ES2292596T3 - Procedimiento de rastreo de matriz. - Google Patents

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Lucy Jessica Holt
Ian Tomlinson
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Abstract

Un procedimiento para rastrear un primer repertorio de miembros que comprenden polipéptidos frente a un segundo repertorio de miembros que comprenden polipéptidos para identificar aquellos miembros del primer repertorio los cuales interaccionan con miembros del segundo repertorio, que comprende: (a) disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y (b) detectar una interacción entre polipéptidos del primer y el segundo repertorios, identificando por lo tanto aquellos miembros del primer repertorio que interaccionan con miembros del segundo repertorio.

Description

Procedimiento de rastreo de matriz.
La presente invención se refiere a un procedimiento el cual se puede usar para rastrear dos o más repertorios de moléculas el uno frente al otro y/o para crear y rastrear repertorios combinatorios combinando dos o más repertorios. En particular, la invención se refiere a un procedimiento como resultado del cual se pueden rastrear dos repertorios de moléculas de tal forma que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se prueban frente a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio por interacciones funcionales. Además, la invención se refiere a la creación y rastreo de repertorios de anticuerpos combinando un repertorio de cadenas pesadas con un repertorio de cadenas ligeras de tal forma que los anticuerpos formados mediante sustancialmente todas las combinaciones de cadenas pesadas y ligeras se pueden rastrear frente a uno o más ligandos objetivo.
Introducción
El mapeado y la secuenciación de diferentes genomas conducirán eventualmente a la clonación de todas las proteínas expresadas por estos organismos. Con el fin de crear los mapas de interacción de estas proteínas, se necesitan llevar a cabo dos rastreos bidimensionales tales que se pueda probar la unión de cada proteína a cada proteína distinta.
Se requieren también rastreos bidimensionales para un número de aplicaciones distintas. Por ejemplo, técnicas tales como inmunización de ratones acopladas con la producción de anticuerpos monoclonales y procedimientos de selección in vitro tales como exposición a fagos se han usado para generar simultáneamente muchos anticuerpos diferentes contra muchos objetivos diferentes. Con el fin de determinar cuales anticuerpos se unen a cuales objetivos estas reservas necesitan hacerse no complicadas, lo cual requiere un procedimiento de rastreo complejo.
Además, si se generan fármacos de molécula pequeña contra objetivos humanos para terapia ello sería útil para determinar no sólo la extensión de unión de una proteína humana dada a un candidato teórico a fármaco sino también la extensión (si hay alguna) de reacción cruzada del mismo candidato a fármaco con otras proteínas humanas o si otros fármacos relacionados son mejores aglutinantes y/o menos reactivos de forma cruzada.
Todos estos ejemplos exigen una técnica como resultado de la cual las interacciones entre miembros de una primera serie (o repertorio) de moléculas se puedan probar rápidamente frente a todos los miembros de una segunda serie (o repertorio) de moléculas. Hasta la fecha, tales rastreos se llevan a cabo generalmente administrando combinaciones de reactivos dentro de pocillos compartimentalizados o unos encima de otros en forma de manchas en una membrana tal que todas las combinaciones de reactivos a probarse estén presentes en pocillos/manchas separados. Por lo tanto si un repertorio de 100 moléculas está para probarse frente a un repertorio diferente que consta también de 100 moléculas, se requerirían 10.000 pocillos/manchas para cubrir exhaustivamente todas las combinaciones de miembros de los dos repertorios. La creación de tales combinaciones dispuestas discontinuamente requeriría, para una interacción de dos componentes, dos veces tantos "eventos" de administración como pocillos o manchas haya, en este caso 20.000, además de cualesquiera eventos de administración que podrían requerirse para facilitar o detectar las interacciones. Como el número de miembros en cada repertorio se incrementa linealmente, el número de combinaciones, y así los eventos de administración, se incrementan exponencialmente. Efectivamente para una interacción de tres componentes, que implican, digamos, un repertorio de sólo 100 cadenas pesadas de anticuerpos, un repertorio de sólo 100 cadenas ligeras, y un repertorio de sólo 100 antígenos potenciales, se requerirían un millón de eventos de "administración".
Sumario de la invención
Los inventores han desarrollado una metodología, la cual han llamado Rastreo de Matriz, la cual se puede usar para estudiar todas las interacciones posibles entre todos los miembros en dos repertorios de moléculas la cual eliminan la necesidad de compartimentalizar combinaciones individuales de miembros de estos repertorios.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para rastrear un primer repertorio de miembros que comprenden polipéptidos frente a un segundo repertorio de miembros que comprenden polipéptidos para identificar aquellos miembros del primer repertorio los cuales interaccionan con miembros del segundo repertorio, que comprende:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
detectar una interacción entre polipéptidos de los repertorios primero y segundo, identificando por lo tanto aquellos miembros del primer repertorio que interaccionan con miembros del segundo repertorio.
La invención, en su forma más amplia, proporciona un procedimiento para rastrear dos repertorios de moléculas uno frente al otro. Los miembros individuales de los dos repertorios se configuran espacialmente para permitir la yuxtaposición de sustancialmente todas las combinaciones de miembros de ambos repertorios. Se entenderá que la referencia en el presente documento a "sustancialmente todas las combinaciones" (o "sustancialmente todos los miembros") no excluyen que ciertas yuxtaposiciones puedan no tener lugar, bien por azar o a propósito. Sin embargo, la invención requiere que dos repertorios de moléculas se rastreen uno frente al otro simultáneamente, y excluye el rastreo de un repertorio individual con miembro(s) individual(es) de un segundo repertorio. Preferiblemente "sustancialmente todos" se refiere al menos al 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o al 100% de los miembros de un repertorio.
De acuerdo con la invención, la yuxtaposición puede llegarse a, por ejemplo, crear una serie de líneas para cada uno de los dos repertorios, las cuales intersectan unas con otras. Las líneas pueden ser rectas, líneas sustancialmente paralelas, o curvas, o combinaciones de las mismas; la única restricción es que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio deberían ser capaces de interaccionar con sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio. Ejemplos de configuraciones complementarias incluyen líneas paralelas rectas, dispuestas en un ángulo a líneas paralelas rectas; círculos concéntricos o polígonos, usados conjuntamente con una estrella de líneas radiales. Una persona experta será capaz de imaginar otros sistemas que se usan para lograr una configuración espacial similar de los miembros del repertorio de acuerdo con la invención, estando caracterizados todos por la administración de alguna forma de línea continua, que corresponde a cada miembro del primer repertorio, sustancialmente todos los cuales tienen la capacidad de interaccionar con sustancialmente todas las líneas, que corresponden a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio.
De acuerdo con la invención, se proporciona un procedimiento en el que miembros de tanto el primer repertorio como el segundo repertorio están dispuestos en una serie de líneas, conteniendo cada una un miembro del primer o el segundo repertorios tal que las líneas, que corresponden al primer repertorio y aquellas que corresponden al segundo repertorio se ponen en contacto unas con otras de tal forma que sustancialmente cada uno de los miembros del primer repertorio están yuxtapuestos con sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio.
En el contexto de la presente invención, "un" miembro puede significar un miembro individual o al menos un miembro. Ventajosamente, se refiere a un miembro individual. Sin embargo, en un aspecto alternativo la invención proporciona también el uso de grupos constituidos por más de un miembro del repertorio en cada línea, canal o tubo. Preferiblemente, tales grupos constan de 10 miembros o menos, ventajosamente 5 o menos, pero al menos 2.
La ventaja de usar líneas entrecruzadas, de acuerdo con la presente invención comparadas con rastreo combinatorio compartimentalizado en la técnica previa es que según el tamaño de los repertorios individuales crece linealmente, así lo hace el número de etapas de administración requeridas para rastrear todas las combinaciones de miembros del repertorio. Así, mientras que las técnicas de rastreo que usan pocillos requerirían 10.000 etapas de administración para rastrear un repertorio de 100 por 100, el rastreo de acuerdo con la presente invención requiere sólo 200 etapas de administración. Además, dado que se usa un único evento de administración para disponer espacialmente cada miembro de cada repertorio, la comparación de interacciones entre miembros individuales del primer repertorio con los miembros del segundo repertorio con los cuales se yuxtaponen será más segura. Además, dado que la presente invención usa líneas entrecruzadas más que manchas o canales entrecruzadas más que pocillos, se necesita menos seguridad posicional para asegurar que se prueban sustancialmente todas las combinaciones de interacciones posibles. Así, si se lleva a cabo un rastreo bidimensional, y una línea que corresponde a un miembro del primer repertorio se contrarresta mediante, por ejemplo, 1 mm, dado que está dispuesta en un ángulo con sustancialmente todas las líneas del segundo repertorio, aún intersecará sustancialmente con todas ellas y por lo tanto se habrán probado adecuadamente sustancialmente aún todas las combinaciones de interacciones. Si, por otro lado, las manchas que corresponden a un miembro del primer repertorio se contrarrestan mediante, por ejemplo, 1 mm, pueden perder las manchas que corresponden a los miembros del segundo repertorio en conjunto y por lo tanto muchas combinaciones de interacciones no se habrán probado. Por lo tanto, la presente invención no sólo está bien establecida para procedimientos automatizados de rastreo sino también para procedimientos manuales, donde la seguridad posicional no se puede garantizar y el número de agentes de administración se debe limitar.
Como se describe anteriormente, las líneas, se pueden disponer en una diversidad de formatos y se pueden disponer en un soporte individual, o en una pluralidad de soportes. En la configuración más simple, las moléculas se pueden alargar manualmente en forma de líneas en un soporte individual, por ejemplo en una membrana de nitrocelulosa. Estas líneas se pueden aplicar a soportes adecuados usando técnicas robóticas, las cuales permiten la seguridad y densidad de disposiciones para incrementarse a gran ventaja en la presente invención. En un aspecto ventajoso de la invención, se puede usar un sistema de multisoporte, en el que se preparan las disposiciones de líneas en soportes separados los cuales se yuxtapusieron después con el fin de valorar la interacción entre, los miembros de los repertorios.
