PT1292710E - Método de rastreio de matriz - Google Patents

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PT1292710E PT01943634T PT01943634T PT1292710E PT 1292710 E PT1292710 E PT 1292710E PT 01943634 T PT01943634 T PT 01943634T PT 01943634 T PT01943634 T PT 01943634T PT 1292710 E PT1292710 E PT 1292710E
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Lucy Jessica Holt
Ian Tomlinson
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Domantis Ltd
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Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE RASTREIO DE MATRIZ" A presente invenção refere-se a um método que pode ser utilizado para rastrear dois ou mais repertórios de moléculas umas contra as outras e/ou para criar e rastrear repertórios combinatórios combinando dois ou mais repertórios. Em particular, a invenção refere-se a um método pelo qual dois repertórios de moléculas podem ser rastreados, de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório são testados contra substancialmente todos os membros do segundo repertório para interacções funcionais. Além disso, a invenção refere-se à criação e rastreio de repertórios de anticorpo combinando um repertório de cadeias pesadas com um repertório de cadeias leves, de modo a que os anticorpos formados por substancialmente todas as combinações de cadeias pesadas e leves possam ser rastreadas contra um ou mais ligandos alvo.
Introdução 0 mapeamento e sequenciação de diferentes genomas irão, eventualmente, conduzir à clonagem de todas as proteínas expressas por estes organismos. De modo a criar mapas de interacção destas proteínas, têm que ser realizados rastreios a duas dimensões de modo a que a ligação de cada proteína para cada outra proteína possa ser testada.
Foram também necessários rastreios a duas dimensões para várias outras aplicações. Por exemplo, foram utilizadas 1 técnicas, tal como imunização de murganhos acoplada com a produção de anticorpos monoclonais e métodos de selecção in vitro de modo a que apresentação em fago, para criar simultaneamente muitos anticorpos diferentes contra muitos alvos diferentes. De modo a determinar quais os anticorpos que se ligam a que alvos, estes agrupamentos precisam de ser desenrolados, o que requer um processo de rastreio complexo.
Além disso, se se querem criar fármacos de molécula pequena contra alvos humanos para terapia, seria útil determinar não apenas a extensão da ligação de uma dada proteina humana a um candidato a fármaco putativo, mas também a extensão (se existir) de reacção cruzada do mesmo candidato a fármaco com outras proteínas humanas, ou se outros fármacos relacionados são melhores ligantes e/ou apresentam menos reacção cruzada.
Todos estes exemplos requerem uma técnica pela qual as interacções entre membros de um primeiro conjunto (ou repertório) de moléculas podem ser rapidamente testadas contra todos os membros de um segundo conjunto (ou repertório) de moléculas. Até à data, esses rastreios são geralmente realizados distribuindo combinações de reagentes em poços compartimentalizados ou uns em cima dos outros, na forma de marcas numa membrana, de modo a que todas as combinações de reagentes a serem testadas estejam presentes em poços/marcas separados. Por isso, se se quiser testar um repertório de 100 moléculas contra um repertório diferente, também consistindo em 100 moléculas, seriam necessários 10000 poços/marcas para cobrir exaustivamente todas as combinações de membros de dois repertórios. A criação dessas combinações, arranjadas de forma descontinua, necessitaria, para uma interacção de dois componentes, do dobro de ''eventos' de distribuição do que existe 2 de poços ou marcas, neste caso 20000, adicionalmente a quaisquer eventos de dispensa que possam ser necessários para facilitar ou detectar as interacções. Como o número de membros em cada repertório aumenta linearmente, o número de combinações e, por isso, os eventos de distribuição, aumentam exponencialmente. Na realidade, para uma interacção de três componentes, envolvendo, digamos, um repertório de apenas 100 cadeias pesadas de anticorpo, um repertório de apenas 100 cadeias leves de anticorpo e um repertório de apenas 100 antigénios potenciais, seria necessário um milhão de eventos de 'distribuição'.
Sumário da Invenção
Os requerentes desenvolveram uma metodologia, que foi denominada Rastreio de Matriz, que pode ser utilizada para estudar todas as interacções possíveis entre todos os membros nos dois repertórios de moléculas, o que retira a necessidade de compartimentalizar combinações individuais de membros destes repertórios.
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para o rastreio de um primeiro repertório de membros, compreendendo polipéptidos, contra um segundo repertório de membros, compreendendo polipéptidos, para identificar os membros do primeiro repertório que interactuam com membros do segundo repertório, compreendendo: (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma primeira série de linhas contínuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório e dispor o segundo repertório em, pelo 3 menos, uma segunda série de linhas continuas, em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma sequência, de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estejam justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) detectar uma interacção entre os polipéptidos do primeiro e do segundo repertórios, identificando, desse modo, os membros do primeiro repertório que interactuam com membros do segundo repertório. A invenção, na sua forma mais lata, proporciona um método para o rastreio de dois repertórios de moléculas, um contra o outro. Membros individuais dos dois repertórios estão configurados espacialmente para permitir a justaposição de substancialmente todas as combinações de membros de ambos os repertórios. Será entendido que a referência aqui apresentada a "substancialmente todas as combinações" (ou "substancialmente todos os membros") não exclui que certas justaposições não possam ocorrer, quer pelo acaso ou por concepção. Todavia, a invenção não necessita que dois repertórios de moléculas sejam rastreados um contra o outro simultaneamente, e exclui o rastreio de um único repertório com membro(s) individual(ais) de um segundo repertório. De um modo preferido, "substancialmente todos" refere-se a, pelo menos, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos membros de um repertório.
De acordo com a invenção, a justaposição pode ser alcançada, por exemplo, criando uma série de linhas para cada um de dois 4 repertórios, que se intersectam um com o outro. As linhas pode ser rectas, substancialmente linhas paralelas, ou curvas, ou suas combinações; a única restrição é que substancialmente todos os membros do primeiro repertório devem ser capazes de interactuar substancialmente com todos os membros do segundo repertório. Exemplos de configurações complementares incluem linhas rectas paralelas, dispostas num ângulo em relação às linhas rectas paralelas; circulos concêntricos ou polígonos, utilizados juntamente com uma estrela de linhas radiais. 0 especialista na técnica será capaz de imaginar muitos outros sistemas que sejam utilizados para alcançar uma configuração espacial semelhante dos membros do repertório, de acordo com a invenção, sendo todos caracterizados pela distribuição de alguma forma de linha contínua, correspondendo a cada membro do primeiro repertório, possuindo substancialmente todos eles a capacidade para intersectar substancialmente todas as linhas, correspondendo a substancialmente todos os membros do segundo repertório.
De acordo com a invenção, é proporcionado um método em que os membros tanto do primeiro repertório como do segundo repertórios são dispostos numa série de linhas contendo, cada uma um membro do primeiro ou segundo repertórios, de modo a que as linhas, correspondendo ao primeiro repertório e aquelas que correspondem ao segundo repertório são contactadas uma com a outra, de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estejam justapostos com substancialmente todos os membros do segundo repertório.
No contexto da presente invenção, "um" membro pode significar um único membro ou, pelo menos um membro, vantajosamente, refere-se a um único membro. Todavia, num 5 aspecto alternativo a invenção também proporciona a utilização de grupos consistindo em mais do que um membro do repertório em cada linha, canal ou tubo. De um modo preferido, esses grupos consistem em 10 ou menos membros, vantajosamente 5 ou menos, mas pelo menos 2. A vantagem de utilizar linhas intersectantes, de acordo com a presente invenção, comparada com o rastreio compartimentalizado combinatório na técnica anterior, é que o tamanho dos repertórios individuais cresce linearmente, assim como o número de passos de distribuição necessários para rastrear todas as combinações de membros do repertório. Desse modo, enquanto as técnicas de rastreio utilizando poços necessitam de 10000 passos de distribuição para rastrear um repertório de 100 por 100, o rastreio de acordo com a presente invenção requer apenas 200 passos de distribuição. Além disso, uma vez que é utilizado um único evento de distribuição para ordenar espacialmente cada membro de cada repertório, a comparação de interacções entre membros individuais do primeiro repertório com os membros do segundo repertório com as quais está justaposto será mais precisa. Adicionalmente, uma vez que a presente invenção utiliza linhas intersectantes em vez de manchas ou canais intersectantes em vez de poços, é necessária uma menor precisão posicionai para assegurar que substancialmente todas as combinações de possíveis interacções são testadas. Assim, se é realizado um rastreio de duas dimensões, e uma linha correspondendo a um membro do primeiro repertório está distanciada em, por exemplo, 1 mm, uma vez que está ordenada num ângulo em relação a substancialmente todas as linhas do segundo repertório, ainda assim irá intersectar substancialmente todas elas e, por isso, substancialmente todas as combinações de interacções irão, ainda assim, ser testadas 6 com sucesso. Se, por outro lado, as manchas correspondendo a um membro do primeiro repertório estão afastadas em, por exemplo, 1 mm, elas podem falhar as manchas correspondendo aos membros do segundo repertório no seu todo e, por isso, muitas combinações de interacções não terão sido testadas. Por isso, a presente invenção não só está bem adequada a métodos de rastreio automatizados, mas também a métodos manuais, nos quais a precisão posicionai não pode ser garantida e o número de eventos de distribuição deve ser limitado.
Como descrito acima, as linhas, podem ser dispostas numa variedade de formatos e podem ser dispostas num único suporte, ou numa pluralidade de suportes. Na configuração mais simples, as moléculas podem ser configuradas manualmente na forma de linhas num único suporte, por exemplo numa membrana de nitrocelulose. Estas linhas também podem ser aplicadas a suportes adequados utilizando técnicas de robótica, que permitem que a precisão e a densidade das matrizes sejam aumentadas para uma maior vantagem na presente invenção. Num aspecto vantajoso da invenção, pode ser utilizado um sistema de multi-suporte, em que são preparadas matrizes de linhas em suportes separados, que são então justapostos de modo a avaliar a interacção entre, os membros dos repertórios. A presente invenção também pode ser aplicada a matrizes de dimensões superiores, por exemplo, aquelas com 3 dimensões. Desse modo, podem ser rastreadas interacções com três componentes de modo a que enzima, substrato e co-factor utilizando linhas, canais ou tubos que são dispostos em 3 dimensões. Alternativamente, os três componentes podem ser cadeia pesada de anticorpo, cadeia leve de anticorpo e antigénio, e repertórios destes podem ser rastreados em três 7 dimensões. 0 rastreio dos repertórios em 2, 3 ou mais dimensões de acordo com a presente invenção é altamente vantajoso, na medida em que reduz o número de eventos de distribuição (ou pipetagem) que seriam necessários para realizar um rastreio combinatório exaustivo. Desse modo, o rastreio de dois repertórios, de, digamos, 300 membros contra um outro utilizando técnicas conventionais na técnica anterior seriam necessários, pelo menos, 90000 eventos de distribuição separados e o rastreio de três repertórios, de, digamos, 300 membros contra um outro necessitaria de, pelo menos, 2,7 milhões de eventos de distribuição. Em contraste, a presente invenção reduz o número de eventos de distribuição para rastrear exaustivamente os mesmos repertórios para 600 ou 900, respectivamente, uma enorme poupança em termos de tempo e trabalho.
