustrato de diferentes JNK in vivo (Gupta et al., supra).
Las JNK, junto con otras MAPK, se han implicado en la mediación de la respuesta celular a cánceres, la agregación plaquetaria inducida por trombina, trastornos de inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunes, muerte celular, alergias, osteoporosis y enfermedad cardíaca. Las situaciones terapéuticas relacionadas con la activación de la ruta de JNK incluyen leucemia mielógena crónica (CML), artritis reumatoide, asma, osteoartritis, isquemia, cáncer y enfermedades neurodegenerativas.
Varios informes han detallado la importancia de la activación de JNK asociada con la enfermedad hepática o con episodios de isquemia hepática [Nat. Genet. 21:326-9 (1999); FEBS Lett. 420:201-4 (1997); J. Clin. Invest. 102:1942-50 (1998); Hepatology 28:1022-30 (1998)].
También se ha notificado un papel de la JNK en enfermedades cardiovasculares tales como el infarto de miocardio o la insuficiencia cardíaca congestiva, ya que se ha demostrado que JNK media respuestas hipertróficas a diversas formas de estrés cardíaco [Circ. Res. 83:167-78 (1998); Circulation 97:1731-7 (1998); J. Biol. Chem. 272:28050-6 (1997); Circ. Res. 79:162-73 (1996); Circ. Res. 78:947-53 (1996); J. Clin. Invest. 97:508-14 (1996)].
Se ha demostrado que la cascada de JNK también participa en la activación de células T, incluyendo la activación del promotor de IL-2. De esta manera, los inhibidores de JNK podrían tener un valor terapéutico en la alteración de respuestas inmunes patológicas [J. Immunol. 162:3176-87 (1999); Eur. J. Immunol. 28:3867-77 (1998); J. Exp. Med. 186:941-53 (1997); Eur. J. Immunol. 26:989-94 (1996)].
También se ha establecido un papel para la activación de JNK en diversos cánceres, lo que sugiere la posibilidad del uso de inhibidores de JNK en cánceres. Por ejemplo, la JNK activada constitutivamente está asociada con la tumorigénesis mediada por HTLV-1 [Oncogene 13:135-42 (1996)]. Los efectos proliferativos de bFGF y OSM sobre células de sarcoma de Kaposi (KS) están mediados por su activación de la ruta de señalización de JNK [J. Clin. Invest. 99:1798-804 (1997)].
Otros efectos proliferativos de otras citoquinas implicadas en la proliferación de KS, tales como el factor de crecimiento del endoteliol vascular (VEGF), IL-6 y TNF\alpha, también están mediados por JNK. Además, la regulación del gen c-jun en células transformadas con p210 BCR-ABL se corresponde con la actividad de JNK, lo que sugiere un papel de los inhibidores de JNK en el tratamiento de la leucemia mielógena crónica (CML) [Blood 92:2450-60 (1998)].
JNK1 y JNK2 se expresan ampliamente en varios tejidos. Por el contrario, JNK3 se expresa selectivamente en el cerebro y en una menor medida en el corazón y en los testículos [Gupta et al., supra; Mohit et al., Neuron 14:67-78 (1995); Martin et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 35:47-57 (1996)]. JNK3 se ha asociado a la apoptosis neuronal inducida por ácido kaínico, lo cual indica un papel de JNK en la patogénesis de la neurotoxicidad de glutamato. En el cerebro humano adulto, la expresión de JNK3 está localizada en una subpoblación de neuronas piramidales en las regiones CA1, CA4 y del subículo del hipocampo y en las capas 3 y 5 del neocórtex [Mohit et al., supra]. Las neuronas CA1 de pacientes con hipoxia aguda mostraron una fuerte inmunorreactividad con JNK3 nuclear en comparación con la tinción citoplásmica difusa mínima de las neuronas del hipocampo de tejidos cerebrales de pacientes normales [Zhang et al., supra]. De esta manera, JNK3 parece estar implicada en las lesiones hipóxicas e isquémicas de neuronas CA1 del hipocampo.
Además, JNK3 se colocaliza inmunoquímicamente con neuronas vulnerables en la enfermedad de Alzheimer [Mohit et al., supra]. La ruptura del gen JNK3 produjo resistencia de ratones al agonista del receptor de glutamato excitotóxico ácido kaínico, incluyendo los efectos sobre la actividad de ataques, la actividad transcripcional de AP-1 y la apoptosis de neuronas del hipocampo, indicando que la ruta de señalización de JNK3 es un componente crítico en la patogénesis de la neurotoxicidad del glutamato (Yang et al., Nature, 389:865-870 (1997)].
Basándose en estos descubrimientos, la señalización de JNK, especialmente la de JNK3, se ha implicado en las áreas de enfermedades neurodegenerativas dirigidas por apoptosis tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, ALS (esclerosis lateral amiotrófica), epilepsia y ataques, enfermedad de Huntington, lesiones traumáticas cerebrales, así como ictus isquémico y hemorrágico.
Existe una gran necesidad médica no satisfecha de crear inhibidores específicos de JNK que sean útiles en el tratamiento de las diversas afecciones asociadas con la activación de JNK, especialmente considerando las opciones de tratamiento relativamente inadecuadas disponibles actualmente para la mayoría de estas afecciones.
La familia de quinasas Src está implicada en cánceres, en disfunciones del sistema inmune y en enfermedades de remodelación ósea. Como revisiones generales, véase Thomas y Brugge, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. (1997) 13, 513; Lawrence y Niu, Pharmacol. Ther. (1998) 77, 81; Tatosyan y Mizenina, Biochemistry (Moscow) (2000) 65, 49; Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25 (7), 717, (2000).
Los miembros de la familia Src incluyen las ocho siguientes quinasas de mamíferos: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck, Blk e Yrc. Éstas son proteína quinasas no asociadas a receptores que varían en masa molecular de 52 a 62 kD. Se caracterizan por una organización estructural común que comprende seis dominios funcionales distintos: el dominio de homología a Src 4 (SH4), un dominio único, el dominio SH3, el dominio SH2, un dominio catalítico (SH1) y una región reguladora C-terminal. Tatosyan et al. Biochemistry (Moscow) 65, 49-58 (2000).
Basándose en estudios publicados, las quinasas Src se consideran posibles dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Los ratones con deficiencias en Src desarrollan osteopetrosis, o acumulación de hueso, debido a que padecen una resorción ósea por los osteoclastos reducida. Esto sugiere que la osteoporosis debida a una resorción ósea anormalmente elevada puede tratarse inhibiendo Src. Soriano et al., Cell, 69, 551 (1992) y Soriano et al., Cell, 64, 693 (1991).
Se ha conseguido una supresión de la destrucción del hueso artrítico por medio de la sobreexpresión de CSK en sinoviocitos y osteoclastos reumatoides. Takayanagi et al., J. Clin. Invest., 104, 137 (1999). La CSK, o quinasa Src C-terminal, fosforila y por lo tanto inhibe la actividad catalítica de Src. Esto implica que la inhibición de Src puede prevenir la destrucción de la articulación que es característica en pacientes que padecen artritis reumatoide. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717, (2000).
Src también juega un papel en la replicación del virus de la hepatitis B. El factor de transcripción codificado viralmente HBx activa a Src en una etapa necesaria para la propagación del virus. Klein et al., EMBO J., 18, 5019, (1999) y Klein et al., Mol.Cell. Biol., 17, 6427 (1997).
Varios estudios han asociado la expresión de Src a cánceres tales como cáncer de colon, de mama, hepático y pancreático, ciertas leucemias de células B y linfomas. Talamonti et al., J. Clin. Invest., 91, 53 (1993); Lutz et al., Biochem. Biophys. Res. 243, 503 (1998); Rosen et al., J. Biol. Chem., 261, 13754 (1986); Bolen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2251 (1987); Masaki et al., Hepatology, 27, 1257 (1998); Biscardi et al., Adv. Cancer Res., 76, 61 (1999); Lynch et al., Leukemia, 7, 1416 (1993); Además, se ha demostrado que el ácido nucleico de Src antisentido expresado en células tumorales de ovario y colon inhibe el crecimiento tumoral. Wiener et al 1., Clin. Cancer Res., 5, 2164 (1999); Staley et a., Cell Growth Diff., 8, 269 (1997).
Otras quinasas de la familia Src también son posibles dianas terapéuticas. LcK participa en la señalización de células T. Los ratones que carecen del gen LcK tienen poca capacidad de desarrollar timocitos. La función de LcK como activador positivo de la señalización de células T sugiere que los inhibidores de LcK pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide. Molina et al., Nature, 357, 161 (1992). Hck, Fgr y Lyn se han identificado como mediadores importantes de la señalización de integrina en leucocitos mieloides. Lowell et al., J. Leukoc. Biol., 65, 313 (1999). La inhibición de estos mediadores de quinasa, por lo tanto, puede ser útil para tratar la inflamación. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717, (2000).
La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) es una serina/treonina proteína quinasa compuesta por isoformas \alpha y \beta que se codifican por distintos genes [Coghlan et al., Chemistry & Biology, 7, 793-803 (2000); Kim y Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 10, 508-514 (2000)]. GSK-3 se ha implicado en diversas enfermedades que incluyen diabetes, enfermedad de Alzheimer, trastornos del SNC tales como trastorno maníaco depresivo y enfermedades neurodegenerativas, e hipertrofia de cardiomiocitos [documentos WO 99/65897; WO 00/38675; y Haq et al., J. Cell Biol. (2000) 151, 117]. Estas enfermedades pueden producirse u ocasionar un funcionamiento anómalo de ciertas rutas de señalización celular en las que participa GSK-3. Se ha descubierto que GSK-3 fosforila y modula la actividad de varias proteínas reguladoras. Éstas incluyen la glucógeno sintasa, que es la enzima limitante de la velocidad necesaria para la síntesis de glucógeno, la proteína Tau, asociada con microtúbulos, el factor de transcripción de genes \beta-catenina, el factor de inicio de la traducción e1F2B, así como la ATP citrato liasa, axina, el factor de choque térmico-1, c-Jun, c-Myc, c-Myb, CREB y CEPB\alpha. Estas diversas dianas implican a GSK-3 en muchos aspectos del metabolismo celular, la proliferación, la diferenciación y el desarrollo.
En una ruta mediada por GSK-3, que es relevante para el tratamiento de la diabetes de tipo II, la señalización inducida por insulina conduce a la captación de glucosa celular y a la síntesis de glucógeno. A lo largo de esta ruta, GSK-3 es un regulador negativo de la señal inducida por insulina. Normalmente, la presencia de insulina produce la inhibición de la fosforilación mediada por GSK-3 y la desactivación de la glucógeno sintasa. La inhibición de GSK-3 conduce a un aumento de la síntesis de glucógeno y de la captación de glucosa [Klein et al., PNAS, 93, 8455-9 (1996); Cross et al., Biochem. J., 303, 21-26 (1994); Cohen, Biochem. Soc. Trans., 21, 555-567 (1993); Massillon et al., Biochem J. 299, 123-128 (1994)].
Sin embargo, en un paciente diabético donde está alterada la respuesta a la insulina, la síntesis de glucógeno y la captación de glucosa no pueden aumentar a pesar de la presencia de niveles sanguíneos relativamente elevados de insulina. Esto lleva a unos niveles de glucosa sanguínea anormalmente elevados con efectos agudos y a largo plazo que finalmente pueden producir enfermedad cardiovascular, insuficiencia renal y ceguera. En estos pacientes, no se puede producir la inhibición normal inducida por insulina de JSK-3. También se ha notificado que en pacientes con diabetes de tipo II se sobreexpresa la GSK-3 [documento WO 00/38675]. Por lo tanto, los inhibidores terapéuticos de GSK-3 son potencialmente útiles para tratar a pacientes diabéticos que padecen una alteración de la respuesta a la insulina.
