ES2289474T3

ES2289474T3 - Derivados lipofilos de acido ribonucleico bicatenario.

Info

Publication number: ES2289474T3
Application number: ES04704041T
Authority: ES
Inventors: Philipp Hadwiger; Matthias John; Christina Lorenz; Hans-Peter Vornlocher; Stefan Limmer
Original assignee: Alnylam Europe AG
Current assignee: Alnylam Europe AG
Priority date: 2003-01-21
Filing date: 2004-01-21
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2024-01-21
Also published as: ATE367441T1; DK1587926T3; WO2004065601A3; EP1852506A2; PT1587926E; EP1852506A3; DE10302421A1; WO2004065601A2; US20060178324A1; CA2513809C; EP1587926B1; AU2004206255A1; AU2008203538A1; EP1587926A2; AU2008203538B2; AU2004206255B2; DE602004007620T2; DE602004007620D1; CA2513809A1

Abstract

Un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN), comprenden una hebra de ARN complementario, una hebra de ARN codificante y solo un grupo lipófilo que tiene un logKow que excede en 1, en donde la hebra de ARN complementario tiene una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ARN objetivo, y en donde el ARN objetivo es un mARN transcrito de un gen objetivo o de un virus de ARN de hebra (+), en donde le grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5'' de la hebra de ARN complementario y el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5'' de la hebra de ARN complementario comprende un grupo fosfodiéster o en donde el grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5'' de la hebra de ARN codificante.

Description

Derivados lipófilos de ácido ribonucleico bicatenario.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) que tiene actividad de interferencia de ARN mejorada, y su uso es mediar la interferencia de ARN in vitro e in vivo.

Antecedentes de la invención

Muchas enfermedades (por ejemplo, cánceres, desordenes hematopoyéticos, desordenes endocrinos, y desordenes inmunes) surgen de la expresión o actividad anormal de un gen o grupo de genes particulares. De manera similar, la enfermedad puede resultar a través de la expresión de una forma mutante de proteína, así como también de la expresión de genes vitrales que han sido integrados en el genoma de su huésped. Los beneficios terapéuticos de ser capaz de silenciar selectivamente estos genes anormales o extraños es obvio.

Varios agentes terapéuticos capaces de inhibir la expresión de un gen objetivo se han desarrollado, más notablemente el ácido nucleico contrasentido (ver, por ejemplo, Skorski, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:4504-4508. Sin embargo, las aproximaciones contrasentido, que usan el ARN o ADN bicatenario actúan en una relación estequiométrica 1:1 y así tienen baja eficacia (Skorski, et al., supra). Por ejemplo, Jansen et al. reportó que dosis relativamente altas (1.7 mg/kg de peso de cuerpo por día, dan como resultado concentraciones de plasma de largo plazo por encima de 1 mg/l) de ARN contrasentido específico para el gene bcl2 se requirieron para lograr el efecto pretendido del compuesto contrasentido (es decir, 40% de reducción en la expresión del bcl2) (Jansen, B., et al., The Lancet (2000)356:1728-1733.

Los esfuerzos considerables de los investigadores se han enfocado en mecanismos para mejorar la eficiencia de la inhibición mediante oligonucleótidos contrasentido, los cuales se deben transportar a través de las membranas celulares o tomar por las células con el fin de alcanzar su objetivo y volverse biológicamente activos. Un método para incrementar el transporte de membrana o celular es mediante la anexión de un grupo lipófilo. Manoharan, M., Antisense Nucl. Acid Drug Dev. (2002) 12:103-128, y la Publ. Solicitud de Patente U.S. No. 20030064492 (Manoharan) describe la conjugación de los oligonucleótidos contrasentido a varios grupos funcionales, incluyendo esteroides y moléculas lipofílicas no aromáticas, para ayudar en la transferencia del agente contrasentido a través de la membrana celular. Ramirez, et al., J. Am. Chem. Soc. (1982) 104:5483, describe la introducción del grupo fosfolípido 5'-O-(1,2-di-O-miristoil-sn-glicero-3-fosforil) en el dímero TpT independientemente en la posición 3' y 5'. Shea, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18:3777, describe los oligonucleótidos que tienen un grupo 1,2-di-O-hexildecil-rac-glicerol ligados a un 5'-fosfato sobre el 5' terminal del oligonucleótido. Bijsterbosch, M.K., et al., Nucl. Acids Res. (2000) 28(14):2717-2725, describe la conjugación de oligodesoxinucleótidos contrasentido fosforotioato con colesterol para incrementar las interacciones con los receptores y las proteínas de plasma, mejorando de esta manera la captación celular de los oligonucleótidos contrasentido.

Las moléculas de ARN bicatenario relativamente de manera reciente (dsARN) han mostrado bloquear la expresión del gen en un mecanismo regulatorio altamente conservado conocido como interferencia de ARN (ARNi). En resumen, la enzima Dicer de ARNasa III procesa el dsARN en los ARN de interferencia pequeños (siARN) de aproximadamente 22 nucleótidos, cuya hebra (la "cadena guía") sirve entonces como una secuencia guía para inducir la división del ARN mensajero (mARN) mediante un complejo silenciante inducido por ARN (RISC) de los mARN que comprenden una secuencia de nucleótido que es complementaria a la secuencia de la hebra guía (Hammond, S.M., et al., Nature (2000) 404:293:296). En otras palabras, el ARNi involucra una reacción de tipo catalítica por medio de la cual los nuevos siARN se generan a través de división sucesiva de los dsARN largos. Así, a diferencia del contrasentido, los ARNi degradan el ARN objetivo de una manera no estequiométrica. Cuando se administran a células u organismos, los dsARN exógenos diseñados para comprender una secuencia sobre una de sus hebras (la "hebra no codificante") que es complementaria a la secuencia en una molécula de mARN objetivo endógeno ha mostrado dirigir la degradación específica de secuencia del mARN objetivo a través del ARNi. Por ejemplo, Kreutzer, R., Limmer, S., Publicación Internacional PCT No. WO 00/44895 describe el dsARN que son agentes efectivos para inducir el ARNi, así como también métodos para introducir el dsARN en una célula para inhibir la expresión de un gen objetivo.

Se ha observado que bloquear el grupo hidroxilo localizado en el 5' terminal de la hebra de complementariedad en un siARN en una manera que precluya su fosforilación por las quinazas del ácido nucleico suprime la capacidad del siARN de interferir con la expresión de su gen objetivo en lisados de embriones de Drosofila (Nykänen et al., Cell (2001) 107:309-321). Schwarz, D.S., et al. (Mol. Cell (2002) 10:537-548) emplea un siARN modificado en el extremo para confirmar la conservación del mecanismo de ARNi entre moscas y mamíferos. Después de bloquear el 5'-OH de la hebra de complementariedad mediante metilación, la quinaza endógena que usualmente fosforila la 5'-OH del dsARN, no fue capaz de agregar un 5'-fosfato al siARN y consecuentemente la actividad ARNi fue totalmente abolida, tanto en extractos de Drosófila así como también en células HeLa humanas cultivadas. Sin embargo, un 5'-fosfodiéster sobre la hebra codificante, es decir, 6-aminohexil fosfodiéster, hizo el dúplex resultante activo en un mARN objetivo silenciante, aunque la actividad se redujo comparada con la del dúplex que lleva el 5'-OH.

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Chiu, Y.L., y Rana, T.M., (Mol. Cell (2002) 10:549-561) investigó la contribución de los terminales 3' y 5' en la actividad de dsARN al emplear el dsARN con un sentido modificado de extremo o hebras anticodificante en experimentos de contrasfección de reportero en células HeLa. Mientras que el terminal 5' de ambas hebras se conjugó a un aminopropil fosfodiéster, la Puromicina, y la Biotina se unieron a ambos extremos 3' del dsARN. La modificación de los extremos 3' fue bien tolerada, sin importar si en sentido o el contrasentido se alteraron. Esta gráfica cambió por la modificación 5', donde la entidad modificadora fue tolerada exclusivamente sobre la hebra codificante. En contradicción a los resultados de Schwarz, D.S., et al. (Mol. Cell (2002) 10:537-548), esta modificación de fosfodiéster 5' de la hebra codificante abolió la actividad de ARNi. Czauderna, F., et al. (Nucleic Acids Research (2003) 31:2705-2716) encontró de manera similar la actividad inhibitoria de la expresión del gen reducida en el dsARN modificado en extremo 5' de la hebra de complementariedad.

De la WO 02/055693 se conoce un dsARN que exhibe una estructura de doble hebra hecha de un máximo de 49 pares de nucleótidos sucesivos, y en donde una hebra o por lo menos un segmento de aquella una hebra de la estructura de doble hebra es complementaria al gen objetivo.

De Tuschl, T. y Borkhardt, A., Molecular Interventions, Vol. 2,2002, páginas 158-167 se conoce un dsARN con residuos lipófilos adheridos. Los residuos lipófilos están unidos al terminal 3' del dúplex siARN.

A pesar de los esfuerzos de incrementar la eficiencia de la tecnología contrasentido, particularmente al mejorar la captación de los oligonucleótidos contrasentido por las células, no existe normalmente medios conocidos para mejorar la eficiencia de la interferencia del ARN por medio del dsARN. Así, subsiste la necesidad de una molécula dsARN más efectiva que pueda silenciar selectiva y eficientemente un gen objetivo. Más específicamente, una molécula de dsARN que tenga una alta actividad biológica y pueda ser fácilmente sintetizada sería altamente deseable. Las composiciones que comprenden tales agentes serían útiles para tratar enfermedades causadas por la expresión anormal o la actividad de un gen.

Resumen de la invención

La presente invención describe un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) que tiene una actividad de interferencia de ARN mejorada, métodos para elaborar el dsARN, así como también composiciones y métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula utilizando el dsARN. La presente invención también describe composiciones para tratar enfermedades causadas por la expresión o actividad del gen objetivo. El dsARN de la invención comprende una hebra de ARN (hebra de ARN complementario) que tiene una región la cual es complementaria a un trascripto de ARN de por lo menos una parte del gen objetivo, y un grupo lipófilo covalentemente ligado.

La invención se relaciona con un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) que tiene actividad biológica mejorada. El dsARN comprende una hebra de ARN complementario que tiene una secuencia de nucleótido que es complementaria para al menos una parte de un gen objetivo y un grupo lipófilo covalentemente ligado. El grupo lipófilo puede ser una porción aromática, alifática o alicíclica, o cualquier combinación de éstos. El grupo lipófilo puede ser un esteroide, tal como un esterol (por ejemplo, colesterol), o un hidrocarburo alifático, tal como un hidrocarburo alifático ramificado, o una combinación de éstos. En una modalidad particular, el grupo lipófilo es colesteril (6-hidroxihexil) carbamato o bisdecilamida de ácido 12-hidroxidodecanóico. El dsARN comprende además una segunda hebra de ARN (codificante). El grupo lipófilo está covalentemente ligado al terminal 5' de la hebra de ARN complementario en donde el enlace covalente comprende una unión fosfodiéster. En otra modalidad, el grupo lipófilo está ligado al terminal 5' de la hebra codificante, y el enlace covalente puede comprender una unión fosfodiéster. La hebra de ARN complementario o la hebra de ARN codificante pueden comprender una saliente de nucleótido de 1 a 4, preferiblemente 1 o 2, nucleótidos de longitud. La saliente de nucleótido puede estar sobre el terminal 3' de la hebra de ARN complementario, y el extremo 5' de la hebra de ARN puede ser truncado. La hebra de ARN complementario está entre 16 y 30 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 16 y 25 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente entre 20 y 25 nucleótidos de longitud. La segunda hebra de ARN (con sentido) puede tener el mismo número (o inferior) de nucleótidos que la hebra ARN de complementariedad. El coeficiente de partición de octanol-agua, logK_{OW}, del grupo lipófilo es mayor de 1, preferiblemente mayor de 1.5, 2, 3, 4 o 5.

La presente invención comprende una molécula de ARN bicatenario que comprende una hebra de ARN complementario y un grupo lipófilo que tiene un logK_{OW} que excede 1, en donde la hebra de ARN complementario tiene una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ARN objetivo y donde el ARN objetivo es un trascripto de mARN de una porción de un gen objetivo o una porción de un virus con ARN de hebra (+), en donde el grupo lipófilo está covalentemente ligado al extremo 5' de la hebra codificante. En una modalidad, el grupo lipófilo está covalentemente ligado a un extremo 5' de la hebra codificante por un enlace covalente que no comprende un grupo fosfodiéster.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula. El método comprende introducir un dsARN, como se describió anteriormente, en la célula, y mantener la célula durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de un trascripto de mARN del gen objetivo. La célula puede ser un hepatocito, una célula pancreática, una célula uterina, o una célula del cerviz o de la vejiga. La célula del hígado puede ser una célula endotelial, una célula Kupffer o una célula parenquimal. El gen objetivo puede ser un gen viral, por ejemplo un virus con ARN de hebra (+) tal como el Virus de la Hepatitis C (HCV). En una modalidad particular, el gen objetivo es por lo menos una porción de una región no traducida 3' (3'-UTR) de un virus con ARN de hebra (+), tal como un 3'-UTR del HCV.