Pode ser criada uma matriz multidimensional de vários modos. Vantajosamente, é criada uma terceira dimensão empilhando filtros ou outras membranas do tipo e dependendo da acção de capilaridade para transferir moléculas, ou forçando as moléculas através da pilha por meios de modo a que electroforese ou osmose ou furando a pilha, ou pela utilização de filtros permeáveis para criar a pilha.
Além disso, pode ser criada uma terceira dimensão, empilhando camadas não permeáveis, que nas intersecções de canais (para o primeiro e segundo repertórios) possuem buracos que (assim que as camadas são empilhadas) formam um conjunto adicional de canais numa terceira dimensão, ao longo da qual os membros de um terceiro repertório podem passar. A terceira dimensão pode ser criada utilizando um bloco de gel ou de uma substância semelhante, que pode ser injectada com membros do primeiro, segundo e terceiro repertórios ao longo dos lados x, y e z, respectivamente, criando, desse modo, canais num espaço tridimensional que forma a matriz.
Além disso, a matriz de interacções entre membros do primeiro, segundo (e opcionalmente terceiro) repertórios de moléculas podem ser criados utilizando uma rede de tubos que se intersectam ou tubos semi-permeáveis colocados adjacentemente um ao outro.
Os membros do primeiro, segundo (e opcionalmente terceiro) repertórios de moléculas podem ser substituídos ao longo do tempo com diferentes membros dos mesmos repertórios, de modo a que possa ser rastreada uma nova combinação ou conjunto de interacções.
Uma vez que a presente invenção pode ser utilizada para rastrear rapidamente interacções de multicomponentes e multi-cadeia, também pode ser aplicada à criação simultânea e ao rastreio de bibliotecas combinatórias de moléculas, por exemplo, bibliotecas de anticorpo ou receptor de células T. Assim, em vez de criar uma grande biblioteca combinatória de anticorpos combinando os genes da cadeia pesada e leve e depois rastrear separadamente os emparelhamentos resultantes, os próprios emparelhamentos podem ser criados de acordo com a invenção e, opcionalmente rastreados contra um ou mais antigénios alvo. Assim, digamos, 1000 cadeias pesadas podem ser desenhadas como linhas numa dimensão e umas 1000 cadeias leves podem ser desenhadas como linhas na outra, de modo a que substancialmente todas as linhas de cadeia pesada intersectam substancialmente todas as linhas de cadeia leve, formando na sua intersecção moléculas de anticorpo totalmente funcionais e dobradas, que 9 podem ser, então, rastreadas com um antigénio justaposto, por exemplo revestido noutro suporte que é colocado em contacto com as linhas de cadeia pesada e leve intersectantes. De acordo com esta forma de realização, substancialmente todas as combinações de 1000 cadeias pesadas e 1000 cadeias leves terão sido rastreadas, í. e., um total de 1 milhão de diferentes anticorpos, utilizando apenas 2000 eventos de distribuição, em vez do 1 milhão que teria tido que ser utilizado de acordo com as técnicas de rastreio na técnica anterior. Isto proporciona um modo rápido para um rastreio 'naive' para interacções especificas. Assim, por exemplo, um repertório de cadeias pesadas e um repertório de cadeias leves, cujos membros (ou qualquer membro relacionado) nunca estiveram em contacto ou foram seleccionados contra um dado antigénio alvo (ou um antigénio alvo relacionado deste) pode ser rastreado contra o antigénio alvo para identificar um emparelhamento de cadeia pesada e cadeia leve de ligação especifica.
Assim, num quinto aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para criar uma biblioteca combinatória de polipéptidos compreendendo duas cadeias, compreendendo cada membro da respectiva biblioteca um membro de um primeiro repertório de membros compreendendo um polipéptido de cadeia pesada e/ou leve e um membro de um segundo repertório de membros compreendendo um polipéptido de cadeia pesada e/ou leve, cujo método compreende o passo de dispor o primeiro repertório de membros numa primeira série de linhas continuas, e o referido segundo repertório numa segunda série de linhas continuas de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos com substancialmente todos os membros do segundo repertório, criando desse modo, nos pontos de justaposição, a pluralidade de combinações de polipéptidos 10 compreendendo duas cadeias, criando deste modo uma biblioteca combinatória de polipéptidos compreendendo duas cadeias.
De um modo preferido, a biblioteca combinatória é uma biblioteca de anticorpos ou de receptores de células T e os dois repertórios consistem em cadeias pesadas e leves (no caso de uma biblioteca de anticorpos) ou cadeias alfa e beta (no caso de uma biblioteca de receptores de células T). A biblioteca combinatória assim produzida é, de um modo preferido, rastreada para interacções com mais do que uma molécula alvo. Assim, a molécula alvo pode ser fornecida na forma de um grupo de moléculas alvo, ou um repertório destas, e rastreado numa matriz tridimensional, como aqui descrito.
De um modo preferido, o método de acordo com a invenção pode ser utilizado, de modo a que seja criada uma biblioteca de polipéptidos de três cadeias (e opcionalmente rastreada) utilizando o primeiro, segundo e terceiro repertórios de moléculas em três dimensões. 0 padrão de interacções entre o primeiro, segundo (e opcionalmente terceiro) repertórios pode ser utilizado para identificar interacções positivas, interacções negativas, interacções específicas ou interacções de reacção cruzada, ou para construir uma árvore filogénica inferindo a semelhança entre membros do primeiro repertório (utilizando o padrão de interacções com o segundo e/ou, opcionalmente terceiro, repertórios), do segundo repertório (utilizando o padrão de interacções com o primeiro e/ou, opcionalmente terceiro, repertórios) e/ou do terceiro repertório (utilizando o padrão de interacções com membros do primeiro e/ou segundo repertórios). 11
Uma vez que muitas das interacções que serão rastreadas de acordo com a presente invenção envolvem polipéptidos que foram derivados, directamente ou indirectamente, pela expressão de sequências de ácidos nucleicos, é altamente vantajoso que os próprios ácidos nucleicos sejam dispostos em linhas, canais ou tubos, de acordo com a invenção e expressos para produzir os seus polipéptidos correspondentes. Deste modo, os polipéptidos de intersecção de cada um dos dois repertórios serão expressos em conjunto. Isto pode auxiliar a sua associação, particularmente quando a associação dos dois membros de repertório depende da dobragem cooperativa, por exemplo, como no caso de anticorpos. Adicionalmente, a informação em relação a interacções de membros dos repertórios estará espacialmente ligada à informação genética que os codifica. Esta informação genética pode ser determinada calculando as coordenadas da interacção e isolando os dados da sequência de nucleótidos correspondente de qualquer ponto nesta linha, canal ou tubo ou isolando os dados da sequência de nucleótidos da própria intersecção.
Consequentemente, num sexto aspecto da presente invenção, é proporcionado um método pelo qual um ou mais do primeiro, segundo e, opcionalmente, terceiro repertórios compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico que são expressas para produzir os seus polipéptidos correspondentes in situ na matriz.
Uma vez que a presente invenção se refere ao rastreio rápido e eficiente de dois ou mais repertórios uns contra os outros, quaisquer técnicas presentemente empregues para aumentar ou destruir interacções moleculares podem ser utilizadas com a invenção. Assim, um repertório pode consistir em variantes de um 12 hapteno livre e o outro repertório pode consistir em anticorpos anti-hapteno seleccionados. Dispondo ambos os repertórios numa curta proximidade em relação a uma versão imobilizada da molécula de hapteno alvo, o rastreio pode ser utilizado para identificar os anticorpos que competem para a ligação ao hapteno alvo imobilizado através da ligação a certas variantes do hapteno livre. Neste caso, a falta de ligação seria considerada um resultado positivo. Os controlos para uma tal experiência pode incluir uma linha de água ao lado dos haptenos livres e uma linha de anticorpos de ligação a não haptenos ao lado dos anticorpos anti-haptenos. Alternativamente, pode ser utilizado um único hapteno livre para destruir a ligação de membros de um repertório de anticorpos anti-hapteno aos membros de um repertório de diferentes variantes de hapteno imobilizados. Outras terceiras moléculas podem incluir substâncias que aumentam a ligação dos membros do repertório uns aos outros, que pode ser utilizado ele próprio na forma de um repertório de acordo com a invenção. Deste modo, a molécula alvo pode ser imobilizada num suporte sólido e repertórios de intersecção de ligandos e intensificadores de ligação pode ser colocada em contacto com a molécula alvo. Os especialistas na técnica irão prever muitas diferentes combinações dessas moléculas e membros de repertório.
Consequentemente, noutro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para rastreio de um primeiro repertório de moléculas contra um segundo repertório de moléculas para identificar membros do primeiro e segundo repertórios cujas interacções um com a outro estão dependentes da presença ou ausência de uma terceira molécula ou conjunto de moléculas, compreendendo: 13 (a) dispor o primeiro repertório em pelo menos uma primeira série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório e dispondo o segundo repertório em pelo menos uma segunda série de linhas contínuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) detectar as interacções entre membros do primeiro repertório e os membros do segundo repertório na presença de diferentes concentrações da terceira molécula ou conjunto de moléculas.