La actividad de GSK-3 también se ha asociado con la enfermedad de Alzheimer. Esta enfermedad se caracteriza por el péptido \beta-amiloide bien conocido y por la formación de ovillos neurofibrilares. Los ovillos neurofibrilares contienen proteína Tau hiperfosforilada, donde Tau se fosforila en sitios anormales. Se ha demostrado que la GSK-3 fosforila estos sitios anormales en modelos celulares y en modelos animales. Además, se ha demostrado que la inhibición de GSK-3 previene la hiperfosforilación de Tau en las células [Lovestone et al., Current Biology 4, 1077-86 (1994); Brownlees et al., Neuroreport 8, 3251-55 (1997)]. Por lo tanto, se cree que la actividad de GSK-3 puede promover la generación de los ovillos neurofibrilares y la progresión de la enfermedad de Alzheimer.
Otro sustrato de GSK-3 es la \beta-catenina, que se degrada después de la fosfosrilzación por GSK-3. Se han notificado niveles reducidos de \beta-catenina en pacientes esquizofrénicos y también se han asociado con otras enfermedades relacionadas con el aumento de la muerte de células neuronales [Zhong et al., Nature, 395, 698-702 (1998); Takashima et al., PNAS, 90, 7789-93 (1993); Pei et al., J. Neuropathol. Exp, 56, 70-78 (1997)].
Las quinasas dependientes de ciclina (CDK) son serina/treonina proteína quinasas consistentes en un lóbulo amino-terminal rico en láminas \beta y un lóbulo carboxilo-terminal más largo que es principalmente \alpha-helicoidal. Las CDK presentan los 11 subdominios compartidos por todas las proteína quinasas y varían en masa molecular de 33 a 44 KD. Esta familia de quinasas, que incluye CDK1, CKD2, CDK4 y CDK6, requiere la fosforilación en el resto correspondiente a la Thr160 de CDK2 para ser totalmente activa [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 3, 83-88 (2000)].
Cada complejo de CDK se forma a partir de una subunidad de ciclina reguladora (por ejemplo, ciclina A, B1 B2, D1, D2, D3 y E) y una subunidad quinasa catalítica (por ejemplo, CDK1, CDK2, CDK4, CDK5 y CDK6). Cada par quinasa/ciclina diferente funciona regulando las fases diferentes y específicas del ciclo celular conocidas como fases G1, S, G2 y M [Nigg, E., Nature Reviews, 2, 21-32 (2001); Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews, 32, 283-305 (2000)].
Las CDK se han implicado en trastornos de proliferación celular, particularmente en cánceres. La proliferación celular es el resultado de una falta de regulación directa o indirecta del ciclo de división celular y las CDK juegan un papel crítico en la regulación de las diversas fases de este ciclo. Por ejemplo, la sobreexpresión de la ciclina D1 está asociada comúnmente con numerosos cánceres humanos incluyendo el cáncer de mama, colon, carcinomas hepatocelulares y gliomas. [Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews, 32, 283-305 (2000)]. El complejo CDK2/ciclina E juega un papel clave en la progresión desde la fase G1 temprana a la fase S del ciclo celular y la sobreexpresión de ciclina E se ha asociado con diversos tumores sólidos. Por lo tanto, los inhibidores de ciclinas D1, E o sus CDK asociadas son dianas útiles para la terapia de cánceres [Kaubisch, A., Schwartz, G., The Cancer Journal, 6, 192-212 (2000)].
Las CDK, especialmente la CDK2, también participan en la apoptosis y el desarrollo de células T. La CDK2 se ha identificado como un regulador clave de la apoptosis de timocitos [Williams, O., et al., European Journal of Immunology, 709-713 (2000)]. La estimulación de la actividad quinasa CDK2 está asociada con la progresión de la apoptosis en timocitos, en respuesta a estímulos específicos. La inhibición de la actividad quinasa CDK2 bloquea esta apoptosis dando como resultado la protección de los timocitos.
Además de regular el ciclo celular y la apoptosis, las CDK están implicadas directamente en el proceso de transcripción. Numerosos virus requieren CDK para su proceso de replicación. Los ejemplos en los que los inhibidores de CDK impiden la replicación viral incluyen el citomegalovirus humano, el virus del herpes y el virus varicella-zoster [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 3, 83-88 (2000)].
La inhibición de CDK también es útil para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer. La aparición de filamentos helicoidales emparejados (PHF), asociada con la enfermedad de Alzheimer, se produce por la hiperfosforilación de la proteína Tau por CDK5/p25 [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 3, 83-88 (2000)].
Como resultado de la importancia biológica de las proteína quinasas, existe un interés actual en inhibidores de proteína quinasas terapéuticamente eficaces. Ciertas 2-aminopirimidinas aril sustituidas se conocen como inhibidores de proteínas quinasas. [Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.958.935, 5.863.924, 5.612.340, y la Publicación PCT WO 01/29009].
Por consiguiente, aún existe una gran necesidad de crear potentes inhibidores de JNK y de quinasas de la familia Src, incluyendo inhibidores de JNK3, Src y Lck, y de inhibidores de GSK3 y CDK2, que sean útiles en el tratamiento de diversas enfermedades o afecciones asociadas con la activación de JNK3, Src, Lck, GSK3 y CDK2.
Compendio de la invención
Actualmente, se ha descubierto que los compuestos de esta invención y composiciones farmacéuticas de los mismos son eficaces como inhibidores de quinasas c-Jun N-terminales (JNK), Src, Lck, GSK3 y CDK2. Estos compuestos tienen las siguientes fórmulas generales I y II:
1
o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, donde W es nitrógeno o CH y R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son como se describen a continuación.
Estos compuestos y composiciones farmacéuticas de los mismos son útiles para tratar o prevenir una diversidad de trastornos, tales como insuficiencia cardíaca, diabetes, enfermedad de Alzheimer, trastornos de inmunodeficiencia, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes, trastornos destructivos óseos tales como osteoporosis, trastornos proliferativos, enfermedades infecciosas y enfermedades virales. Las composiciones también son útiles en métodos para prevenir la muerte celular y la hiperplasia y por lo tanto pueden usarse para tratar o prevenir la reperfusión/isquemia en apoplejía, ataques al corazón e hipoxia de órganos. Las composiciones también son útiles en métodos para prevenir la agregación plaquetaria inducida por trombina. Las composiciones son especialmente útiles para trastornos tales como leucemia mielogenosa crónica (CML), artritis reumatoide, asma, osteoartritis, isquemia, cáncer, enfermedad hepática incluyendo isquemia hepática, enfermedad cardíaca tal como infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca congestiva, afecciones patológicas inmunes que implican la activación de células T y trastornos neurodegenerativos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I o II:
2
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:
cada W se selecciona independientemente entre nitrógeno o CH;
R^{1}, R^{2} y R^{3} se seleccionan independientemente entre OH, OCH_{3}, OCH_{2}CH_{3}, NHCOMe, NH_{2}, NH (grupo alifático C_{1-4}), N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, O(CH_{2})_{2}morfolin-4-ilo, O(CH_{2})_{2}NH_{2}, O(CH_{2})_{2}NH(grupo alifático C_{1-4}), O(CH_{2})_{2}N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, bromo, cloro o flúor; o
R^{1} y R^{2} o R^{2} y R^{3} se toman juntos para formar
3
R^{4} es un anillo fenilo, ciclohexilo, naftilo, piridilo, pirimidinilo, triazinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, indazolilo o bencimidazolilo sustituido; donde
dicho anillo está sustituido con 1-2 grupos seleccionados independientemente entre cloro, flúor, bromo, metilo, etilo, t-butilo, isopropilo, ciclopropilo, CF_{3}, NH_{2}, bencilo, benciloxi, OH-, metilendioxi, SO_{2}NH_{2}, fenoxi, O-piridinilo, SO_{2}fenilo, nitrofenoxi, aminofenoxi, S-dimetilpirimidina, NH-fenilo, NH-metoxifenilo, piridinilo, aminofenilo, fenol, cloro-fluoro-fenilo, dimetilaminofenilo, CF_{3}-fenilo, dimetilfenilo, clorofenilo, fluorofenilo, metoxifenoxi, clorofenoxi, etoxifenoxi, o fluorofenoxi; con la condición de que:
dicho compuesto sea distinto de un compuesto de fórmula III
4
en la que:
A es un anillo fenilo sustituido con uno o más grupos seleccionados entre halógeno, N(R^{10})_{2} o OR^{10}, donde
cada R^{10} se selecciona independientemente entre hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{7} opcionalmente sustituido con NH_{2}, NH(alquilo C_{1}-C_{7}) o N(alquilo C_{1}-C_{7})_{2}; y
B se selecciona entre halógeno, SO_{2}N(R^{10})_{2}, N(R^{10})_{2}, OR^{10} o fluoro-(alquilo C_{1}-C_{7}).
Como se usa en este documento, se aplicarán las siguientes definiciones a menos que se indique otra cosa.
La expresión "opcionalmente sustituido" se usa de forma intercambiable con la expresión "sustituido o sin sustituir". A menos que se indique otra cosa, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo, y cada sustitución es independientemente del resto.
El término "alifático" o la expresión "grupo alifático", como se usan en este documento, se refieren a una cadena de hidrocarburo C_{1}-C_{12} de cadena lineal o ramificada, que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo C_{3}-C_{8} monocíclico o C_{8}-C_{12} bicíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático (también denominado en este documento "carbociclo" o "cicloalquilo"), que tiene un único punto de unión con el resto de la molécula, donde cualquier anillo individual de dicho sistema de anillos bicíclicos tiene 3-7 miembros. Por ejemplo, los grupos alifáticos adecuados incluyen, pero sin limitación, grupos lineales o ramificados o alquilo, alquenilo, alquinilo e híbridos de los mismos, tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
Las expresiones "alquilo", "alcoxi", "hidroxialquilo", "alcoxialquilo" y "alcoxicarbonilo", usadas solas o como parte de un resto mayor incluyen cadenas lineales y ramificadas que contienen de uno a doce átomos de carbono. Las expresiones "alquenilo" y "alquinilo" usadas solas o como parte de un resto mayor incluirán cadenas lineales y ramificadas que contienen de dos a doce átomos de carbono.
Las expresiones "haloalquilo", "haloalquenilo" y "haloalcoxi" se refieren a alquilo, alquenilo o alcoxi, según el caso, sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "halógeno" se refiere a F, Cl, Br o I.
El término "heteroátomo" se refiere a nitrógeno, oxígeno o azufre e incluye cualquier forma oxidada de nitrógeno y azufre, y la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico. El término "nitrógeno" también incluye un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico. Como ejemplo, en un anillo saturado o parcialmente insaturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados entre oxígeno, azufre o nitrógeno, el nitrógeno puede ser N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR^{+} (como en pirrolidinilo N-sustituido).
El término "arilo" usado solo o como parte de un resto mayor como en "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros de anillo, donde al menos un anillo del sistema es aromático y donde cada anillo del sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo. El término "arilo" puede usarse de forma intercambiable con la expresión "anillo arilo". El término "arilo" también se refiere a sistemas de anillos heteroarilo como se define a continuación en este documento.