La presente invención se puede aplicar a ensayos dimensionales mayores, por ejemplo, aquellos de tres dimensiones. Así, interacciones de tres componentes, tales como enzima, sustrato y cofactor se pueden rastrear usando líneas, canales o tubos que se disponen en tres dimensiones. Alternativamente, los tres componentes podrían ser cadena pesada de anticuerpo, cadena ligera de anticuerpo y antígeno, y se pueden rastrear repertorios de los mismos en tres dimensiones. El rastreo de los repertorios en 2, 3 o mayores dimensiones de acuerdo con la presente invención es altamente ventajoso y reduce el número de eventos de administración (o de pipeteo) que se requerirían para llevar a cabo un rastreo combinatorio exhaustivo. Así, el rastreo de dos repertorios, de, digamos, 300 miembros uno frente al otro usando técnicas convencionales en la técnica previa requeriría al menos 90.000 eventos de administración separados y el rastreo de tres repertorios, de, digamos, 300 miembros el uno frente al otro requeriría al menos 2,7 millones de eventos de administración. En contraste, la presente invención reduce el número de eventos de administración para rastrear exhaustivamente los mismos repertorios a 60 ó 900, respectivamente, un ahorro enorme en términos de tiempo y trabajo.
Se puede crear un ensayo multidimensional en un número de maneras. Ventajosamente, se crea una tercera dimensión mediante filtros apilados u otros membranas tales y dependen de acción capilar para transferir moléculas, o forzando moléculas a través del apilamiento mediante un medio tal como electroforesis u ósmosis o penetrando el apilamiento o mediante el uso de filtros permeables para crear el apilamiento.
Además, se puede crear una tercera dimensión apilando capas no permeables las cuales en las intersecciones de canales (para los repertorios primero y segundo) tienen agujeros los cuales (una vez que las capas están apiladas) forman una serie adicional de canales en una tercera dimensión a lo largo de la cual los miembros de un tercer repertorio pueden pasar. La tercera dimensión se puede crear usando un bloque de gel o sustancia similar tal, el cual se puede inyectar con miembros del primero, segundo, o tercero repertorios a lo largo de las caras x, y y z, respectivamente, creando así canales en un espacio tridimensional el cual forma la disposición.
Aún adicionalmente, la matriz de interacciones entre miembros del primero, segundo (y opcionalmente tercero) repertorios de moléculas se pueden crear usando una red de tubos entrecruzadas o tubos semipermeables colocados adyacentes unos a otros.
Los miembros de los repertorios de moléculas primero, segundo (y opcionalmente tercero) se pueden reemplazar a lo largo del tiempo con miembros diferentes de los mismos repertorios de tal forma que se puede rastrear una nueva combinación o grupo de interacciones.
Dado que la presente invención se puede usar para rastrear rápidamente interacciones de multicomponente y de multicadena, se puede aplicar a la creación y rastreo simultáneos de bibliotecas combinatorias de moléculas, por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos o de receptores de células T. Así en lugar de generar una biblioteca combinatoria grande de anticuerpos combinando los genes de cadenas pesadas y ligeras y después rastrear separadamente los emparejamientos resultantes, los emparejamientos por sí mismos se pueden generar de acuerdo con la invención y, opcionalmente pueden rastrearse frente a uno o más antígenos objetivo. Así, digamos, 1000 cadenas pesadas se pueden representar como líneas en una dimensión, y 1000 cadenas ligeras se pueden representar como líneas en otra, tal que sustancialmente todas las líneas de cadenas pesadas intersecan con sustancialmente todas las líneas de cadenas ligeras, formando en su intersección moléculas de anticuerpo totalmente funcionales y plegadas, las cuales se pueden rastrear con un antígeno yuxtapuesto, por ejemplo recubierto en un soporte adicional el cual se lleva en contacto con las líneas de cadenas pesadas y ligeras entrecruzadas. De acuerdo con esta realización, sustancialmente todas las combinaciones de 1000 cadenas pesadas y 1000 cadenas ligeras se habrán rastreado es decir un total de 1 millón de anticuerpos diferentes, usando sólo 2000 eventos de administración, más que el 1 millón que tendrían que usarse de acuerdo con las técnicas de rastreo en la técnica previa. Esto proporciona una forma rápida para rastreo "simple" para interacciones específicas. Así, por ejemplo, un repertorio de cadenas pesadas y un repertorio de cadenas ligeras, los miembros (o cualquier miembro relacionado) de los cuales nunca han estado en contacto o se han seleccionado frente a un antígeno objetivo dado (o un antígeno objetivo dado de los mismos) se pueden rastrear frente al antígeno objetivo para identificar un emparejamiento de cadena pesada y ligera de unión específico.
Así, en un quinto aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para crear una biblioteca combinatoria de polipéptidos que comprenden dos reivindicaciones, cada miembro de la cual biblioteca comprende un miembro de un primer repertorio de miembros que comprenden un polipéptido de cadena pesada y/o ligera y un miembro de un segundo repertorio de miembros que comprenden un polipéptido de cadena pesada y/o ligera, procedimiento el cual comprende la etapa de disponer el primer repertorio de miembros en una primera serie de líneas continuas, y dicho segundo repertorio en una segunda serie de líneas continuas, de tal forma que se yuxtaponen sustancialmente todos los miembros del primer repertorio a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio, generando de este modo en los puntos de yuxtaposición, una pluralidad de combinaciones de polipéptidos que comprenden dos cadenas, creando de este modo una biblioteca combinatoria de polipéptidos que comprenden dos cadenas.
Preferiblemente, la biblioteca combinatoria es una biblioteca de anticuerpos o receptores de células T y los dos repertorios constan de cadenas pesadas y ligeras (en el caso de una biblioteca de anticuerpos) o cadenas alfa y beta (en el caso de una biblioteca de receptores de células T).
La biblioteca combinatoria así producida se rastrea preferiblemente para interacciones con más de una molécula objetivo. Así, la molécula objetivo se puede proporcionar en forma de un grupo de moléculas objetivo, o un repertorio de las mismas, y rastrear en una disposición tridimensional como se describe en el presente documento.
Preferiblemente, el procedimiento de acuerdo con la invención se puede usar de tal forma que se cree una biblioteca de polipéptidos de tres cadenas (y opcionalmente se rastree) usando los repertorios primero, segundo y tercero de moléculas en tres dimensiones.
Se puede usar el patrón de interacciones entre los repertorios primero, segundo (y opcionalmente tercero) para identificar interacciones positivas, interacciones negativas, interacciones especificas o interacciones de reacción cruzada, o para construir un árbol filogenético que infiere la similaridad entre miembros de primer repertorio (usando el patrón de interacciones con el segundo y/o, opcionalmente el tercero, repertorios), del segundo repertorio (usando el patrón de interacciones con el primero y/o, opcionalmente el tercero, repertorios), y/o el tercer repertorio (usando el patrón de interacciones con el primero y/o el segundo repertorios).
Dado que muchas de las interacciones que se rastrearán de acuerdo con la presente invención implican polipéptidos que se han derivado, directa o indirectamente, mediante expresión de secuencias de ácidos nucleicos, es altamente ventajoso que los ácidos nucleicos por sí mismos estén dispuestos en líneas, canales o tubos de acuerdo con la invención y se expresen para producir sus polipéptidos correspondientes. De esta manera, los polipéptidos que intersecan para cada uno de los dos repertorios se expresarán juntos. Esto puede ayudar a su asociación, particularmente cuando la asociación de los dos miembros de los repertorios depende del plegamiento cooperativo, por ejemplo, como en el caso de anticuerpos. Además, la información respecto a las interacciones de miembros de los repertorios estará ligada espacialmente a la información genética la cual las codifica. Esta información genética se puede determinar calculando las coordenadas de la interacción y aislando los datos de secuencia de nucleótidos correspondiente a partir de cualquier punto de esta línea, canal o tubo o aislando los datos de la secuencia de nucleótidos de la interacción propia.
De acuerdo con ello, en un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento en el que uno o más de los repertorios, primero, segundo, y opcionalmente tercero comprende una pluralidad de moléculas de ácido nucleico las cuales se expresan para producir sus correspondientes polipéptidos in situ en la disposición.
Dado que la presente invención se refiere al rastreo rápido y eficiente de dos o más repertorios uno frente al otro, cualesquiera técnicas actualmente empleadas para potenciar o trastornar las interacciones moleculares se pueden usar con la invención. Así, un repertorio puede constar de variantes de un hapteno libre y el otro repertorio puede constar de anticuerpos antihapténicos seleccionados. Disponiendo ambos repertorios en proximidad cercana a una versión inmovilizada de la molécula hapténica objetivo el rastreo se puede usar para identificar aquellos anticuerpos que están compitiendo por unión al hapteno objetivo inmovilizado uniendo a ciertas variantes de hapteno libres. En este caso, la carencia de unión se consideraría un resultado positivo. Los controles para un experimento tal pueden incluir una línea de agua al lado de los anticuerpos antihapténicos y una línea de anticuerpos de unión no de haptenos al lado de los anticuerpos antihapténicos. Alternativamente, un hapteno libre individual podría usarse para trastornar unión de miembros de un repertorio de anticuerpos antihapténicos a miembros de un repertorio de diferentes variantes de haptenos inmovilizadas. Otras terceras moléculas pueden incluir sustancias que potencian unión de los miembros del repertorio unos con otros, las cuales se pueden usar por sí mismas en forma de un repertorio de acuerdo con la invención. De este modo, una molécula objetivo se podría inmovilizar en un soporte sólido y los repertorios de aglutinantes que intersecan y los potenciadores de aglutinantes podrían ponerse en contacto con la molécula objetivo. Aquellos expertos en la técnica prevendrán muchas combinaciones diferentes de de tales moléculas y miembros del repertorio.
De acuerdo con ello, en un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para escanear un primer repertorio de moléculas frente a un segundo repertorio de moléculas para identificar miembros de los repertorios primero y segundo cuyas interacciones unos con otros son dependientes de la presencia o ausencia de una tercera molécula o grupo de moléculas, comprendiendo:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, de tal forma que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
detectar las interacciones entre miembros del primer repertorio y los miembros del segundo repertorio en presencia de diferentes concentraciones de la tercera molécula o grupo de moléculas.
En una realización adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para rastrear un primer repertorio de moléculas frente a un segundo repertorio de moléculas para identificar aquellos miembros del primer repertorio los cuales no interaccionan con aquellos miembros del segundo repertorio, comprendiendo:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; e
(b)
identificar aquellos miembros de los repertorios primero y segundo que no interaccionan unos con los otros.