En aún otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen objetivo en un organismo. Las composiciones comprenden un dsARN, como se describió anteriormente, y un portador farmacéuticamente aceptable. El organismo celular puede ser un mamífero, tal como un humano. La unidad de dosis del dsARN puede ser de menos de 5 miligramos (mg) del dsARN por kg de peso de cuerpo del mamífero, en un rango de 0.01 a 2.5 miligramos (mg), 0.1 a 200 microgramos (\mug), 0.1 a 100 \mug por peso de kilogramo de cuerpo del mamífero, o menos de 25 \mug por peso de kilogramo de cuerpo del mamífero. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa, tal como solución salina amortiguada de fosfato, o ésta puede comprender una estructura micelar, tal como un liposoma, cápsido, capsoide, nanocápsula polimérica, o microcápsula polimérica.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en los dibujos que la acompañan y la descripción de adelante. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán evidentes de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama de un esquema sintético para el derivado de colesterol "Chol".

La Fig. 2 es un diagrama de un esquema sintético para el derivado di-n-decilamina "C32".

La Fig. 3 muestra la actividad de \beta-galactosidasa relativa en las células \beta-Gal+HuH-7 luego de la transfección con dsARN.

La Fig. 4 muestra la actividad de \beta-galactosidasa relativa en las células \beta-Gal+HuH-7 luego de la transfección con dsARN sin el uso de una ayuda de transfección, y un análisis Northern blot del dsARN aislado de las células después de la transfección.

La Fig. 5 muestra un análisis Northern blot del dsARN aislado de las células del (a) páncreas, (b) útero, y (c) vejiga luego de la transfección sin el uso de la ayuda de transfección.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) que tiene actividad biológica mejorada, métodos para elaborar el dsARN, así como también composiciones y métodos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula utilizando el dsARN. La presente invención también describe composiciones para tratar enfermedades en organismos causadas por la expresión de un gen objetivo que utiliza un dsARN. El dsARN dirige la degradación específica de la secuencia del mARN a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (ARNi). El proceso ocurre en una amplia variedad de organismos, que incluyen mamíferos y otros vertebrados. El dsARN de la invención comprende una hebra de ARN (hebra de ARN complementario) que tiene una región que es complementaria a un trascripto de ARN de por lo menos una porción de un gen objetivo, y un grupo lipófilo pendiente que tiene un logK_{OW} que excede 1 covalentemente unido al extremo 5' de la hebra de ARN complementario o de la hebra de ARN codificante. El grupo lipófilo puede ser una porción aromática, una alifática o una alicíclica, o cualquier combinación de éstas. Por ejemplo, el grupo lipófilo puede ser un esterol, tal como colesterol o un hidrocarburo alifático, tal como un hidrocarburo alifático ramificado, (por ejemplo, colesteril 6-hidroxihexil) carbamato o bisdecilamida de ácido 12-hidroxidodecanóico). Utilizando un ensayo basado en célula, los presentes inventores han demostrado que estos dsARN lipófilos conjugados pueden mediar específica y eficientemente las ARNi, sin importar el mecanismo de captación celular, dando como resultado la inhibición significativa de la expresión del gen objetivo. La presente invención comprende estos dsARN y composiciones que comprenden el dsARN y su uso para inactivar específicamente la función del gen. El uso de estos dsARN posibilita la degradación del objetivo de los mARN de los genes que están implicados en una amplia variedad de procesos de enfermedad, que incluyen aquellos implicados en las infecciones virales de hebra de ARN (+), tal como la Hepatitis C. Así, los métodos y composiciones de la presente invención que comprenden estos dsARN son útiles para tratar las enfermedades y afecciones causadas por la expresión o actividad de un gen particular, tal como el HCV y enfermedades asociadas al HCV.

La siguiente descripción detallada describe como hacer y utilizar el dsARN y las composiciones que contienen dsARN para inhibir la expresión de un gen objetivo, así como también composiciones para tratar enfermedades y afecciones originadas por la expresión del gen. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un dsARN que tiene una secuencia de nucleótido complementaria de entre 16 y 30 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 16 y 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente entre 20 y 25 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente entre 21 y 24 nucleótidos de longitud, y que es sustancialmente idéntica a por lo menos una parte del gen objetivo (por ejemplo, un 3'-UTR de un virus con ARN de hebra (+)), junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con esto, ciertos aspectos de la presente invención se relacionan con composiciones farmacéuticas que comprenden el dsARN de la presente invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

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1. Definiciones

Por conveniencia, el significado de ciertos términos y frases utilizados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones finales, se suministran adelante.

Como se utiliza aquí, "gen objetivo" se refiere a una sección de una hebra de ADN de un ADN bicatenario que es complementaria a una sección de una hebra de ADN, que incluye todas las regiones transcritas, que sirve como una matriz para la trascripción, así como también a una sección de una hebra de ARN de un virus con ARN de hebra (+). Un gen objetivo, usualmente la hebra codificante, es un gen cuya expresión va a ser selectivamente inhibida o silenciada a través de la interferencia del ARN. El término "gen objetivo" comprende específicamente cualquier gen celular o fragmento de gen cuya expresión o actividad está asociada con una enfermedad o afección (por ejemplo, un oncogen), así como también cualquier gen extraño o exógeno o fragmento de gen cuya expresión o actividad está asociada con una enfermedad, tal como un gen proveniente de un organismo patógeno (por ejemplo, un gen viral o pro-viral, viroide, o plasmodio). El gen objetivo puede ser un gen viral, por ejemplo un virus con ARN de hebra (+) tal como el Virus de la Hepatitis C (HCV). En una modalidad particular, el gen objetivo es por lo menos una porción de una región no traducida 3' (3'-UTR) de un virus con ARN de hebra (+), tal como un 3'-UTR del HCV.

Ejemplos de genes que pueden ser destino para tratamiento incluyen, sin limitación, un oncogen (Hanahan, D. y R.A. Weinberg, Cell (2000) 100:57; y Yokota, J., Carcinogenesis (2000) 21(3):497-503); un gen de citoquina (Rubinstein, M., et al., Cytokine Growth Factor Rev. (1988) 9(2):175-81); un gen de proteína de idiotipo (ld) (Benezra, R., et al., Oncogene (2001) 20(58):8334-41; Norton, J.D., J. Cell Sci. (2000) 113(22):3897-905); un gen prion (Prusiner, S.B., et al., Cell (1998) 93(3):337-48; Safar, J. y S.B. Prusiner, Prog. Brain Res. (1998) 117:421-34); un gen que expresa moléculas que inducen angiogénesis (Gould, V.E. y B.M. Wagner, Hum. Pathol. (2002) 33(11):1061-3); moléculas de adhesión (Chothia, C. y E.Y. Jones, Annu. Rev. Biochem. (1997)66:823-62; Parise, L.V. et al., Semin. Cancer Biol. (2000) 10(6):407-14); receptores de superficie celular (Deller, M.C., y Y.E. Jones, Curr. Opin. Struct. Biol (2000) 10(2):213-9); genes de proteínas que están involucrados en metástasis y/o procesos invasivos (Boyd. D., Cancer Metastasis Rev. (1996) 15(1):77-89; Yokota, J., Carcinogenesis (2000) 21(3):497-503; genes de proteasas así como también de moléculas que regulan la apoptosis y el ciclo celular (Matrisian, L.M., Curr. Biol. (1999) 9(20):R776-8; Krepela, E., Neoplasma (2001) 48(5):332-49; Basbaum y Werb, Curr. Opin. Cell Biol. (1996) 8:731-738; Brikedal-Hansen, et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med. (1993) 4:197-250; Mignatti y Rifkin, Physiol, Rev. (1993) 73:161-195; Stetler-Stevenson, et al., Annu. Rev. Cell Biol. (1993) 9:541-573; Brinkerhoff, E., y L.M. Matrisan, Nature Reviews (2002) 3:207-214; Strasser, A., et al., Annu. Rev.Biochem. (2000) 69:217-45; Chao, D.T. y S.J. Korsmeyer, Annu. Rev. Immunol. (1998) 16:395-419; Mullauer, L., et al., Mutat. Res. (2001) 488(3):211-31; Fotedar, R., et al., Prog. Cell Cycle Res. (1996) 2:147-63; Reed, J.C., Am. J. Pathol. (2000) 157(5):1415-30; D'Ari, R., Bioassays (2001) 23(7):563-5); genes que expresan el receptor EGF; Mendelsohn, J. y J. Baselga, Oncogene (2000) 19(56):6550-65; Normanno, N., et al., Front. Biosci. (2001) 6:D685-707); y gen de resistencia a multidroga 1, gen MDR1 (Childs, S., y V. Ling. Imp. Adv. Oncol. (1994) 21-36).

En una modalidad preferida, el gen objetivo es un gen que se expresa en hepatocitos, células pancreáticas, y células de los sistemas reproductor o urinario (por ejemplo, el útero, la cérvix, o la vejiga). El hepatocito puede ser una célula endotelial, una célula Kupffer o una célula parenquimal. Los dsARN de la presente invención son particularmente activos en células de los sistemas reproductor y urinario, tal como aquellas listadas anteriormente, y así son particularmente útiles para tratar enfermedades infecciosas de estos órganos, tales como el virus de la Hepatitis C y los virus similares a HCV que apuntan a estas células.

Como se utiliza aquí, los términos "región no traducida 3' " y "3'-UTR" se refieren a la región no codificada, conservada en el extremo 3' del genoma viral. El 3'-UTR puede ser la región no codificante completa o un fragmento de ésta. Como se utiliza aquí, el término "región altamente conservada" se refiere a una región del genoma viral que permanece evolucionadamente constante, es decir, una región genómica que tiene una tasa de mutación muy baja y comparte así identidad de secuencia significativa (>99%) entre distintos genotipos virales.

El término "hebra de ARN complementario" (también denominada aquí como la "hebra codificante" se refiere a la hebra de un dsARN que es complementaria a un trascripto de mARN que se forma durante la expresión del gen objetivo, o sus productos de procesamiento, o una región (tal como el 3'-UTS) de un virus con ARN de hebra (+). Como se utiliza aquí, el término "secuencia de nucleótido complementaria" se refiere a la región sobre la hebra de ARN complementario que es complementaria a una región de un trascripto de mARN del gen objetivo o una región de un virus con ARN de hebra (+) (por ejemplo, 3'-UTR). El "dsARN" se refiere a una molécula de ácido ribonucleico que tiene una estructura dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico complementarias y anti-paralelas. No todos los nucleótidos del dsARN deben exhibir los pares de base Watson-Crick; las dos hebras de ARN pueden ser sustancialmente complementarias (es decir, no tener más de uno o dos nucleótidos coincidentes). El máximo número de pares base es el número de nucleótidos en la hebra más corta del dsARN donde el dsARN forma una estructura dúplex. Las hebras de ARN pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. La hebra de ARN complementario tiene entre 16 y 30, preferiblemente entre 16 y 25, más preferiblemente entre 20 y 25 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente entre 21 y 24 nucleótidos de longitud.

"Introducir en" significa la captación o la absorción en las células, como se entiende por aquellos expertos en la técnica. La absorción o captación del dsARN puede ocurrir a través de los procesos celulares, o mediante agentes o dispositivos auxiliares, tales como los vectores viral y sintético. Por ejemplo, para un suministro in vivo, el dsARN se puede inyectar a un sitio del tejido o administrar sistémicamente. El suministro in vitro incluye métodos conocidos en la técnica tal como la electroporación y la lipofección.

Como se utiliza aquí, una "saliente de nucleótido" se refiere a un nucleótido no pareado o nucleótidos que sobresalen de la estructura dúplex cuando el extremo 3' de una hebra de ARN se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra no codificante, o viceversa. "Truncado" o "extremo truncado" significa que las longitudes de las dos hebras de ARN son la misma en ese extremo del dsARN, y de esta manera no existe saliente de nucleótido(s) (es decir, no existe una saliente de nucleótido).