Noutro aspecto da invenção, é proporcionado um método para rastrear um primeiro repertório de moléculas contra um segundo repertório de moléculas para identificar aqueles membros do primeiro repertório que não interactuam com os membros do segundo repertório, compreendendo: (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório e dispondo o segundo repertório em, pelo menos, uma segunda série de linhas contínuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo a que substancialmente todos 14 os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) identificar os membros do primeiro e segundo repertórios que não interactuam um com o outro. 0 método da presente invenção forma uma ponte no intervalo entre a identificação inicial de alvos principais e moléculas de repertórios muito grandes e a identificação final de alvos ou fármacos para intervenção terapia. Este problema é abordado na técnica anterior através da utilização de rastreio por ELISA de possíveis intervenientes positivos. Todavia, os protocolos para ELISA não são facilmente automatizados para rendimentos elevados. A natureza altamente paralela do método de acordo com a presente invenção revelará perfis de interacção abrangente para membros de cada repertório. Isto irá permitir, por exemplo, ligandos que interactuem que uma família inteira de proteínas seja distinguida daquelas que reagem com apenas um subconjunto dessa familia, que sejam eliminados fármacos de reacção cruzada de programas de desenvolvimento, e que seja determinada a verdadeira especificidade e reactividade cruzada de anticorpos A determinação de uma reactividade cruzada de anticorpos e por isso a sua especificidade é de vital importância quando existe um painel de diferentes anticorpos que derivaram de um murganho imunizado ou de uma selecção realizada in vitro, por exemplo, pela apresentação em fagos. 0 Rastreio de Matriz é particularmente poderoso neste contexto já que permite que uma gama abrangente de antigénios sejam testados contra cada anticorpo no painel, minimizando a oportunidade de reactividades cruzadas desconhecidas e indesejadas interrompendo investigações a jusante. 15
Alternativamente, utilizando a presente invenção para criar e rastrear grandes bibliotecas combinatórias abrangentes, podem ser criadas bibliotecas de um milhão de clones de anticorpo e rastreadas utilizando apenas 2000 eventos de distribuição. Adicionalmente, podem ser criados mapas complexos proteina-proteina a partir de fontes enriquecidas de pares de interacção, ou possivelmente utilizando proteomas inteiros juntamente com matrizes de densidade muito elevada de acordo com a invenção. A invenção também incorpora as vantagens chave de apresentação em fago e outras técnicas de apresentação de expressão, nomeadamente que os ácidos nucleicos codificam os membros de um repertório de polipéptidos podem estar espacialmente associados com os seus polipéptidos correspondentes e podem, desse modo, serem seleccionados com base nas caracteristicas funcionais do polipéptido individual. Ao contrário da apresentação em fago, todavia, em que esta associação é alcançada compartimentalizando os ácidos nucleicos e os polipéptidos utilizando células bacterianas que apresentam os polipéptidos nas suas superfícies, o tema da invenção explora vantajosamente uma nova estratégia de matriz para proporcionar esta associação. Eliminando a necessidade para os ácidos nucleicos e os polipéptidos a serem retidos dentro ou sobre as células bacterianas, a presente invenção pode ser estendida para além da selecção de actividades de ligação para seleccionar qualquer repertório de polipéptido com base em qualquer propriedade funcional dos polipéptidos, incluindo actividade enzimática, conformação ou qualquer outra característica detectável. 16
Outros aspectos da presente invenção são métodos proporcionados como se segue.
Um método para o rastreio de dois ou mais repertórios de enzimas que compreendem uma reacção de dois ou mais enzimas para identificar os membros do primeiro repertório e os membros do segundo repertório que, em conjunto, criam um dado produto a partir de um dado substrato, cujo método compreende: (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma série de segundas linhas continuas, em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam pelo menos uma matriz, de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estejam justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) detectar a formação do produto nas intersecções dos membros do primeiro e do segundo repertórios.
Um método para rastrear diferentes populações celulares contra diferentes populações virais para identificar as populações virais que infectam essas populações celulares, cujo método compreende: (a) dispor as populações celulares e as populações virais para formar, pelo menos, uma matriz, em que as populações virais são dispostas em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas, em que cada linha da referida população 17 virai compreende um membro da referida população e dispor a população celular em, pelo menos, uma segunda série de linhas continuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro da referida população celular, em que as populações virais e celulares formam, pelo menos, uma matriz, de modo a que substancialmente todos os membros da população celular estão justapostos a substancialmente todos os membros da população virai; e (b) detectar as populações virais que infectam essas populações celulares.
Um método para rastrear diferentes fracções celulares uma contra a outra para identificar essas fracções celulares que contêm componentes que interactuam com componentes noutras fracções celulares, cujo método compreende: (a) dispor as fracções celulares em, pelo menos, duas séries de linhas continuas em que cada linha da referida primeira e segundo série compreende um membro da referida fracção celular e de modo a que substancialmente todas as diferentes fracções celulares estejam justapostas uma à outra. (b) detectar a(s) interacção(ões) nas intersecções das diferentes fracções celulares.
Um método para rastrear um repertório de péptidos contra o mesmo repertório de péptidos para identificar os membros do repertório de péptidos que interactuam com outros membros do repertório de péptidos, cujo método compreende: 18 (a) dispor os membros do repertório de péptidos em, pelo menos, duas séries de linhas contínuas em que cada linha da referida primeira e segunda série compreende um membro do referido repertório de péptidos e de modo a que substancialmente todos os diferentes membros do repertório de péptidos estão justapostos um ao outro (b) detectar a/s interacção/ões nas intersecções dos diferentes membros do repertório de péptidos.
Um método para criar (e opcionalmente rastrear) uma biblioteca de dois híbridos de leveduras consistindo em substancialmente todos os membros de um primeiro repertório de polipéptidos emparelhados com substancialmente todos os membros de um segundo repertório de polipéptidos, cujo método compreende: (a) dispor células de leveduras contendo uma pluralidade de sequências de nucleótidos para criar, pelo menos, uma matriz, em que as sequências de nucleótidos estão dispostas em, pelo menos, uma primeira série de linhas contínuas em que cada linha da referida primeira série compreende células de leveduras contendo uma sequência de nucleótidos e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma segunda série de linhas contínuas em que cada linha da referida segunda série compreende células de leveduras contendo um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo a que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; 19 (b) permitir que as células de leveduras contendo os membros do primeiro repertório se cruzem com as células de leveduras contendo os membros do segundo repertório, em que os dois repertórios intersectam; e opcionalmente (c) expressar as sequências de nucleótidos para produzir os polipéptidos correspondentes do primeiro e segundo repertórios; e opcionalmente (d) detectar a/s interacção/ões entre os membros de polipéptidos do primeiro e segundo repertórios.
Podem ser fornecidos vários dispositivos em associação com reagentes ou ferramentas para realizar os rastreios descritos acima.
Definições 0 termo "repertório", como utilizado de acordo com a presente invenção refere-se a uma população de diversas variantes, por exemplo variantes de polipéptido que diferem na sequência de aminoácidos, variantes de ADN que diferem na composição de nucleótidos e/ou sequência ou qualquer outro tipo de molécula que pode existir em várias formas diferentes. De um modo geral, um repertório inclui mais de 10 variantes diferentes. Repertórios grandes compreendem o número mais elevado de variantes possíveis para selecção e podem ser até 1013 em tamanho. Repertórios mais pequenos são particularmente úteis, especialmente se tiverem sido pré-seleccionados para enriquecer num subconjunto particularmente útil (por exemplo, anticorpos 20 que se ligam a marcadores de superfície celular, enzimas que catalizam um certo conjunto de reacções, proteínas que se ligam a outras proteínas, etc.) ou para remover membros indesejados (tais como aqueles que incluem codões de terminação, incapazes de corrigir a dobragem ou que são, caso contrário, inactivos). Esses repertórios mais pequenos podem compreender 10, ΙΟ2, 103, ΙΟ4, ΙΟ5, 106 ou mais polipéptidos. Vantajosamente, repertórios mais pequenos compreendem entre 10 e 104 polipéptidos.
Na presente invenção, dois ou mais repertórios de polipéptidos são rastreados um contra o outro. Vantajosamente, pelo menos, 50% dos membros ou cada repertório são rastreados um contra o outro em cada rastreio. De um modo preferido, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mesmo 100% dos membros de cada repertório são assim, rastreados.
No contexto da presente invenção, "interactuar" refere-se a qualquer interacção detectável entre as moléculas que compreendem os vários repertórios e, opcionalmente, quaisquer moléculas adicionais que compreendem o rastreio. Por exemplo, no caso das interacções anticorpo-antigénio, um repertório pode compreender uma população diversa de anticorpos e o outro uma população diversa de antigénios, sendo as interacções uma interacção de ligação. Alternativamente, a interacção pode ser uma reacção catalizada enzimaticamente, em que um repertório é composto por enzimas e o outro repertório é composto por substratos destes. Qualquer interacção pode ser ensaiada utilizando a presente invenção, incluindo interacções de ligação, metilação de ADN, degradação de ácido nucleico, clivagem de ácido nucleico (de cadeia simples ou dupla), eventos de sinalização, reacções catalíticas, eventos de fosforilação, eventos de glicosilação, clivagem proteolítica, reacções 21 químicas, infecção celular e suas combinações. A detecção dessas interacções é bem conhecida na técnica.
No contexto da presente invenção, "molécula" refere-se a qualquer substância que pode ser aplicada ao rastreio. Essas moléculas podem incluir péptidos, polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, proteínas purificadas, proteínas recombinantes, aminoácidos, ADNc, ADNc expressos, oligonucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, famílias de genes relacionados ou as proteínas correspondentes destes, enzimas, proteínas de ligação ao ADN, membros da família de imunoglobulinas, anticorpos, receptores de células T, haptenos, moléculas orgânicas pequenas, compostos não orgânicos, iões metálicos, hidratos de carbono e combinações destes. A criação de repertórios dessas moléculas é bem conhecida na técnica. Os "polipéptidos" podem referir-se a polipéptidos, tais como ADNc expressos, membros da superfamília da imunoglobulina de modo a que polipéptidos de anticorpo ou polipéptidos receptores de células T. Vantajosamente, os repertórios de anticorpo podem compreender repertórios compreendendo ambos os polipéptidos de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL), que são ou pré-montados ou montados e rastreados de acordo com a presente invenção. Um polipéptido de anticorpo, como aqui utilizado, é um polipéptido que ou é um anticorpo ou é uma parte de um anticorpo, modificado ou não modificado. Deste modo, o termo polipéptido de anticorpo inclui uma cadeia pesada, uma cadeia leve, um dímero de cadeia pesada-cadeia leve, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Dab, um domínio único de cadeia leve ou pesada, e um fragmento Fv incluindo uma cadeia simples Fv (scFv) ou um Fv ligado a persulfureto (dsFv). Métodos para a construção dessas moléculas de anticorpo e ácidos nucleicos que os codificam são bem conhecidos na técnica. Todavia, "polipéptidos" pode referir- 22 se a outros polipéptidos de modo a que enzimas, antigénios, fármacos, moléculas envolvidas na sinalização celular de modo a que moléculas receptoras, ou um ou mais dominios individuais de polipéptidos maiores, que são capazes de uma interacção com uma molécula alvo. Podem ser proporcionadas moléculas de acordo com a invenção na forma celular, que está na forma de células que produzem uma molécula como descrito acima, ou na forma não celular, que não está contida nas células. As células podem ser, por exemplo, células bacterianas, células de eucariotas inferiores (e. g., leveduras), ou células de eucariotas superiores (e. g., células de insectos, anfibios, aves ou mamíferos). A utilização de células de leveduras está também contemplada.
No contexto da presente invenção, o termo "população celular" refere-se a uma colecção de células. As células compreendendo a população celular podem ser todas da mesma espécie e tipo celular, ou podem ser uma população mista. Uma forma de realização de uma população celular compreende uma população de células essencialmente, substancialmente uniforme, por exemplo fibroblastos de mamífero, transformados com uma biblioteca codificando variantes de uma dada sequência de gene codificante.