El término "heterociclo", "heterociclilo" o "heterocíclico" como se usa en este documento se refiere a sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, no aromáticos, que tienen de cinco a catorce miembros de anillo, donde uno o más miembros del anillo es un heteroátomo, donde cada anillo del sistema contiene de 3 a 7 miembros de
anillo.
El término "heteroarilo", usado solo o como parte de un resto mayor, como en "heteroaralquilo" o "heteroarilalcoxi", se refiere a sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros de anillo, donde al menos un anillo del sistema es aromático, al menos un anillo del sistema contiene uno o más heteroátomos y donde cada anillo del sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo. El término "heteroarilo" puede usarse de forma intercambiable con la expresión "anillo heteroarilo" o el término "heteroaromático".
Un grupo alifático o un grupo heterocíclico no aromático puede contener uno o más sustituyentes. Los sustituyentes adecuados sobre el carbono saturado de un grupo alifático o de un grupo heterocíclico no aromático se seleccionan entre halógeno, oxo, -R^{0}, -OR^{0}, -SR^{0}, 1,2-metilendioxi, 1,2-etilendioxi, fenilo (Ph) opcionalmente sustituido con R^{0}, -O(Ph) opcionalmente sustituido con R^{0}, -CH_{2}(Ph) opcionalmente sustituido con R^{0}, -CH_{2}CH_{2}(Ph), opcionalmente sustituido con R^{0}, -NO_{2}, -CN, -N(R^{0})_{2}, -N R^{0}C(O)R^{0}, -NR^{0}C(O)N(R^{0})_{2}, -NR^{0}CO_{2}R^{0}, -NR^{0}NR^{0}C(O)R^{0}, -NR^{0}NR^{0}C(O)N(R^{0})_{2}, -NR^{0}NR^{0}CO_{2}R^{0}, -C(O)C(O)R^{0}, -C(O)CH_{2}C(O)R^{0}, -CO_{2}R^{0}, -C(O)R^{0}, -C(O)N(R^{0})_{2}, -OC(O)N(R^{0})_{2}, -S(O)_{2}
R^{0}, -SO_{2}N(R^{0})_{2}, -S(O)R^{0}, -NR^{0}SO_{2}N(R^{0})_{2}, -NR^{0}SO_{2}R^{0}, -C(=S)N(R^{0})_{2}, -C(=NH)-N(R^{0})_{2}, =S, =NNHR^{0}, =NN(R^{0})_{2},
=NNHC(O)R^{0}, =NNHCO_{2}(alquilo), =NNHSO_{2}(alquilo), =NR^{0} o -(CH_{2})_{y}NHC(O)R^{0}, donde cada R^{0} se selecciona independientemente entre hidrógeno, un grupo alifático C_{1-4} opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo o un grupo heterocíclico de 5-6 miembros, sin sustituir, fenilo, -O(Ph) o -CH_{2}(Ph). Los sustituyentes opcionales sobre el grupo alifático de R^{0} se seleccionan entre NH_{2}, NH(grupo alifático C_{1-4}), N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, halógeno, grupo alifático C_{1-4}, OH, O(grupo alifático C_{1-4}), NO_{2}, CN, CO_{2}H, CO_{2}(grupo alifático C_{1-4}), O(grupo halo alifático C_{1-4}) o un grupo haloalifático C_{1-4}.
La expresión "cadena alquilideno" se refiere a una cadena de carbonos lineal o ramificada que puede estar totalmente saturada o tener una o más unidades de insaturación.
Una combinación de sustituyentes o variables se permite únicamente si tal combinación da como resultado un compuesto estable o químicamente viable. Un compuesto estable o un compuesto químicamente viable es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40ºC o menor, en ausencia de humedad o de otras condiciones químicamente reactivas, durante al menos una semana.
Será evidente para un especialista en la técnica que ciertos compuestos de esta invención pueden existir en formas tautoméricas, estando todas estas formas tautoméricas de los compuestos dentro del alcance de la invención.
A menos que se indique otra cosa, las estructuras representadas en este documento también pretenden incluir todas las formas estereoquímicas de la estructura; es decir, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico. Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos individuales así como las mezclas enantioméricas y diastereoméricas de los compuestos de la presente memoria descriptiva están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique otra cosa, las estructuras representadas en este documento también pretenden incluir compuestos que difieren únicamente en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto para el reemplazo de un hidrógeno por un deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido ^{13}C o ^{14}C están dentro del alcance de esta invención.
Los grupos R^{1}, R^{2} y R^{3} preferidos de las fórmulas I y II se seleccionan entre halógeno, QR o QAr^{2}, donde Q es una cadena alquilideno C_{1-3} en la que una unidad metileno de Q se reemplaza opcionalmente por -O-, -S-, -NHCO- o -NR-, y Ar^{2} es un anillo saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado, de 5-6 miembros, opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre. Los grupos R^{1}, R^{2} y R^{3} más preferidos se seleccionan entre OH, OCH_{3}, OCH_{2}CH_{3}, NHCOMe, NH_{2}, NH(grupo alifático C_{1-4}), N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, O(CH_{2})_{2}morfolin-4-ilo, O(CH_{2})_{2}NH_{2}, O(CH_{2})_{2}NH(grupo alifático C_{1-4}), O(CH_{2})_{2}N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, bromo, cloro o flúor. Otros compuestos preferidos de fórmulas I y II son aquellos en los que R^{1} y R^{2}, o R^{2} y R^{3} se toman juntos para formar 5. Los grupos Ar^{2} más preferidos son morfolin-4-ilo, pirrolidin-1-ilo, piperidin-1-ilo, tiomorfolin-4-ilo, pirazol-1-ilo o imidazol-1-ilo.
Los grupos R^{4} preferidos de fórmulas I y II se seleccionan entre un anillo de 6 miembros saturado, parcialmente insaturado o arilo que tiene 0-3 nitrógenos, un anillo arilo bicíclico de 9-10 miembros que tiene 0-2 nitrógenos o un anillo heteroarilo de 5 miembros que tiene 2-3 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre, donde cada anillo está opcionalmente sustituido. Los grupos R^{4} más preferidos de fórmulas I y II son anillos sustituidos seleccionados entre fenilo, ciclohexilo, naftilo, piridilo, pirimidinilo, triazinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, indazolilo o bencimidazolilo.
Los sustituyentes preferidos sobre R^{4} se seleccionan independientemente entre R, halógeno, NO_{2}, OR, N(R)_{2}, R^{x} o Z-R^{6}, donde R es hidrógeno o un grupo alifático C_{1-4} opcionalmente sustituido. Los grupos Z preferidos de fórmulas I y II se seleccionan entre una cadena alquilideno C_{1-4} en la que una unidad metileno de Z se reemplaza opcionalmente por -O-, -S-, -SO_{2}- o -NH-. Los grupos R^{6} preferidos se seleccionan entre fenilo opcionalmente sustituido, piridilo y pirimidinilo. Los sustituyentes R^{x}preferidos sobre R^{4} se seleccionan entre fenilo, piridilo y pirimidinilo, donde R^{x} está opcionalmente sustituido con 1-2 R^{5}. Los sustituyentes más preferidos sobre R^{4} se seleccionan entre cloro, flúor, bromo, metilo, etilo, t-butilo, isopropilo, ciclopropilo, nitro, OMe, OEt, CF_{3}, NH_{2}, bencilo, benciloxi, OH, metileno dioxi, SO_{2}NH_{2}, fenoxi, O-piridinilo, SO_{2}fenilo, nitrofenoxi, aminofenoxi, S-dimetilpirimidina, NH-fenilo, NH-metoxifenilo, piridinilo, aminofenilo, fenol, cloro-fluoro-fenilo, dimetilaminofenilo, CF_{3}-fenilo, dimetilfenilo, clorofenilo, fluorofenilo, metoxifenoxi, clorophehoxi, etoxifenoxi y fluorofenoxi. Los grupos R^{4} más preferidos de fórmulas I y II son los que se representan en las Tablas 1, 2 y 3.
Una realización preferida se refiere a un compuesto de fórmula I-a o II-a:
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o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, donde R^{1}, R^{3}, R^{4}, Q y Ar^{2} son como se han definido anteriormente.
Los grupos R^{1}, R^{3}, R^{4}, Ar^{2} y Q preferidos son como se han descrito anteriormente para compuestos de fórmulas I y II.
Los compuestos más preferidos de I-a y II-a son los de fórmula I-a' y II-a':
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o un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos, donde R^{1}, R^{3} y R^{4} son como se han definido anteriormente.
Los grupos R^{1}, R^{3} y R^{4} preferidos de fórmulas I-a' y II-a' son los que se han descrito anteriormente para compuestos de fórmulas I y II.
Otra realización preferida se refiere a un compuesto de fórmula I-b o II-b:
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o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, Z y R^{6} son como se han definido anteriormente.
Los grupos R^{1}, R^{2}, R^{3}, Z y R^{6} preferidos son como se han descrito anteriormente para los compuestos de fórmulas I y II.
Las estructuras ejemplares de fórmula I, en la que W es nitrógeno, se indican en la Tabla 1 que se muestra a continuación.
TABLA 1 Compuestos de Fórmula I
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Las estructuras ejemplares de fórmula I, en la que W es CH, se indican en la Tabla 2 que se muestra a continuación.
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TABLA 2 Compuestos de Fórmula I
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Las estructuras ejemplares de fórmula II, en la que W es nitrógeno, se indican en la Tabla 3 que se muestra a continuación.
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TABLA 3 Compuestos de Fórmula II
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Los compuestos de la presente invención pueden prepararse en general por métodos conocidos por los especialistas en la técnica para compuestos análogos, como se ilustra por los Esquemas generales I a IV, y los ejemplos sintéticos que se muestran a continuación.
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Esquema 1
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Reactivos y condiciones: (a) MeMgCl, THF, -78ºC; (b) MnO_{2}, CH_{2}Cl_{2}, temperatura de reflujo;
El Esquema I anterior muestra una ruta sintética general usada para preparar el compuesto intermedio 3. A una solución de aldehído (i) en THF, a -78ºC, se le añade una solución de cloruro de metilmagnesio en THF. La reacción se interrumpe con HCl frío (1 N) y después el tratamiento acuoso seguido de cromatografía produce el alcohol
(ii).
Se añade dióxido de manganeso a una solución de ii en CH_{2}Cl_{2} y la mezcla resultante se calienta a reflujo. Después de 3 horas, la suspensión se filtra a través de Celite® y el filtrado se concentra al vacío para producir la cetona (3).
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Esquema II
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Reactivos y condiciones: (a) NH_{2}NCN, HCl, 1,4-dioxano; (b) DMF-DMA, 80ºC, 12-18 horas; (c) acetonitrilo, temperatura de reflujo.
El Esquema II anterior muestra una ruta sintética general usada para preparar compuestos de fórmula I. La anilina 1 se combina con cianamida, HCl (4 N en 1,4-dioxano) y 1,4-dioxano en un tubo cerrado herméticamente y la mezcla resultante se calienta a 60ºC. Después de 12-18 horas, el tratamiento acuoso produce el derivado de guanidina deseado (2).
El Intermedio 4 se prepara disolviendo 3 en N,N-dimetilformamida dimetilacetal (DMF-DMA) y calentando la solución resultante a 80ºC. La reacción se concentra al vacío y el producto bruto se recristaliza para producir la enaminona 4.