Como se utiliza aquí y como se conoce en la técnica, el término "identidad" es la relación entre dos o más secuencias de polinucleótido, como se determino al comparar las secuencias. La identidad también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polinucleótido, según se determinó por la coincidencia entre cuerdas de tales secuencias. La identidad puede ser fácilmente calculada (ver, por ejemplo, Computation Molecular Biology, Lesk, A.M., eds., Oxford University Press, New York (1998), y Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993), ambas incorporada aquí como referencia). Aunque existe un número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótido, el término es bien conocido por los expertos (ver, por ejemplo, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer, Gribskov., M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad entre las secuencias incluyen, por ejemplo, aquellas descritas en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48:1073. "Sustancialmente idénticas", como se utiliza aquí, significa que existe un muy alto grado de homología (preferiblemente 100% de identidad de secuencia) entre la hebra codificante del dsARN y la parte correspondiente del objetivo 3'-UTR del genoma viral. Sin embargo, el dsARN que tiene más del 90%, o 95% de identidad de secuencia se puede utilizar en la presente invención, y así las variaciones de la secuencia que podrían ser esperadas debido a la mutación genética, el polimorfismo de la seta, o la divergencia evolucionaria se pueden tolerar. Aunque se prefiere el 100% de la identidad, el dsARN puede contener faltas de coincidencia aleatoria en los pares base simples o múltiples entre el ARN y el 3'-UTR objetivo.

Como se utiliza aquí, el término "porción" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es un fragmento de un gen objetivo, y que incluye por lo menos parte de una secuencia exon del gen objetivo. Preferiblemente una "porción" es de aproximadamente 30 residuos consecutivos del gen objetivo de longitud, e incluye 5, 10, 15, 20, 25, y hasta 30 residuos consecutivos o más del gen objetivo.

Como se utiliza aquí, el término "que comprende" o "que involucra" "un enlace fosfodiéster" o un "grupo fosfodiéster" se refiere a una entidad química que comprende un grupo de fórmula estructural general I.

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Allí, el R_{1}O representa el extremo 5' del dsARN, y R_{2} a un grupo lipófilo. Sin embargo, los átomos de oxígeno en I se pueden reemplazar por cualquier otro elemento adecuado, por ejemplo, para incrementar la estabilidad de la construcción total.

Como se utiliza aquí, el término "tratamiento" se refiere a la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración a un agente terapéutico a un tejido aislado o a un línea celular de un paciente, que tiene una afección, por ejemplo, una enfermedad o condición, un síntoma de enfermedad, o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mejorar, alterar, remediar, mejorar, ayudar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad, o la predisposición hacia la enfermedad.

Como se utiliza aquí, una "composición farmacéutica" comprende una cantidad farmacológicamente efectiva de un dsARN y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aquí, "cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" o simplemente "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de ARN efectiva para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo pretendido. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado es considerado efectivo cuando existe por lo menos un 25% de reducción en un parámetro medible asociado con una enfermedad o afección, la cantidad terapéuticamente efectiva de una droga para el tratamiento de esa enfermedad o afección es la cantidad necesaria para afectar por lo menos un 25% de la reducción en ese parámetro.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o diluyente para la administración de un agente terapéutico. Los portadores farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, ed. 1985). Tales portadores incluyen, pero no están limitados a, solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de éstos. El término excluye específicamente el medio de cultivo celular. Para las drogas administradas oralmente, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes desintegrantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes endulzantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y preservativos. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, aunque el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes desintegrantes adecuados. Los agentes de unión pueden incluir almidón y gelatina, aunque el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, las tabletas pueden estar recubiertas con un material tal como gliceril monoestearato o gliceril diestearato, para retrasar la absorción en el tracto intestinal.

Como se utiliza aquí, una "célula transformada" es una célula en la cual una molécula de dsARN se ha introducido por medio de técnicas de ADN recombinante.

Como se utiliza aquí, el término "lipófilo" o "grupo lipófilo" se refiere ampliamente a cualquier compuesto o porción química que tenga una afinidad por los lípidos. La lipofilicidad es a menudo expresada en términos de un coeficiente de partición de octanol-agua, logK_{OW}, donde K_{OW} es la proporción de la proporción de la concentración de químico en la fase de octanol a su concentración en la fase acuosa de un sistema bifásico en equilibrio. El coeficiente de partición de octanol-agua es una propiedad medida en laboratorio de una sustancia. Sin embargo, también se puede predecir al utilizar coeficientes atribuidos a los componentes estructurales de un químico que es calculado utilizando métodos de primer principio o empíricos (ver, por ejemplo, Tetko, I.V., et al., J Chem Inf Comp. Sci. (2001) 41:1407-21. Éste suministra una medición termodinámica de la tendencia de la sustancia a preferir un no acuoso o un medio aceitoso en lugar de agua (es decir, su balance hidrofílico/lipófilo). En principio, una sustancia química es lipofílica de carácter cuando su logK_{OW} excede 0. Sin embargo, para los propósitos de la presente invención, para un grupo lipófilo R_{2}, como se definió anteriormente, el compuesto padre R_{2}-OH poseerá un logK_{OW} de más de 1, preferiblemente más de 1.5, más preferiblemente más de 2, aún más preferiblemente más de 3 o 4, y más preferiblemente más de 5; aquí, donde éste se refiere al logK_{OW} de un grupo lipófilo, se debe entender que significa el logK_{OW} del compuesto padre R_{2}-OH. El logK_{OW} predicho del 6-amino hexanol, el sustituyente del extremo 5' utilizado en las investigaciones de Schwarz, D.S. et al. (Mol. Cell (2002) 10:537-548) se predice como aproximadamente 0.7. Otras investigaciones utilizaron sustituyentes con logK_{OW} considerablemente más bajo. Utilizando el mismo método, el logK_{OW} de colesteril N-(hexan-6-ol) carbamato se predice como 10.7.

Para evitar la duda, en la determinación del logK_{OW} para un grupo lipófilo dado a continuación, los valores determinados experimentalmente deben prevalecer sobre los valores obtenidos de los algoritmos de predicción. Cuando una determinación experimental es por alguna razón no factible, el método de predicción de Tetko, LV., et al. (J Chem Inf Comput Sci. (2001) 41:1407-21) se debe emplear.

II. Ácido ribonucleico bicatenario (dsARN)

En una modalidad, la invención se relaciona con un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) que tiene una secuencia de nucleótido que es sustancialmente idéntica a por lo menos una porción de un gen objetivo, tal como 3'-UTR de un virus con ARN de hebra (+). El dsARN comprende dos hebras de ARN que son suficientemente complementarias para hibridizarse para formar la estructura dúplex. Una hebra del dsARN comprende la secuencia de nucleótido que es sustancialmente idéntica a una porción del gen objetivo (la hebra "con sentido"), y la otra hebra (la hebra "complementaria" o "contrasentido") comprende una secuencia que es complementaria al gen objetivo. El dsARN de la presente invención comprende además un grupo lipófilo. Los grupos lipófilos comprenden compuestos de muchos tipos diferentes, incluyendo aquellos que tienen características aromáticas, alifáticas o alicíclicas, y combinaciones de éstas. En una modalidad, la invención suministra una molécula de ARN de hebra doble que comprende una hebra de ARN complementario y un grupo lipófilo, en donde la hebra de ARN complementario tiene una secuencia de nucleótido que es complementara a un ARN objetivo y donde el ARN objetivo es un trascripto de mARN de una porción de un gen objetivo o una porción de un virus con ARN de hebra (+), en donde el grupo lipófilo está covalentemente ligado al extremo 5' de la hebra codificante. En una modalidad, el grupo lipófilo está covalentemente ligado al extremo 5' de la hebra codificante mediante un enlace covalente que no comprende un grupo fosfodiéster.

En modalidades específicas, el grupo lipófilo es una sustancia alifática, alicíclica, o polialicíclica, tal como un esteroide (por ejemplo, esterol) o un hidrocarburo alifático ramificado. El grupo lipófilo comprende generalmente una cadena de hidrocarburo, que puede ser cíclica o acíclica. La cadena de hidrocarburo puede comprender varios sustituyentes y/o por lo menos un heteroátomo, tal como un átomo de oxígeno. Tales porciones alifáticas lipofílicas incluyen, sin limitación, ácidos grasos saturados o insaturados, ceras (por ejemplo, ésteres de alcohol monohídrico de ácidos grasos y diamidas grasas), terpenos (por ejemplo, los terpenos C_{10}, sesquiterpenos C_{15}, diterpenos C_{20}, triterpenos C_{30}, y tetraterpenos), y otros hidrocarburos polialicíclicos. El grupo lipófilo se puede unir mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo por vía de la agrupación funcional presente en o introducida en el dsARN, tal como un grupo hidroxi (por ejemplo, -CO-CH_{2}-OH). La conjugación del dsARN y el grupo lipófilo puede ocurrir, por ejemplo, a través de la formación de un éter o un enlace éster carboxílico o de carbamoilo entre el hidroxi y un grupo alquilo R-, un grupo alcanoilo RCO o un grupo carbamoilo sustituido RNHCO-. El grupo alquilo R puede ser cíclico (por ejemplo, ciclohexil) o acíclico (por ejemplo, de cadena recta o ramificada; y saturado o insaturado). El grupo alquilo R puede ser un grupo butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo u octadecilo, o similares. Preferiblemente, el grupo lipófilo está conjugado al grupo hidroxilo 5' del nucleótido terminal. En una modalidad preferida, el grupo lipófilo es bisdecilamida de ácido 12-hidroxidodecanóico.

En otra modalidad, el grupo lipófilo es un esteroide, tal como esterol. Los esteroides son compuestos policíclicos que contienen un sistema de anillo perhidro-1,2-ciclopentanofenantreno. Los esteroides incluyen, sin limitación, ácidos biliares (por ejemplo, ácido cólico, ácido desoxicólico y ácido deshidrocólico), la cortisona, digoxigenina, testosterona, colesterol y esteroides catiónicos, tal como cortisona. Un "derivado de colesterol" se refiere a un compuesto derivado de colesterol, por ejemplo mediante la sustitución, adición o remoción de los sustituyentes. El esteroide se puede unir al dsARN por cualquier método conocido en el arte, por ejemplo, como se describió en la Sección III de adelante. En una modalidad preferida, el grupo lipófilo es colesteril (6-hidroxihexil)carbamato.

En otra modalidad, el grupo lipófilo es una porción aromática. En este contexto, el término "aromático" se refiere ampliamente a hidrocarburos mono y poliaromáticos. Los grupos aromáticos incluyen, sin limitación, porciones arilo C_{6}-C_{14} que comprenden uno a tres anillos aromáticos, que pueden ser opcionalmente sustituidos; los grupos "aralquilo" o "arilalquilo" comprenden un grupo arilo covalentemente ligado a un grupo alquilo, o del cual pueden ser independientemente opcionalmente sustituidos o no sustituidos; y los grupos "heteroarilo". Como se utiliza aquí, el término "heteroarilo" se refiere a grupos que tienen 5 a 14 átomos por anillo, preferiblemente 5, 6, 9, o 10 átomos por anillo; que tienen 6, 10 o 14 electrones - \pi compartidos en un arreglo cíclico; y que tienen, además, de los átomos de carbono, entre uno y aproximadamente tres heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno (N), oxígeno (O), y azufre (S).

Como se emplea aquí, un grupo "sustituido" alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterocíclico es aquel que tiene entre uno y aproximadamente cuatro, preferiblemente entre uno y aproximadamente tres, más preferiblemente uno o dos, sustituyentes sin hidrógeno. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, grupos halo, hidroxi, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, amino, acilamino, alquilcarbamoilo, arilcarbamoilo, aminoalquilo, alcoxicarbonilo, carboxi, hidroxialquilo, alcanosulfonilo, arenosulfonilo, alcanosulfonamido, arenosulfonamido, aralquilsulfonamido, alquilcarbonilo, aciloxi, ciano, y ureido.

La hebra de ARN complementario es de menos de 30 nucleótidos, preferiblemente entre 16 y 30 nucleótidos, más preferiblemente entre 16 y 25 nucleótidos, y más preferiblemente entre 20 y 25 nucleótidos de longitud. El dsARN se puede sintetizar por métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como están comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En una modalidad particular, la hebra de ARN contrasentido (complementaria) comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO:1, y la hebra de ARN codificante comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO:2.