No contexto da presente invenção, o termo "população virai" refere-se a uma colecção de partículas virais. As partículas compreendendo uma população virai podem ser todas da mesma espécie e estirpe, ou podem ser uma população mista. Uma forma de realização de uma população virai compreende população de partículas recombinantes ou sujeitas a mutagénese aleatória, por exemplo partículas retrovirais. A população virai pode 23 compreender múltiplos indivíduos comportando variações de uma ou mais sequências de genes codificantes. "Justaposição", no contexto da presente invenção, inclui, mas não está limitado a um contacto físico. Dois ou mais repertórios, de acordo com a invenção, podem ser justapostos, de modo a que as moléculas sejam capazes de interactuar uma com a outra, de modo a que os sítios das interacções entre os membros dos repertórios possam ser correlacionados com a sua posição. Alternativamente, os repertórios podem ser justapostos um ao outro e com uma molécula alvo, de modo a que os membros dos repertórios interactuem um com o outro e depois em conjunto interactuem com uma molécula alvo.
Uma "matriz", como aqui referido, é um arranjo espacial pré-determinado dos membros do repertório. A matriz pode tomar qualquer forma física. A matriz pode ser criada por meios manuais ou automatizados e tecnologias preferidas para preparação de matrizes são posteriormente descritas abaixo.
Um "evento de distribuição" é um evento único pelo qual uma substância é transferida de um local discreto para um segundo local discreto. Um local discreto pode estar na forma de um poço, um tubo, um canal, uma mancha, uma linha, um rectângulo, uma esfera, um cubo, etc. Exemplos de eventos de distribuição únicos incluem: (i) pipetar um liquido de um tubo ou poço para um segundo tubo ou poço. Neste caso, pipetar fracções do mesmo liquido para múltiplos tubos ou poços pode ser considerado como sendo eventos múltiplos de distribuição, como seria distribuir dois ou 24 mais líquidos diferentes para o mesmo tubo ou poço, ou (ii) transferir líquido de uma fonte de poço para uma membrana através de transferência com uma aqulha para criar uma mancha desse líquido. Neste caso, criar uma mancha de uma segunda fracção dessa mesma fonte de poço para uma localização de destino diferente na membrana seria considerado um evento de distribuição separado, ou (iii) transferir líquido de uma única fonte de poço para criar uma única linha contínua de líquido numa membrana. Neste caso, criar uma segunda linha separada, mesmo do mesmo líquido, seria considerado um evento de distribuição separado, ou (iv) distribuir uma solução por um tubo abaixo ou por um canal. Neste caso, distribuir uma solução diferente pelo mesmo tubo ou canal, ou a mesma solução por um tubo ou canal diferentes seria considerado um evento de distribuição separado
Uma "matriz", no contexto da presente invenção, é um tipo particular de matriz que pode ser utilizada para estudar substancialmente todas as possíveis interacções entre substancialmente todos os membros em dois ou mais repertórios de moléculas. Essas matrizes podem compreender uma série de linhas de intersecção, canais ou tubos, contendo cada um, um ou mais membros dos repertórios. Uma matriz única irá conter muitas linhas individuais, canais ou tubos e muitas mais intersecções, ou nódulos. 25 0 termo "aumentado" como aqui utilizado significa que uma interacção detectada é aumentada em, pelo menos, 10% na presença de uma dada molécula ou moléculas em relação à interacção na ausência dessa molécula ou moléculas. O termo "bloqueado", como aqui utilizado, significa que uma interacção detectada é diminuída em, pelo menos, 10% na presença de uma dada molécula ou moléculas, em relação à interacção na ausência dessa molécula ou moléculas. O termo "fracção celular", como aqui utilizado, significa uma porção de um lisado celular que resulta de um processo de fraccionamento celular. Exemplos não limitantes de processos de fraccionamento celular incluem, extracção com detergente, extracção salina, precipitação ácida, extracção de componentes solúveis em lípidos, isolamento de membranas, extracção de componentes solúveis em água ou aquosos, fraccionamento núcleo/citoplásmico, e separações baseadas em forças de centrifugação (e. g:, a fracção S-100) . Outras separações consideradas como sendo processos de fraccionamento celular incluem isolamento de ácidos nucleicos, separação cromatográfica de componentes do lisado celular ou lisado celular fraccionado, fraccionamento electroforético preparativo, separações por permuta iónica e afinidade (e. g., cromatografia de imunoprecipitação ou imunoafinidade, interacções His/Ni++, interacções GST/glutationa, etc.). 26
Breve Descrição dos Desenhos
Figura. 1: esboço de um método para rastrear um repertório de anticorpos contra um repertório de antigénios, de acordo com a presente invenção, demonstrando como centenas de diferentes anticorpos podem ser rastreados simultaneamente contra centenas de diferentes antigénios para identificar pares interactuantes. São indicadas interacções especificas.
Figura 2: Análise de scFvs utilizando uma matriz criada manualmente. Aqui, 21 antigénios (horizontalmente) são rastreados contra 16 scFvs (verticalmente). Foram seleccionados quatro scFvs contra a ubiquitina através de selecção em fagos (Ublbl, Ublal, R13 e R14). Dois clones de antigénio são conhecidos por serem ubiquitina (Q e T) e cinco outros clones (A, P, R, Se U) foram identificados num rastreio primário como ligando-se provavelmente a um scFv anti-ubiquitina. Cada um destes quatro scFvs anti-ubiquitina liga-se a dois clones de ubiquitina conhecidos e a cada um dos cinco potenciais clones de ubiquitina. Todavia, pode ser observado que os scFv Ublbl e scFv R14 são altamente reactivos para reacção cruzada.
Figura 3: Uma cabeça para desenhar linhas por robótica de acordo com a presente invenção concebida para montagem numa plataforma robótica que permite o movimento nas dimensões x, y e z. Uma fila de pontas de caneta de tinta distribui membros de repertório numa suspensão liquida, pela acção da capilaridade a um suporte sólido adequado. As pontas são montadas de modo a distribuir o liquido num ângulo óptimo num suporte sólido e depois para serem mantidas na vertical por um travão para carregar com liquido a partir de uma placa de microtitulação de 96 poços. 27
Figura 4: Análise de scFvs utilizando uma matriz criada por robótica. Linhas duplas de 12 antigénios (horizontalmente) são rastreadas contra 192 scFvs (verticalmente). Podem ser observadas interacções especificas nas intersecções de emparelhamentos específicos. Adicionalmente, os scFvs que apresentam reacção cruzada com a nitrocelulose podem ser observados como linhas horizontais contínuas, assim como os scFvs que apresentam reacção cruzada com substancialmente todos os antigénios (manchas horizontais).
Figura 5: Exemplo da criação e rastreio de um repertório de anticorpos de duas cadeias, (a) Uma matriz em manchas de acordo com a técnica anterior. Bactérias que segregam 1. Cadeias pesadas de ligação a Albumina de Soro Bovino (BSA), 2. Cadeias leves de ligação a BSA, 3. cadeias pesadas e leves de não ligação ou 4. As cadeias pesadas e leves de ligação a BSA foram misturadas e depois cultivadas e induzidas em grande proximidade com BSA imobilizado, indicando que 1 e 2 necessitam de estar misturados para obter um anticorpo de ligação (como observado no controlo, 4). Foram necessários 32 eventos de distribuição separados para produzir este rastreio. (b) Um rastreio de matriz de acordo com a presente invenção permite que o mesmo rastreio seja realizado utilizando apenas 8 eventos de distribuição (a falta de um sinal para 1 vertical com 2 horizontais é provavelmente devida a uma bolha que está presente entre os filtros durante a indução).
Figura 6: Aumentando a densidade das linhas de cadeia pesada e leve podem ser criadas e rastreadas matrizes de anticorpo de densidade mais elevada. Assim, foram concebidas 24 cadeias pesadas anti-BSA e 48 cadeias leves anti-BSA perpendicularmente 28 aos eixos x e y para criar 1152 emparelhamentos rastreados contra BSA.
Figura 7: Foram concebidas 384 cadeias pesadas não seleccionadas e 384 cadeias leves não seleccionadas perpendicularmente aos eixos dos x e y e rastreados contra BSA revestido num filtro de nitrocelulose (147456 combinações) . Foi isolado um único emparelhamento especifico de cadeia pesada e leve que foi subsequentemente confirmado como de ligação a nitrocelulose.
Figura 8: Esquema para rastreio tridimensional de acordo com a invenção. Neste caso, membros dos repertórios são dispostos em planos nos eixos x, y e z e as interacções ocorrem nos vários vértices dos planos de intersecção.
Figura 9: Prova do conceito de um rastreio tridimensional. A cadeia pesada anti-BSA é depositada num plano, a cadeia leve anti-BSA é depositada num segundo plane, e a BSA é depositada no terceiro plane. Uma interacção no seu vértice é detectada apenas quando estão presentes todos os três.
Descrição Detalhada da invenção.
Podem ser criadas matrizes de acordo com a presente invenção de muitos modos diferentes para rastrear muitas interacções diferentes envolvendo muitas moléculas diferentes. A invenção é caracterizada pela capacidade para rastrear substancialmente todas as combinações de membros de dois ou mais repertórios. Os requerentes demonstraram que isto pode ser realizado utilizando uma série de linhas de intersecção, mas estão contempladas 29 outras abordagens que permitem o rastreio combinatório de dois ou mais repertórios utilizando um número mínimo de eventos de distribuição de modo a que a utilização de canais ou tubos de intersecção. 0 método dos requerentes baseia-se na justaposição de agrupamentos contínuos de moléculas para criar uma teia em duas ou três dimensões, pela qual os membros dos diferentes repertórios ficam unidos e, potencialmente, interactuam um com o outro. Este contraste com os protocolos de rastreio na técnica anterior, nos quais são utilizadas manchas descontínuas ou poços compartimentalizados para segregar combinações individuais de moléculas. Na presente invenção, linhas contínuas, canais ou tubos que se intersectam uns aos outros de modo a que as combinações individuais de moléculas existam nos seus pontos de intersecção, ou nódulos. Considerada como um todo, a 'teia' ou 'rede' molecular assim criada pode ser utilizada não apenas para identificar pares de interactuação específica, mas também o padrão global de interacções entre dois repertórios. A informação assim proporcionada pode ser utilizada para comparar o desempenho de membros de qualquer um dos repertórios um com o outro e, em particular, pode ser utilizado para identificar rapidamente as reactividades cruzadas de membros de repertório individuais na matriz.