El procedimiento de la presente invención tiende un puente sobre el espacio entre la identificación inicial de los objetivos guía y moléculas de repertorios muy largos y la identificación final de objetivos de o fármacos para la intervención terapéutica. Este problema se afrontaba en la técnica previa mediante el uso de rastreo de ELISA de interaccionantes positivos posibles. Sin embargo, los protocolos de ELISA no están automatizados fácilmente para alta capacidad de procesamiento. La naturaleza altamente paralela del procedimiento de acuerdo con la presente invención revelará perfiles de interacción exhaustivos para miembros de cada repertorio. Esto permitirá, por ejemplo, que se distingan ligandos que interaccionan con una familia entera de proteínas de aquellos los cuales reaccionan con sólo un subgrupo de esa familia, fármacos de reactividad cruzada para eliminarse de los programas de desarrollo, y la verdadera especificidad y reactividad cruzada de anticuerpos a determinarse. La determinación de una reactividad cruzada de anticuerpos y así de su especificidad es de vital importancia donde hay un panel de diferentes anticuerpos habiéndose derivado de un ratón inmunizado o de una selección in vitro llevada a cabo, por ejemplo, mediante exposición a fagos. El Rastreo de Matriz es particularmente poderoso en este contexto ya que permite probarse un intervalo exhaustivo de antígenos frente a cada anticuerpo en el panel, minimizando el cambio de reactividades cruzadas desconocidas e indeseadas que alteran las investigaciones posteriores.
Alternativamente, usando la presente invención para crear y rastrear bibliotecas combinatorias exhaustivamente, se crearían y rastrearían bibliotecas de anticuerpos de un millón de clones usando sólo 2.000 eventos de administración. Además, los mapas de interacción proteína-proteína complejos se pueden crear a partir de fuentes enriquecidas de pares interaccionantes, o usando posiblemente proteomas enteros conjuntamente con matrices de muy alta densidad de acuerdo con la invención.
La invención también incorpora las ventajas clave de la exposición a fagos y otras técnicas de exposición de expresión, a saber que los ácidos nucleicos que codifican los miembros de un repertorio de polipéptidos pueden asociarse espacialmente con sus polipéptidos correspondientes y pueden seleccionarse así sobre la base de las características funcionales del polipéptido individual. A diferencia de la exposición a fagos, sin embargo, en la cual esta asociación se logra compartimentalizando los ácidos nucleicos y los polipéptidos usando células bacterianas las cuales exponen los polipéptidos en sus superficies, la invención sujeto aprovecha ventajosamente una estrategia de disposición novedosa para proporcionar esta asociación. Eliminando el requerimiento para que los ácidos nucleicos y los polipéptidos estén retenidos en o sobre células bacterianas, la presente invención puede ampliarse más allá de selección de actividades de unión para seleccionar cualquier repertorio de polipéptidos sobre la base de cualquier propiedad funcional de los polipéptidos, incluyendo actividad enzimática, conformación o cualquier otra característica detectable.
Aspectos adicionales de la presente invención son procedimientos proporcionados como sigue.
Un procedimiento para rastrear dos o más repertorios de enzimas los cuales comprenden dos o más reacciones enzimáticas para identificar aquellos miembros del segundo repertorio los cuales crean conjuntamente un producto dado a partir de un sustrato dado, procedimiento que comprende:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
detectar la formación de producto y la intersección de los miembros en el primero y el segundo repertorios.
Un procedimiento para rastrear diferentes poblaciones celulares frente a diferentes poblaciones virales para identificar aquellas poblaciones virales que infectan aquellas poblaciones celulares, procedimiento el cual comprende
(a)
disponer las poblaciones celulares y las poblaciones virales para formar al menos un ensayo, en el que las poblaciones virales se disponen en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de de dicha población viral comprende un miembro de dicha población y disponer la población celular en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicha población celular, en las que las poblaciones viral y celular forman al menos una disposición, de tal forma que sustancialmente todos los miembros de la población celular se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros de la población viral; y
(b)
detectar aquellas poblaciones virales que infectan aquellas poblaciones celulares.
Un procedimiento para rastrear diferentes fracciones celulares unas frente a otras para identificar aquellas fracciones celulares que contienen componentes los cuales interaccionan con componentes en otras fracciones celulares, procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer las fracciones celulares en al menos dos series de líneas continuas en las que cada línea de dichas series primera y segunda comprende un miembro de dicha fracción celular y tal que sustancialmente todas las fracciones celulares diferentes están yuxtapuestas unas a otras;
(b)
detectar la(s) interacción/interacciones en las intersecciones de las diferentes fracciones celulares.
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Un procedimiento para escanear un repertorio de péptidos frente al mismo repertorio de péptidos para identificar aquellos miembros del repertorio de péptidos con otros miembros del repertorio de péptidos, procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer los miembros del repertorio de péptidos en al menos dos series de líneas continuas en las cuales cada línea de dichas series primera y segunda comprende un miembro de dicho repertorio de péptidos y tal que sustancialmente todos los diferentes miembros del repertorio de péptidos están yuxtapuestos uno a otro
(b)
detectar la(s) interacción/interacciones en las intersecciones de los diferentes miembros del repertorio de péptidos.
Un procedimiento para crear (y opcionalmente rastrear) una biblioteca de dos híbridos de levaduras constituida por sustancialmente todos los miembros de un primer repertorio de polipéptidos emparejados con sustancialmente todos los miembros de un segundo repertorio de polipéptidos, procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer células de levaduras que contienen una pluralidad de secuencias de nucleótidos para crear al menos una disposición, en la que las secuencias de nucleótidos se disponen en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende células de levaduras que contienen una secuencia de nucleótidos y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende células de levaduras que contienen un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
permitir a las células de levadura que contienen los miembros del primer repertorio aparearse con las células que contienen los miembros del segundo repertorio donde los dos repertorios intersecan, y opcionalmente
(c)
expresar las secuencias nucleotídicas para producir los polipéptidos correspondientes de los repertorios primero y segundo; y opcionalmente
(d)
detectar las interacciones entre los miembros polipeptídicos de los repertorios primero y segundo.
Diversos aparatos pueden suministrarse en asociación con reactivos o herramientas para llevar a cabo los rastreos anteriormente descritos.
Definiciones
El término "repertorio" como se usa de acuerdo con la presente invención se refiere a una población de diversas variantes, por ejemplo variantes polipeptídicas las cuales difieren en secuencia de aminoácidos, variantes de DNA que difieren en composición nucleotídica y/o secuencia de cualquier otro tipo de molécula la cual puede existir en un número de formas diferentes. Generalmente, un repertorio incluye más de 10 variantes diferentes. Los repertorios grandes comprenden el número más alto de variantes posibles para selección y pueden ser hasta 10^{13} en tamaño. Los repertorios menores son particularmente útiles, especialmente si se han preseleccionado para enriquecer para un subgrupo particularmente útil (por ejemplo, anticuerpos que unen marcadores de superficie celular, enzimas que catalizan un cierto grupo de reacciones, proteínas que unen a otras proteínas, etc.) o para eliminar miembros no deseados (tales como aquellos que incluyen codones de parada, incapaces de plegamiento correcto o los cuales son inactivos de otra manera). Tales repertorios menores pueden comprender 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o más polipéptidos. Ventajosamente, los repertorios menores comprenden entre 10 y 10^{4} polipéptidos.
En la presente invención, se rastrean dos o más repertorios de polipéptidos unos frente a otros. Ventajosamente, al menos el 50% de los miembros de cada repertorio se rastrean uno frente al otro en cada rastreo. Preferiblemente, el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso el 100% de los miembros de cada repertorio se rastrean así.
En el contexto de la presente invención, "interaccionar" se refiere a cualquier interacción detectable entre las moléculas las cuales comprenden los diversos repertorios y, opcionalmente, cualesquiera moléculas adicionales que comprenden el rastreo. Por ejemplo, en el caso de alteraciones antígeno-anticuerpo un repertorio puede comprender una población diversa de anticuerpos y el otro una población diversa de antígenos, siendo la interacción una interacción de unión. Alternativamente, la interacción puede ser una reacción catalizada enzimáticamente, en la cual un repertorio está compuesto de enzimas y el otro repertorio está compuesto de sustratos para ello. Cualquier interacción se puede ensayar usando la presente invención, incluyendo interacciones de unión, metilación de DNA, degradación de ácidos nucleicos, escisión de ácidos nucleicos (de cadena simple o doble), eventos de señalización, reacciones catalíticas, eventos de fosforilación, eventos de glicosilación, escisión proteolítica, reacciones químicas, infección celular y combinaciones de las mismas. La detección de tales interacciones se conoce bien en la técnica.
En el contexto de la presente invención, "molécula" se refiere a cualquier sustancia la cual se puede aplicar al rastreo. Tales moléculas pueden incluir péptidos, polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos, proteínas purificadas, proteínas recombinantes, aminoácidos, cDNA, cDNA expresados, oligonucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, familias de genes relacionados o las proteínas correspondientes de los mismos, enzimas, proteínas de unión a DNA, miembros de la familia de las inmunoglobulinas, anticuerpos, receptores de células T, haptenos, moléculas orgánicas pequeñas, compuestos no orgánicos, iones metálicos, carbohidratos y combinaciones de los mismos. La creación de repertorios de tales moléculas se conoce bien en la técnica. "Polipéptidos" se puede referir a polipéptidos los cuales expresan cDNA, miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, tales como polipéptidos de anticuerpos o polipéptidos de receptores de células T. Ventajosamente, los repertorios de anticuerpos pueden comprender repertorios que comprenden tanto polipéptidos de cadena pesada (V_{H}) como polipéptidos de cadena ligera (V_{L}), los cuales bien se preensamblan o bien se ensamblan y se rastrean de acuerdo con la presente invención. Un polipéptido de anticuerpo, como se usa en el presente documento, es un polipéptido el cual bien es un anticuerpo o bien es una parte de un anticuerpo, modificado o inmodificado. Así, el término polipéptido de anticuerpo incluye una cadena pesada, una cadena ligera, un dímero de cadena pesada-cadena ligera, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento Dab, un dominio individual de de cadena pesada o de cadena ligera, y un fragmento Fv que incluye un Fv de cadena simple (scFv) o un Fv con puentes disulfuro (dsFv). Se conocen bien en la técnica procedimientos para la construcción de tales moléculas de anticuerpos y ácidos nucleicos que las codifican. Sin embargo, "polipéptidos" se pueden referir a otros polipéptidos, tales como enzimas, antígenos, fármacos, moléculas implicadas en señalización celular, tales como moléculas receptoras, o uno o más dominios individuales de polipéptidos mayores, los cuales son capaces de una interacción con una molécula objetivo. Las moléculas de acuerdo con la invención se pueden proporcionar en forma celular, que está en forma de células que producen una molécula como se describe anteriormente, o en forma no celular, que no está contenida dentro de células. Las células pueden ser, por ejemplo, células bacterianas, células eucariotas inferiores (por ejemplo, levaduras), o células eucariotas superiores (por ejemplo, células de insectos, anfibios, aves o mamíferos). El uso de células bacterianas también está previsto.