En una modalidad, por lo menos un extremo del dsARN es trunco. El dsARN con al menos un extremo trunco muestra estabilidad mejorada comparado con el dsARN que tiene dos nucleótidos salientes. El dsARN con por lo menos un extremo trunco muestra mayor estabilidad in vivo (es decir, es más resistente a la degradación en la sangre, plasma, y células). Sin embargo, los dsARN que tienen por lo menos un nucleótido saliente tienen superiores propiedades inhibitorias que sus contrapartes con extremos truncos. La presencia de solamente un nucleótido saliente fortalece la actividad de interferencia del dsARN, sin afectar su estabilidad total. El dsARN que tiene solamente una saliente ha probado ser particularmente efectivo in vivo (así como también en una variedad de células, y medios de cultivo de células), y son más estables que el dsARN que tiene dos extremos trucos. El nucleótido de hebra simple saliente puede ser 1 a 4, preferiblemente 1 o 2, nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la saliente de hebra simple está localizada en el extremo 3' de la hebra de ARN complementario (contrasentido). Tales dsARN han mejorado la estabilidad y la actividad inhibitoria, permitiendo así la administración a dosis bajas, es decir, menos de 5 mg/kg de peso de cuerpo del receptor por día. Preferiblemente, la hebra no codificante del dsARN tiene un nucleótido saliente en el extremo 3', y en el extremo 5' es trunca.

En otra modalidad, el grupo lipófilo está covalentemente ligado al extremo 5' de la hebra de ARN complementario o la segunda hebra de ARN (con sentido). El dsARN que tiene un grupo lipófilo covalentemente ligado en el extremo 5' de una hebra de ARN puede ser sintetizado fácilmente, por ejemplo, mediante síntesis de fase sólida, como se describe en cualquier parte aquí. El dsARN tiene solamente un grupo lipófilo colgante, que está covalentemente ligado al extremo 5' de la segunda hebra de ARN (con sentido). En una modalidad, el enlace covalente comprende una unión fosfodiéster. En otra modalidad, el grupo lipófilo está ligado al terminal 5' de la hebra codificante, y el enlace covalente no comprende una unión fosfodiéster. En aún otra modalidad, el grupo lipófilo está covalentemente unido al extremo 5' de la hebra no codificante, y el enlace comprende un grupo fosfodiéster.

El dsARN con un grupo lipófilo covalentemente ligado muestra actividad de interferencia de ARN mejorada comparada con el dsARN correspondiente (no modificado) sin un grupo lipófilo adherido. Más aún, los presentes inventores han descubierto que el dsARN que comprende un grupo lipófilo covalentemente ligado puede ser tomado por células con o sin la ayuda de transfección, tal como el reactivo de transfección vendido bajo la marca FuGENE 6^{TM} (Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, D-68305, Mannheim, Alemania), y que estos adARN derivados muestran una actividad sorprendentemente mejorada sin importar el mecanismo de entrada a la célula. Así, a diferencia del ARN contrasentido similarmente conjugado, la actividad inhibitoria mejorada del dsARN de la presente invención es independiente de la asociación celular o del receptor de unión, y así no es una consecuencia de las membranas celulares a través del transporte mejorado.

Se cree habitualmente por la persona experta que el dsARN con modificaciones 5' en la hebra codificante es incapaz de originar una interferencia del ARN (Nykänen et al., Cell (2001) 107:309-321, Schwarz, D.S., et al., Mol. Cell (2002) 10:537-548, Chiu, Y.L., y Rana T.M. Mol. Cell (2002) 10:549-561, Czauderna, F., et al., Nucleic Acids Research (2003) 31:2705-2716. Es el merito de los inventores de la presente invención probar que las modificaciones 5' donde el grupo modificante está ligado al extremo 5' de la hebra codificante por vía del grupo fosfodiéster pueden funcionar muy bien como agentes de interferencia de ARN. Por el contrario, donde el grupo modificante este ligado al extremo 5' de la hebra codificante por vía de un enlace diferente, la interferencia del ARN de hecho es abolida. Sin embargo, este efecto se puede utilizar para evitar efectos colaterales que se originan de la hebra codificante del dsARN diseñada para inhibir un gen que actúa como una hebra codificante para otro gen que es fortuitamente complementario. Donde la hebra codificante está ligada a 5' a un grupo modificante por un enlace no comprende un grupo fosfodiéster, el dsARN puede ya no más como inhibidor de la expresión de genes complementarios o parcialmente complementarios a su hebra codificante.

Un enlace que no comprende un grupo fosfodiéster puede ser cualquier enlace que no comprende un grupo fosfodiéster. Por ejemplo, sin limitación, un grupo no fosfodiéster que comprende enlace se puede efectuar por vía de un grupo éster de un ácido carboxílico, un grupo amida, un grupo éter, un grupo tioéter, un grupo amino, una cadena alifática lineal, una cadena alifática ramificada, una cadena de poliéter, un grupo cíclico o un grupo aromático. Preferiblemente, el enlace no es fácilmente dividido por las enzimas presentes dentro de la célula de mamífero.

III. Método para Elaborar un dsARN que Tiene Actividad Biológica Mejorada

La invención se relaciona además con un método para elaborar un dsARN que tiene una actividad de interferencia de ARN mejorada. El método comprende sintetizar una primera hebra de ARN (complementaria) y una segunda hebra de ARN (con sentido), en donde una de las hebras de ARN comprende un grupo lipófilo colgante, y una mezcla de la primera y la segunda hebra de ARN para formar un dsARN. La etapa de sintetizar la hebra de ARN involucra preferiblemente la síntesis de fase sólida, en donde los nucleótidos individuales se unen extremo con extremo a través de la formación de los enlaces fosfodiéster 3'-5' internucleótido en ciclos de síntesis consecutivos.

En una modalidad, una molécula lipofílica que tiene un grupo fosforamidita está acoplada al extremo 5' de cualquiera de las hebras de ARN primera (complementaria) o segunda (con sentido) en el último ciclo de síntesis. En la síntesis de fase sólida de un ARN, que se describe con más detalle adelante, los nucleótidos están inicialmente en la forma de los nucleósidos de fosforamidita. En cada ciclo de síntesis, una nucleósido de fosforamidita adicional está ligada al grupo 5'-OH del nucleótido previamente incorporado. Si la molécula lipofílica tiene un grupo fosforamidita, ésta se puede acoplar de manera similar a un nucleósido de fosforamidita al extremo 5'-OH libre del ARN previamente sintetizado en la síntesis de fase sólida. La síntesis puede tener lugar de una manera automatizada y estandarizada utilizando un sintetizador de ARN convencional, como se describe adelante. La síntesis de la molécula lipofílica que tiene un grupo fosforamidita puede incluir la fosforilación de un hidroxilo libre para generar el grupo fosforamidita. La síntesis de una molécula lipofílica que comprende un grupo fosforamidita puede involucrar la conversión del cloroformato de colesteril en una amida, o la reacción del ácido 12-hidroxilaurico con di-n-decilamina para formar un enlace amida. En las modalidades ejemplificadas, la molécula lipofílica que tiene un grupo fosforamidita es colesteril N-[6-(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilaminofosfaniloxi]-hexil carbamato o bisdecilamida de ácido 12-[(2-cianoetoxi)N,N-diisopropilamino-fosfaniloxi]dodecanóico.

En una modalidad específica de la presente invención, la molécula lipofílica está unida a un extremo 5' de la hebra codificante, en donde el enlace de la molécula lipofílica no comprende un grupo fosfodiéster. La síntesis de una hebra codificante que lleva una derivación 5' en donde el enlace no comprende una unión fosfodiéster es igualmente logrado de manera fácil utilizando los métodos estándar de síntesis conocidos por la persona experta. Por ejemplo, la parte de nucleótido de la hebra se puede sintetizar utilizando una química de fosforamidita estándar mencionada anteriormente, y el 5'-OH terminal desprotegido de la hebra puede reaccionar con un haluro de ácido carboxílico, tal como, por ejemplo, cloruro de pivaloilo. La persona experta conocerá muchos otros métodos por medio de los cuales el enlace que no comprende un grupo fosfodiéster se puede establecer.

En general, los oligonucleótidos de la presente se pueden sintetizar utilizando los protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Caruthers, et al., Methods in Enzymology (1992)211:3-19; Thompson, et al., Publicación Internacional PCT No. WO 99/54459; Wincott, et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:2677-2684; Wincott, et al., Methods Mol. Biol. (1997) 74:59; Brennan, et al., Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45; y Brennan, Pat. U.S. No. 6,001,311. En general, la síntesis de oligonucleótidos involucra grupos protectores y acoplantes del ácido nucleico convencionales, tal como dimetoxitritil en el extremo 5', y fosforamiditas en el extremo 3'. En un ejemplo no limitante, las síntesis a escala pequeña son conducidas sobre un sintetizador 8909 de ARN Expedite vendido por Applied Biosystems, Inc. (Weiterstadt, Alemania), utilizando fosforamiditas de ribonucleósido vendido por ChemGenes Corporation (Ashland Technology Center, 200 Homer Avenue, Ashland MA 01721, USA). Alternativamente, la síntesis se puede desarrollar sobre un sintetizador de placa de 96 pozos, tal como el instrumento producido por Protogene (Palo Alto, Calif., USA), o mediante los métodos tales como aquellos descritos en Usman, et al., J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845; Scaringe, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18:5433; Wincott, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 23:2677-2684; y Wincott, et al., Methods Mol. Bio. (1997) 74:59.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se puede sintetizar separadamente y se unen conjuntamente post-sintéticamente, por ejemplo, mediante ligación (Moore, et al., Science (1992)256:9923; Draper, et al., Publicación Internacional PCT No. WO 93/23569; Shabarova, et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247; Bellon, et al., Nucleosides & Nucleotides (1997) 16:951; Bellon, et al., Bioconjugate Chem. (1997) 8:204; o mediante la hibridización luego de la síntesis y/o desprotección. Las moléculas de ácido nucleico se pueden purificar mediante electroforesis de gel utilizando métodos convencionales o se pueden purificar mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC; ver Wincott et al., supra) y resuspendidas en agua.

IV. Composiciones farmacéuticas que comprenden dsARN

En una modalidad, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un dsARN, como se describe en la sección precedente, y un portador farmacéuticamente aceptable, como se describe adelante. La composición farmacéutica que comprende el dsARN es útil para tratar una enfermedad causada por la expresión de un gen objetivo. En este aspecto de la invención, el dsARN de la invención se formula como se describe adelante. La composición farmacéutica se administró en una dosis suficiente para inhibir la expresión del gen objetivo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran en dosis suficientes para inhibir la expresión o la actividad del gen objetivo, por ejemplo, la actividad o replicación de un virus con ARN de hebra (+), tal como el HCV. Las composiciones que comprenden el dsARN de la invención se pueden administrar en dosis sorpresivamente bajas. Una dosis máxima de 5 mg de dsARN por kilogramo de peso de cuerpo por día puede ser suficiente para inhibir o suprimir completamente la actividad o replicación del virus objetivo.

En general, una dosis adecuada del dsARN estará en el rango de 0.01 a 5.0 miligramos por kilogramo de peso de cuerpo del receptor por día, preferiblemente en el rango de 0.1 a 2.5 miligramos por kilogramo de peso de cuerpo del receptor por día, más preferiblemente en el rango de 0.1 a 200 microgramos por kilogramo de peso de cuerpo por día, y más preferiblemente en el rango de 0.1 a 100 microgramos por kilogramo de peso de cuerpo por día. La composición farmacéutica se puede administrar una vez diariamente, o el dsARN se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más sub-dosis a intervalos apropiados durante el día. En ese caso, el dsARN contenido en cada sub-dosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosis diaria total. La unidad de dosis también se puede componer para el suministro durante varios días, por ejemplo, utilizando una formulación de liberación sostenida convencional que suministre la liberación sostenida del dsARN durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. En esta modalidad, la unidad de dosis contiene una dosis múltiple diaria correspondiente.

La persona experta apreciará que ciertos factores pueden influenciar la dosis y el tiempo requerido para tratar efectivamente un sujeto, incluyendo pero no estando limitado a la severidad de la infección o enfermedad, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Más aún, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición puede incluir un tratamiento simple o una serie de tratamientos. Los estimados de las dosis efectivas y las vidas medias in vivo de los dsARN individuales comprendidos por la invención se pueden hacer utilizando metodologías convencionales o sobre la base de ensayos in vivo utilizando un modelo animal apropiado, como se describe en cualquier parte aquí.

Los avances en las genéticas de ratones han generado un número de modelos de ratón para el estudio de varias enfermedades en humanos. Por ejemplo, repositorios de ratón se puede encontrar en The Jackson Laboratory, Charles River Laboratories., Taconic, Harlan, Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) National Network and at the European Mouse Mutant Archive. Tales modelos se pueden utilizar para ensayos in vivo del dsARN, así como también para determinar una dosis farmacéuticamente efectiva.