Repertórios para rastreio
Podem ser utilizados muitos repertórios diferentes com a presente invenção, cuja construção é bem conhecida pelos especialistas na técnica. Podem ser construídos repertórios de pequenas moléculas orgânicas através de métodos de química combinatória. Podem ser sintetizados repertórios de péptidos num conjunto de agulhas ou hastes, tal como descrito no documento 30 WO84/03564. Um método semelhante, envolvendo a síntese de péptidos em esferas, que forma um repertório de péptidos em que cada esfera é um número de repertório individual, é descrito na Patente U.S. N° 4631211 e um método relacionado é descrito no documento W092/00091. Um melhoramento significativo dos métodos à base de esferas envolve marcar cada esfera com um único marcador identificador de modo a que um oligonucleótido, de modo a facilitar a identificação da sequência de aminoácidos de cada membro da biblioteca. Estes métodos melhorados à base de esferas são descritos no documento WO93/06121. Embora esses repertórios possam ser construídos antes da formação de matrizes para produzir a matriz, está contemplado que todas as técnicas descritas acima podem ser adaptadas para síntese in situ dos membros do repertório directamente na própria matriz - ligando, desse modo, a construção do repertório e o rastreio do repertório de acordo com a presente invenção. Na verdade, outro método de síntese química envolve a síntese de matrizes de péptidos (ou mimetizadores de péptidos) numa superfície de um modo que coloca cada membro da biblioteca distinto (e. g., sequência de péptidos única) numa localização discreta, pré-definida na matriz. A identidade de cada membro de biblioteca é, por isso, determinada pela sua localização espacial na matriz. As localizações na matriz em que ocorrem as interacções de ligação entre uma molécula pré-determinada (e. g., um receptor) e membros reactivos da biblioteca são determinadas, identificando, desse modo, as sequências dos membros reactivos da biblioteca com base na localização espacial. Estes métodos são descritos na Patente U.S. N° 5143854; documento WO90/15070 e documento WO92/10092; Fodor et al. (1991) Science, 251: 767; Dower e Fodor (1991) Ann. Rep. Med Chem, 26: 271 e pode ser facilmente adaptado para a criação de matrizes de acordo com a presente invenção. 31 A presente invenção é especialmente útil para o rastreio de interacções proteina-proteina, particularmente interacções anticorpo-antigénio. A preparação de repertórios apropriados de anticorpo úteis na presente invenção é descrita no documento wo 99/20749, cuja descrição é aqui incorporada por referência. O documento WO 99/20749 descreve como uma biblioteca de imunoglobulinas pode ser preparada e pré-seleccionada utilizando um ligando genérico, e/ou preparado utilizando uma única conformação de cadeia principal. Bibliotecas, como descrito no documento WO 99/20749 podem ser expressas em organismos hospedeiros, como ai descrito ou de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica, para produzir repertórios de polipéptidos que são adequados para a construção de matrizes e utilização na presente invenção. Alternativamente, os polipéptidos podem ser sintetizados in situ para utilização na presente invenção, ou expressos utilizando transcrição/tradução in vitro.
Dispor em matriz membros dos repertórios para criar o rastreio de matriz
De acordo com a presente invenção, as moléculas podem ser dispostas em matriz através de qualquer um de entre uma variedade de métodos, manuais ou automatizados, de modo a criar uma matriz, dependendo de as moléculas serem dispostas em matriz como tal ou expressos por disposição em matriz de precursores de nucleótidos, que podem estar presentes ou não em células hospedeiras. As matrizes são criadas vantajosamente por meios robóticos, uma vez que as técnicas robóticas permitem a criação de matrizes precisas e condensadas, que podem ser facilmente replicadas de modo a que, por exemplo, possa ser rastreado um 32 repertório de anticorpos combinatórios criados de acordo com a invenção contra muitos ligandos alvo diferentes. São conhecidas na técnica plataformas robóticas, e estão disponíveis máquinas de empresas, tais como Genetix, Genetic Microsystems e BioRobotics que são capazes de preparar matrizes a uma velocidade elevada com grande precisão ao longo de superfícies pequenas ou grandes. Essas máquinas são capazes de preparar manchas de proteínas purificadas, sobrenadante ou células em superfícies porosas ou não porosas, de modo a que possam ser subsequentemente fixadas a esta se necessário para produzir matrizes estáveis. Embora a manipulação robótica seja o método preferido para criar matrizes de elevada densidade, pode ser utilizada qualquer técnica, incluindo técnicas manuais, que seja adequada para localizar moléculas ou células em localizações pré-definidas num suporte. As matrizes podem ser regulares, de modo a que as linhas sejam 'concebidas' a uma dada distância da seguinte, irregulares ou aleatórias.
Os repertórios de moléculas podem ser rastreado em solução para interacções ou um ou mais dos repertórios podem ser imobilizados num suporte sólido. Assim, duas soluções podem fluir por dois canais de modo a que no seu ponto de intersecção ocorra uma interacção que pode ser detectada por, por exemplo, uma reacção colorimétrica, fluorescente, ou luminescente. Alternativamente, um dos repertórios pode ser imobilizado numa membrana de nitrocelulose através de, por exemplo, ligação cruzada e depois soluções correspondendo a um segundo repertório podem ser 'concebidas' no suporte contendo os membros do primeiro repertório imobilizados. Essa imobilização pode ser directa ou indirecta. Por exemplo, a imobilização indirecta pode envolver colocar em matriz um repertório de polipéptido num suporte sólido revestido com a ligando genérico. 33
Num aspecto, os membros dos repertórios são dirigidos para as suas posições por meio de um sistema de marcação, de modo a que cada linha, se liga ou está predisposta a ligar-se a um membro particular do repertório. Por exemplo, cada polipéptido num membro de um repertório pode compreender um marcador, tal como um epitopo para um anticorpo desconhecido, ou um membro de um par de afinidade (e. g., avidina/biotina, etc.). A linha, é revestida com uma molécula correspondente que se liga ao marcador (e. g., um anticorpo especifico para o marcador de epitopo, ou o membro correspondente do par de ligação). Colocar em contacto a linha revestida, com a solução compreendendo o membro do repertório marcado irá realizar o arranjo desse membro da matriz.
Alternativamente, ambos os repertórios podem ser imobilizados num suporte sólido separado e depois justapostos para identificar pares de interacção. Num aspecto preferido da invenção, as matrizes de polipéptidos podem ser criados primeiro dispondo em matriz os seus precursores de ácido nucleico em células hospedeiras e depois expressando as sequências de nucleótidos para produzir os correspondentes polipéptidos.
Num aspecto, as células de leveduras podem ser utilizadas para expressar um ou mais repertórios de moléculas úteis num método de acordo com a invenção. Os métodos de introdução e expressão de ácidos nucleicos exógenos em levedura são bem conhecidos na técnica. Uma abordagem preferida utilizando levedura tem vantagem sobre as técnicas de leveduras de dois híbridos. Nesta abordagem, uma população de leveduras é transformada com uma biblioteca codificando um repertório de fusões com um membro de um par de dois híbridos, e outra 34 população é transformada com uma biblioteca codificando um repertório de fusões com o correspondente segundo membro de um par de dois híbridos. As populações de células de duas leveduras são de diferentes tipos de cruzamento. As duas populações estão arranjadas de modo a criar uma matriz, de modo a que as células de leveduras contendo todos os membros do primeiro repertório se intersectem com células de leveduras contendo todos os membros do segundo repertório, e as células sejam deixadas cruzar. Interacções entre membros do primeiro repertório e do segundo repertório irão gerar um sinal de uma construção de repórter de dois híbridos apropriada.
Noutro aspecto, podem ser utilizadas células de insecto, anfíbio, aves, mamífero ou de outros eucariotas superiores. Como um exemplo não limitante, pode ser rastreado um repertório de moléculas (moléculas orgânicas pequenas, péptidos, polipéptidos, etc.) para aquelas que interactuam com um repertório de receptores superfície celular modificados recombinantes (e. g., um receptor com uma cassete variável inserida numa região instrumental em ligação ao ligando ou activação) criando uma matriz na qual cada membro do repertório de moléculas intersecta com cada membro do repertório de receptores. A detecção subsequente de activação de receptor ou inibição nas células indica quais das moléculas afectaram a actividade de qual receptor modificado. 0 processo permite tanto a identificação de novos moduladores do receptor ou outra proteína, e a identificação rápida de relações estrutura/função. 0 método pode também ser adaptado para utilizar células eucarióticas superiores para a expressão de ambos os repertórios a serem analisados para interacção. Isto pode ser realizado, por exemplo, expressando ambos os repertórios como moléculas de superfície celular, ou por exemplo, expressando um repertório 35 como uma proteína secretada e o outro como uma proteína de superfície celular. Após contacto ou justaposição próxima das células que expressam os respectivos repertórios, a interacção produtiva de membros de cada repertório com membros do outro pode ser detectada. Um especialista na técnica pode criar rapidamente células de eucariotas superiores expressando um dado repertório de polipéptidos.
Os métodos de detectar interacções irão variar com a natureza exacta da matriz criada. Por exemplo, os métodos variarão dependendo se a matriz utiliza células ou não. Exemplos não limitantes de métodos de detecção incluem: transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET); supressão de fluorescência; expressão de repórter (e. g., luciferase, GST, transferase de acetil de cloranfenicol, β-galactosidase, resistência a antibiótico); resgate de auxotrofia; eventos de sinalização de modo a que alterações nos níveis dos mensageiros secundários, GDP para permuta de GTP, activação da cinase ou fosforilação, activação da fosfatase ou desfosforilação, proteólise ou permeabilidade aos iões alterada; reacções enzimáticas; metilação; clivagem de ácido nucleico; glicosilação; proteólise; e infecção (e. g., com um vírus ou fago). Cada uma destas abordagens ou leituras para a detecção de interacções é conhecida na técnica, de modo a que um especialista na técnica pode empregá-la nos métodos da invenção sem a necessidade de experimentação desnecessária. 36
Utilização de moléculas seleccionadas de acordo com a invenção
As moléculas seleccionadas de acordo com o método da presente invenção podem ser empregues em substancialmente qualquer processo. Quando as moléculas são polipéptidos, elas podem ser utilizadas em qualquer processo que envolva ligação ou catálise, incluindo aplicações terapias in vivo e profilácticas, aplicações de diagnóstico in vitro e in vivo, ensaio in vitro e aplicações de reagentes, e semelhantes. Por exemplo, pode ser utilizadas moléculas de anticorpo em técnicas de ensaio baseadas em anticorpo de modo a que técnicas de ELISA, transferência de Western, imuno-histoquimica, cromatografia de afinidade e semelhantes, de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica.
Como aludido acima, as moléculas seleccionadas de acordo com a invenção são de utilização em processos de diagnóstico, profilácticos e terapêuticos. Por exemplo, variantes enzimáticas, criadas e seleccionadas por estes métodos podem ser ensaiadas para actividade, quer in vitro ou in vivo, utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, pelas quais são incubadas com moléculas de substrato candidatas e a conversão do substrato em produto é analisada. Receptores de superfície de células ou moléculas de adesão seleccionadas podem ser expressas em células cultivadas que são então testadas quanto à sua capacidade para responder a estímulos bioquímicos ou quanto à sua afinidade com outros tipos de células que expressam moléculas de superfície celular às quais a molécula de adesão não diversificada é esperado que se ligue, respectivamente. 37
Utilizações terapias e profilácticas de proteínas preparadas de acordo com a invenção envolvem a administração de polipéptidos seleccionados de acordo com a invenção a um mamífero recipiente, tal como um humano. De particular utilização neste contexto são anticorpos, outros receptores (incluindo, mas não limitado aos receptores de células T) ou sua proteina de ligação.