La enaminona 4 se combina con la guanidina 2 y acetonitrilo y la mezcla resultante se calienta a 80ºC. Después del tratamiento acuoso, el producto bruto se purifica por cromatografía para producir I con un rendimiento de 50-95%, dependiendo del derivado de guanidina usado.
Una diversidad de R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son adecuados para las condiciones de reacción descritas anteriormente para el Esquema II, incluyendo los que se han indicado anteriormente en la Tabla 1.
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Esquema III
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Reactivos y condiciones: (a) Mg, I_{2}, THF, trimetilborato; temperatura ambiente, 12-18 horas; (b) Na_{2}CO_{3}, Pd(PPh_{3})_{4}, tolueno:metanol (4:1), temperatura de reflujo, 24 horas; (c) NaH (dispersión al 60% en aceite mineral), Pd(PPh_{3})_{4}, THF, temperatura de reflujo, 3 horas.
El Esquema III anterior muestra un método alternativo para preparar compuestos de fórmula I. El ácido arilborónico (6) se prepara tratando el bromuro iii con limaduras de magnesio y una cantidad catalítica de yodo en THF a la temperatura de reflujo durante 12-18 horas. La reacción se enfría a 0ºC, después se añade borato de trimetilo y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 12-18 horas. La reacción se hidroliza con HCl (6 N, acuoso) a 60ºC y después el tratamiento acuoso produce el ácido borónico deseado 6.
El ácido borónico 6 se combina con la dicloropirimidina (5), Na_{2}CO_{3} y Pd(PPh_{3})_{4} en una solución de tolueno:metanol (4:1). La mezcla resultante se calienta a reflujo durante 24 horas y después se filtra a través de gel de sílice. El producto bruto se purifica por cromatografía ultrarrápida para producir la cloropirimidina 7.
La cloropirimidina 7 se combina con la anilina 1, NaH (dispersión al 60% en aceite mineral) y Pd(PPh_{3})_{4} en THF y la mezcla resultante se calienta a reflujo durante 3 horas. La reacción se enfría y después se vierte en agua. El tratamiento acuoso seguido de cromatografía ultrarrápida produce I. Una diversidad de R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son adecuados para las condiciones de reacción descrita anteriormente para el Esquema III, incluyendo los que se indican en la Tabla 1.
Los compuestos de fórmula I en la que W es CH también pueden sintetizarse de manera esencialmente similar a los descritos anteriormente en el Esquema III, por los métodos mostrados en el siguiente Esquema IV, y por métodos conocidos para un especialista en la técnica.
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Esquema IV
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Reactivos y condiciones: (a) NCCH_{2}P(O)(OEt)_{2}, NaH, THF; (b) hexametildisilazida de litio, THF y después cloruro de trimetilsililo; (c) dimetilformamida dimetilacetal; (d) HBr gaseoso, CHCl_{3}; e) R^{4}NH_{2}, NaH, dimetilformamida, 80ºC.
Los detalles de las condiciones usadas para producir estos compuestos se muestran en los Ejemplos.
Un especialista en la técnica puede sintetizar otros compuestos de esta invención siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva usando reactivos que se sintetizan fácilmente o que están disponibles en el mercado.
La actividad de un compuesto utilizado en esta invención como un inhibidor de JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src puede ensayarse in vitro, in vivo o en una línea celular. Los ensayos in vitro incluyen ensayos que determinan la inhibición de la actividad de fosforilación o de la actividad ATPasa de JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src activadas. Los ensayos in vitro alternativos cuantifican la capacidad del inhibidor para unirse a JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src. La unión del inhibidor puede medirse radiomarcando el inhibidor antes de la unión, aislando el complejo inhibidor/JNKS, inhibidor/GSK-3, inhibidor/CDK2, inhibidor/Lck o inhibidor/Src y determinando la cantidad de radiomarcador unido. Como alternativa, la unión del inhibidor puede determinarse realizando un experimento de competición en el que se incuban nuevos inhibidores con JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src unidas a radioligandos conocidos.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de esta invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención debe ser tal que sea eficaz para inhibir de forma detectable una proteína quinasa, particularmente JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en una muestra biológica o en un paciente. Preferiblemente, la composición de esta invención se formula para administración a un paciente que necesita tal composición. Más preferiblemente, la composición de esta invención se formula para administración oral a un paciente.
El término "paciente", como se usa en este documento, se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, y aún más preferiblemente un ser humano.
La expresión "excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente, adyuvante o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Los excipientes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones de esta invención incluyen, pero sin limitación, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias con base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y
lanolina.
La expresión "inhibir de forma detectable", como se usa en este documento, se refiere a un cambio medible en la actividad de JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src entre una muestra que comprende dicha composición y una quinasa JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src y una muestra equivalente que comprende una quinasa JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en ausencia de dicha composición.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal no tóxica, éster, sal de un éster u otro derivado de un compuesto de esta invención que, después de la administración a un receptor, es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto de esta invención o un metabolito activo como inhibidor o resto del mismo.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen las obtenidas a partir de ácidos y bases inorgánicas y orgánicas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales de ácidos adecuadas incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Pueden emplearse otros ácidos tales como oxálico, aunque no son farmacéuticamente aceptables por sí mismos, en la preparación de sales útiles como intermedios para la obtención de los compuestos de la invención y sus sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables.
Las sales obtenidas a partir de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), de amonio y de N^{+}(alquilo C_{1-4})_{4}. Esta invención también incluye la cuaternización de cualquier grupo básico que contiene nitrógeno de los compuestos descritos en este documento. Pueden obtenerse productos solubles o dispersables en agua o aceite mediante dicha cuaternización.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía oral, parenteral, por pulverización para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un reservorio implantado. El término "parenteral", como se usa en este documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa. Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en este campo usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable y no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, convencionalmente se emplean aceites estériles fijos como disolvente o medio de suspensión.
Para este propósito puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles en la preparación de composiciones inyectables, como también lo son aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan habitualmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados habitualmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan habitualmente en la preparación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, también pueden usarse para los propósitos de formulación.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable para la vía oral incluyendo, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos usados habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de una cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz secado. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o
colorantes.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Éstos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Estos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse por vía tópica, especialmente cuando la diana del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluyendo enfermedades del ojo, la piel o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede realizarse en una formulación de supositorio rectal (véase más arriba) o en una formulación de enema adecuada. También pueden usarse parches transdérmicos por vía tópica.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos para administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica estéril, de pH ajustado o, preferiblemente, como soluciones en solución salina isotónica, estéril, de pH ajustado, con o sin un conservante tal como cloruro de bencilalconio. Como alternativa, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse por medio de una inhlalación o aerosol nasal. Estas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se formulan para administración oral.
La cantidad de los compuestos de la presente invención que puede combinarse con los materiales excipientes para producir una composición en una forma de dosificación individual variará dependiendo del paciente tratado y de la vía particular de administración. Preferiblemente, las composiciones deben formularse de manera que pueda administrarse una dosificación de entre 0,01-100 mg/kg de peso corporal/día del inhibidor a un paciente que recibe estas composiciones.
También debe entenderse que una dosificación y régimen de tratamiento específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo, dieta, momento de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, el criterio del médico a cargo del tratamiento y de la gravedad de la enfermedad particular que se trate. La cantidad de un compuesto de la presente invención en la composición también dependerá del compuesto particular en la composición.
Dependiendo de la afección o enfermedad particular que se trate o se prevenga, también pueden estar presentes en las composiciones de esta invención agentes terapéuticos adicionales que normalmente se administran para tratar o prevenir esa afección.
Por ejemplo, pueden combinarse agentes quimioterapéuticos u otros agentes antiproliferativos con los compuestos de esta invención para tratar enfermedades proliferativas y cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos conocidos incluyen, pero sin limitación, Gleevec^{TM}, adriamicina, dexametasona, vincristina, ciclofosfamida, fluorouracilo, topotecan, taxol, interferones y derivados de platino.
Otros ejemplos de agentes con los que pueden combinarse los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, agentes antiinflamatorios tales como corticosteroides, bloqueantes de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida y sulfasalazina; agentes inmunomoduladores e inmunosupresores tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato mofetil, interferones, corticosteroides, ciclofosfamida, azatioprina y sulfasalazina; factores neurotróficos tales como inhibidores de acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones, anti-convulsionantes, bloqueantes de los canales de iones, riluzol y agentes anti-parkinsonianos; agentes para tratar enfermedades cardiovasculares tales como beta-bloqueantes, inhibidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueantes de los canales de calcio y estatinas; agentes para tratar enfermedades hepáticas tales como corticosteroides, colestiramina, interferones y agentes antivirales; agentes para tratar trastornos sanguíneos tales como corticosteroides, agentes antileucémicos y factores del crecimiento; agentes para tratar la diabetes tales como insulina, análogos de insulina, inhibidores de alfa glucosidasa, biguanidas y sensibilizadores a la insulina; y agentes para tratar trastornos de inmunodeficiencia tales como gamma globulina.
La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la cantidad que se administraría normalmente en una composición que comprende ese agente terapéutico como único agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones descritas en la presente invención variará de aproximadamente 50% a 100% de la cantidad presente normalmente en una composición que comprende ese agente como único agente terapéuticamente activo.
De acuerdo con otra realización, la invención se refiere a un método para inhibir la actividad quinasa de JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en una muestra biológica que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biológica con un compuesto de esta invención, o composición que comprende dicho compuesto.
La expresión "muestra biológica", como se usa en este documento, incluye, pero sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material biopsiado obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
La inhibición de la actividad quinasa de JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en una muestra biológica es útil para una diversidad de propósitos que son conocidos por un especialista en la técnica. Los ejemplos de tales propósitos incluyen, pero sin limitación, transfusión sanguínea, transplante de órganos, almacenamiento de muestras biológicas y ensayos biológicos.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona un método para tratar o reducir la gravedad de una enfermedad o afección mediada por JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en un paciente, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composición de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un método para tratar un cáncer que comprende la etapa de bloquear la transición de células cancerosas en su fase proliferativa mediante la inhibición de CDK2 con un compuesto de acuerdo con la presente invención, o una composición farmacéuticamente aceptable que comprende dicho compuesto.
La expresión "enfermedad mediada por JNK", como se usa en este documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sabe que JNK juega un papel. Tales afecciones incluyen, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, trastornos destructivos óseos, trastornos proliferativos, cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en apoplejía, ataques al corazón, trastornos angiogénicos, hipoxia de órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardíaca, agregación de plaquetas inducida por trombina y afecciones asociadas con prostaglandina endoperoxidasa sintasa-
2.
Las enfermedades inflamatorias que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma, alergias y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos.
Las enfermedades autoinmunes que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, tiroiditis crónica, enfermedad de Graves, gastritis autoinmune, diabetes, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, dermatitis atópica, hepatitis activa crónica, miastenia gravis, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, psoriasis o enfermedad de injerto contra
hospedador.
Los trastornos destructivos óseos que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, osteoporosis, osteoartritis y trastorno óseo relacionado con mieloma múltiple.
Las enfermedades proliferativas que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, leucemia mielógena aguda, leucemia mielogenosa crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple y tumorigénesis mediada por HTLV-1.
Los trastornos angiogénicos que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen tumores sólidos, neovasculización ocular y hemangiomas infantiles. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, sépsis, choque séptico y
Shigellosis.