Las composiciones farmacéuticas comprendidas por la invención se pueden administrar mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica que incluyen, pero no está limitados a rutas oral o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, aérea (aerosol), rectal, vaginal y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas se administran mediante infusión intravenosa o intraperitoneal o inyección.

Para la administración oral, los dsARN útiles en la invención serán generalmente suministrados en la forma de tabletas o cápsulas, como polvo o gránulos, o como una solución o suspensión acuosa.

Las tabletas para uso oral pueden incluir los ingredientes activos mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes desintegrantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes endulzantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y preservativos. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y de calcio, fosfato de sodio y de calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes desintegrantes adecuados. Los agentes de unión pueden incluir almidón y gelatina, aunque el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, las tabletas pueden estar recubiertas con un material tal como gliceril monoestearato o gliceril diestearato, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal.

Las cápsulas para uso oral incluyen cápsulas de gelatina dura en las cuales el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido, y las cápsulas de gelatina blanda en donde los ingredientes activos se mezclan con agua o un aceite tal como aceite de maní, parafina líquida o aceite de oliva.

Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, las composiciones farmacéuticas de la invención serán generalmente suministradas en soluciones o suspensiones acuosas estériles, amortiguadas con un pH e isotonicidad apropiados. Los portadores acuosos apropiados incluyen solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. En una modalidad preferida, el portador consiste exclusivamente de un amortiguador acuoso. En este contexto, "exclusivamente" significa que no están presentes agentes auxiliares o sustancias encapsulantes que podrían afectar o mediar la captación del dsARN en las células que mantienen el virus. Tales sustancias incluyen, por ejemplo, estructuras micelares, tales como liposomas o cápsidos, como se describe adelante. De manera sorprendente, los presentes inventores han descubierto que las composiciones que contienen solamente dsARN desnudos y un disolvente fisiológicamente aceptable son tomadas por las células, donde el dsARN inhibe efectivamente la replicación del virus. Aunque la microinyección, la lipofección, los virus, los viroides, los cápsidos, los capsoides, u otros agentes auxiliares se requieren para introducir los dsARN en los cultivos celulares, sorprendentemente estos métodos y agentes no son necesarios para captar el dsARN in vivo. Los dsARN de la presente invención son particularmente ventajosos por que ellos no requieren el uso de un agente auxiliar para mediar la captación del dsARN en la célula, muchos de cuyos agentes son tóxicos o asociados con efectos colaterales deletéreos. Las suspensiones acuosas de acuerdo con la invención pueden incluir agentes de suspensión tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinil-pirrolidona y goma tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los preservativos adecuados para las suspensiones acuosos incluyen etilo y n-propil p-hidroxibenzoato.

Las composiciones farmacéuticas útiles de acuerdo con la invención también incluyen formulaciones encapsuladas para proteger el dsARN contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulado. Los polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden utilizar, tal como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (que incluyen lipososmas apuntados a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. No. 4,522,811; publicación PCT WO 91/06309; y la publicación de patente europea EP-A-43075.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los dsARN se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal del 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y éste se puede expresar como la proporción LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales se pueden utilizar en la formulación en un rango de dosis para uso en humanos. La dosis de las composiciones de la invención descansa preferiblemente en un rango de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de los ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un rango de concentración de plasma circulante del compuesto o, cuando es apropiado, del producto de polipéptido de la secuencia objetivo (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición máxima media de los síntomas) como se determinó en el cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar más precisamente las dosis útiles en los humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño.

Además de su administración individualmente o como una pluralidad, cono se discutió anteriormente, los dsARN útiles de acuerdo con la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos efectivos para tratar infecciones virales y enfermedades. En cualquier evento, el médico administrante puede ajustar la cantidad y el tiempo de la administración del dsARN sobre la base de los resultados observados utilizando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas aquí.

Para la administración oral, los dsARN útiles en la invención serán generalmente suministrados en la forma de tabletas o cápsulas, como un polvo o gránulos, o como una solución o suspensión acuosa.

V. Métodos para tratar enfermedades causadas por la expresión de un gen objetivo

En un método para tratar un sujeto que tenga una enfermedad o esté en riesgo de desarrollar una enfermedad causada por la expresión de un gen objetivo el dsARN puede actuar como agentes terapéuticos novedosos para controlar una o más afecciones proliferativas y/o diferenciadoras, afecciones asociadas con metabolismo de huesos, afecciones inmunes, afecciones hematopoyéticas, afecciones cardiovasculares, afecciones del hígado, enfermedades virales o afecciones metabólicas. El método comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al paciente (por ejemplo, humano), de tal forma que la expresión del gen objetivo es silenciada. En razón de su alta eficiencia y especificidad, los dsARN de la presente invención específicamente apuntan a los mARN de los genes objetivo de las células y tejidos enfermos, como se describe adelante, y a dosis sorprendentemente bajas. Las composiciones farmacéuticas se formulan como se describió en la sección precedente, la cual se incorpora aquí como referencia.

En la prevención de la enfermedad, el gen objetivo puede ser aquel que se requiera para la iniciación o mantenimiento de la enfermedad, o que se ha identificado por estar asociado con un riesgo mayor de contraer la enfermedad. En el tratamiento de la enfermedad, el dsARN se puede poner en contacto con las células o tejido que exhiben la enfermedad. Por ejemplo, el dsARN sustancialmente idéntico a todo o parte de un gen mutado asociado con cáncer, o uno expresado con altos niveles en células tumorales, por ejemplo, aurora quinaza, se puede poner en contacto con o introducir en una célula cancerosa o gen tumoral.

Ejemplos de afecciones proliferativos y/o diferenciadores celulares incluyen cáncer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, afecciones metastáticos o afecciones neoplásicas hematopoyéticas, por ejemplo, leucemias. Un tumor metastático puede surgir de una multitud de tipos de tumor primario, incluyendo pero no estando limitados a aquellos de próstata, colon, pulmón, mama y de origen hepático. Como se utiliza aquí, los términos "cáncer", "hiperproliferativo", y "neoplásico" se refiere a células que tienen la capacidad para crecer autónomamente, es decir, un estado anormal de la condición caracterizada por el crecimiento celular rápidamente proliferante. Estos términos pretenden incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastáticos o células malignamente transformadas, tejidos, u órganos, sin importar el tipo histopatológico o etapa de invasión. Las afecciones proliferativas también incluyen afecciones neoplásicas hematopoyéticas, que incluyen enfermedades que involucran células hiperplasias/neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, que surgen del mieloide, linfoide o linajes eritroide o células precursoras de éstas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden utilizar para tratar una variedad de afecciones inmunes, en particular aquellas asociadas con sobre expresión de un gen o expresión de un gen mutante. Ejemplos de las afecciones o enfermedades hematopoyéticas incluyen, sin limitación, enfermedades auto-inmunes (incluyendo, por ejemplo, diabetes mellitus, artritis (que incluye artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática), esclerosis múltiple, encefalomielitis, myastenia gravis, lupus sistémico eritematoso, tiroiditis auto-inmune, dermatitis (que incluye dermatitis atópica y dermatitis eczematosa), soriasis, Síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerativa, asma, asma alérgico, lupus eritematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, erupciones por droga, reacciones reversas de lepra, eritema nodoso leproso, uveitis auto-inmune, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante, escucha sensorineural progresiva bilateral idiopática, pérdida, anemia aplásica, anemia de célula roja pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome Stevens-Johnson, espurre idiopático, lichen planus, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, y fibrosis de pulmón intersticial), enfermedades de injerto versus huésped, casos de transplante, y alergias.

Los dsARN de la invención se preparan como se describe aquí para apuntar secuencias expresadas de un virus, así mejorando la actividad viral y la replicación. Las moléculas se pueden utilizar en el tratamiento y/o diagnóstico del tejido infectado viral, tanto en animales como en plantas. También, tales moléculas se pueden utilizar en el tratamiento de carcinoma asociado a virus, tal como cáncer hepatocelular.

En razón a su alta especificidad y actividad en las células infectadas mediante HCV (por ejemplo, hepatocitos), los dsARN de la presente invención son particularmente útiles para apuntar virus con ARN de hebra (+) que tienen un 3'-UTR, como se describió anteriormente, y unas dosis sorprendentemente bajas.

Ejemplos de los virus con ARN de hebra (+) que se pueden apuntar para la inhibición incluyen, sin limitación, picornavirus, clacivirus, nodavirus, coronavirus, arterivirus, flavivirus, y togavirus. Ejemplos de picornavirus incluyen enterovirus (poliovirus 1), rinovirus (rinovirus humano 1A), hepatovirus (virus de la hepatitis A), cardiovirus (virus de la encefalomiocarditis), aftovirus (virus 0 de la enfermedad de pie y boca), y parecovirus (ecovirus humano 22). Ejemplos de calicivirus incluyen vesiculovinis (virus de exantema vesicular de cerdo), lagovirus (virus de enfermedad hemorrágica de conejo), "virus similares a Norwalk" (virus Norwalk), "virus similares a Sapporo" (virus Sapporo), y "virus similares a hepatitis E" (virus de la hepatitis E). el betanodavirus (virus de necrosis nerviosa "striped jack") es el nodavirus representativo. Los coronavirus incluyen coronavirus (virus de bronquitis infecciosa aviar) y torovirus (virus Berne). Arterivirus (virus de arteritis equina), es el arteriviridus representativo. Los togavirus incluyen alfavirus (virus Sindbis) y rubivirus (virus de Rubella). Finalmente, los flavivirus incluyen flavivirus (virus de la fiebre amarilla), pestivirus (virus de diarrea bovina), y hepacivirus (virus de la hepatitis C). En una modalidad preferida, el virus es hepacivirus, el virus de la hepatitis C. Aunque la lista anterior ejemplifica los virus de vertebrados, la presente invención comprende las composiciones para tratar infecciones y enfermedades causadas por cualquier virus con ARN de hebra (+) que tenga un 3'-UTR, sin importar el huésped. Por ejemplo, la invención comprende el tratamiento para enfermedades de plantas causadas por sequivirus, comovirus, potivirus, sobemovirus, luteovirus, tombusvirus, tobavirus, tobravirus, bromovirus, y closterovirus.

Las composiciones farmacéuticas comprendidas por la invención se pueden administrar por cualquiera de los medios conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a rutas oral o parenteral, que incluyen administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, aérea (aerosol), rectal, vaginal y tópica (que incluyen bucal y sublingual). En las modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas se administran mediante infusión intravenosa o intraparenteral o inyección.

A menos que defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente para las personas medianamente versadas en la técnica a las cuales corresponde esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen adelante.

Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de un derivado de colesterol

El esquema sintético para preparar un derivado de colesterol ejemplificado, denominado aquí como "Chol", se muestra en la Fig. 1.

En este esquema sintético, el colesteril cloroformato 8 se convierte como sigue al agregar 1.2 equivalentes de 6-aminohexanol en la presencia de NaHCO_{3} en la amida colesteril (6-hidroxi-hexilo) carbamato 9: 2 g (4.45 mmol) de colesteril cloroformato 8 fueron disueltos en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}, y 561 mg (6.68 mmol) de NaHCO_{3} se agregó. Entonces, aunque agitando vigorosamente a 0ºC, 626 mg (5.34 mmol) de 6-aminohexanol disuelto en 10 ml de CH_{2}Cl_{2} se agregaron. La tasa de caída durante esta fue de aproximadamente 1 gota por segundo. La reacción tuvo lugar durante 16 horas, durante las cuales la temperatura subió lentamente hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó luego con 30 ml de CH_{2}Cl_{2} y se extrajo con H_{2}O, y la fase acuosa se retro-extrajo con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas fueron entonces secadas sobre Na_{2}SO_{4}, filtradas y concentradas. El producto crudo obtenido de esta manera se purificó mediante cromatografía de columna, utilizando una columna con un diámetro de 4.5 cm y empacada a una altura de 15 cm con silica gel, tamaño de partícula 40-63 \mum (Merck KGaA, Frankfurter Str. 250, Darmstadt, Alemania). Ciclohexano/etil acetato 2:1 se utilizó como eluyente.