Substancialmente, moléculas puras de, pelo menos, 90 a 95% de homogeneidade são preferidas para administração a um mamifero, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade é mais preferida para utilizações farmacêuticas, especialmente quando o mamifero é um humano. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade conforme desejado, os polipéptidos seleccionados podem ser utilizados para diagnóstico ou terapia (incluindo extracorporeamente) ou no desenvolvimento realização de processos de ensaio, coloração imunofluorescente e semelhantes (Lefkovite e Pernis, (1979 e 1981) Immunological Methods, Volumes I e II, Academic Press, NY).
Os anticorpos seleccionados ou as suas proteínas de ligação da presente invenção terão utilidade tipicamente na prevenção, supressão ou tratamento de estados inflamatórios, hipersensibilidade alérgica, cancro, infecção bacteriana ou virai, e distúrbios autoimunitários (que incluem, mas não estão limitados a, diabetes de Tipo I, esclerose múltipla, artrite reumatóide, lúpus sistémico eritematoso, doença de Crohn e miastenia gravis).
No presente pedido, o termo "prevenção" envolve a administração da composição protectora antes da indução da doença. "Supressão" refere-se à administração da composição após 38 um evento de indução, mas antes do surgimento clinico da doença. "Tratamento" envolve a administração da composição protectora após os sintomas da doença se manifestarem.
Existem disponíveis sistemas de modelo animal que podem ser utilizados para pesquisar a eficácia dos anticorpos ou as suas proteínas de ligação na protecção ou tratamento a doença. Os métodos para o teste de lúpus eritematoso sistémico (SLE) em murganhos susceptíveis são conhecidos na técnica (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New
Eng. J. Med, 299: 515). A miastenia grave (MG) é testada em murganhos fêmeas SJL/J através da indução da doença com proteína AchR solúvel de outra espécie (Lindstrom et al., (1988) Adv. Immunol., 42: 233). A artrite é induzida numa estirpe
susceptível de murganhos por injecção de colagénio do Tipo II
(Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Foi descrito um modelo através do qual é induzida artrite adjuvante em ratos susceptíveis através de injecção com proteína de choque térmico micobacteriana (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). A tiroidite é induzida em murganhos por administração de tiroglobulina como descrito (Maron et al., (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). A diabetes mellitus dependente da insulina (IDDM) ocorre naturalmente ou pode ser induzida em certas estirpes de murganho de modo a que aquelas descritas por Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE em murganhos e ratos serve como um modelo para MS em humanos. Neste modelo, a doença de desmielinização é induzida por administração de proteína básica de mielina (ver Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune e Stratton, Nova Iorque, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: e Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179). 39
Os anticorpos, receptores (incluindo, mas não limitado a receptores de células T) ou as suas proteínas de ligação seleccionados da presente invenção também podem ser utilizados em combinação com outros anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais (MAbs) reactivos com outros marcadores em células humanas responsáveis pelas doenças. Por exemplo, marcadores de células T adequados podem incluir aqueles agrupados nos denominados "Aglomerados de Diferenciação", como nomeados pelo Primeiro Workshop Internacional sobre Diferenciação de Leucócitos (Bernhard et al. (1984) Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY).
De um modo geral, os presentes anticorpos, receptores ou proteínas de ligação seleccionados serão utilizados na forma purificada juntamente com veículos farmacologicamente apropriados. Tipicamente, esses veículos incluem soluções aquosas ou soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, qualquer uma incluindo meio salino e/ou tamponado. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer lactado. Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessário para manter um complexo de polipéptido em suspensão, podem ser seleccionados a partir de espessantes de modo a que carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.
Veículos intravenosos incluem repositórios de fluidos e nutrientes e repositores de electrólitos de modo a que aqueles que se baseiam em dextrose de Ringer. Conservantes e outros aditivos de modo a que antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, também podem estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16* Edição). 40
Os polipéptidos seleccionados da presente invenção podem ser utilizados como composições administradas separadamente ou em conjunção com outros agentes. Estes podem incluir vários fármacos imunoterapêuticos de modo a que ciclosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina, e imunotoxinas. Composições farmacêuticas podem incluir "cocktails" de vários agentes citotóxicos ou outros, em conjunção com os anticorpos, receptores ou as suas proteínas de ligação, seleccionados, da presente invenção, ou ainda combinações de polipéptidos seleccionados, de acordo com a presente invenção, possuindo diferentes especificidades de modo a que polipéptidos seleccionados utilizando diferentes ligandos alvo, quer sejam reunidos ou não antes da administração. A via de administração das composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser qualquer uma daquelas que são normalmente conhecidas dos especialistas na técnica. Para terapia, incluindo sem limitação imunoterapia, os anticorpos, receptores ou as suas proteínas de ligação seleccionados da invenção, podem ser administrados a qualquer doente de acordo com técnicas convencionais. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo parentericamente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdermicamente, através da via pulmonar, ou também, apropriadamente, por infusão directa com um cateter. A dosagem e frequência da administração dependerá da idade, sexo e estado do doente, administração simultânea de outros fármacos, contra-indicações e outros parâmetros a serem tomados em consideração pelo clínico.
Os polipéptidos seleccionados desta invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo 41 adequado antes da utilização. Esta técnica demonstrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais e podem ser empregues técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na técnica. Será entendido pelos especialistas na técnica que a liofilização e reconstituição pode conduzir a graus variáveis de perda de actividade de anticorpo (e. g., com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a possuir maior perda de actividade do que os anticorpos IgG) e que a utilização de niveis pode ter que ser ajustada para cima para compensar.
As composições contendo os presentes polipéptidos seleccionados ou um seu cocktail podem ser administradas para tratamentos profilácticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapias, uma quantidade adequada para alcançar a inibição, pelo menos, parcial, supressão, modulação, morte, ou algum outro parâmetro mensurável, de uma população de células seleccionadas é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades necessárias para alcançar esta dosagem dependerão da severidade da doença e do estado geral do próprio sistema imunitário do doente, mas geralmente varia desde 0,005 até 5,0 mg de anticorpo, receptor (e. g., um receptor de células T) ou proteina de ligação destes seleccionados por quilograma de peso corporal, sendo mais usualmente utilizadas doses de 0,05 até 2,0 mg/kg/dose. Para aplicações profilácticas, composições contendo os presentes polipéptidos seleccionados ou os seus cocktails também podem ser administrados em dosagens semelhantes ou ligeiramente inferiores.
Pode ser utilizada uma composição contendo um polipéptido seleccionado de acordo com a presente invenção, em ambientes profilácticos e terapêuticos para auxiliar na alteração, inactivação, morte ou remoção de uma população de células alvo 42 seleccionada, num mamífero. Adicionalmente, os repertórios de polipéptidos seleccionados aqui descritos podem ser utilizados extracorporealmente ou in vitro selectivamente para matar, empobrecer ou, de outra forma, remover eficazmente uma população de células alvo a partir de uma colecção de células heterogénea. 0 sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporealmente com os anticorpos, receptores de superfície celular ou as suas proteínas de ligação, seleccionados, pelo qual as células indesejadas são mortas ou, de outra forma, removidas do sangue para regressar ao mamífero, de acordo com técnicas convencionais. A invenção é ainda descrita, apenas para efeitos de ilustração, nos seguintes exemplos.
Exemplo 1
Rastreio de Matriz de um Repertório de scFv 0 sistema de captura de dois filtros, utilizado como parte do presente exemplo, baseia-se naquele descrito no Pedido de Patente UK co-pendente dos requerentes, intitulado "Método de Rastreio de Matriz", (Pedido de Patente UK Número: 9928787.2).
As bactérias são cultivadas em linhas num filtro e os scFvs assim produzidos são capturados num segundo filtro que possui
linhas de antigénio ligado a nitrocelulose, que são orientadas a 90° destas linhas de scFv no primeiro filtro (ver Fig 1) . Nas intersecções em que scFv interactua com o antigénio, o scFv é capturado se o antigénio e scFv se ligarem. Neste exemplo, a detecção de scFv ligado é realizada com Proteína L superantigénio conjugada com HRP. 43 Métodos
Biblioteca de Antigénios
Os antigénios são da biblioteca de expressão humana hEXl, preparada a partir de ARN poli(A)+ de cérebro fetal por iniciação com oligo(dT) (Bussow et al. 1998). Os ADNcs são clonados direccionalmente num vector pQE-30 modificados (Qiagen).
Filtros de Antigénio
Clones de antigénio foram cultivados durante a noite em cultura liquida (2xTY contendo Amp a 100 pg/mL, e glucose a 1%) a 37 °C. Para concepção de linha manual, as culturas liquidas foram transferidas para um filtro de PVDF pré-humedecido (embebido em etanol, passado por PBS e mergulhado em 2xTY) concebendo juntamente o filtro contra uma régua de metal com uma ponta de plO com filtro (Art) não montada numa pipeta. Assim, a acção capilar da ponta foi utilizada para distribuir o liquido na superfície da membrana. Cada foi concebida num filtro de 6 mm a partir do anterior. Para concepção automatizada do conceito da linha, foram transferidas culturas líquidas para um filtro de PVDP utilizando a cabeça robótica apresentada na Fig 3 ligada a um sistema Kaybee Systems picker/gridder. Cada clone foi concebido no filtro 4,5 mm do anterior a uma velocidade de 25 mm/s. 44
Os filtros de antigénio foram então cultivados durante a noite em placas de TYE agar contendo Amp a 100 pg/mL, glucose a 1% a 30 °C. O filtro foi então transferido para outra placa de TYE agar contendo Amp a 100 pg/mL, IPTG a 1 mM durante 3 h a 37 °C para indução dos clones. Os filtros de antigénio foram removidos da placa e desnaturados num papel de transferência pré-embebido contendo NaOH a 0,5 M, NaCl a 1,5 M durante 10 min, neutralizado durante 2x5 min em Tris-HCl a 1M, pH7,5, NaCl a 1,5 M e incubados durante 15 min em 2 x SSC. Os filtros foram secos, embebidos brevemente em etanol e depois bloqueados em PBS Marvel a 4%, passado por PBS e mergulhado em 2xTY.
Biblioteca de ScFv
Os scFvs são de uma biblioteca baseada numa única moldura humana para VH (V3-23/DP-47 e JH4b) e VK (012/02/DPK9 e JK1), com diversidade de cadeia lateral (codificada por NNK ou DVT) incorporada nas posições no sitio de ligação de antigénio que entra em contacto com o antigénio em estruturas conhecidas e são altamente diversas no repertório maduro. A dobragem que é utilizada é frequentemente expressa in vivo, e liga-se aos ligandos genéricos Proteína L e A, que facilita a captura ou detecção dos scFvs, mas não interfere com a ligação ao antigénio. Os clones de scFv foram pré-rastreados no formato scFv para ligação a Proteína A e Proteína L para assegurar que eram funcionais. 45
Filtro de ScFv
Os clones de anticorpo foram cultivados durante a noite em cultura liquida (2xTY contendo ampicilina a 100 pg/mL e glucose a 1%) a 37 °C. As culturas liquidas foram então transferidas para um filtro de nitrocelulose pré-bloqueado (leite em pó magro a 4% em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente (RT), passagem por PBS e mergulhado em 2xTY). A transferência manual e robótica dos anticorpos para o filtro foi realizada como para as culturas de antigénio, excepto que a densidade das linhas de scFvs criadas pela transferência robótica foi de uma em cada 1,125 mm.