Las enfermedades virales que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, infección por hepatitis aguda (incluyendo hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C), infección por HIV y retinitis por CMV.
Las enfermedades neurodegenerativas que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), epilepsia, ataques, enfermedad de Huntington, lesión traumática cerebral, apoplejía isquémica y hemorrágica, isquemias cerebrales o enfermedad neurodegenerativa, incluyendo enfermedad neurodegenerativa dirigida por apoptosis, provocada por una lesión traumática, hipoxia aguda, isquemia o neurotoxicidad por glutamato.
Las "enfermedades mediadas por JNK" también incluyen isquemia/reperfusión en apoplejía, ataques al corazón, isquemia de miocardio, hipoxia de órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardíaca, isquemia hepática, enfermedad hepática, insuficiencia cardíaca congestiva, respuestas inmunes patológicas tales como las provocadas por la activación de células T y por la agregación de plaquetas inducida por trombina.
Además, los compuestos de la presente invención pueden ser capaces de inhibir la expresión de proteínas pro-inflamatorias inducibles. Por lo tanto, otras "afecciones mediadas por JNK" que pueden tratarse por los compuestos de esta invención incluyen edema, analgesia, fiebre y dolor, tal como dolor neuromuscular, dolor de cabeza, dolor por cáncer, dolor dental y dolor por artritis.
Los compuestos de esta invención también son útiles como inhibidores de quinasas de la familia Src, especialmente Src y Lck. Como revisión general de estas quinasas véase Thomas y Brugge, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. (1997) 13, 513; Lawrence y Niu, Pharmacol. Ther. (1998) 77, 81; Tatosyan y Mizenina, Biochemistry (Moscow) (2000) 65, 49. La expresión "enfermedad mediada por Src o enfermedad mediada por Lck", como se usa en este documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sabe que Src o Lck juega un papel. Por consiguiente, estos compuestos son útiles para tratar enfermedades o afecciones que se sabe que están afectadas por la actividad de una o más quinasas de la familia Src. Tales enfermedades o afecciones incluyen hipercalcemia, reestenosis, osteoporosis, osteoartritis, tratamiento sintomático de metástasis ósea, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus, enfermedad de injerto contra hospedador, enfermedad de hipersensibilidad mediada por células T, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Guillain-Barre, trastorno pulmonar obstructivo crónico, dermatitis por contacto, cáncer, enfermedad de Paget, asma, lesión isquémica o de reperfusión, enfermedad alérgica, dermatitis atópica y rinitis alérgica. Las enfermedades que están afectadas por la actividad de Src, en particular, incluyen hipercalcemia, osteoporosis, osteoartritis, cáncer, tratamiento sintomático de metástasis ósea y enfermedad de Paget. Las enfermedades que están afectadas por la actividad de Lck, en particular, incluyen enfermedades autoinmunes, alergias, artritis reumatoide y leucemia.
La expresión "enfermedad mediada por GSK3", como se usa en este documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sabe que GSK3 juega un papel. Por consiguiente, estos compuestos son útiles para tratar enfermedades o afecciones que se sabe que están afectadas por la actividad de la quinasa GSK3. Tales enfermedades o afecciones incluyen diabetes, enfermedad de Alzheimer, de Huntington, de Parkinson, demencia asociada con el SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (AML), esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia, hipertrofia de los cardiomiocitos y calvicie.
La expresión "enfermedad mediada por CDK2", como se usa en este documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sabe que CDK2 juega un papel. Por consiguiente, estos compuestos son útiles para tratar enfermedades o afecciones que se sabe que están afectadas por la actividad de la quinasa CDK2. Tales enfermedades o afecciones incluyen infecciones virales, trastornos neurodegenerativos, trastornos asociados con apoptosis de timocitos, o trastornos proliferativos que se producen como resultado de la desrregulación del ciclo celular, especialmente de la progresión de la fase G_{1} a S.
Una realización preferida se refiere al método usado para tratar o prevenir una enfermedad mediada por JNK seleccionada entre enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, trastornos destructivos óseos, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en apoplejía, ataques al corazón, trastornos angiogénicos, hipoxia de órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardíaca o agregación de plaquetas inducida por trombina.
Otra realización preferida se refiere al método usado para tratar o prevenir una enfermedad mediada por Src o Lck seleccionada entre hipercalcemia, osteoperosis, osteoartritis o tratamiento sintomático de metástasis ósea.
Otra realización preferida se refiere al método usado para tratar o prevenir una enfermedad mediada por GSK3 seleccionada entre diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple (MS) o esclerosis lateral amiotrófica (AML).
De acuerdo con otra realización preferida, el método se usa para tratar o prevenir una enfermedad mediada por CDK2 seleccionada entre infecciones virales, trastornos neurodegenerativos o trastornos asociados con la apoptosis de los timocitos.
Además de los compuestos de esta invención, también pueden emplearse derivados farmacéuticamente aceptables los compuestos de esta invención en composiciones para tratar o prevenir los trastornos indicados anterior-
mente.
En una realización alternativa, los métodos de esta invención que utilizan composiciones que no contienen ningún agente terapéutico adicional, comprenden la etapa adicional de administrar por separado a dicho paciente un agente terapéutico adicional. Cuando estos agentes terapéuticos adicionales se administran por separado, pueden administrarse al paciente antes de, secuencialmente con o después de la administración de las composiciones de esta
invención.
Los compuestos de esta invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos también pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo médico implantable, tales como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, stents y catéteres. Los stents vasculares, por ejemplo, se han usado para solucionar reestenosis (re-estrechamiento de la pared de un vaso sanguíneo después de una lesión). Sin embargo, los pacientes que usan stents u otros dispositivos implantables corren el riesgo de sufrir la formación de coágulos o la activación de las plaquetas. Estos efectos indeseados pueden prevenirse o mitigarse recubriendo previamente el dispositivo con una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un inhibidor de quinasas. Se describen recubrimientos adecuados y la preparación general de dispositivos implantables recubiertos en las Patentes de Estados Unidos 6.099.562; 5.886.026; y 5.304.121. Los recubrimientos son típicamente materiales poliméricos biocompatibles tales como un polímero de hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenglicol, ácido poliláctico, vinilacetato de etileno y mezclas de los mismos. Los recubrimientos puede recubrirse opcionalmente adicionalmente con un recubrimiento superior adecuado de fluorosilicona, polisacáridos, polietilenglicol, fosfolípidos o combinaciones de los mismos para otorgar características de liberación controladas a la composición. Otra realización de la presente invención son dispositivos implantables recubiertos con un compuesto de esta invención.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para que la invención descrita en este documento pueda entenderse de forma más completa. Debe entenderse que estos ejemplos sólo tienen fines ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse limitantes de esta invención.
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Ejemplos
Ejemplo 1
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37 
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1-(7-Metoxi-benzo[1,3]dioxol-5-il)-etanol (2)
Una solución de 7-metoxi-benzo[1,3]dioxol-5-carbaldehído (I) (1,8 g, 10 mmol) en THF (20 ml) se enfrió a -78ºC. A la solución de i en THF se le añadió gota a gota una solución de cloruro de metilmagnesio en THF (5,0 ml de 3 M, 15 mmol). La reacción se interrumpió mediante la adición de HCl (1 N, acuoso) y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice; acetato de etilo al 40%-60% en hexanos) para producir 2 (0,89 g,
45%).
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Ejemplo 2
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38 
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1-(7-Metoxi-benzo[1,3]dioxol-5-il)-etanona (3)
Se añadió dióxido de manganeso (5 g, exceso molar) a una solución de 2 (0,89 g, 4,5 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 3 horas y después se filtró a través de Celite®. El filtrado se concentró al vacío para producir 3 en forma de un sólido castaño.
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Ejemplo 3
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39 
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3-Dimetilamino-1-(7-metoxi-benzo[1,3]dioxol-5-il)-propenona (4)
Una solución de 3 (0,89 g, 4,5 mmol) en N,N-dimetilformamida dimetilacetal (3,5 g, exceso molar) se calentó a 80ºC durante una noche. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el producto bruto se recristalizó en acetato de etilo/hexanos para producir 4 (1,0 g, 89%).
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Ejemplo 4
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40 
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N-Fenil-guanidina
Una mezcla de anilina (11 mmol), cianamida (420 mg, 10 mmol) y HCl (3 ml de 4 N en dioxano, 12 mmol) en 1,4-dioxano (10 ml) se calentó en un tubo cerrado herméticamente a 60ºC durante una noche. La reacción se concentró al vacío y el residuo se repartió entre NaOH (2 N) y diclorometano. La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró al vacío para producir N-fenil-guanidina.
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Ejemplo 5
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41 
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[4-(7-Metoxi-benzo[1,3]dioxol-5-il)-pirimidin-2-il]-fenil-amina (I-26)
En un tubo cerrado herméticamente, se combinó N-fenil-guanidina (40 mg, exceso) con 4 (50 mg, 0,2 mmol) en acetonitrilo y la mezcla se calentó a 80ºC durante una noche. Después, la mezcla de reacción se repartió entre agua y acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, acetato de etilo al 40% en hexanos) para producir I-26. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 8,40 (d, 1H), 7,69 (d, 2H), 7,43 (s, 1H), 7,35 (t, 2H), 7,21 (s, 1H), 7,05 (m, 2H), 6,07 (s, 2H), 3,99 (s, 3H).
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Ejemplo 6
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42 
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2-Cloro-4-(2,3,4-trimetoxifenil)pirimidina (5)
En un matraz de fondo redondo de 250 ml se combinaron 1,49 gramos (10 mmol) de 2,4-dicloropirimidina con ácido 2,3,4-trimetoxifenilborónico (2,12 g, 10 mmol), carbonato sódico (2,12 g, 2 equivalentes) y 1,15 g (0,1 equivalentes) de tetraquis-trifenilfosfinapaladio. Se añadieron tolueno (50 ml) y agua (5 ml). La reacción se dejó a la temperatura de reflujo en una atmósfera de nitrógeno durante una noche. La reacción se diluyó con tolueno y agua y la capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró para producir la pirimidina bruta 5. El compuesto se purificó sobre gel de sílice usando un eluyente de acetona al 30%/hexano para producir 2,08 g (74%) del producto 5 en forma de un sólido blanco.
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Ejemplo 7
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43 
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(3,5-Dimetilfenil)-[4-(2,3,4-trimetoxifenil)-pirimid-2-il]-amina (II-14)
En un vial se pusieron 28 mg (100 \mumol) de la cloropirimidina 5, 3,5-dimetilanilina (24 mg, 200 \mumol), NaH al 60% (6 mg, exceso) y tetraquis(trifenilfosfina)paladio (6 mg, cantidad catalítica). Se añadió tetrahidrofurano (2 ml) y el vial se cerró herméticamente y se calentó a reflujo durante dos horas. La reacción se diluyó con éter dietílico y se lavó con ácido clorhídrico 1 N. La capa orgánica se separó y se lavó con una solución 1 N de NaOH, agua y salmuera. El extracto orgánico se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío para producir el producto bruto. El compuesto se purificó sobre gel de sílice usando un eluyente de acetona al 20%/hexano para producir el producto puro II-14 en forma de un sólido blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 8,41 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,08 (s, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,68 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,91 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 2,34 (s, 6H).