En el contexto de la presente invención, el término "población celular" se refiere a una colección de células. Las células que comprenden una población celular pueden ser todas de la misma especie y tipo celular, o pueden ser una población mezclada. Una realización de una población celular comprende una población esencialmente sustancialmente uniforme de células, por ejemplo fibroblastos de mamíferos, transformados con una biblioteca que codifica variantes de una secuencia codificante génica dada.
En el contexto de la presente invención, el término "población viral" se refiere a una colección de partículas virales. Las partículas que comprenden una población viral pueden ser todas de la misma especie y cepa, o pueden ser una población mixta. Una realización de una población viral comprende población de partículas recombinantes o mutagenizadas aleatoriamente, por ejemplo partículas retrovirales. Una población viral puede comprender múltiples individuos que llevan variaciones de una o más secuencias codificantes génicas.
"Yuxtaposición", en el contexto de la presente invención, incluye pero no se limita a contacto físico. Se pueden yuxtaponer dos o más repertorios de acuerdo con la invención de tal forma que las moléculas son capaces de interaccionar unas con otras en una manera tal que los sitios de interacciones entre los miembros de los repertorios se pueden correlacionar con su posición. Alternativamente, los repertorios se pueden yuxtaponer unos con otros y con una molécula objetivo tal que los miembros de los repertorios interaccionan unos con otros y después interaccionan conjuntamente con una molécula objetivo.
Una "disposición" como se refiere en el presente documento, es una disposición espacial pro-determinada de los miembros del repertorio. La disposición puede tomar cualquier forma física. La disposición se puede crear mediante medios manuales o automatizados y se describen adicionalmente más adelante tecnologías de disposición preferidas.
Un "evento de administración" es un evento individual a través del cual una sustancia se transfiere de una localización discreta a una segunda localización discreta. Una localización discreta puede estar en forma de un pocillo, un tubo, un canal, una mancha, una línea, un rectángulo, una esfera, un cubo etc. Ejemplos de eventos de administración individuales incluyen:
(i)
pipetear un líquido de un tubo o pocillo a un segundo tubo o pocillo. En este caso pipetar alícuotas del mismo líquido dentro de múltiples tubos o pocillos se consideraría que son eventos de administración múltiples, como sería administrar dos o más líquidos diferentes dentro del mismo tubo o pocillo, o
(ii)
transferir líquido desde un pocillo fuente a una membrana mediante transferencia de poro para crear una mancha de ese líquido. En este caso salpicar una segunda alícuota desde el mismo pocillo fuente sobre una localización de destino diferente en la membrana se consideraría un evento de administración separado, o
(iii)
líquido de transferencia de un pocillo de fuente individual para crear una línea continua individual de líquido de una membrana. En este caso crear una segunda línea separada, incluso del mismo líquido, se consideraría un evento de administración separado o
(iv)
administrar una solución en la parte de abajo de un tubo o canal. En este caso, administrar una solución diferente en la parte de abajo de un mismo tubo o canal, o la misma solución en la parte de debajo de un tubo o canal diferente se consideraría un evento de administración separado.
Una "matriz" en el contexto de la presente invención, es una clase de disposición particular la cual se puede usar para estudiar sustancialmente todas las interacciones posibles entre sustancialmente todos los miembros en dos o más repertorios de moléculas. Tales matrices pueden comprender una serie de líneas, canales o tubos entrecruzados, conteniendo cada uno uno o más miembros de los repertorios. Una matriz individual contendrá muchas líneas, canales o tubos individuales y muchas más intersecciones, o nodos.
El término "potenciado" como se usa en el presente documento quiere decir que una interacción detectada se incrementa en al menos el 10% en presencia de una molécula o moléculas dadas en relación a la interacción en ausencia de esa molécula o moléculas.
El término "bloqueado" como se usa en el presente documento, significa que una interacción detectada está disminuida en al menos el 10% en presencia de una molécula o moléculas dadas en relación a la interacción en ausencia de esa molécula o moléculas.
El término "fracción celular" como se usa en el presente documento significa una parte de lisado celular que resulta de un proceso de fraccionamiento celular. Ejemplos no limitantes de los procedimientos de fraccionamiento celular incluyen, extracción de detergente, extracción de sal, precipitación ácida, extracción de componentes solubles en lípidos, aislamiento de membrana, extracción de componentes solubles en agua o acuosos, fraccionamiento nuclear/citoplasmático, y separaciones basadas en fuerzas centrífugas (por ejemplo, la fracción S-100). Otras separaciones consideradas para ser procedimientos de fraccionamiento celular incluyen el aislamiento de ácido nucleico, la separación cromatográfica de componentes de lisado celular o lisado celular fraccionado, fraccionamiento preparativo electroforético, intercambio iónico y separaciones de afinidad (por ejemplo, cromatografía de inmunoprecipitación o de inmunoafinidad, interacciones de His/Ni++, interacciones de GST/glutation, etc.).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: esbozo de un procedimiento para rastrear un repertorio de anticuerpos frente a un repertorio de antígenos de acuerdo con la presente invención, que demuestra como cientos de anticuerpos diferentes se pueden rastrear simultáneamente frente a cientos de antígenos diferentes para identificar pares que interaccionan. Se indican las interacciones específicas.
Figura 2: análisis de scFv usando una matriz creada manualmente. Aquí, 21 antígenos (horizontalmente) se rastrean frente a 16 scFv (verticalmente). Se han seleccionado cuatro scFv frente a ubiquitina mediante selección de fagos (Ub1b1, Ub1a1, R13 y R14). Dos clones de antígenos se conocen por ser ubiquitina (Q y T) y se han identificado otros cinco clones (A, P, R, S y U) en un rastreo principal como que unen probablemente un scFv antiubiquitina. Cada uno de los cuatro scFv de antiubiquitina une los dos clones de ubiquitina conocidos y cada uno de los cinco clones de ubiquitina potenciales. Sin embargo, se puede ver que scFv Ub1b1 y scFv R14 son altamente reactivos de forma cruzada.
Figura 3: un cabezal de dibujo de líneas robótico de acuerdo con la presente invención diseñado para montarse en una plataforma robótica la cual permite movimientos en dimensiones x, y y z. Una sucesión de puntas de bolígrafo administra miembros de repertorio en una suspensión líquida, mediante acción de capilaridad a un soporte sólido adecuado. Las puntas están montadas en un modo tal como para administrar líquido en un ángulo óptimo al soporte sólido y después para mantenerse verticales mediante una parada para cargar con líquido a partir de una placa de microvaloración de 96 pocillos.
Figura 4: análisis de scFv usando una matriz creada robóticamente. Las líneas dobles de 12 antígenos (horizontalmente) se rastrean frente a 192 scFv (verticalmente). Las interacciones específicas se pueden observar en las intersecciones de emparejamientos específicos. Además, scFv que interaccionan con la nitrocelulosa se pueden ver como líneas horizontales continuas como pueden verse scFv que reacciona de forma cruzada con sustancialmente todos los antígenos (salpicado horizontal).
Figura 5: ejemplo de la creación y rastreo de un repertorio de anticuerpos de cadena doble, (a) una disposición en manchas de acuerdo con la técnica previa. Bacterias que segregan: 1. cadenas pesadas de unión a seroalbúmina bovina (BSA), 2. cadenas ligeras de unión a BSA, 3. cadenas pesadas y ligeras de no unión o 4. se mezclaron cadenas pesadas y ligeras de unión a BSA y después se cultivaron e indujeron en proximidad cercana a BSA inmovilizado indicando que 1 y 2 necesitan mezclarse para conseguir un anticuerpo de unión (como se ve en el control, 4). Se requirieron 32 eventos de administración separados para producir este rastreo. (b) Un rastreo de matriz de acuerdo con la presente invención permite que se lleve a cabo el mismo rastreo usando sólo 8 eventos de administración (la carencia de una señal para 1 cruzado con 2 se debe probablemente a que una burbuja está presente entre los filtros durante la inducción).
Figura 6: incrementando la densidad de líneas de cadenas pesadas y ligeras se pueden crear y rastrear disposiciones de anticuerpos de densidad mayor. Así, se dibujaron 24 cadenas pesadas anti-BSA y 48 cadenas ligeras anti-BSA perpendiculares a los ejes x e y para crear 1152 emparejamientos rastreados frente a BSA.
Figura 7: se dibujaron 384 cadenas pesadas no seleccionadas y 384 cadenas ligeras no seleccionadas perpendiculares a los ejes x e y y se rastrearon frente a BSA cubiertos sobre un filtro de nitrocelulosa (147.456 combinaciones). Se aisló un emparejamiento de cadena pesada y ligera específico individual el cual se confirmó subsiguientemente como unión a nitrocelulosa.
Figura 8: esquemática para rastreo tridimensional de acuerdo con la invención. Aquí, miembros de los repertorios están dispuestos en planos en los ejes x, y y z y las interacciones tienen lugar en los diversos vértices de los planos entrecruzadas.
Figura 9: prueba de concepto de un rastreo tridimensional. La cadena pesada anti-BSA se deposita en un plano, la cadena ligera anti-BSA se deposita en un segundo plano, y BSA se deposita en el tercer plano. Una interacción en su vértice se detecta sólo cuando todos los tres están presentes.
Descripción detallada de la invención
Las matrices de acuerdo con la presente invención se pueden generar en formas muy diferentes para rastrear muchas interacciones diferentes que implican muchas moléculas diferentes. La invención se caracteriza por la capacidad para rastrear sustancialmente todas las combinaciones de miembros de dos o más repertorios. Los inventores han mostrado que esto se puede llevar a cabo usando una serie de líneas entrecruzadas pero se prevén otras aproximaciones las cuales permiten rastreo combinatorio de dos o más repertorios que usan un número mínimo de eventos de administración, tales como el uso de canales o tubos entrecruzados. El procedimiento de los inventores cuenta con la yuxtaposición de agrupamientos continuos de moléculas para crear una red en dos o tres dimensiones a través de la cual los miembros de los diferentes repertorios vienen juntos e interaccionan potencialmente el uno con el otro. Esto contrasta con protocolos de rastreo en la técnica previa, en la que se usan pocillos salpicados de forma discontinua o compartimentalizados para segregar combinaciones individuales de moléculas. En la presente invención, las líneas, canales o tubos continuos intersecan unos con otros de tal forma que existen combinaciones individuales de moléculas en sus puntos de intersección, o nodos. Tomada como un todo, la "red" o "entramado" molecular creada de este modo se puede usar no sólo para identificar pares que interaccionan de forma específica, sino también el patrón general de interacciones entre dos repertorios. La invención así proporcionada se puede usar para comparar la representación de miembros de cualquiera de los repertorios con otro distinto y en particular se puede usar para identificar rápidamente reactividades cruzadas de miembros de repertorio individuales dentro de la matriz.