El grupo hidroxilo libre del producto resultante 9 fue fosfilitado como sigue, es decir, convertido en un grupo fosforamidita: 500 mg (0.944 mmol) del precursor 9 fueron disueltos en 15 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro y, en una contracorriente de argón, puestos en un recipiente que había sido previamente evacuado y ventilado con argón. Luego, aunque agitando, 485 \mul (2.83 mmol) de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) y, gota a gota, 261 \mul (1.04 mmol) de 2-cianoetil diisopropil-clorofosforamidita se agregaron, y la mezcla de reacción se agitó en una corriente de argón a temperatura ambiente. La reacción se completó después de 90 minutos. La mezcla de reacción se diluyó primero con CH_{2}Cl_{2} y luego se extrajo con una solución de NaCl saturada. Finalmente, la fase acuosa se retro-extrajo con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas se secaron entonces sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron utilizando un evaporador rotatorio ventilado con argón. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna bajo presión de argón, utilizando una columna con un diámetro de 4.5 cm y empacada a una altura de 8 cm con silica gel, tamaño de partícula 40-63 \mum (Merck KGaA). Ciclohexano/etil acetato 6:1 + 1% de trietilamina (Et_{3}N) se utilizó como eluyente. La silica gel utilizada en este caso fue previamente suspendida con ciclohexano/1% de Et_{3}N durante 2 horas. El producto obtenido fue colesteril N-[6-(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilaminofosfaniloxi]-hexil carbamato 10, que se denomina aquí como "Chol".

Ejemplo 2 Síntesis de derivado de di-n-decilamina

El esquema sintético para preparar un derivado de di-n-decilamina ejemplificado, denominado aquí como "C32", se muestra en la Fig. 2.

Para sintetizar C32, ácido 12-hidroxiláurico 11 reaccionó como sigue con 2 equivalentes de la amina secundaria di-n-decilamina 15 para dar el producto bisdecilamida de ácido 12-hidróxido decanóico 16: 1 g (4.623 mmol) de ácido 12-hidroxiláurico 11 reaccionó con 282 mg (2.31 mmol) de p-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) y 1.329 g (6.94 mmol) de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC1). Luego 2.751 g (9.246 mmol) de di-n-decilamina 15 se agregaron, y la mezcla de reacción se agitó vigorosamente a temperatura ambiente. Después de 16 horas, el producto crudo se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se extrajo dos veces con H_{2}O, durante el cual un floculante blanco sólido se formó en la fase acuosa. La fase acuosa fue retro-extraída con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas fueron entonces secadas con Na_{2}SO_{4}, filtradas y concentradas. El producto crudo obtenido de esta manera se purificó mediante cromatografía de columna. Una columna con un diámetro de 4.5 cm y empacada a una altura de 19 cm con silica gel, tamaño de partícula 40-63 \mum (Merck KgaA), se utilizó para esto. Ciclohexano/etil acetato 4:1 se utilizó como eluyente.

El grupo hidroxilo libre del producto resultante 16 fue fosfitilado como sigue: 1.018 g (2.05 mmol) de la amida 16 se disolvieron en 30 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro y se pusieron en una contracorriente de argón, en un recipiente que había sido previamente evacuado y ventilado con argón. Luego, mientras se agita, 1.054 \mul (6.16 mmol) de DIPEA y, gota a gota, 504 \mul (2.26 mmol) de 2-cianoetil diisopropilcloro-fosforamidita se agregaron, y la mezcla de reacción se agitó en una corriente de argón a temperatura ambiente. La reacción se completo después de 2 horas. La mezcla de reacción fue inicialmente diluida con CH_{2}Cl_{2} y luego se extrajo con una solución de NaCl saturada. Finalmente, la fase acuosa se retro-extrajo con CH_{2}Cl_{2}. Las fases orgánicas combinadas fueron entonces secadas sobre Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron utilizando un evaporador rotatorio ventilado con argón. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna bajo presión de argón, utilizando una columna con un diámetro de 4.5 cm y empacada a una altura de 20 cm con silica gel, tamaño de partícula 40-63 \mum (Merck KGaA). Ciclohexano/etil acetato 8:1 + 1% Et_{3}N se utilizaron como eluyente. La silica gel utilizada fue previamente suspendida con ciclohexano/1% Et_{3}N durante 2 horas. El producto obtenido fue bisdecilamida de ácido 12-[(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilaminofosfaniloxi]dodecanóico 17, que se denomina aquí como "C32".

El colesterol y los derivados de di-n-decilamina, Chol y C32, se sintetizaron utilizando químicos obtenidos de Fluka, Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs SG. Suiza, y los químicos por eluyentes para cromatografía de columna se obtuvieron de Carl Roth GmbH & Co, Schoemperlenstr, 1-5, 76185 Karlsruhe, Alemania.

Ejemplo 3 Síntesis de ARN

Las secuencias de la región 3'-UTR altamente conservada del gen del virus de la hepatitis C (HCV) y el gen de \beta-galactosidasa (\beta-Ga1) de E. coli se seleccionaron como secuencias objetivo para este experimento. Las siguientes secuencias de oligoribonucleotido de hebra doble, diseñada SEQ ID NOS: 1-4 en la lista de secuencia, se utilizaron en los experimentos de transfección:

HCV: dsARN cuya hebra de ARN complementario es complementaria a una secuencia objetivo del gen HCV:

S2:	5'-ACG GCU AGC UGU GAA AGG UCC-3'	(HCV11s - SEQ ID NO:2)

S1:	3'-AG UGC CGA UCG ACA CUU UCC AGG-5'	(HCV2 - SEQ ID NO:1)

\vskip1.000000\baselineskip

Gal: dsARN cuya hebra de ARN complementario es complementaria a una secuencia objetivo del gen de \beta-galactosidasa

S2:	5'-GUG AAA UUA UCG AUG AGC GUG-3'	(Gal3s - SEQ ID NO:4)

S1:	3'-GC CAC UUU AAU AGC UAC UCG CAC-5'	(Gal2 - SEQ ID NO:3)

Un dsARN referido aquí como "K22, "el cual no se expresa y tienen las secuencias de la SEQ ID Nos: 5 y 6, se utiliza como un control negativo.

Los ARN monocatenarios se preparan utilizando un sintetizador de ARN (tipo Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) y síntesis de fase sólida convencional utilizando fosforamiditas de ribonucleósido (ChemGenes Corporation, Ashland Technology Center, 200 Homer Avenue, Ashland, MA 01721, USA). Las amiditas colesteril [6-(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilamino-fosfaniloxi]carbamato 10 y bisdecilamida de ácido 12-[(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilamino-fosfaniloxi]dodecanoico 17 se acoplan al extremo 5'-OH del ARN sintetizado, en forma análoga a las fosforamiditas de ribonucleósido, en el ciclo sintético anterior.

Los ARN monocatenarios con y sin un grupo lipófilo se purifican por HPLC, utilizando NucleoPac PA-100,9 x 250 mm de Dionex GmbH, Am Wortzgarten 10, 65510 Idstein, Alemania; se emplea amortiguador de sal inferior: 20 mM de Tris, 10 mM de NaClO_{4}, pH 6.8, 6 M de urea; se emplea amortiguador de sal superior 20 mM de Tris, 400 mM de NaClO_{4}, pH 6.8, 6 M de urea. El índice de flujo es de 3 ml/minuto. La hibridación de las hebras sencillas para dar la hebra doble ocurre al calentar la mezcla estequiométrica de las hebras sencillas en 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 6.8, 100 mM de NaCl, a 80-90ºC y enfriado lento posterior a temperatura ambiente durante 6 horas.

Se sintetizan los siguientes derivados lipófilos de dsARN (o siARN):

Gal con el grupo lipófilo Chol en la hebra S1 (hebra de ARN complementario): GalChol-as

Gal con el grupo lipófilo Chol en la hebra S2 (hebra codificante): GalChol-s

Gal con el grupo lipófilo Chol en cada una de la hebra S1 y la hebra S2: GalChol-2

Gal con el grupo lipófilo C32 en la hebra S1: GalC32-as Gal con el grupo lipófilo C32 en la hebra S2: GalC32-s

Gal con el grupo lipófilo C32 en cada una de la hebra S1 y la hebra S2: GalC32-2

HCV con el grupo lipófilo Chol en la hebra S1: HCVChol-as

HCV con el grupo lipófilo Chol en la hebra S2: HCVChol-s

HCV con el grupo lipófilo Chol en cada una de la hebra S1 y la hebra S2: HOVChol-2

HCV con el grupo lipófilo C32 en la hebra S 1: HCVC32-as

HCV con el grupo lipófilo C32 en la hebra S2: HCVC32-s

HCV con el grupo lipófilo C32 en cada una de la hebra Sl y la hebra S2: HCVC32-2

Ejemplo 4 Inhibición de la expresión de gen vírica utilizando dsARN

El efecto inhibidor de dsARN de la invención en la expresión y actividad de genes víricos se evalúa utilizando un sistema sustituto no patogénico. Específicamente, se clona un oligonucleótido como se muestra en la SEQ ID NO: 7 de la lista de secuencia delante de una codificación de gene para E. coli \beta-galactosidasa del Control-ppGal del vector de expresión disponible comercialmente (BD Biosciences Clontech, Tullastrasse 4, D-69126 Heidelberg, Alemania, Número de Acceso de Gen U13186; nucleótido 280-3429). La SEQ ID NO: 7 corresponde a una secuencia que comprende 24 nucleótidos de una región altamente conservada del 3'-UTR del genoma HCV. La fusión de gen generada en esta forma se clonan en el plásmido de expresión pcADN3.1 (+) disponible comercialmente (Invitrogen, Life Technologies, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether-Str. 10, D-76131 Karlsruhe, Alemania, número de catalogo V790-20) que contiene un gen de resistencia al antibiótico neomicina. El plásmido resultante se refiere como "p3." La secuencia HCV mostrada en la SEQ ID NO: 7 en p3 no es parte del marco de lectura abierto de la secuencia que codifica para \beta-Galactosidasa, de modo que aunque la secuencia HCV se transcriba como parte de un mARN que codifica para p-galactosidasa no se expresa como parte de una proteína de fusión. Así, la secuencia mARN que corresponde a los 24 nucleótidos es idéntico a la secuencia correspondiente en la genoma HCV. El plásmido p3 tiene el siguiente segmento de secuencia importante como se muestra en la SEQ ID NO: 8 de la lista de secuencia:

100

La secuencia de aminoácido de terminal N de la proteína de fusión HCV-(3-galactosidasa se muestra debajo de la secuencia de ADN. La secuencia HCV se representa en letra cursiva. El se subraya inicio del gen p-GAl (incluyendo 6 nucleótidos de la secuencia Kozak delante del codón ATG).

Se llevan a cabo todos los experimentos para investigar la inhibición post-transcripcional de la expresión de gen por interferencia de ARN con células de la línea celular \beta-Gal+HuH-7 que se deriva de células HuH-7 (JCRB0403, Japónese Collection of Research Bioresources Cell Bank, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga 1-18-1, Setagaya-ku, Tokyo 158, Japón) el HuH-7 es una línea celular de hepatoma humana. Las células HuH-7 se transfectan con p3. Las células HuH-7 transfectadas exhiben resistencia a la neomicina G418 análoga, de modo que solo las células HuH-7 seleccionadas en la presencia de G418 son aquellas que han tomado el genoma plásmido, y así el gen reportero, es estable en su genoma. Estas células se refieren aquí como P-Gal+HuH-7.

Se utilizan las siguientes soluciones y medios para el cultivo celular y los experimentos:

- Dulbecco's MEN (BIOCHROM AG, Leonorenstr. 2-6, D-12247 Berlin, Alemania) con 10% (v/v) de suero fetal de becerro (FCS) y 350 ug/ml de L-glutamina, se refiere aquí como "medio",

- Dulbecco's MEM sin FCS, se refiere aquí como "medio libre de suero" (SFM) y

- salina amortiguada con fosfato que consiste de 137 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 4.3 mM de Na2HPO4@7 H2O y 1.4 mM de KH2PO4, pH 7.3, se esteriliza por filtración, se refiere aquí como "PBS".

Se cultivan las células en 10 ml de medio a 37ºC con una atmósfera de CO_{2} al 5% en botellas de cultivo celular de 75 cm^{2} (Coming B.V, Life Sciences, Koolhovenlaan 12,1119 NE Schiphol-Rijk, Los Países Bajos).

Experimentos de transfección

Se llevan a cabo experimentos de transfección con células P-Gal+Huh-7, células de carcinoma cervical (Línea celular HELA S3, comprado de DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania, número de orden ACC 161), human células de carcinoma de vesícula (línea de célula T-24, comprado de DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, número de orden ACC 376) y células de una línea celular cultivada de carcinoma pancreático humano. Un ensayo de bioluminiscencia se utiliza para determinar la actividad del gen reportero galactosidasa en las células 3-Gal+Huh-7, el cual permite la cuantificación de la eficiencia de inhibición del dsARN.