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Ejemplo 8
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44 
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1-[3,4-Dimetoxi-2-(2-morfolin-4-il-etoxi)fenil-etanona (6)
En un matraz de fondo redondo de 500 ml se combinó 2,3-dihidroxi-4-metoxiacetofenona (3,39 gramos, 17,2 mmol) con hidrocloruro de 4-(2-cloroetil)morfolina (3,53 gramos, 19,0 mmol), 4 gramos de K_{2}CO_{3} y 50 ml de DMF anhidra. La reacción se calentó a 60ºC durante una noche, se diluyó con éter dietílico y se lavó con una solución 1 N de hidróxido sódico. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando un eluyente de MeOH al 5%-CH_{2}Cl_{2} para producir la acetofenona pura 6.
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Ejemplo 9
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45 
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1-[3,4-Dimetoxi-2-(2-morfolin-4-il-etoxi)fenil-3-dimetilamino-propenona (7)
En un vial se trataron 0,95 g de 6 con 2 ml (exceso) de dimetilformamida dimetil acetal. La reacción se calentó a 100ºC durante una noche. La reacción se concentró para dar un aceite y se sometió a cromatografía ultrarrápida sobre una columna de gel de sílice con un eluyente de MeOH al 5%/CH_{2}Cl_{2} para producir 0,57 g (51%) de la enaminona
7.
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Ejemplo 10
46
(4-[3,4-Dimetoxi-2-(2-morfolin-4-il-etoxi)fenil-pirimidin-2-il)-(3-fenoxifenil)-amina (II-21)
En un tubo de vidrio con tapa a rosca y paredes gruesas se combinaron 50 mg de la enaminona 7 con 3-fenoxiguanidina y 2 ml de acetonitrilo. El tubo de reacción se cerró herméticamente y se calentó a 100ºC durante dos días. El disolvente se evaporó al vacío y el material restante se recristalizó en éter dietílico/hexano para producir II-21 puro en forma de un sólido blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 8,32 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,48 (d, 1H), 7,32 - 7,22 (m, 5H), 7,19 (s, 1H), 7,09 - 7,05 (m, 2H), 6,69 - 6,63 (m, 2H), 4,05 (t, 2H), 3,94 (s, 3H),3,91 (s, 3H), 3,68 (t, 4H), 2,62 (t, 2H), 2,42 (s a, 4H).
Ejemplo 11
47
1-(5-Metoxi-2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-il)etan-1-ona (8)
En un matraz de fondo redondo se disolvieron 500 mg de 1-(5-hidroxi-2, 3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-il)etan-1-ona en 1 ml de DMF. A esta solución se le añadieron 414 mg de K_{2}CO_{3} y yoduro de metilo (1 ml, exceso). La reacción se calentó a 80ºC durante una noche. La reacción se vertió en agua y se extrajo con éter dietílico. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró para producir 0,38 g (70%) de la acetofenona 8.
Ejemplo 12
48
3-Dimetilamino-1-(5-metoxi-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-il)-propenona (9)
En un vial se disolvieron 0,38 g (1,8 mmol) de 8 en 1 ml de acetonitrilo. Se añadió dimetilformamida dimetil acetal (321 mg, 2,7 mmol). El vial se cerró herméticamente y se calentó a 90ºC durante una noche. La mezcla de reacción se vertió directamente sobre una columna de gel de sílice que después se eluyó con acetato de etilo al 70%/hexano. La evaporación de las fracciones apropiadas produjo 0,30 g (61%) de la enaminona pura 9.
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Ejemplo 13
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49 
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[4-(5-Metoxi-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-il)-pirimidin-2-il]-(3-fenoxifenil)-amina (II-17)
La enaminona 9 se disolvió en 2 ml de acetonitrilo en un vial pequeño. Se añadió un exceso de 3-fenoxifenilguanidina, el vial se cerró herméticamente y la mezcla se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla de reacción se vertió directamente sobre una columna de gel de sílice que después se eluyó con acetato de etilo al 50%/hexano. Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron al vacío para dar la pirimidina bruta II-17. La pirimidina se recristalizó en éter dietílico/hexano para producir II-17 puro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 9,78 (s, 1H), 8,45 (d, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,48 (d, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,23 (m, 3H), 7,08 (t, 1H), 6,96 (d, 2H), 6,62 (d, 1H), 6,52 (d, 1H), 4,30 (s, 4H), 3,70 (s, 3H).
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Ejemplo 14
50
8-Metoxi-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxino-6-carbaldehído (10)
En un vial se pusieron 0,5 g (3,0 mmol) de 3,4-dihidroxi-5-metoxibenzaldehído, 414 mg (3,0 mmol) de K_{2}CO_{3} y 3 ml de DMF anhidra. A esta mezcla se le añadieron gota a gota 0,56 g (3,0 mmol) de 1,2-dibromoetano. El vial se cerró herméticamente y se calentó a 100ºC durante una noche. A la reacción se le añadió agua y la mezcla se extrajo con éter dietílico. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró para dar el producto bruto. El material se purificó por cromatografía sobre gel de sílice usando acetato de etilo al 50%/hexano como eluyente para producir 0,25 g (43%) del aldehído puro 10.
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Ejemplo 15
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51
1-(8-Metoxi-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-il)-etanol (11)
En un matraz de fondo redondo de 250 ml se disolvieron 0,60 g (3,1 mmol) de 10 en 15 ml de tetrahidrofurano anhidro. La solución se enfrió a 0ºC y se trató con 1,1 ml (3,3 mmol) de cloruro de metilmagnesio 3 M en THF. La reacción se agitó durante unos minutos y después se interrumpió con una solución 1 N de HCl. La mezcla se extrajo con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío para producir el alcohol 11.
Ejemplo 16
52
1-(8-Metoxi-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-il)-etanona (12)
En un matraz de fondo redondo se disolvieron 0,65 g (3,1 mmol) del alcohol 11 en diclorometano. A esta solución se le añadió un exceso de óxido de manganeso. La suspensión se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla se enfrió y se filtró a través de Celite. El filtrado se evaporó al vacío para producir 0,61 g (85%) de 12 en forma de un aceite amarillo.
Ejemplo 17
53
3-Dimetilamino-1-(8-metoxi-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-il)-propenona (13)
En un vial se combinaron 548 mg (2,6 mmol) de 12 con 2 ml de dimetilformamida dimetil acetal. El vial se cerró herméticamente y se calentó a 100ºC durante una noche. La reacción se concentró a sequedad y el producto bruto se recristalizó en acetato de etilo/hexano para producir 0,5 g (73%) de la enaminona pura 13.
Ejemplo 19
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54 
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1-[3,5-Dimetoxi-4-(2-morfolin-4-il-etoxi)-fenil)etanona (14)
En un vial se combinaron 500 mg (2,5 mmol) de 3',5'-dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona con hidrocloruro de 4-(2-cloroetil)morfolina (600 mg, 3,2 mmol) y carbonato potásico en polvo (1,5 g, exceso). Se añadió dimetilformamida (2 ml), el vial se cerró herméticamente y la mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante una noche. La reacción se diluyó con agua y se extrajo con éter dietílico. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó al vacío para producir 540 mg (67%) de 14 en forma de un sólido blanco.
Ejemplo 20
55
1-[3,5-Dimetoxi-4-(2-morfolin-4-il-etoxi)-fenil]-3-dimetilamino-propenona (15)
En un vial se combinaron 540 mg (1,7 mmol) de 14 con 2 ml (exceso) de dimetilformamida dimetilacetal. La reacción se cerró herméticamente y se calentó a 130ºC durante una noche. La reacción se concentró a sequedad y el residuo se trituró con éter dietílico/hexano para producir la enaminona pura 15.
Ejemplo 21
56
(3-Clorofenil)-(4-[3,5-dimetoxi-4-(2-morfolin-4-il-etoxi)fenil]pirimidin-2-il)-amina (I-39)
En un vial se combinaron 60 mg de 3-clorofenilguanidina con 40 mg de 15. Se añadió acetonitrilo (0,25 ml), el vial se cerró herméticamente y la reacción se calentó a 80ºC durante tres días. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La fase orgánica se separó, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó al vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando acetato de etilo al 50%/cloruro de metileno como eluyente para producir I-39 puro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 8,48 (d, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,38 (s, 2H), 7,25 - 7,16 (m, 4H), 7,00 (d, 1H), 4,18 (s a, 2H), 3,98 (s, 6H), 3,77 (s a, 2H), 2,80 (s a, 2H), 2,59 (s a, 2H).
Ejemplo 22
57
3-(3,4,5-Trimetoxifenil)-but-2-enonitrilo (16)
A una suspensión de NaH al 60% (1,46 g, 61,1 mmol) en THF a 0ºC se le añadieron 10,0 g (56,4 mmol) de fosfato de etil(cianometilo). Se añadió una solución de 9,88 g (47,0 mmol) de 3,4,5-trimetoxiacetofenona en THF, lo que provocó la precipitación de un sólido amarillo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se inactivó con agua y se extrajo con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó al vacío para producir 9,32 g (85%) de 16 en forma de un aceite amarillo.
Ejemplo 23
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58 
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3-(3,4,5)-Trimetoxifenil)-4-(trimetilsilanil)-but-2-enonitrilo (17)
A una solución de 16 (3,82 g, 16,3 mmol) en THF se le añadió clorotrimetilsilano (19,6 ml, 49,17 mmol). A esta solución se le añadió una solución de hexametildisilazida de litio en THF (24,6 ml de 1,0 M, 24,6 mmol). La solución se agitó durante 1 hora, se inactivó con agua y se extrajo con diclorometano. El extracto orgánico se secó (MgSO_{4}) y se evaporó al vacíopara producir un aceite amarillo. El aceite se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando un eluyente de acetato de etilo al 10-15%/hexano para producir 2,6 g (52%) de 17 en forma de un sólido blanco.
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Ejemplo 24
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59 
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5-Dimetilamino-3-(3,4,5-trimetoxifenil)penta-2,4-dienonitrilo (18)
A una solución de 17 (5,8 g, 19,01 mmol) en 30 ml de tolueno se le añadieron 30 ml (exceso) de dimetilformamida dimetil acetal. La suspensión se calentó a reflujo durante una noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se extrajo con diclorometano. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó al vacío para producir un aceite amarillo. El aceite se purificó usando cromatografía en columna sobre gel de sílice usando un eluyente de acetato de etilo al 20-30%/hexano para producir 3,6 g (83%) de 18 en forma de un aceite
amarillo.
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Ejemplo 25
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60 
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2-Bromo-4-(3,4,5-trimetoxifenil)piridina (19)
Se burbujeó HBr gaseoso en una solución de 18 (3,6 g, 16,1 mmol) en cloroformo durante 15 minutos. La reacción se diluyó con diclorometano, se lavó con agua, se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó al vacío para producir 3,2 g (62%) de 19 en forma de un sólido blanquecino.
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Ejemplo 26
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(3-Clorofenil)-[4-(3,4,5-trimetoxifenil)-piridin-2-il]-amina (I-146)
A una solución de 19 (50 mg) en 3 ml de DMF se le añadieron 2 equivalentes de anilina, 2 equivalentes de NaH y Pd(PPh_{3})_{4}. La mezcla se calentó a 80ºC durante una noche, se enfrió, se vertió en agua y se extrajo con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó al vacíopara producir un aceite pardo. El aceite se purificó por HPLC prep. para producir I-146 puro. Masa esperada = 370,1084; Masa encontrada (M+1) = 371,0. Tiempo de retención = 3,25 minutos.