Repertorios de rastreo
Se pueden usar muchos repertorios diferentes con la presente invención, la construcción de los cuales se conoce bien por aquellos expertos en la técnica. Se pueden construir repertorios de moléculas orgánicas pequeñas mediante procedimientos de química combinatoria. Los repertorios de péptidos se pueden sintetizar en un conjunto de varas o alfileres, tal como se describe en el documento WO84/03564. Un procedimiento similar que implica síntesis de péptidos en perlas, el cual forma un repertorio de péptidos en el cual cada perla es un miembro de individual, se describe en la Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.631.211 y un procedimiento relacionado se describe en el documento WO92/00091. Una mejora significativa de los procedimientos basados en perlas implica marcar cada perla con una marca identificativa única, tal como un oligonucleótido, tal como para facilitar identificación de la secuencia de aminoácidos de cada miembro de la biblioteca. Estos procedimientos basados en perlas mejorados se describen en el documento WO93/06121. Aunque estos repertorios podrían construirse antes de disponerse para producir la matriz, se prevé que todas las técnicas descritas anteriormente se podrían adaptar para síntesis in situ de los miembros del repertorio directamente sobre la matriz por sí misma -uniendo así construcción de repertorio y rastreo de repertorio de acuerdo con la presente invención. Es más, otro procedimiento de síntesis química implica la síntesis de disposiciones de péptidos (o peptidomiméticos) en una superficie en una manera que sitúa cada miembro de biblioteca distinto (por ejemplo, secuencia de péptido única) en una localización discreta, predefinida en la disposición. La identidad de cada miembro de la biblioteca se determina por lo tanto mediante su localización espacial en la disposición. Se determinan las localizaciones en la disposición donde tienen lugar las interacciones de unión entre una molécula predeterminada (por ejemplo, un receptor) y miembros de una biblioteca reactivos, identificando por lo tanto las secuencias de los miembros de biblioteca reactivos en base a la localización espacial. Estos procedimientos se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.143.854; documentos WO90/15070 y WO92/10092; Fodor y col. (1991) Science, 251: 767; Dower y Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271 y podrían adaptarse fácilmente para creación de matrices de acuerdo con la presente invención.
La presente invención es especialmente útil para el rastreo de interacciones proteína-proteína, particularmente interacciones anticuerpo-antígeno. La preparación de repertorios de anticuerpos apropiados útiles en la presente invención se describe en el documento WO 99/20749, la descripción de los cuales se incorpora en el presente documento mediante referencia. El documento 99/20749 describe como una biblioteca de inmunoglobulinas se puede preparar y preseleccionar usando un ligando genérico, y/o se puede preparar usando una conformación de cadena principal individual. Las bibliotecas como se describen en el documento WO 99/20749 se pueden expresar en organismos huéspedes, como se describen en él o de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica, para producir repertorios de polipéptidos los cuales son adecuados para disponer y usar en la presente invención. Alternativamente, se pueden sintetizar polipéptidos
in situ para usar en la presente invención, o se pueden expresar polipéptidos usando transcripción/traducción in vitro.
Disponer miembros de los repertorios para crear la matriz de rastreo
De acuerdo con la presente invención, las moléculas se pueden disponer mediante una cualquiera de una diversidad de procedimientos, manuales o automatizados, con el fin de crear una matriz, dependiendo de si las moléculas están dispuestas como tales o se expresan mediante precursores de nucleótidos dispuestos, los cuales pueden o no pueden estar presentes en células huésped. Las disposiciones están ventajosamente creadas mediante medios robóticos, dado que las técnicas robóticas permiten la creación de matrices precisas y condensadas, las cuales se pueden replicar fácilmente tal como, por ejemplo, un repertorio de anticuerpos combinatorio creado de acuerdo con la invención se puede rastrear frente a diferentes ligandos objetivo. Las plataformas robóticas se conocen bien en la técnica, y están disponibles máquinas a partir de compañías tales como Genetix, Genetic MicroSystems y BioRobotics las cuales son capaces de disponerse a alta velocidad con gran seguridad sobre superficies pequeñas o grandes. Tales máquinas son capaces de salpicar proteína purificada, sobrenadante o células sobre superficies porosas o no porosas, de tal forma que pueden fijarse subsiguientemente a ellas si es necesario para producir ensayos estables. Aunque la manipulación robótica es el procedimiento preferido para crear ensayos de alta densidad, cualquier técnica, incluyendo técnicas manuales la cual sea adecuada para localizar moléculas o células en localizaciones predefinidas en un soporte, se puede usar. La disposición puede ser regular, de tal forma que las líneas se "dibujan" a una distancia dada de la siguiente, de forma irregular o aleatoria.
Los repertorios de las moléculas se pueden rastrear en solución para interacciones o uno o más de los repertorios se pueden inmovilizar en un soporte sólido. Así, dos soluciones pueden fluir bajo dos canales de tal forma que en su punto de intersección tenga lugar una interacción la cual se pueda detectar mediante, por ejemplo, una reacción colorimétrica, fluorescente o luminiscente. Alternativamente, uno de los repertorios se podría inmovilizar sobre una membrana de nitrocelulosa mediante, por ejemplo, entrecruzamiento y después las soluciones que corresponden a un segundo repertorio se podrían "arrastrar" sobre el soporte que alberga los miembros inmovilizados del primer repertorio. Tal inmovilización puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la inmovilización indirecta puede implicar disponer un repertorio de polipéptidos sobre un soporte sólido recubierto con un ligando genérico.
En un aspecto, los miembros de los repertorios se dirigen a sus posiciones por medio de un sistema de marcado, tal que cada línea, une o está predispuesta a unir un miembro en particular del repertorio. Por ejemplo, cada polipéptido en un miembro del repertorio puede comprender una marca, tal como un epitopo para un anticuerpo conocido, o un miembro de un par de afinidad (por ejemplo, avidina/biotina, etc.). La línea, está recubierta con una molécula correspondiente que une la marca (por ejemplo, un anticuerpo específico para la marca del epitopo, o el miembro correspondiente del par de unión). Poner en contacto la línea recubierta, con una solución que comprende el miembro marcado del repertorio llevará a cabo la disposición de ese miembro en el ensayo.
Alternativamente, ambos repertorios se podrían inmovilizar en soportes sólidos separados y después yuxtaponerse para identificar pares que interaccionan. En un aspecto preferido de la invención, las matrices de polipéptidos se pueden crear disponiendo primero sus precursores de ácido nucleico en células hospedadoras y expresando después las secuencias de nucleótidos para producir los polipéptidos correspondientes.
En un aspecto, las células de levaduras se pueden usar para expresar uno o más repertorios de moléculas útiles en un procedimiento de acuerdo con la invención. Los procedimientos de introducir y expresar ácidos nucleicos exógenos en levaduras se conocen bien en la técnica. Una aproximación preferida usando levadura toma ventaja de técnicas de dos-híbridos de levaduras. En esta aproximación, una población de levadura se transforma con una biblioteca que codifica un repertorio de fusiones con un miembro de un par de dos-híbridos, y otra población se transforma con el segundo miembro correspondiente de un par de dos-híbridos. Las dos poblaciones celulares de levaduras son de diferentes tipos de apareamiento. Las dos poblaciones se disponen tal como para crear una disposición, de tal forma que las células de levadura que contienen todos los miembros del primer repertorio intersequen con las células de levadura que contienen todos los miembros del segundo repertorio, y se permita aparearse a las células. Interacciones entre miembros del primer repertorio y el segundo repertorio generarán una señal a partir de una construcción indicadora de dos híbridos apropiada.
En otro aspecto, se pueden usar células de insectos, anfibios, aves, mamíferos, u otras células eucariotas superiores. Como un ejemplo no limitante, se puede rastrear un repertorio de moléculas (moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos, etc.) para aquellas que interaccionan con un repertorio de receptores de superficie de células modificadas recombinantes (por ejemplo, un receptor con un cartucho variable insertado en una región instrumental en unión o activación de ligando) creando una disposición en la cual cada miembro del repertorio de moléculas interseca con cada miembro del repertorio de receptores. La detección subsiguiente de activación o inhibición de receptor en las células indica cuales de las moléculas afectaron la actividad de cual receptor modificado. El proceso permite tanto la identificación de los nuevos moduladores del receptor u otra proteína, como la identificación rápida de relaciones estructura/función. El procedimiento puede también adaptarse para usar células eucariotas superiores para la expresión de ambos repertorios que se están analizando para interacción. Esto se llevaría a cabo, por ejemplo, expresando ambos repertorios como moléculas de superficie celular, o por ejemplo expresando un repertorio como una proteína segregada y el otro como una proteína de superficie celular. Tras contacto o yuxtaposición cercana de las células que expresan los repertorios respectivos, se puede detectar la interacción productiva de los miembros de cada uno de los repertorios con miembros del otro. Todo experto en la técnica puede generar fácilmente células eucariotas superiores que expresan un repertorio dado de polipéptidos.
Los procedimientos para detectar interacciones variarán con la naturaleza exacta de la disposición generada. Por ejemplo, los procedimientos variarán dependiendo de si el ensayo usa células o no. Ejemplos no limitantes de procedimientos de detección incluyen: transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); desactivación de fluorescencia; expresión indicadora (por ejemplo, luciferasa, GST, cloranfenicol acetiltransferasa, \beta-galactosidasa, resistencia a antibióticos); auxilio para auxotropía; eventos de señalización, tales como cambios en niveles de segundos mensajeros, GDP para intercambio de GTP, activación de quinasa o fosforilación, activación de fosfatasa o defosforilación, proteolisis o permeabilidad iónica alterada; reacciones enzimáticas; metilación; escisión de ácidos nucleicos; glicosilación; proteolisis; e infección (por ejemplo, con un virus o fago). Cada una de estas aproximaciones o lecturas de salida para la detección de interacciones se conoce en la técnica de tal forma que alguien de habilidad ordinaria puede emplearlas en los procedimientos de la invención sin la necesidad de experimentación indebida.