Las transfecciones ocurren 24 horas después de la siembra de las células en placas de 96 pozos (se cuentan las células en el día de la siembra: 2 x 10^{4} por pozo) o placas de 12-pozos (se cuentan las células en el día de la siembra: 1-2 x 10^{5} por pozo). La transfección de las células ocurre utilizando Reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH) o sin un ayudante de transfección.

Transfección de células \beta-Gal+Huh-7 con FuGENE 6

Las transfecciones se llevan a cabo en placas de 96 pozos (determinación quintuplicada) con una concentración de dsARN de 50 nM por pozo. Las mezclas de transfección que se agregan a las células por pipeteo tienen un volumen de 100 \mul/5 pozos. Las mezclas de transfección consisten de una cantidad de dsARN que corresponde luna concentración a ser ensayada, 3 \mul de FuGENE 6 por 1 \mug o ADN y SFM, con los cuales ellos se hacen hasta 100 \mul. La transfección se lleva a cabo al mezclar inicialmente el dsARN en vasos de reacción Eppendorf con SFN y luego agregar FuGENE 6. Esta mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se pipetea en los pozos, y las células se incuban a 37ºC con una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 48 horas.

Transfección de células de carcinoma pancreático, de carcinoma de vesícula, de carcinoma cervical y -Gal+Huh-7 y sin ayudante de transfección

Las transfecciones se llevan a cabo en mezclas triplicadas en placas de 12 pozos. Una concentración de 100 nM de dsARN se utiliza por pozo. Para una mezcla de transfección, se mezclan 6 \mul de 20 \muM de dsARN con 1 194 \mul de SFM. El medio luego se remueve de las células y se reemplaza por 400 \mul de la mezcla de transfección por pozo. Después de incubación a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 2H horas, la mezcla de transfección se remueve por pipeteo y se reemplaza por 1 ml de medio, y las células se incuban durante unas 24 horas adicionales.

Ensayo de bioluminiscencia y lisis celular

La lisis celular se lleva a cabo 24 o 48 horas después de la transfección en las placas de 96 -o 12 pozos. Para este propósito, el medio se remueve completamente y las células se lavan dos veces con 100 \mul o 500 \mul de PBS cada vez. Luego ellas se cubre a temperatura ambiente con 50 \mul o 250 \mul de solución de lisis (0.5 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) e inhibidor de proteasa (Comprimidos de Cóctel de Inhibidor de proteasa Completo 50x, Roche Diagnostics GmbH, orden No. 1 697 498) en la concentración recomendada por el fabricante en solución de lisis (Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404 USA, orden No. ABX070LM) durante 10 minutos y finalmente se resuspende completamente con una pipeta y se transfieren en vasos de reacción Eppendorf en hielo. Esto se sigue por mezclado giratorio durante 10-15 segundos y centrifugación a 16 100 g durante 2 minutos. El supernadante se utiliza inmediatamente para el ensayo o almacenamiento a -80ºC.

La actividad \beta-galactosidasa se mide en tubos de hemólisis de 5 ml (Sarstedt AG & Co., Postfach 1220, D-51582 Numbrecht, Alemania, orden No. 55.476) enun luminómetro Sirius (Berthold Detección Systems GmbH, Bleichstr. 56-68, D-75173 Pforzheim, Alemania). Para medir la actividad \beta-galactosidasa, 5 \mul de lisato celular se mezclan con 30 \mul de amortiguador de ensayo \beta-Gal (100 mM de fosfato de Na, pH 8.0, 10 mM de 2, 12.5 \mug/ml de Galacton (Applied Biosystems, orden No. GC020)) en un tubo de hemólisis y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se agregan 100 \mul de mezcla de detención \beta-Gal (200 mM de NaOH, 0.06% de Potenciador Emerald II (Applied Biosystems, orden No. LAY250)) y, después de mezclado breve, la luminiscencia se mide inmediatamente en el luminómetro.

Aislamiento dsARN de células

24 horas después de la transfección en una placa de 12 pozos, se aíslan el ARN total y el siARN de los lisatos celulares utilizando el minikit RNeasy (QIAGEN GmbH, Max-Volmer-Straße 4,40724 Hilden, Alemania). El aislamiento se lleva a cabo como se describe en el protocolo "Aislamiento de ARN total de células animales" de QIAGEN, con la siguiente modificación: después de la primera etapa de centrifugación, la columna de flujo continuo, que contiene el dsARN pequeño, se almacena a -80ºC hasta uso adicional.

Detección de siARN por Northern blotting

Puesto que no es posible medir la concentración de dsARN directamente en el flujo continuo, se determina en relación con la concentración ARN total. En cada caso se emplean cantidades idénticas de dsARN de los flujos continuos de las muestras individuales. Los volúmenes de flujo continuo corresponden a cantidades de dsARN idénticas que se hacen a volúmenes idénticos con amortiguador RLT (del minikit RNeasy)/70% de etanol 1: 1, y se agregan 5 \mul de E. coli tARN (Roche Diagnostics GmbH, orden No. 109541) (10 \mug/\mul). El siARN se precipita al agregar 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio (NaOAc), pH 5.4 y 3 volúmenes de etanol absoluto (EtOH) a -20ºC durante 16 horas. El dsARN se granula por centrifugación a 16 100 g durante 10 minutos, y los gránulos se lavan con 700 \mul de 70% de EtOH y otra vez se centrifuga al mismo número de g durante 5 minutos. Después de remoción del supernadante, las muestras de dsARN resultantes se resuspenden en 10 \mul de amortiguador de detención (95% (v/v) de formamida, 0.1% (p/v) xileno cianola, 0.1% (p/v) de bromofenol azul y 10 mM de sal de etilenodiaminatetraacetato de disodio), desnaturalizada por incubación a 95ºC durante 5 minutos, se coloca sobre hielo y se carga en un gel de secuenciamiento desnaturalizado al 18% (10 x 10 x 0.8 cm, 14.5 ml de concentrado de gel de secuenciamiento, 2 ml de concentrado de amortiguador, 3.5 ml de diluyente de gel secuenciamiento, cada uno del sistema de secuenciamiento de ADN Rotiphorese A431.1 ADN (Carl Roth GmbH &; Co., Schoemperlenstr. 1-5, D-76185 Karlsruhe) 20 \mul de N,N,N',N'-tecametiletilenodiamina (TEMED) (Carl Roth GmbH & Co., orden No. 2367.3) y 60 \mul de 10% de peroxodisulfato de amonio (Carl Roth GmbH & Co., orden No. 9592.3). El gel se corre a 150 V con 1x de ácido Tris-bórico-EDTA (TBE) (10.8 g de Tris, 5.5 g de ácido bórico, 4 ml de EDTA 0.5 M, pH 8.0) como amortiguador de corrida durante 2-3 horas. El ARN luego se transfiere en una membrana Hybond N+ (Amersham Biosciences Europe GmbH, orden No. RPN203B) por electroforesis (2 h a 100 mA) por el método semiseco en una unidad de transferencia semiseca Hoefer (Amersham Biosciences Europe GmbH, Munziger Str. 9, D-79111 Freiburg, Alemania, orden No. 80-621-86). La membrana luego se seca a temperatura ambiente durante 16 horas y posteriormente se hornea a 80ºC durante 3 horas.

Preparación de las sondas radioetiquetadas

Las sondas se emplean para detectar el siARN que son los ARN monocatenarios Gal3 (SEQ ID NO: 3) y HCV11s (SEQ ID NO: 2) que se radiomarcan para este propósito en los extremos 5' utilizando quinasa polinucelótido T4 (PNK). Para esto, 3 \mul de ARN (20 \muM) se mezclan con 5 \mul de \gamma-[^{32}P]-ATP (10, \muCi/ \mul), 35 \mul de H_{2}O, 5 \mul de amortiguador PNK 10x y 1 \mul de PNK (10 U/\mul) (amortiguador PNK 10 x y PNK de New England Biolabs, Bruningstr. 50, Geb. G810, D-65926 Frankfurt am Main, Alemania, orden No. M0201 S) y se incuba a 37ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción se hace luego a 100 \mul con H_{2}O, y las sondas se purifican utilizando una columna MicroSpin^{TM} 25 (Amersham Biosciences Europe GmbH). Esto se hace al cargar la mezcla de reacción en las columnas, que han sido mezcladas en forma giratoria centrifugadas en seco a 0.7 g durante 1 minuto, y la sonda se eluye por centrifugación otra vez a 0.7 g durante 1 minuto.

Hibridación

La solución de hibridación ExpressHyb^{TM} (BD Biosciences Clontech, Tullastr. 4, D-69126 Heidelberg, Alemania) se utiliza para la reacción de hibridación. Primero, la membrana se humedece brevemente con el siARN en H_{2}O y prehibridiza con 5 ml de solución de hibridación ExpressHyb en un agitador a 37ºC durante 30 minutos. La solución de hibridación ExpressHyb luego se reemplaza por una mezcla de 5 ml de solución de hibridación ExpressHyb y 250 ng de la sonda radiomarcada, y el blot se hibridiza a 37ºC durante 1 hora. Esto se sigue por varias etapas de lavado a temperatura ambiente, inicialmente con solución de lavado 1 (0.3 M de NaCl, 30 mM de citrato de sodio, pH 7.0, 0.05% de sulfato dodecil de sodio (SDS)), el cual se cambia tres veces dentro de 45 minutos, y luego durante 45 minutos con solución de lavado 2 (15 mM de NaCl, 1.5 mM de citrato de sodio, pH 7.0, 0.1% SDS), se intercambia la solución dos veces. Para el desarrollo, la membrana se coloca en papel filtro, se envuelve en película transparente y se expone en un casete en una pantalla de fósforo de almacenamiento (Amersham Biosciences Europe GmbH) durante 16 h. This was finally read utilizando a Storm 820 Fosforimager (Amersham Biosciences Europe GmbH, orden No. 63-0035-52).

Resultados

Todos los experimentos para determinar la actividad \beta-galactosidasa se llevan a cabo en quintuplicado y se forma un promedio de los valores de medida. Los resultados para los cambios en la actividad \beta-Galactosidasa se ocasiona por las transfecciones que se muestran en la La Figura 3. El promedio para células no tratadas se define como 1.0, con los valores para células transfectadas siendo relativos a estos. Estos resultados demuestran que la expresión de gen se reduce a 56% utilizando los dsARN modificados (ver, por ejemplo, resultados con GalChol-s).

El resultado de los experimentos de la transfección se llevan a cabo con células P-Gal+Huh-7 sin ayudante de transfección se muestra en la Figura 4. La inhibición de la expresión \beta-Gal se determina al medir la actividad p-galactosidasa. El dsARN tomado por las células se detectan en el lisato celular por Northern blotting a través de hibridación con las sondas de ARN monocatenario radioetiquetadas Gal3s y HCVl ls.

La parte superior de la Figura 4 muestra la actividad \beta-Gal de las células que se tratan con los dsARN designados. La parte inferior de la figura muestra el Northern blot del dsARN aislado de estas células. De izquierda a derecha, las primeras cuatro líneas del Northern blot muestran el dsARN aislado de las células que se tratan con los dsARN modificados HCVChol-s, HCVC32-s, GalChol-s y GalC32-s.

Las siguientes tres líneas muestran el dsARN aislado de las células que se tratan con los dsARNs HCV, Gal y K22 no modificados.

La Figura 4 muestra que los dsARN con las modificaciones C32-s y Chol-s se toman por las células aún sin adición de ayudantes de transfección y origina inhibición de la expresión de un gen objetivo.

dsARN no modificados son, por lo contrario, no tomados por sin ayudante de transfección y no inhibe la expresión de \beta-galactosidasa.

La Figura 5a, 5b y 5c muestra Northern blots de dsARN aislado de carcinoma pancreático (La Figura 5a), carcinoma cervical (La Figura 5b) y células de carcinoma de vesícula (La Figura 5c). Las respectivas líneas de los Northern blots muestran, de izquierda a derecha, dsARN aislado de células que se tratan con los siguientes dsARN sin ayudante de transfección: HCVChol-s (línea 1), HCVC32-s (línea 2), GalChol-s (línea 3), GalC32-s (línea 4), HCV (línea 5) y Gal (línea 6). La Figura 5a, 5b y 5c muestra que el dsARN de la invención también se toma de células con excepción de las células de hígado sin ayudante de transfección.