Se han preparado otros compuestos de fórmula I por métodos sustancialmente similares a los descritos en los Ejemplos 1-26 anteriores y a los ilustrados en los Esquemas I-IV. Los datos de caracterización para estos compuestos se resumen en la Tabla 4 que se muestra a continuación e incluyen datos de LC/MS (observado), HPLC y ^{1}H RMN.
Como se usa en este documento, en la Tabla 4 que se muestra a continuación, "Y" significa que se dispone de los datos indicados y que se descubrió que eran coherentes con la estructura. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos indicados en las Tablas 1, 2 y 3.
El término "R_{t}" se refiere al tiempo de retención, en minutos, asociado con el compuesto.
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TABLA 4 Datos de Caracterización para los Compuestos Seleccionados 
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Los siguientes ejemplos demuestran cómo pueden ensayarse los compuestos de esta invención como inhibidores de las quinasas JNK3, Src, Lck, GSK3 y CDK2.
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Ejemplo 27
Clonación, Expresión y Purificación de la Proteína JNK3
Una búsqueda BLAST de la base de datos EST usando el ADNc de JNK3\alpha1 publicado como secuencia problema (query) identificó un clon EST (Nº 632588) que contenía la secuencia codificante entera de la JNK3\alpha1 humana. Se usaron reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) usando polimerasa pfu (Strategene) para introducir sitios de restricción en el ADNc para la clonación en el vector de expresión pET-15B en los sitios NcoI y BamHI. La proteína se expresó en E. coli. Debido a la mala solubilidad de la proteína de longitud completa expresada (Met 1-Gln 422), se produjo una proteína truncada en el extremo N-terminal que empezaba en el resto Ser en la posición 40 (Ser 40). Este truncamiento corresponde a la Ser 2 de las proteínas JNK1 y JNK2, y va precedido de una metionina (iniciación) y un resto de glicina. El resto de glicina se añadió para introducir un sitio NcoI para clonación en el vector de expresión. Además, se realizaron truncamientos C-terminales sistemáticos por PCR para identificar una construcción que produjera cristales con cualidad de difracción. Tal construcción codifica los restos aminoacídicos Ser 40-Glu 402 de JNK3\alpha1 y va precedida de restos de Met y Gly.
La construcción se preparó por PCR usando desoxioligonucleótidos:
5' GCTCTAGAGCTCCATGGGCAGCAAAAGCAAAGTTGACAA 3' (cebador directo con el codón de iniciación subrayado) (SEC ID Nº: 1) y 5' TAGCGGATCCTCATTCTGAATTCATTACTTCCTTGTA 3' (cebador inverso con el codón de parada subrayado) (SEC ID Nº: 2) como cebadores y se confirmó por secuenciación del ADN. Los experimentos de control indicaron que la proteína JNK3 truncada tenía una actividad kinasa equivalente hacia la proteína básica de mielina cuando se activaba con una kinasa MKK7 corriente arriba in vitro.
Se transformó la cepa BL21 (DE3) (Novagen) de E. coli con la construcción de expresión JNK3 y se cultivó a 30ºC en LB suplementado con 100 \mug/ml de carbenicilina en matraces de agitación hasta que las células estuvieron en la fase logarítmica (DO_{600} \sim 0,8). Se añadió isopropiltio-\beta-D-galactosidasa (IPTG) a una concentración final de 0,8 mM y las células se recogieron 2 horas después por centrifugación.
La pasta de células E. coli que contenía JNK3 se resuspendió en 10 volúmenes/g de tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,2, que contenía glicerol al 10% (v/v), NaCl 100 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM, 2 \mug/ml de Pepstatina, 1 \mug/ml de E-64 y 1 \mug/ml de Leupeptina). Las células se lisaron en hielo usando un microfluidizador y se centrifugaron a 100.000 x g durante 30 min a 4ºC. El sobrenadante de 100.000 x g se diluyó 1:5 con tampón A (HEPES 20 mM, pH 7,0, glicerol al 10% (v/v), DTT 2 mM) y se purificó por cromatografía de intercambio catiónico en SP-Sepharose (Pharmacia) (dimensiones de la columna: 2,6x 20 cm) a 4ºC. La resina se lavó con 5 volúmenes de columna de tampon A, seguido de 5 volúmenes de columna de tampon A que contenía NaCl 50 mM. La JNK3 unida se eluyó con un gradiente lineal de volumen de columna 7,5 de NaCl 50-300 mM. La JNK3 eluyó entre NaCl 150 y NaCl
200 mM.
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Ejemplo 28
Activación de JNK3
Se diluyeron 5 mg de JNK3 a 0,5 mg/ml en tampón HEPES 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 100 mM, DTT 5 mM, MgCl_{2} 20 mM y ATP 1 mM. Se añadió GST-MKK7 (DD) a una relación molar de 1:2,5 GST-MKK7:JNK3. Después de la incubación durante 30 minutos a 25ºC, la mezcla de reacción se concentró 5 veces por ultrafiltración en un Centriprep-30 (Amicon, Beverly, MA), se diluyó a 10 ml y se añadió mas ATP 1 mM. Este procedimiento se repitió tres veces para retirar el ADP y reponer el ATP. La adición final de ATP fue 5 mM y la mezcla se incubó durante una noche a 4ºC.
La mezcla reacción de JNK3/GST-MKK7(DD) activada se sometió a intercambio en tampón HEPES 50 mM, pH 7,5, que contenía DTT 5 mM y glicerol al 5% (p/v) por diálisis o unltrafiltración. La mezcla de reacción se ajustó a fosfato potásico 1,1 M, pH 7,5, y se purificó por cromatografía de interacción hidrófoba (a 25ºC) usando una columna Rainin Hydropore. GST-MKK7 y JNK3 inactivada no se unen de estas condiciones, de tal forma que cuando se crea un gradiente de fosfato potásico de 1,1 a 0,05 M durante 60 minutos a un caudal de 1 ml/minuto, la JNK3 doblemente fosforilada se separa de la JNK fosforilada en un solo sitio. La JNK3 activada (es decir, la JNK3 doblemente fosforilada) se almacenó a -70ºC a 0,25-1 mg/ml.
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Ejemplo 29
Ensayo de Inhibición de JNK
Se ensayaron los compuestos con respecto a la inhibición de JNK3 por un ensayo enzimático acoplado espectrofotométrico. En este ensayo, se incubó una concentración fija de JNK3 (10 nM) con diversas concentraciones de un inhibidor potencial disuelto en DMSO durante 10 minutos a 30ºC en un tampón que contenía tampón HEPES 0,1 M, pH 7,5, que contenía MgCl_{2} 10 mM, fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 200 \muM, 150 \mug/ml de piruvato quinasa, 50 \mug/ml de lactato deshidrogenasa y péptido receptor de EGF 200 \mug/ml. El péptido receptor de EGF tiene la secuencia KRELVEPLTPSGEAPNQALLR, y es un aceptor de fosforilo en la reacción quinasa catalizada por JNK3. La reacción se inició por la adición de ATP 10 \muM y la placa de ensayo se insertó en el compartimento de placas de ensayo del espectrofotómetro que se mantuvo a 30ºC. Se controló la reducción de absorbancia a 340 nm en función del tiempo. Los datos de velocidad en función de la concentración de inhibidor se ajustaron a un modelo cinético de inhibición competitiva para determinar el valor de K_{i}.
La Tabla 5 muestra los resultados de la actividad de los compuestos seleccionados de esta invención en el ensayo de inhibición de JNK. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos en las Tablas 1, 2 y 3. Los compuestos que tienen un valor de K_{i} menor de 0,1 micromolar (\muM) se califican como "A", los compuestos que tienen un valor de K_{i} entre 0,1 y 1 \muM se califican como "B" y los compuestos que tienen un valor de K_{i} mayor de 1 \muM se califican como "C". Las calificaciones de actividad "D", "E" y "F" corresponden al porcentaje de inhibición a una concentración de inhibidor 2 \muM. Los compuestos que tenían una actividad denominada "D" proporcionaron un porcentaje de inhibición menor o igual al 33%; los compuestos que tenían una actividad denominada "E" proporcionaron un porcentaje de inhibición comprendido entre 24% y 66%; y los compuestos que tenían una actividad denominada "F" proporcionaron un porcentaje de inhibición comprendido entre 67% y
100%.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 5 Actividad en el Ensayo de Inhibición de JNK3
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Ejemplo 30
Ensayo de inhibición de Src
Los compuestos se ensayaron como inhibidores de la quinasa Src humana recombinante de longitud completa (de Upstate Biotechnology, nº de cat. 14-117) expresada y purificada en células baculovirales. La actividad quinasa de Src se controlo siguiendo la incorporación de ^{33}P procedente de ATP en la tirosina de un sustrato polimérico de poli Glu-Tyr aleatorio de composición Glu:Tyr=4:1 (Sigma, nº de cat. P-0275). A continuación se proporcionan las concentraciones finales de los componentes de ensayo: HEPES 0,05 M, pH 7,6, MgCl_{2} 10mM, DTT 2 mM, 0,25 mg/ml de BSA, ATP 10 \muM (1-2 \muCi de ^{33}P-ATP por reacción), 5 mg/ml de poli Glu-Tyr, y 1-2 unidades de quinasa Src humana recombinante. En un ensayo típico, todos los componentes de la reacción con la excepción de ATP se premezclaron y se pusieron alícuotas en los pocillos de la placa de ensayo.
A los pocillos se añadieron inhibidores disueltos de DMSO para dar una concentración final de DMSO de 2,5%. La placa de ensayo se incubó a 30ºC durante 10 minutos antes de iniciar la reacción con ^{33}P-ATP. Después de 20 minutos de reacción, las reacciones se inactivaron con 150 \mul de ácido tricloroacético (TCA) al 10% que contenía Na_{3}PO_{4} 20 mM. Las muestras inactivadas después se transfirieron a una placa de filtro de 96 pocillos (Whatman, Filtro de fibra de vidrio UNI-Filter GF/F, nº de cat. 7700-3310) instalada en un colector de vacío de placas de filtro. Las placas de filtro se lavaron cuatro veces con TCA al 10% que contenía Na_{3}PO_{4} 20 mM y después 4 veces con metanol. Después se añadieron 200 \mul de líquido de centelleo a cada pocillo. Las placas se cerraron y la cantidad de radiactividad asociada con los filtros se cuantificó en un contador de centelleo TopCount.
La Tabla 6 muestra los resultados de la actividad de compuestos seleccionados de esta invención en el ensayo de inhibición de Src. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos de las Tablas 1, 2, y 3. Los compuestos con un valor de K_{i} menor de 0,1 micromolar (\muM) se califican como "A", los compuestos con un valor de K_{i} comprendido entre 0,1 y 1 \muM se califican como "B" y los compuestos con un valor de K_{i} mayor de 1 \muM se califican como "C". Las calificaciones de actividad "D", "E", y "F" corresponden al porcentaje de inhibición a una concentración de inhibidor 2 \muM. Los compuestos que tenían una actividad denominada "D" proporcionaron un porcentaje de inhibición menor o igual al 33%; los compuestos que tenían una actividad denominada "E" proporcionaron un porcentaje de inhibición comprendido entre 24 y 66%; y los compuestos con una actividad denominada "F" proporcionaron un porcentaje de inhibición comprendido entre 67 y 100%.