Uso de moléculas seleccionadas de acuerdo con la invención
Moléculas seleccionadas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención se pueden emplear en sustancialmente cualquier proceso. Donde las moléculas son polipéptidos, se pueden usar en cualesquiera procedimientos los cuales impliquen unión o catálisis, incluyendo aplicaciones in vivo terapéuticas y profilácticas, aplicaciones diagnósticas in vitro e in vivo, ensayo in vitro y aplicaciones de reactivos, y similares. Por ejemplo, se pueden usar moléculas de anticuerpos en técnicas de ensayo basadas en anticuerpos, tales como técnicas de ELISA, prueba de bandas de Western, inmunohistoquímica, cromatografía de afinidad y similares, de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
Como se aludió anteriormente, las moléculas seleccionadas de acuerdo con la invención son de uso en procedimientos diagnósticos, profilácticos y terapéuticos. Por ejemplo, enzima, variantes generadas y seleccionadas mediante estos procedimientos se pueden ensayar para actividad, bien in vivo o bien in vitro usando técnicas bien conocidas en la técnica, por lo cual se han incubado con moléculas sustrato candidatas y se analiza la conversión de sustrato a producto. Los receptores de de superficie celular seleccionados o moléculas de adhesión seleccionadas se pueden expresar en células cultivadas las cuales se probaron para su capacidad para responder a estímulos bioquímicos o para su afinidad con otros tipos celulares que expresan moléculas de superficie celular a las cuales se esperaría unir la molécula de adhesión no diversificada, respectivamente.
Usos terapéuticos y profilácticos de proteínas preparadas de acuerdo con la invención implican la administración de polipéptidos seleccionados de acuerdo con la invención a un receptor mamífero, tal como un ser humano. De uso particular a este respecto son anticuerpos, otros receptores (incluyendo, pero no limitados a, receptores de células T) o proteína de unión a los mismos.
Se prefieren moléculas sustancialmente puras de al menos 90 a 95% de homogeneidad para administración a un mamífero, y lo que más se prefiere es 98 a 99% o más de homogeneidad para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un ser humano. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad como se desee, los polipéptidos seleccionados se pueden usar diagnósticamente o terapéuticamente (incluyendo extracorporalmente) o en desarrollar y llevar a cabo procedimientos de ensayo, tinción inmunofluorescente y similares (Lefkovite y Pernis, (1979 y 1981) Immunological Methods, volúmenes I y I, Academic Press, NY).
Los anticuerpos seleccionados o proteínas de unión de los mismos de la presente invención encontrarán típicamente uso en prevenir, suprimir o tratar estados inflamatorios, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección bacteriana o viral, y trastornos autoinmunes (los cuales incluyen, pero no se limitan a, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritrematoso sistémico, enfermedad de Crohn y miastenia gravis).
En la aplicación actual, el término "prevención" implica administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a administración de la composición después de un evento inductor, pero antes de la aparición clínica de la enfermedad. "Tratamiento" implica administración de la composición protectora después de que lleguen a manifestarse los síntomas de la enfermedad.
Están disponibles sistemas de modelos animales los cuales se pueden usar para rastrear la efectividad de los anticuerpos o proteína de unión de los mismos en proteger contra o tratar la enfermedad. Se conocen en la técnica procedimientos para prueba de lupus eritrematoso sistémico (SLE) en ratones susceptibles (Knight y col. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten y col. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). Se prueba miastenia gravis (MG) en ratones hembra SJL/J introduciendo la enfermedad con proteína soluble AchR de otras especies (Lindstrom y col., (1988) Avd. Immunol., 42: 233). Se induce artritis en una cepa susceptible de ratones mediante inyección de colágeno de tipo II (Stuart y col. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo mediante el cual se induce artritis coadyuvante en ratas susceptibles mediante infección de proteína de choque térmico micobacteriana (Van Eden y col. (1988) Nature, 331: 171). La tiroiditis se induce en ratones mediante administración de tiroglobulina según se describe (Maron y col. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes melitus insulinodependiente (IDDM) tiene lugar de forma natural o se puede inducir en ciertas cepas de ratones tales como aquellas descritas mediante Kanasawa y col. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE en ratones y ratas sirve como un modelo para MS en ser humano. En este modelo, la enfermedad desmielinizadora se induce mediante administración de proteína básica de mielina (véase Paterson (1986) Textbok of Immunopathology, Mischer y col., eds., Grune and Stratton, Nueva York, páginas 179-213; McFarlin y col. (1973) Science, 179: 478; y Satoh y col. (1987) J. Immunol., 138: 179).
Los anticuerpos, receptores (incluyendo, pero no limitados a receptores de células T) o proteínas de unión de los mismos seleccionados de la presente invención se pueden usar también en combinación con otros anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales (MAb) reactivos con otros marcadores en células humanas responsables de las enfermedades. Por ejemplo, los marcadores de células T adecuados pueden incluir aquellos agrupados dentro de los así llamados "Racimos de Diferenciación" según se llaman por el First International Leukocyte Differentiation Workshop (Bernhard y col. (1984) Leucocyte Typing, Springer Verlag, NY).
Generalmente, los presentes anticuerpos, receptores o proteínas de unión seleccionados se utilizarán en forma purificada conjuntamente con transportadores farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos transportadores incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, cualquiera incluyendo medios salinos y/o tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico y lactato de Ringer. Se pueden elegir coadyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, a partir de espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.
Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores de fluidos y nutrientes y rellenadores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. Los conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, pueden también estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición).
Los polipéptidos seleccionados de la presente infección se pueden usar como composiciones administradas separadamente o en conjunción con otros agentes. Estos pueden incluir diversos fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de diversos citotóxicos u otros agentes en conjunción con los anticuerpos, receptores o proteínas de unión de los mismos seleccionados de la presente invención, o incluso combinaciones de polipéptidos seleccionados de acuerdo con la presente invención que tienen especificidades diferentes, tales como polipéptidos seleccionados usando diferentes ligandos objetivo, se almacenen o no antes de administración.
La vía de administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de aquellas comúnmente conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Para terapia, incluyendo sin limitación inmunoterapia, los anticuerpos, receptores o proteínas de unión de los mismos seleccionados de la invención se pueden administrar a cualquier paciente de acuerdo con técnicas estándar. La administración puede ser mediante cualquier medio apropiado, incluyendo parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdérmicamente, por medio de la vía pulmonar, o también, apropiadamente, mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y afección del paciente, administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros para tomarse en cuenta por el clínico.
Los polipéptidos seleccionados de esta invención se pueden liofilizar para almacenamiento y reconstituir en un transportador adecuado antes de usar. Esta técnica ha mostrado ser efectiva con inmunoglobulinas convencionales y liofilización conocida en la técnica y se pueden emplear técnicas de reconstitución. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que liofilización y reconstitución pueden conducir a diversos grados de actividad de anticuerpos (por ejemplo con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG) y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse hacia arriba para compensar.
Las composiciones que contienen los presentes polipéptidos seleccionados o un cóctel de los mismos se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para llevar a cabo al menos inhibición, supresión, modulación, matanza, o algún otro parámetro medible parcial, de una población de células seleccionadas se define como "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades necesarias para lograr esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmune del propio paciente, pero generalmente varía de 0,005 a 5,0 mg de anticuerpo seleccionado, receptor (por ejemplo un receptor de célula T) o proteína de unión del mismo por kilogramo de peso corporal, con dosis de 0,05 a 2,0 mg/kg/dosis usándose más comúnmente. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes polipéptidos seleccionados o cócteles de los mismos se pueden administrar en dosificaciones similares o ligeramente
menores.
Una composición que contiene un polipéptido seleccionado de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en ajustes profilácticos y terapéuticos para ayudar en alternación, inactivación, matanza o retirada de una población de células objetivo seleccionadas en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en el presente documento se pueden usar extracorporalmente o selectivamente in vitro para matar, deplecionar o retirar de otra manera de forma efectiva una población de células objetivo de una colección de células heterogénea. La sangre de un mamífero se puede combinar extracorporalmente con los anticuerpos, receptores de superficie celular o proteínas de unión de los mismos seleccionados como resultado de lo cual las células no deseadas se matan o eliminan de otra manera de la sangre a devolver al mamífero de acuerdo con técnicas estándar.
La invención se describe adicionalmente, sólo para el propósito de ilustración, en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Rastreo de Matriz en un Repertorio de scFv
El sistema de captura de dos filtros usado como parte del presente ejemplo se basa en aquel descrito en la Solicitud de Patente del Reino Unido en trámite con el presente documento de los inventores titulada "Array Screening Method", (Solicitud de Patente del Reino Unido Número: 9928787,2). Las bacterias se cultivan en líneas en un filtro y los scFv producidos de este modo se capturan en un segundo filtro que tiene líneas de antígeno unidas a la nitrocelulosa, las cuales están orientadas a 90º a partir de aquellas líneas de scFv en el primer filtro (véase figura 1). En intersecciones donde scFv interacciona con antígeno, el scFv se captura si el antígeno y el scFv se unen. En este ejemplo, la detección de scFv unido se lleva a cabo con Proteína L superantígeno conjugada con HRP.
Procedimientos Biblioteca de Antígenos
Los antígenos son de biblioteca de expresión humana hEXI, preparados a partir de poli(A) + RNA de cerebro fetal mediante cebado de oligo(dT) (Büssow y col. 1998). Los cDNA se clonaron direccionalmente en un vector de pQE-30 modificado (Qiagen).
Filtros de Antígeno
Los clones de antígeno se cultivaron durante toda una noche en cultivo líquido (TY 2x conteniendo Amp 100 \mug/ml, y glucosa al 1%) a 37ºC. Para dibujo de línea manual, los cultivos líquidos se transfirieron a un filtro de PVDF prehumedecido (remojar en etanol, aclarar en PBS y bañar en TY 2x) dibujando a lo largo del filtro frente a una regla de metal con un filtro p10 (Art) no montado en una pipeta. Así, la acción capilar de la punta se usó para reparto del líquido sobre la superficie de la membrana. Cada clon se dibujó sobre el filtro a 6 mm del previo. Para dibujar línea de forma automática, los cultivos líquidos se transfirieron a un filtro de PVDP usando el cabezal robótico descrito en la figura 3 unido a un sistema de rejilla/grúa de Kaybee Systems. Cada clon se dibujó sobre el filtró a 4,5 mm del previo a una velocidad de 25 mm/s.
Los filtros antigénicos se cultivaron durante toda una noche en las placas de agar TYE conteniendo 100 Amp a 100 \mug/ml, glucosa al 1% a 30ºC. El filtro se transfirió después a otra placa de agar TYE que contiene 100 Amp a 100 \mug/ml, IPTG 1 mM durante 3 horas a 37ºC para inducción de los clones. Los filtros de antígeno se eliminaron de la placa y se desnaturalizaron en papel de bandas prerremojado que contiene NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M durante 10 minutos, se neutralizaron durante 2 x 5 minutos en Tris-HCl 1 M, pH 7,5, NaCl 1,5 M y se incubaron durante 15 minutos en SSC 2x. Los filtros se secaron, se remojaron brevemente en etanol y después se bloquearon en PBS Marvel al 4%, se aclararon en PBS y se bañaron en TY 2x.