Os filtros de ScFv foram então cultivados em placas de TYE agar contendo Amp a 100 pg/mL, glucose a 1% a 37 °c. Após cultura durante a noite o filtro de antigénio foi colocado numa placa de agar TYE fresco com Amp a 100 pg/mL, IPTG a 1 mM, seco, e depois o filtro de scFv foi colocado em cima disto. A placa com os dois filtros foi então incubada durante 3 h a 30 °C durante a indução dos scFvs. Râstreio dos filtros com sondas O filtro de cima (scFv) foi eliminado e o segundo (antigénio) filtro foi lavado 3 x com PBS/Tween a 0,05% (PBST) e bloqueado com MPBS a 4% durante 30 min à RT. Os filtros foram lavados 3x com PBST e depois incubados com o conjugado Proteína L HRP (Actigen, 1/2000) em MPBS a 4% durante 1 h à RT. Os filtros foram então lavados mais três vezes com PBST e revelados com reagente ECL. Todas as incubações foram realizadas em 50 mL de tampão num agitador, com agitação moderada. 46
Resultados
Como um sistema modelo, os requerentes realizaram um rastreio de matriz manual de 21 antigénios contra 16 scFvs, resultando em 336 interacções testadas, utilizando apenas 37 eventos de distribuição, incluídos no repertório de scFv estavam quatro scFvs que tinham sido seleccionados contra ubiquitina por selecção de fagos (Ublbl, Ublal, R13 e R14). Incluídos no repertório de antigénios estavam dois clones conhecidos por serem ubiquitina (Q e T) e cinco outros clones (A, P, R, S e U) que tinham sido identificados num rastreio primário como provavelmente ligando um scFv anti-ubiquitina. Com pode ser observado (Fig 2), cada um dos quatro scFvs anti-ubiquitina liga-se aos dois clones de ubiquitina conhecidos e a cada um dos cindo potenciais clones de ubiquitina. Todavia, pode ser observado que o scFv Ublbl e o scFv R14 são altamente reactivos em reacção cruzada. Estão também incluídos na matriz modelo 14 clones de antigénio identificados num rastreio primário de matriz de antigénio como possíveis ligandos a doze clones de scFv, C2 até Hll. Como pode ser observado a partir da matriz (Fig 2), o antigénio M (uma proteína de função desconhecida) liga-se especificamente ao scFv D12. Também, o antigénio E, (uma proteína de ligação ao ADN) liga-se especificamente ao scFv Hll. Isto demonstra a utilidade do rastreio da matriz na confirmação das interacções originalmente identificadas num rastreio de matriz de antigénio.
Os requrentes mudaram, então, para um rastreio de matriz de alta densidade, utilizando uma cabeça robótica (Fig 3a desenho. Fig 3b - fotografia) para criar as linhas. Neste sistema, foram rastreadas linhas duplas de 12 antigénios (horizontalmente) contra 192 scFvs (verticalmente). Deste modo, 47 foram testadas 2304 diferentes potenciais interacções, duas vezes cada uma, utilizando apenas 216 eventos de distribuição. Novamente, são observadas muitas interacções diferente nas intersecções das linhas, particularmente contra três antigénios (dois dos quais são iguais).
Exemplo 2
Criação e rastreio de um repertório de anticorpo de duas cadeias, de acordo com a presente invenção 0 sistema de captura de dois filtros utilizado como parte do presente exemplo é baseado naquele descrito no Pedido de Patente UK co-pendente dos requerentes intitulado "Método de Rastreio de
Matriz", (Pedido de Patente UK Número: 9928787.2).
Anteriormente, foi demonstrado que as cadeias pesadas e leves do anticorpo podem associar-se em solução para formar fragmentos Fv que possuem um sítio de ligação ao antigénio activo e essas técnicas são bem conhecidas na técnica. De modo a verificar se a associação não covalente da cadeia pesada e leve particular tinha força suficiente para que essa associação ocorra numa matriz, foi separada a cadeia pesada e a cadeia leve de um fago seleccionado anti-BSA scFv (13cg2). Como não havia certeza sobre quão forte seria a associação entre as cadeias pesada e leves, foram clonados os 13cg2 de cadeias pesadas e leves separadamente em três formatos de fragmento recombinante; cadeia pesada ou leve isoladamente (domínios únicos); scFv (com um ligando de 15 aminoácidos entre a cadeia pesada e a leve) e diacorpo (com um ligando de zero aminoácidos entre as cadeias pesada e leve). Os últimos dois formatos foram construídos com qualquer diversidade de 13cg2 de cadeia leve ou pesada, sendo a cadeia não 48 diversificada em cada caso uma cadeia pesada ou leve simulada. (A cadeia simulada possui uma especificidade de ligação ao antigénio única mas desconhecida). Testar os vários formatos na matriz, utilizando BSA como antigénio, indica que os formatos de diacorpo proporcionam a associação mais estável na superfície do filtro.
As bactérias que expressam qualquer uma de entre uma cadeia pesada (I) que se liga a Albumina de Soro Bovino (BSA), uma cadeia leve que se liga a BSA (2), cadeias pesada e leve que não se ligam (3) ou cadeia pesada e leve que se liga a BSA (4), todos no formato de diacorpo descrito acima, foram quer misturados e cultivados como manchas (Figura 5a) ou concebidos como linhas horizontais e verticais e depois cultivados (Figura 5b) . Em ambos os casos, após cultivo durante a noite, os filtros que contêm as bactérias cultivadas foram depositados sobre o segundo filtro revestido com BSA e depois induzidas para expressão de proteína. Apenas nos casos em que é co-expressa uma cadeia pesada de ligação com uma cadeia leve de ligação é que é observado um sinal positivo (í. e., 1 e 2 juntamente ou qualquer combinação envolvendo 4. A falta de um sinal para 1 vertical com 2 horizontal deve-se provavelmente à presença de uma bolha entre os filtros durante a indução). A concepção das linhas reduz dramaticamente o número de eventos de distribuição (neste caso de 32 para 8).
Aumentando a densidade das linhas de cadeia pesada e leve, podem ser criadas e rastreadas matrizes de anticorpo com densidade mais elevada. Desse modo, foram concebidas 24 cadeias pesadas anti-BSA e 48 cadeias leves anti-BSA perpendicularmente aos eixos dos x e y, para criar 1152 emparelhamentos rastreados 49 contra BSA (Figura 6) . Num formato de densidade mais elevada foram concebidas 384 cadeias pesadas não seleccionadas e 384 cadeias leves não seleccionadas perpendicularmente aos eixos dos x e y e rastreadas contra BSA revestido num filtro de nitrocelulose (147 456 combinações). Foi isolado um único emparelhamento de cadeia pesada e leve especifico, que foi subsequentemente confirmado como ligando-se à nitrocelulose (Figura 7) . Se o rastreio fosse aumentado para cobrir 1000 cadeias pesadas versus 1000 cadeias leves (1 milhão de anticorpos diferentes) o número de eventos de distribuição seria reduzido de 2 milhões para 2 mil utilizando o método de acordo com a presente invenção.
Exemplo 3
Rastreio tridimensional É apresentado um esquema para rastreio tridimensional, de acordo com a invenção (Figura 8) . Aqui, os membros dos repertórios são dispostos em planos nos eixos dos x, y e z e as interacções ocorrem nos vários vértices dos planos de intersecção. Como prova do conceito, é depositada num plano uma cadeia pesada anti-BSA, é depositada uma cadeia leve anti-BSA num segundo plano, e é depositada BSA no terceiro plano. É detectada uma interacção no seu vértice apenas quando todos os três estão presentes (Figura 9) .
Varias modificações e variações dos métodos e sistema da invenção descritos serão óbvios para o especialista na técnica sem se afastar do âmbito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em relação a formas de realização especificas 50 preferidas, deve ser entendido que a invenção, como reivindicado, não deve ficar limitada a essas formas de realização especificas. Na verdade, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção, que são óbvios para os especialistas em biologia molecular ou campos relacionados, pretendem estar dentro do âmbito das seguintes reivindicações.
Lisboa, 22 de Novembro de 2007 51

Claims (49)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para rastreio de um primeiro repertório de membros compreendendo polipéptidos contra um segundo repertório de membros compreendendo polipéptidos, para identificar os membros do primeiro repertório que interagem com membros do segundo repertório, compreendendo: (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório, e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma segunda série de linhas contínuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) detectar uma interacção entre polipéptidos do primeiro e segundo repertórios, identificando, deste modo, os membros do primeiro repertório que interactuam com membros do segundo repertório.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que o referido primeiro e segundo repertórios estão, cada um, presentes numa série de linhas contínuas, sem intersecção. 1
  3. 3. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, em que o primeiro e segundo repertórios estão arranjados no primeiro e segundo suportes, respectivamente.
  4. 4. Método de acordo com reivindicação 1 ou 2, em que membros do primeiro e segundo repertórios são aplicados a um único suporte.
  5. 5. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que cada linha do referido primeiro e segundo repertórios corre ao longo de canais cortados ou moldados num material sólido, de modo que substancialmente todos os canais contendo um membro do primeiro repertório intersecta substancialmente todos os canais contendo um membro do segundo repertório.
  6. 6. Método de qualquer reivindicação anterior em que a cadeia de polipéptido é um polipéptido de cadeia pesada ou leve.
  7. 7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o referido polipéptido de cadeia pesada ou leve é um fragmento dAb.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o referido primeiro repertório compreende VH ou VL.
  9. 9. Método da reivindicação 7, em que o referido segundo repertório compreende VH ou VL.
  10. 10. Método de qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o referido primeiro repertório compreende VH e o referido segundo repertório compreende VL. 2
  11. 11. Método de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 10, em que o referido passo de detecção compreende o contacto da referida, pelo menos, uma matriz com um epitopo alvo e detecção de liqação do epitopo alvo por membros justapostos do referido primeiro e segundo repertórios na referida matriz, em que a referida ligação do antigénio alvo é indicativa de uma interacção de membros do referido primeiro e segundo repertório.
  12. 12. Método de qualquer reivindicação 1 a 10, em que o referido passo de detecção compreende o contacto da referida, pelo menos, uma matriz com um terceiro repertório de membros de antigénio alvo arranjados numa série de linhas continuas, e detectar a ligação do antigénio alvo por membros justapostos do referido primeiro e segundo repertórios em posições, na referida matriz, em que a referida ligação de antigénio alvo é indicadora de uma interacção de membros do referido primeiro e segundo repertório.
  13. 13. Método da reivindicação 12, em que a pluralidade de linhas do referido terceiro repertório compreende um diferente antigénio alvo.