TABLA 6 Actividad en el Ensayo de Inhibición de SRC
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Ejemplo 31
Ensayo de inhibición de Lck
Los compuestos se ensayaron como inhibidores de la quinasa Lck purificada a partir de timo bovino (de Upstate Biotechnology, nº de cat. 14-106). La actividad quinasa de Lck se controló siguiendo la incorporación de ^{33}P procedente de ATP en la tirosina de un sustrato polimérico de poli Glu-Tyr aleatorio de composición Glu:Tyr = 4:1 (Sigma, nº de cat. P-0275). A continuación se proporcionan las concentraciones finales de los componentes de ensayo: HEPES 0,05 M, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2 mM, 0,25 mg/ml de BSA, ATP 10 \muM (1-2 \muCi de ^{33}P-ATP por reacción), 5 mg/ml de poli Glu-Tyr y 1-2 unidades de quinasa Lck. En un ensayo típico, todos los componentes de la reacción con la excepción del ATP se premezclaron y se introdujeron alícuotas en los pocillos de la placa de ensayo. Se añadieron a los pocillos inhibidores disueltos en DMSO para dar una concentración final de DMSO de 2,5%. La placa de ensayo se incubó a 30ºC durante 10 minutos antes de iniciar la reacción con ^{33}P-ATP. Después de 20 minutos de reacción, las reacciones se inactivaron con 150 \mul de ácido tricloroacético (TCA) al 10% que contenía Na_{3}PO_{4} 20 mM. Las muestras inactivadas después se transfirieron a una placa de filtro de 96 pocillos (Whatman, Filtro de fibra de vidrio UNI-Filter GF/F, nº de cat. 7700-3310) instalada en un colector de vacío de placas de filtro. Las placas de filtro se lavaron cuatro veces con TCA al 10% que contenía Na_{3}PO_{4} 20 mM y después 4 veces con metanol. Después se añadieron 200 \mul de líquido de centelleo a cada pocillo. Las placas se cerraron y la cantidad de radiactividad asociada con los filtros se cuantificó en un contador de centelleo
TopCount.
La Tabla 7 muestra los resultados de la actividad de compuestos seleccionados de esta invención en el ensayo de inhibición de Lck. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos de las Tablas 1, 2 y 3. Los compuestos con un valor de K_{i} menor de 0,1 micromolar (\muM) se califican como "A", los compuestos con un valor de K_{i} comprendido entre 0,1 y 1 \muM se califican como "B" y los compuestos con un valor de K_{i} mayor de 1 \muM se califican como "C". Las calificaciones de actividad "D", "E" y "F" corresponden al porcentaje de inhibición a una concentración de inhibidor 5 \muM. Los compuestos que tenían una actividad denominada "D" proporcionaron un porcentaje de inhibición menor o igual a 33%; los compuestos con una actividad denominada "E" proporcionaron un porcentaje de inhibición comprendido entre 24 y 66%; y los compuestos con una actividad denominada "F" proporcionaron un porcentaje de inhibición comprendido entre 67 y
100%.
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TABLA 7 Actividad en el Ensayo de Inhibición de Lck 
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Ejemplo 32
Ensayo de inhibición de GSK-3
Se investigaron los compuestos de la manera que se indica a continuación, para comprobar su capacidad de inhibir la Glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3) usando un ensayo enzimático acoplado convencional (Fox et al (1998) Protein Sci 7, 2249). A una solución de tampón madre de ensayo que contenía HEPES 0,1 M 7,5, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 25 mM, fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 300 \muM, DTT 1 mM, 30 \mug/ml de piruvato quinasa, 10 \mug/ml de lactato deshidrogenasa, péptido (HSSPHQp-SEDEEE, American Peptide, Sunnyvale, CA) 300 \muM y GSK-3 60 nM, se le añadió una solución 30 \muM del compuesto en DMSO y la mezcla resultante se incubó a 30ºC durante 5 minutos. La reacción se inició por la adición de ATP 10 \muM. Las velocidades de reacción se obtuvieron controlando la absorbancia a 340 nm durante un tiempo de lectura de 5 minutos a 30ºC usando un lector de placas Molecular Devices (Sunnyvale, CA). El valor de CI_{50} se determinó a partir de los datos de velocidad como una función de la concentración de
inhibidor.
La Tabla 8 muestra los resultados de la actividad de compuestos seleccionados de esta invención en el ensayo de inhibición de GSK-3. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos de las Tablas 1, 2 y 3. Los compuestos con un valor de K_{i} menor de 0,1 micromolar (\muM) se califican como "A", los compuestos con un valor de K_{i} comprendido entre 0,1 y 1 \muM se califican como "B" y los compuestos con un valor de K_{i} mayor de 1 \muM se califican como "C".
TABLA 8 Actividad Inhibidora de GSK-3 de los Compuestos Seleccionados 
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Ejemplo 33
Ensayo de inhibición de CDK2
Se investigaron los compuestos de la manera indicada a continuación para comprobar su capacidad de inhibir CDK2 usando un ensayo enzimático acoplado convencional (Fox et al (1998) Protein Sci 7, 2249).
A una solución de tampón madre de ensayo que contenía HEPES 0,1 M 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, NaCl 25 mM, fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 300 mM, 30 mg/ml de piruvato quinasa, 10 mg/ml de lactato deshidrogenasa, ATP 100 mM y péptido (MAHHHRSPRKRAKKK, American Peptide, Sunnyvale, CA) 100 \muM se le añadió una solución en DMSO de un compuesto de la presente invención a una concentración final de 30 \muM. La mezcla resultante se incubó a 30ºC durante 10 minutos.
La reacción se inició por la adición de 10 \mul de solución madre de CDK-2/Ciclina A para dar una concentración final de 25 nM en el ensayo. Las velocidades de reacción se obtuvieron controlando la absorbancia a 340 nm durante un tiempo de lectura de 5 minutos a 30ºC usando un lector de placas Biorad Ultramark (Hercules, CA). Los valores de K_{i} se determinaron a partir de los datos de velocidad en función de la concentración de inhibidor.
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La Tabla 9 muestra los resultados de la actividad de compuestos seleccionados de esta invención en el ensayo de inhibición de CDK2. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos de las Tablas 1, 2 y 3. Los compuestos con un valor de K_{i} menor de 2 micromolar (\muM) se califican como "A", los compuestos con un valor de K_{i} comprendido entre 2 y 5 \muM se califican como "B" y los compuestos con un valor de K_{i} mayor de 5 \muM se califican como "C".
TABLA 9 Actividad Inhibidora de CDK2 de los Compuestos Seleccionados
73
Aunque se han descrito varias realizaciones de esta invención, es evidente que los ejemplos básicos pueden alterarse para proporcionar otras realizaciones que utilizan los compuestos y métodos de esta invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de esta invención debe definirse por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por las realizaciones específicas que se han representado a modo de ejemplo.

Claims (13)

1. Un compuesto de fórmula I o II:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:
cada W se selecciona independientemente entre nitrógeno o CH;
R^{1}, R^{2} y R^{3} se seleccionan independientemente entre OH, OCH_{3}, OCH_{2}CH_{3}, NHCOMe, NH_{2}, NH (grupo alifático C_{1-4}), N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, O(CH_{2})_{2}morfolin-4-ilo, O(CH_{2})_{2}NH_{2}, O(CH_{2})_{2}NH(grupo alifático C_{1-4}), O(CH_{2})_{2}N(grupo alifático C_{1-4})_{2}, bromo, cloro o flúor; o
R^{1} y R^{2} o R^{2} y R^{3} se toman juntos para formar 76
R^{4} es un anillo fenilo, ciclohexilo, naftilo, piridilo, pirimidinilo, triazinilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, indazolilo o bencimidazolilo sustituido; donde
dicho anillo está sustituido con 1-2 grupos seleccionados independientemente entre cloro, flúor, bromo, metilo, etilo, t-butilo, isopropilo, ciclopropilo, CF_{3}, NH_{2}, bencilo, benciloxi, OH-, metilendioxi, SO_{2}NH_{2}, fenoxi, O-piridinilo, SO_{2}fenilo, nitrofenoxi, aminofenoxi, S-dimetilpirimidina, NH-fenilo, NH-metoxifenilo, piridinilo, aminofenilo, fenol, cloro-fluoro-fenilo, dimetilaminofenilo, CF_{3}-fenilo, dimetilfenilo, clorofenilo, fluorofenilo, metoxifenoxi, clorofenoxi, etoxifenoxi o fluorofenoxi; con la condición de que:
dicho compuesto sea distinto de un compuesto de fórmula III
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77 
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en la que:
A es un anillo fenilo sustituido con uno o más grupos seleccionados entre halógeno, N(R^{10})_{2} o OR^{10}, donde
cada R^{10} se selecciona independientemente entre hidrógeno o un grupo alquilo C_{1}-C_{7} opcionalmente sustituido con NH_{2}, NH(alquilo C_{1}-C_{7}) o N(alquilo C_{1}-C_{7})_{2}; y
B se selecciona entre halógeno, SO_{2}N(R^{10})_{2}, N(R^{10})_{2}, OR^{10} o fluoro-(alquilo C_{1}-C_{7}).
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre los indicados en cualquiera de las Tablas que se muestran a continuación:
donde, cuando W es N, el compuesto de fórmula I se selecciona entre:
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80
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y donde, cuando W es CH, el compuesto de fórmula I se selecciona entre:
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y donde, cuando W es N, el compuesto de fórmula II se selecciona entre:
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94
95
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97
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99
100
101
3. Una composición que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y un excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional seleccionado entre un agente antiproliferativo, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador, un factor neurotrófico, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un agente para tratar una enfermedad hepática, un agente antiviral, un agente para tratar trastornos sanguíneos, un agente para tratar la diabetes o un agente para tratar trastornos de inmunodeficiencia.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; o una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en la inhibición de la actividad quinasa de JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en una muestra biológica.
6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección mediada por JNK3, GSK-3, CDK2, Lck o Src en un paciente.
7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección en un paciente seleccionada entre una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, trastorno destructivo óseo, enfermedad neurodegenerativa, reperfusión/isquemia en apoplejía, ataque cardíaco, trastorno angiogénico, hipoxia de órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardíaca, agregación de plaquetas inducida por trombina o una afección asociada con citoquinas proinflamatorias.
8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección en un paciente seleccionada entre hipercalcemia, osteoporosis, osteoartritis, tratamiento sintomático de metástasis ósea, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus, enfermedad de injerto contra hospedador, enfermedad de hipersensibilidad mediada por células T, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Guillain-Barre, trastorno pulmonar obstructivo crónico, dermatitis por contacto, enfermedad de Paget, asma, lesión isquémica o de reperfusión, enfermedad alérgica, dermatitis atópica o rinitis alérgica.
9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección en un paciente seleccionada entre diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, demencia asociada con el SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (AML), esclerosis múltiple (MS), esquizofrenia, hipertrofia de cardiomiocitos o calvicie.
10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; o una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de un cáncer.
11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, para uso junto con un agente terapéutico adicional seleccionado entre un agente anti-proliferativo, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador, un factor neurotrófico, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un agente para tratar una enfermedad hepática, un agente antiviral, un agente para tratar trastornos sanguíneos, un agente para tratar la diabetes o un agente para tratar trastornos de inmunodeficiencia, donde dicho agente terapéutico adicional está junto con dicha composición como una forma de dosificación individual o de forma separada de dicha composición como parte de una forma de dosificación múltiple.
12. Una composición para recubrir un dispositivo implantable que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo adecuado para recubrir dicho dispositivo implantable.
13. Un dispositivo implantable recubierto con una composición de acuerdo con la reivindicación 12.
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