Biblioteca de scFv
Los scFv son de una biblioteca basada en un armazón humano individual para V_{H} (V3-23/DP-47 y J_{H}4b) y V_{K} (012/02/DPK9 y J_{K}1), con diversidad de cadena lateral (NNK o DVT codificada) incorporada en posiciones en el sitio de unión de antígeno que hace contactos con antígeno en estructuras conocidas y son ampliamente diversos en el repertorio maduro. El plegamiento que se usa se expresa frecuentemente in vivo, y une a los ligandos genéricos Proteína L y A, lo cual facilita captura o detección de los scFV pero no interfiere con unión de antígeno. Los clones de scFv se han prerrastreado en formato scFv para unión a Proteína A y Proteína L para asegurar que son funcionales.
Filtro de scFv
Los clones de anticuerpos se cultivaron durante toda una noche en líquido de cultivo (TY 2x que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y glucosa al 1%) a 37ºC. Los cultivos líquidos se transfirieron después a un filtro de nitrocelulosa prebloqueado (leche desnatada en polvo al 4% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente (TA), aclarar en PBS y bañar en TY 2x). Se llevó a cabo transferencia manual y robótica de anticuerpos al filtro como para los cultivos de antígeno, excepto en que la densidad de líneas de scFv creadas mediante transferencia robótica fue una cada 1,125 mm.
Los filtros de scFv se cultivaron después en placas de agar de TYE conteniendo Amp a 100 \mug/ml, glucosa al 1% a 37ºC. Después de cultivo durante toda una noche el filtro de antígeno se situó sobre una placa de agar TYE fresco Amp a 100 \mug/ml, IPTG 1 mM, se secó, y después el filtro de scFv se situó en la parte superior de ésto. La placa con dos filtros se incubó después durante 3 horas a 30ºC para inducción de los scFv.
Sondeos fuera de filtros
El filtro superior (scFv) se descartó y el filtro segundo (antígeno) se lavó 3 x con PBS/Tween al 0,05% (PBST) y se bloqueó con MPBS al 4% durante 30 minutos a TA. Los filtros se lavaron 3x con PBST u después se incubaron con un conjugado de Proteína L HRP (Actigen, 1/2000) en MPBS al 4% durante 1 hora a TA. Los filtros se lavaron después unas tres veces adicionales con PBST y se repartieron con reactivo ECL. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en 50 ml de tampón en un agitador que se agita suavemente.
Resultados
Como un sistema modelo, los inventores llevaron a cabo un rastreo de matriz manual de 21 antígenos frente a 16 scFv, dando como resultado 336 interacciones que se prueban usando sólo 37 eventos de administración. Estuvieron incluidos en el repertorio de scFv cuatro scFv que se han seleccionado frente a ubiquitina mediante selección de fago (Ub1b1, Ub1a1, R13 y R14). Estuvieron incluidos en el repertorio de antígenos dos clones conocidos por ser ubiquitina (Q y T) y cinco clones distintos (A, P, R, S y U) que se han identificado en un rastreo primario como que unen probablemente un scFv antiubiquitina. Como se puede ver (figura 2), cada uno de los cuatro scFv antiubiquitina unieron los dos clones de ubiquitina conocidos y cada uno de los cinco clones potenciales de ubiquitina. Sin embargo, se puede ver que scFv Ub1b1 y scFv R14 son altamente reactivos de forma cruzada. También estuvieron incluidos en la disposición modelo 14 clones de antígenos identificados en un rastreo de disposición de antígeno principal como posibles ligandos para doce clones de scFv C2 a H11. Como se puede ver a partir de la matriz (figura 2), el antígeno M (una proteína de función desconocida) une específicamente a scFv D12. Además antígeno E, (una proteína de unión a DNA) une específicamente a scFv H11. Esto demuestra la utilidad del rastreo de matriz en confirmar interacciones identificadas originalmente en un rastreo de disposición de antígenos.
Los inventores avanzaron después a un rastreo de matriz de mayor densidad, usando un cabezal robótico (figura 3a - diseño, figura 3b - fotografía) para dibujar las líneas. Se rastrearon en este sistema líneas dobles de 12 antígenos (horizontalmente) frente a 192 scFv (verticalmente). Así, se probaron 2304 interacciones potenciales diferentes cada dos veces usando sólo 216 eventos de administración. De nuevo se observaron muchas interacciones diferentes en las intersecciones de las línea, particularmente frente a tres antígenos (dos de los cuales son el mismo).
Ejemplo 2 Creación y rastreo de un repertorio de anticuerpos de dos cadenas de acuerdo con la presente invención
El sistema de captura de dos filtros usado como parte del ejemplo actual se basa en aquel descrito en la Solicitud de Patente del Reino Unido en trámite con el presente documento de los inventores titulada "Array Screening Method", (Solicitud de Patente del Reino Unido Número: 9928787,2). Previamente, se ha mostrado que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se pueden asociar en solución formando fragmentos de Fv que tienen un sitio de unión a antígeno activo y tales técnicas se conocen bien en la técnica. Con el fin de probar si la asociación no covalente de las cadenas pesadas y ligeras en particular era de suficiente fuerza para que tal asociación tenga lugar en una disposición, los inventores dividieron la cadena pesada y la cadena ligera de un scFv anti-BSA seleccionado de un fago (13cg2). Como los inventores estuvieron poco seguros de cómo de fuerte sería la asociación entre cadenas pesadas y ligeras, los inventores clonaron las cadenas pesadas y ligeras de 13cg2 por separado dentro de tres formatos de fragmento recombinante; cadena pesada o ligera sola (dominios individuales); scFv (con un engarce de 15 aminoácidos entre cadena pesada y ligera) y fragmento bivalente (con un engarce de cero aminoácidos entre cadena pesada y ligera). Los últimos dos formatos se construyeron con cada variedad de cadena pesada o ligera de 13cg2, con la cadena no diversificada siendo en cada caso una cadena pesada o ligera de imitación. (La cadena de imitación tiene una especificidad de unión a antígeno individual pero desconocida). La prueba de los diversos formatos en el ensayo, que usan BSA como el antígeno, indica que los formatos de fragmento bivalente proporcionan la asociación más estable en la superficie del filtro.
Las bacterias que expresan bien una cadena pesada de unión a Seroalbúmina Bovina (BSA) (1), una cadena ligera de unión a BSA (2), cadenas pesada y ligera que no unen (3) o bien cadenas pesada y ligera de unión a BSA (4), todas en el formato del fragmento divalente descrito anteriormente, bien se mezclaron y se cultivaron como manchas (figura 5a) o bien se dibujaron como líneas horizontales y verticales y después se cultivaron (figura 5b). En ambos casos, después de cultivar durante toda una noche los filtros que albergaban las bacterias cultivadas se dejaron en la parte superior de un segundo filtro recubierto con BSA y después inducido para expresión de proteínas. Sólo en aquellos casos donde una cadena pesada de unión se coexpresa con una cadena ligera de unión es una señal positiva observada (es decir 1 y 2 juntas o cualquier combinación que implique 4. La falta de una señal para 1 cruzado con 2 se debe probablemente a una burbuja que está presente entre los filtros durante la inducción). El dibujo de líneas reduce dramáticamente el número de eventos de administración (en este caso de 32 a 8).
Incrementando la densidad de las líneas de cadena pesada y de cadena ligera se pueden crear y rastrear disposiciones de anticuerpo de densidad más alta. Así, 24 cadenas pesadas de anti-BSA y 48 cadenas ligeras de anti-BSA se dibujaron perpendiculares a los ejes de x e y creando 1152 emparejamientos rastreados frente a BSA (figura 6). En un formato de densidad incluso mayor se dibujaron 384 cadenas pesadas no seleccionadas y 384 cadenas ligeras no seleccionadas perpendiculares a los ejes x e y y se rastrearon frente a BSA que recubre un filtro de celulosa (147.456 combinaciones). Se aisló un emparejamiento de cadena pesada y ligera específico individual el cual se confirmó subsiguientemente que une a nitrocelulosa (figura 7). Si el rastreo está incrementándose cubriendo 1000 cadenas pesadas frente a 1000 cadenas ligeras (1 millón de anticuerpos diferentes) el número de eventos de administración se reduciría de 2 millones a 2 miles usando el procedimiento de acuerdo con la presente invención.
Ejemplo 3 Rastreo tridimensional
Un esquema para rastreo tridimensional de acuerdo con la invención se muestra (figura 8). Aquí, se disponen los miembros de los repertorios en planos en los ejes x, y y z y las interacciones tienen lugar en los diversos vértices de los planos intersecantes. Como una prueba de concepto, se deposita una cadena pesada de BSA en un plano, se deposita una cadena ligera de BSA en un segundo plano, y se deposita BSA en el tercer plano. Se detecta una interacción en su vértice sólo cuando todas las tres están presentes (figura 9).
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Diversas modificaciones y variaciones de los procedimientos descritos y sistema de la invención serán patentes para los expertos en la técnica sin desviarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones preferidas específicas, se debería entender que la invención, según se reivindica, no debe limitarse indebidamente a tales realizaciones específicas. Por supuesto, se pretende que las diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que sean obvias a los expertos en biología molecular o campos relacionados estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (49)

1. Un procedimiento para rastrear un primer repertorio de miembros que comprenden polipéptidos frente a un segundo repertorio de miembros que comprenden polipéptidos para identificar aquellos miembros del primer repertorio los cuales interaccionan con miembros del segundo repertorio, que comprende:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
detectar una interacción entre polipéptidos del primer y el segundo repertorios, identificando por lo tanto aquellos miembros del primer repertorio que interaccionan con miembros del segundo repertorio.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos repertorios primero y segundo están presentes cada uno en una serie de líneas continuas, no entrecruzadas.
3. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el primer y segundo repertorios se disponen en soportes primero y segundo respectivamente.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que miembros de los repertorios primero y segundo se aplican a un soporte individual.
5. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que cada línea de dichos repertorios primero y segundo se hace pasar a lo largo de canales cortados o grabados dentro de un material sólido tal que sustancialmente todos los canales que contienen un miembro del primer repertorio intersectan sustancialmente con todos los canales que contienen un miembro del segundo repertorio.
6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la cadena polipeptídica es un polipéptido de cadena pesada o ligera.
7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipéptido de cadena pesada o ligera es un fragmento de dAb.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho primer repertorio comprende V_{H} o V_{L}.
9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho segundo repertorio comprende V_{H} o V_{L}.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho primer repertorio comprende V_{H}, y dicho segundo repertorio comprende V_{L}.