  14. 14. Método da reivindicação 12, em que o referido primeiro e segundo repertório estão, cada um, arranjados numa série de linhas continuas, sem intersecção.
  15. 15. Método para produzir uma biblioteca combinatória de polipéptidos compreendendo duas cadeias, cada membro da biblioteca compreendendo um membro de um primeiro repertório de membros compreendendo um polipéptido de 3 cadeia pesada e/ou cadeia leve e um membro de um segundo repertório de membros compreendendo um polipéptido de cadeia pesada e/ou leve, cujo método compreende o passo de dispor o primeiro repertório de membros numa primeira série de linhas continuas, e o referido segundo repertório numa segunda série de linhas continuas, de modo que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório, produzindo deste modo, nos pontos de justaposição, uma pluralidade de combinações de polipéptidos compreendendo duas cadeias, produzindo assim uma biblioteca combinatória de polipéptidos compreendendo duas cadeias.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a biblioteca combinatória produzida é pesquisada quanto a interacções com mais do que uma molécula alvo.
  17. 17. Método de acordo com a reivindicação 12 em que é produzida uma biblioteca de polipéptidos de três cadeias (e opcionalmente pesquisada) utilizando primeiro, segundo e terceiro repertórios de moléculas em três dimensões.
  18. 18. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, pelo qual o padrão de interacção entre os (primeiro, segundo e opcionalmente terceiro) repertórios é utilizado para identificar interacções positivas, interacções negativas, interacções especificas ou interacções de reacção cruzada ou é utilizado para construir uma árvore filogénica, inferindo a semelhança entre membros do primeiro repertório (utilizando o padrão de interacções com o segundo e/ou, opcionalmente terceiro repertórios) do segundo repertório 4 (utilizando o padrão de interacções com o primeiro e/ou, opcionalmente terceiro repertórios) e/ou do terceiro repertório (utilizando o padrão de interacções com membros do primeiro e/ou segundo repertórios).
  19. 19. Método da reivindicação 18, em que o referido primeiro e segundo repertórios estão, cada um, arranjados numa série de linhas continuas, sem intersecção.
  20. 20. Método da reivindicação 15, em que os referidos polipéptidos são polipéptidos de cadeias pesadas ou leves de anticorpo.
  21. 21. Método da reivindicação 15, em que os referidos polipéptidos são fragmentos dAb.
  22. 22. Método da reivindicação 15, em que o referido primeiro repertório compreende VH ou VL.
  23. 23. Método da reivindicação 15, em que o referido segundo repertório compreende VH ou VL.
  24. 24. Método da reivindicação 15, em que o referido primeiro repertório compreende VH, e o referido segundo repertório compreende VL.
  25. 25. Método de pesquisa da biblioteca combinatória de polipéptidos de duas cadeias da reivindicação 15 para ligação a uma molécula alvo, compreendendo o método o passo de detecção de uma interacção entre os polipéptidos de duas cadeias e a molécula alvo. 5
  26. 26. Método da reivindicação 25, em que o referido passo de detecção compreende o contacto da referida biblioteca combinatória de polipéptidos de duas cadeias com um terceiro repertório de membros de antigénio alvo arranjados numa série de linhas continuas de modo que uma pluralidade de membros do referido primeiro, segundo e terceiro repertório está justaposta a uma pluralidade de outros membros do referido primeiro, segundo e terceiro repertório, e detectar a ligação do antigénio alvo por membros justapostos do referido primeiro e segundo repertórios, em que a referida ligação do antigénio alvo é indicadora de uma interacção de membros do referido primeiro e segundo repertório.
  27. 27. Método da reivindicação 26, em que o referido primeiro, segundo e terceiro repertórios estão, cada um, arranjados numa série de linhas contínuas, sem intersecção.
  28. 28. Método de qualquer reivindicação anterior, pelo qual um ou mais do primeiro, segundo e, se presente, terceiro repertórios são proporcionados por uma pluralidade de sequências de ácidos nucleicos que codificam o referido polipéptido de cadeia pesada ou leve do referido primeiro e segundo repertórios ou o referido epitopo alvo do referido terceiro repertório e que são expressos para produzir os seus polipéptidos correspondentes in situ na matriz.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que as sequências de ácidos nucleicos são proporcionadas por vectores de expressão que codificam polipéptidos membros do repertório, e estão operacionalmente ligados a sequências 6 de controlo suficientes para dirigir a transcrição das moléculas de ácido nucleico.
  30. 30. Método da reivindicação 29, em que o vector de expressão é um bacteriófago.
  31. 31. Método da reivindicação 29, em que o vector de expressão é um plasmideo.
  32. 32. Método da reivindicação 29, em que o vector de expressão é uma molécula linear de ácido nucleico.
  33. 33. Método da reivindicação 29, em que os ácidos nucleicos estão contidos e são expressos em células.
  34. 34. Método de acordo com reivindicação 33, em que as células são seleccionadas do grupo consistindo de células bacterianas, células eucariotas inferiores e células eucariotas superiores.
  35. 35. Método da reivindicação 28, em que as moléculas de ácido nucleico estão imobilizadas na forma de ácido nucleico simples ou em complexos.
  36. 36. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior em que os membros de, pelo menos, um repertório são colocados em matriz utilizando meios robóticos.
  37. 37. Método para pesquisar um primeiro repertório de moléculas contra um segundo repertório de moléculas para identificar os membros do primeiro repertório que não interactuam com os membros do segundo repertório, compreendendo: 7 (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma segunda série de linhas continuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) identificar os membros do primeiro e segundo repertórios que não interactuam com outros.
  38. 38. Método para pesquisa de um primeiro repertório de moléculas contra um segundo repertório de moléculas para identificar membros do primeiro e segundo repertórios cujas interacções são dependentes da presença ou ausência de uma terceira molécula ou conjunto de moléculas, compreendendo: (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma segunda série de linhas continuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo que substancialmente todos 8 os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) detectar as interacções entre membros do primeiro repertório e os membros do segundo repertório na presença de diferentes concentrações da terceira molécula ou conjunto de moléculas.
  39. 39. Método de acordo com reivindicação 38, em que a terceira molécula ou conjunto de moléculas interactua com certos membros do primeiro repertório, possibilitando deste modo que os membros do primeiro repertório interactuem com certos membros do segundo repertório.
  40. 40. Método de acordo com reivindicação 38, em que as interacções entre os membros do primeiro e segundo repertório necessitam da ligação simultânea destes membros à terceira molécula ou conjunto de moléculas.
  41. 41. Método de acordo com reivindicação 38, em que as interacções entre os membros do primeiro e segundo repertório são estimuladas pela presença de uma terceira molécula ou conjunto de moléculas.
  42. 42. Método de acordo com reivindicação 38, em que as interacções entre os membros do primeiro e segundo repertório são bloqueadas pela presença de uma terceira molécula ou conjunto de moléculas. 9
  43. 43. Método de acordo com reivindicação 1, em que são necessários menos eventos de distribuição do que o número de interacções a serem testadas.
  44. 44. Método para pesquisa de dois ou mais repertórios de enzimas que compreende duas ou mais reacções enzimáticas para identificar os membros do primeiro repertório e os membros do segundo repertório que, em conjunto, produzem um determinado produto a partir de um determinado substrato, cujo método compreende: (a) dispor o primeiro repertório em, pelo menos, uma série de linhas continuas em que cada linha da referida primeira série compreende um membro do referido primeiro repertório, e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma série de segundas linhas continuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; e (b) detectar a formação de produto nas intersecções dos membros do primeiro e do segundo repertórios.
  45. 45. Método para pesquisa de diferentes populações celulares contra diferentes populações virais para identificar as populações virais que infectam as populações celulares, cujo método compreende: 10 (a) dispor as populações celulares e as populações virais para formar, pelo menos, uma matriz, em que as populações virais estão arranjadas em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas em que cada linha da referida população virai compreende um membro da referida população e dispondo a população celular em, pelo menos, uma segunda série de linhas continuas em que cada linha da referida segunda série compreende um membro da referida população celular, em que as populações virais e celulares formam, pelo menos, uma matriz, de modo que substancialmente todos os membros da população celular estão justapostos a substancialmente todos os membros da população virai; e (b) detectar as populações virais que infectam as populações celulares.
  46. 46. Método para pesquisar diferentes fracções celulares umas contra as outras, para identificar as fracções celulares que contêm componentes que interactuam com componentes em outras fracções celulares, cujo método compreende: (a) dispor as fracções celulares em, pelo menos, duas séries de linhas continuas em que cada linha da referida primeira e segunda série compreende um membro da referida fracção celular e de modo que substancialmente todas as diferentes fracções celulares estão justapostas uma à outra. (b) detectar as interacções nas intersecções das diferentes fracções celulares. 11
  47. 47. Método para pesquisa de um repertório de péptidos contra o mesmo repertório de péptidos, para identificar os membros do repertório de péptidos que interactuam com outros membros do repertório de péptidos, cujo método compreende: (a) dispor os membros do repertório de péptidos em, pelo menos, duas séries de linhas contínuas em que cada linha da referida primeira e segunda série compreende um membro do referido repertório de péptidos e de modo que substancialmente todos os diferentes membros do repertório de péptidos estão justapostos um ao outro (b) detectar as interacções nas intersecções dos diferentes membros do repertório de péptidos.
  48. 48. Método de acordo com as reivindicações 46 ou 47, cujo método utiliza o sistema de dois híbridos de leveduras para identificar os membros dos repertórios de moléculas que interactuam uma com a outra.
  49. 49. Método para produzir (e opcionalmente pesquisar) uma biblioteca de dois híbridos de levedura consistindo em substancialmente todos os membros de um primeiro repertório de polipéptidos a par com substancialmente todos os membros de um segundo repertório de polipéptidos, cujo método compreende: (a) dispor células de leveduras contendo uma pluralidade de sequências de nucleótidos para produzir, pelo menos, uma matriz, em que as sequências 12 de nucleótidos estão dispostas em, pelo menos, uma primeira série de linhas continuas, em que cada linha da referida primeira série compreende células de leveduras contendo a sequência de nucleótidos, e dispor o segundo repertório em, pelo menos, uma segunda série de linhas continuas em que cada linha da referida segunda série compreende células de leveduras contendo um membro do referido segundo repertório, em que o primeiro e segundo repertórios formam, pelo menos, uma matriz, de modo que substancialmente todos os membros do primeiro repertório estão justapostos a substancialmente todos os membros do segundo repertório; (b) permitir que as células de leveduras contendo os membros do primeiro repertório cruzem com as células de leveduras contendo os membros do segundo repertório em que os dois repertórios intersectam; e opcionalmente © expressar as sequências de nucleótidos para produzir os polipéptidos correspondentes do primeiro e segundo repertórios; e opcionalmente (d) detectar as interacções entre os polipéptidos membros do primeiro e segundo repertórios. Lisboa, 22 de Novembro de 2007 13
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