11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha al menos una disposición con un epitopo objetivo, y detectar la unión del epitopo objetivo mediante miembros yuxtapuestos de dichos repertorios primero y segundo en dicha disposición, en el que dicha unión de antígeno objetivo es indicadora de una interacción de miembros de dichos repertorios primero y segundo.
12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha al menos una disposición con un tercer repertorio de miembros antígenos objetivo dispuestos en una serie de líneas continuas, y detectar la unión de antígeno objetivo mediante miembros yuxtapuestos de dichos repertorios primero y segundo en posiciones en dicha disposición, en la que dicha unión de antígeno objetivo es indicadora de una interacción de miembros de dichos repertorios primero y segundo.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que una diversidad de líneas de dicho tercer repertorio comprenden un antígeno objetivo diferente.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dichos repertorios primero y segundo se disponen cada uno en una serie de líneas continuas, no entrecruzadas.
15. Un procedimiento para crear una biblioteca combinatoria de polipéptidos que comprende dos cadenas, cada miembro de la cual biblioteca comprende un miembro de un primer repertorio de miembros que comprende un polipéptido de cadena pesada y/o ligera y un miembro de un segundo repertorio de miembros que comprende un polipéptido de cadena pesada y/o ligera, procedimiento el cual comprende la etapa de disponer el primer repertorio de miembros en una primera serie de líneas continuas, y dicho segundo repertorio en una segunda serie de líneas continuas, de tal forma que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio están yuxtapuestos a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio, generando de este modo en los puntos de yuxtaposición, una pluralidad de combinaciones de polipéptidos que comprenden dos cadenas, creando de este modo una biblioteca combinatoria de polipéptidos que comprende dos cadenas.
16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15 en el que la biblioteca combinatoria producida se rastrea para interacciones con más de una molécula objetivo.
17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 en el que se crea (y opcionalmente se rastrea) una biblioteca de polipéptidos de tres cadenas usando repertorios primero, segundo y tercero de moléculas en tres dimensiones.
18. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, a través del cual se usa el patrón de interacción entre los repertorios (primero, segundo y opcionalmente tercero) para identificar interacciones positivas, interacciones negativas, interacciones específicas o interacciones reactivas de forma cruzada o se usa para construir un árbol filogenético infiriendo la similaridad entre miembros del primer repertorio (usando el patrón de interacciones con los repertorios segundo y/o, opcionalmente tercero) del segundo repertorio (usando el patrón de interacciones con los repertorios primero y/o, opcionalmente tercero) y/o del tercer repertorio (usando el patrón de interacciones con miembros de los repertorios primero y/o segundo).
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dichos repertorios primero y segundo se disponen cada uno en una serie de líneas continuas, no entrecruzadas.
20. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dichos polipéptidos son cadenas polipeptídicas pesadas o ligeras de anticuerpos.
21. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dichos polipéptidos son fragmentos de dAb.
22. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho primer repertorio comprende V_{H} o V_{L}.
23. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho segundo repertorio comprende V_{H} o V_{L}.
24. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho primer repertorio comprende V_{H}, y dicho segundo repertorio comprende V_{L}.
25. Un procedimiento para rastrear la biblioteca combinatoria de polipéptidos de dos cadenas de la reivindicación 15 para unión a una molécula objetivo, el procedimiento comprende la etapa de detectar una interacción entre los polipéptidos de dos cadenas y la molécula objetivo.
26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicha biblioteca combinatoria de polipéptidos de dos cadenas con un tercer repertorio de miembros de antígenos objetivo dispuestos en una serie de líneas continuas, de tal forma que una diversidad de miembros de dichos repertorios primero, segundo y tercero se yuxtaponen a una pluralidad de otros miembros de dichos repertorios primero, segundo y tercero, y detectar la unión de antígeno objetivo mediante miembros yuxtapuestos de dichos repertorios primero y segundo, en los que dicha unión del antígeno objetivo es indicadora de una interacción de miembros de dichos repertorios primero y segundo.
27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que dichos repertorios primero, segundo y tercero se disponen cada uno en una serie de líneas continuas, no entrecruzadas.
28. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente como resultado del cual uno o más de los repertorios primero, segundo, y, si está presente, tercero se proporcionan mediante una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos las cuales codifican dicho polipéptido de cadena pesada o ligera de dichos repertorios primero y segundo o dicho epitopo objetivo de dicho tercer repertorio y las cuales se expresan para producir sus polipéptidos correspondientes in situ en la disposición.
29. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en el que las secuencias de ácido nucleico se proporcionan mediante vectores de expresión los cuales codifican miembros polipeptídicos del repertorio, y están ligados operativamente a secuencias control suficientes para dirigir la transcripción de las moléculas de ácido nucleico.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el vector de expresión es un bacteriófago.
31. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el vector de expresión es un plásmido.
32. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el vector de expresión es una molécula de ácido nucleico lineal.
33. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que los ácidos nucleicos están contenidos y expresados dentro de células.
34. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 33, en el que las células se seleccionan del grupo que consta de células bacterianas, células eucariotas inferiores y células eucariotas superiores.
35. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que las moléculas de ácido nucleico están inmovilizadas en forma de ácido nucleico desnudo o complejado.
36. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que los miembros de al menos un repertorio están dispuestos usando medios robóticos.
37. Un procedimiento para rastrear un primer repertorio de moléculas frente a un segundo repertorio de moléculas para identificar aquellos miembros del primer repertorio los cuales no interaccionan con aquellos miembros del segundo repertorio, que comprende:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; e
(b)
identificar aquellos miembros de los repertorios primero y segundo que no interaccionan el uno con el otro.
38. Un procedimiento para rastrear un primer repertorio de moléculas frente a un segundo repertorio de moléculas para identificar miembros de los repertorios primero y segundo cuyas interacciones el uno con el otro son dependientes de la presencia o ausencia de una tercera molécula o grupo de moléculas, que comprende:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
detectar las interacciones entre miembros del primer repertorio y los miembros del segundo repertorio en presencia de diferentes concentraciones de la tercera molécula o grupo de moléculas.
39. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la tercera molécula o grupo de moléculas interacciona con ciertos miembros del primer repertorio, permitiendo así habilitar a aquellos miembros del primer repertorio con ciertos miembros del segundo repertorio.
40. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, en el que las interacciones entre los miembros de los repertorios primero y segundo requieren la unión simultánea de estos miembros a la tercera molécula o grupo de moléculas.
41. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, en el que las interacciones entre los miembros de los repertorios primero y segundo se potencian mediante la presencia de una tercera molécula o grupo de moléculas.
42. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 38, en el que las interacciones entre los miembros de los repertorios primero y segundo se bloquean mediante la presencia de una tercera molécula o grupo de moléculas.
43. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se requieren menos eventos de administración que el número de interacciones a probarse.
44. Un procedimiento para rastrear dos o más repertorios de enzimas que comprende dos o más reacciones enzimáticas para identificar aquellos miembros del primer repertorio y aquellos miembros del segundo repertorio los cuales crean conjuntamente un producto dado a partir de un sustrato dado, procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer el primer repertorio en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende un miembro de dicho primer repertorio y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio se yuxtaponen a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio; y
(b)
detectar la formación de producto en las intersecciones de los miembros de los repertorios primero y segundo.
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45. Un procedimiento para rastrear diferentes poblaciones celulares frente a diferentes poblaciones virales para identificar aquellas poblaciones virales que infectan aquellas poblaciones celulares; procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer las poblaciones celulares y las poblaciones virales para formar al menos una disposición, en la que las poblaciones virales se disponen en al menos una primera serie de líneas continuas en la que cada línea de dicha población viral comprende un miembro de dicha población y disponer la población celular en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende un miembro de dicha población celular, en la que las poblaciones viral y celular forman al menos una disposición, tal que sustancialmente todos los miembros de la población celular están yuxtapuestos a sustancialmente todos los miembros de la población vírica; y
(b)
detectar aquellas poblaciones virales que infectan aquellas poblaciones celulares.
46. Un procedimiento para rastrear fracciones celulares diferentes una frente a otra para identificar aquellas fracciones celulares que contienen componentes los cuales interaccionan con componentes en otras fracciones celulares, procedimientos los cuales comprenden:
(a)
disponer las fracciones celulares en al menos dos series de líneas continuas en las que cada línea de dichas series primera y segunda comprende un miembro de dicha fracción celular y de tal forma que sustancialmente todas las fracciones celulares diferentes se yuxtaponen unas con otras;
(b)
detectar la interacción/las interacciones en las intersecciones de fracciones celulares diferentes.
47. Un procedimiento para rastrear un repertorio de péptidos frente al mismo repertorio de péptidos para identificar aquellos miembros del repertorio de péptidos que interaccionan con otros miembros del repertorio de péptidos, procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer los miembros del repertorio de péptidos en al menos dos series de líneas continuas en las que cada línea de dichas series primera y segunda comprende un miembro de dicho repertorio peptídico y de tal forma que sustancialmente todos los miembros diferentes del repertorio peptídico se yuxtaponen unos con otros
(b)
detectar la interacción/las interacciones en las intersecciones de los diferentes miembros del repertorio peptídico.
48. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 46 ó 47, procedimiento el cual usa el sistema de dos-híbridos de levaduras para identificar aquellos miembros de los repertorios de moléculas que interaccionan unas con otras.
49. Un procedimiento para crear (y opcionalmente rastrear) una biblioteca de dos-híbridos de levaduras constituida por sustancialmente todos los miembros de un primer repertorio de polipéptidos emparejados con sustancialmente todos los miembros de un segundo repertorio de polipéptidos, procedimiento el cual comprende:
(a)
disponer células de levadura que contienen una diversidad de secuencias de nucleótidos para crear al menos una disposición, en la que las secuencias de nucleótidos se disponen en al menos una primera serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha primera serie comprende células de levadura que contienen una secuencia de nucleótidos y disponer el segundo repertorio en al menos una segunda serie de líneas continuas en las que cada línea de dicha segunda serie comprende células de levadura que contienen un miembro de dicho segundo repertorio, en los que los repertorios primero y segundo forman al menos una disposición, de tal forma que sustancialmente todos los miembros del primer repertorio están yuxtapuestos a sustancialmente todos los miembros del segundo repertorio;
(b)
permitir a las células de levaduras que contienen los miembros del primer repertorio aparearse con las células de levaduras que contienen los miembros del segundo repertorio donde los dos repertorios intersectan; y opcionalmente
(c)
expresar las secuencias de nucleótidos para producir los polipéptidos correspondientes de los repertorios primero y segundo; y opcionalmente
(d)
detectar la interacción/las interacciones entre los miembros polipeptídicos de los repertorios primero y segundo.
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