Ejemplo 5 Tratamiento de un paciente infectado con HCV con dsARN

En este Ejemplo, ARN bicatenario específico HCV (dsARN) se inyecta en pacientes infectados con HCV y muestra que inhibe específicamente la expresión del gen HCV.

Dosificación y Administración de dsARN

El presente ejemplo se suministra para composiciones farmacéuticas para el tratamiento de pacientes humanos infectados con HCV que comprende una cantidad efectiva de un dsARN específico para HCV como se describe aquí, en combinación con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Los dsARN útiles de acuerdo con la invención se pueden formular para administración oral o parenteral. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier forma conveniente, efectiva, por ejemplo, administración por rutas tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradermal, entre otras. Un experto en la técnica puede fácilmente preparar dsARNs para inyección utilizando tales portadores que incluyen, pero no se limitan a, salina, salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de estos. Ejemplos adicionales de portadores adecuados se encuentran en los textos farmacéuticos estándar por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16th edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980.

Ejemplo 6 Vectores de expresión dsARN específicos para HCV

The individual strands de un dsARN can be transcribed by promoters on Las moléculas de dsARN específicas para HCV que interactúan con moléculas ARN objetivo para HCV y modulan actividad de expresión de gen HCV se expresan a partir de unidades de trascripción insertadas dentro de vectores ARN o ADNH (ver, por ejemplo, Couture, et al., TIG. (1996) 12: 510-515, Skillern et A, Publicación Internacional PCT No. WO 00/22113, Conrad, Publicación Internacional PCT No. WO 00/22114, y Conrad, Patente Estadounidense No. 6,054, 299). Estos transgenes se pueden introducir con una construcción lineal, un plásmido circular, o un vector vírico, que se puede incorporar y heredar como un transgen integrado dentro de la célula huésped. El transgen también se puede construir para permitir que sea heredado como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).

Las hebras individuales de un dsARN se pueden transcribir por promotores en dos vectores de expresión separados y cotransfectar en una célula objetivo. Alternativamente, cada hebra individual del dsARN puede ser transcrita por promotores, ambos de los cuales se localizan en el mismo plásmido de expresión. En una modalidad preferida, el dsARN se expresa como un unido que repite invertido por una secuencia de polinucleótido ligadora a tal que el dsARN tienen una estructura de bucle y de tallo.

Los vectores de expresión dsARN recombinantes son preferiblemente plásmidos de ADN o vectores víricos. Los vectores víricos que expresan dsARN se pueden construir basados en, pero no limitados a, virus asociados con adeno (para una revisión, ver Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158: 97-129), adenovirus (ver, por ejemplo, Berkner et al., BioTechniques (1998) 6: 616, Rosenfeld et al., Science (1991) 252: 431-434, y Rosenfeld, et al., Cell (1992) 68: 143-155), o alfavirus, así como también otros conocidos en la técnica. Los retrovirus han sido utilizados para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, que incluyen células epiteliales, en vitro y/o en vivo (ver, por ejemplo Eglitis, et al., Science (1985) 230: 1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 6460-6464; Wilson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 3014-3018; Armentano, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254: 1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89: 7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150: 4104-4115; Patente Estadounidense No. 4,868,116; Patente Estadounidense No. 4,980,286; Solicitud PCT WO 89/07136; Solicitud PCT WO 89/02468; Solicitud PCT WO 89/05345; y Solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovíricos recombinantes capaces de transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula se pueden producir al transfectar el genoma retrovírico recombinante en líneas celulares empacadas adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2: 5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349). Los vectores adenovíricos se pueden utilizar para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro, y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166: 769), y también tienen la ventaja de no requerir células activas mitotícamente para infección.

El promotor que conduce la expresión dsARN en un plásmido de ADN o vector vírico de la invención puede ser una polimerasa ARN eucariótica I (por ejemplo promotor de ARN ribosómico), polimerasa ARN II (por ejemplo promotor temprano CMV o promotor actina o promotor snARN U1) o preferiblemente promotor de polimerasa ARN III (por ejemplo snARN U6 o promotor de ARN 7SK) o un promotor procariótico, por ejemplo el promotor T7, que suministra el plásmido de expresión también codifica la polimerasa ARN T7 requerida para la transcripción de un promotor T7. El promotor también puede dirigir la expresión de transgen del hígado por ejemplo secuencia reguladora de albúmina (Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1: 268276).

En adición, la expresión del transgen puede ser regulada precisamente, por ejemplo, al utilizar una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa de circulación, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de trangen en células o en mamíferos incluye la regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización, y isopropil-beta-D1-tiogalactopiranosida (EPTG). Una persona experta en la técnica será capaz de escoger la secuencia promotora/reguladora apropiada basada en el uso previsto del transgen dsARN.

Preferiblemente, vectores recombinantes capaces de expresar moléculas ARN se entregan como se describe adelante, y persisten en células objetivo. Alternativamente, los vectores víricos se pueden utilizar para suministrar expresión transiente de moléculas dsARN. Tales vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, el dsARN se una a ARN objetivo y modula su función o expresión. La entrega de vectores de expresión de dsARN puede ser sistémica, tal como por administración intramuscular e intravenosa, por administración a células objetivo ex-plantadas del paciente seguido por la reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita para la introducción en una célula objetivo deseada.

Los plásmidos ADN de expresión dsARN típicamente se transfectan en células objetivo como un complejo con portadores de lípido catiónicos (por ejemplo Oligofectamina) o portadores basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo Transit-TKOTM). Transfecciones de lípidos múltiples para regiones de diferentes caídas mediadas por dsARN de un gen objetivo único o genes objetivo múltiples durante un periodo de una semana o más también se contemplan por la presente invención. La introducción exitosa de los vectores de la invención en las células huésped se puede monitorear utilizando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transciente se puede señalar con un reportero, tal como un marcador fluorescente, tal como Proteína Fluorescente Verde (GFP). La transfección establece células ex vivo se puede asegurar utilizando marcadores que suministran la célula transfectada con resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y drogas), tal como resistencia a higromicina B.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención descritas anteriormente también pueden ser insertadas generalmente en vectores y utilizadas como vectores de terapia de gen para pacientes humanos infectados con HCV. Los vectores de terapia de gen pueden ser suministrados a un sujeto por, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (ver Patente Estadounidense 5,328,470) o by inyección estereotáctica (ver por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia de gen puede incluir el vector de terapia de gen en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación controlada en la que se embebe el vehículo de suministro de gen. Alternativamente, donde el vector que suministra gen completo se puede producir intacto de células recombinantes, por ejemplo, retrovectores víricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro de gen.

Ejemplo 7 Síntesis de un dsARN que comprende un grupo lipófilo covalentemente adherido a un extremo 5' de la hebra codificante y demostración de su eficacia superior y selectividad Síntesis de ARN

Se sintetiza el ARN en un Sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Frankfurter Str. 129b, 64293 Darmstadt, Alemania) a una escala de 1 \mumole empleando soporte sólido CPG y fosforamiditas de ARN Expedite (ambas de Proligo Biochemie GmbH, Georg-Hyken-Str. 14, Hamburg, Alemania). Reactivos auxiliares se obtienen de Mallinckrodt Baker (Im Leuschnerpark 4,64347 Griesheim, Alemania).

Para la derivación 5' el oligonucleótido ARN sintetizado de DMT todavía unido al soporte sólido se trata con una mezcla de 60 \muL de cloruro de Piridina/Pivaloilo (5/1 v/v) en Diclorometano (500 \muL) para esterificar el alcohol primario no protegido. Después de cuatro horas el soporte sólido se lava con Diclorometano (5 mL) y Acetona (10 mL) y se seca al pasar Argón a través de la columna de síntesis. Los químicos para estas manipulaciones de sintetizador comprado de Fluka (Fluka Chemie GmbH, Industriestrasse 25,9471 Buchs, Suiza).

El clivage del ARN modificado del soporte sólido y la desprotección base se alcanza con metilamina en etanol (Fluka Chemie GmbH, Industriestrasse 25,9471 Buchs, Suiza). Se lleva a cabo la 2'-Desililación de acuerdo con los procedimientos establecidos. (Wincott, F. et al., Nucleic Acids Res. (1995) 23: 2677-2684). Se purifican los oligoribonucleótidos por HPLC de intercambio de anión utilizando una columna 22x250 mm ADNPac PA 100 (Dionex GmbH, Am Wortzgarten 10,65510 Idstein). El oligoribonucleótido modificado tiene un tiempo más largo de retención comparado con el compuesto pariente no modificado. Todos los compuestos se caracterizan por LC/ESI-MS (LC: Ettan Micro, Amersham Biosciences Europe GmbH, Munzinger Strasse 9, 79111 Freiburg, Alemania, ESI-MS: LCQ, Deca XP, Thermo Finnigan, Im Steingrund 4-6, 63303 Dreieich, Alemania).

Se determinan los rendimientos y concentraciones por absorción UV de una solución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm utilizando un fotómetro de espectro (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, 85702
Unterschleilßheim, Alemania). El ARN bicatenario se genera al mezclar una equimolar de hebras complementarias en amortiguador de recocido (20 mM de fosfato de sodio, pH 6.8; 100 mM de cloruro de sodio), se calienta en un baño de agua a 85-90ºC durante 3 minutos y se enfría a temperatura ambiente durante un periodo de 3-4 horas. Hasta uso el ARN se mantiene A -20ºC.

Las secuencias en el mARN BCL2 humano son los mismos como en Wacheck et al. (Oligonucleotides (2003), 13: 394-400) así como también la secuencia de la luciferasa de luciérnaga de control.

Evaluación de especificidad de siARN

Se evalúa los siARN para especificidad en las células HeLa (Número ATCC CCL-2). Las células se siembran 24 horas antes del tratamiento con siARN para permitir el crecimiento celular adherente. Los cultivos se incuban durante cuatro horas con siARNs precomplejados en medio opti-MEM con OligofectAmine (ambos de Invitrogen, Carlsbad, California, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de incubación el medio de incubación se intercambia por completo se cultivan células bajo condiciones estándar.

La evaluación de de la especificidad de los siARN se desarrolla al analizar alícuotas con tecnología de análisis de expresión de gen "chip" como se describe, por ejemplo, en Jackson et al., Nature Biotechn. (2003) 21: 635-638. La información adicional sobre esta tecnología se puede obtener de, por ejemplo, "The chipping forecast", Nature Genetics, Supplement, Vol. 21, Ene. 1999 and"The chipping forecast II", Nature Genetics, Supplement, Vol. 32, Dec. 2002.

Con la introducción exclusiva del éster de 5'-Pivaloilo en la hebra codificante del siARN anti-BCL2 específico una disminución significativa en el efecto de los objetivos se puede observar según se analiza utilizando chips relacionados con el siARN que no abarca este éster.

Varios grupos de genes además de el gen BCL2 objetivo que muestra la desregulación por siARN objetivado en soporte BCL2 de no 5'-derivatización en sus hebras codificantes. Dos grupos de genes se regulan en una escala de tiempo similar a BCL2, un grupo parcialmente complementario en hebra del siARN complementaria, el otro a la hebra codificante. Otros grupos que no tienen secuencia complementaria a la hebra se desregulan con considerable tiempo de retraso como se compara con las dos grupos formados y el BCL2, indican que estos efectos son secundarios.

En contraste, el tratamiento de células con el siARN comprende la hebra codificante 5'-derivada resulta en regulación reducida significante de aquellos genes con complementariedad de secuencia parcial a la hebra codificante, y genes inferiores muestran la desregulación secundaria, que indica alta selectividad. Adicionalmente, la regulación de BCL2 demuestra más efectividad utilizando siARN derivado.

Especulamos que esta observación se puede atribuir al fosfodiéster ausente o 5'-OH ausente que se fosforilata por una actividad de quinasa dentro de las células como se mostró previamente (Nykanen et al., Cell (2001) 107: 309-321, Schwarz, D. S., et al., Mol. Cell (2002) 10: 537-548).

<110> Ribopharma AG

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<120> Ácido ribonucleico bicatenario con actividad mejorada

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<130> 422517EH

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 23

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<212> ARN

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<213> Virus de Hepatitis C

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<400> 1

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ggaccuuuca cagcuagccg uga

\hfill

23

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<210> 2

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<211>21

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<212> ARN

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<213> Virus de Hepatitis C

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<400> 2

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acggcuagcu gugaaagguc c

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21

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<211> 23

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<212> ARN

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<213> Escherichia coli

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<400> 3

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cacgcucauc gauaauuuca ccg

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23

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<210> 4

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<211>21

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<212> ARN

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<213> Escherichia coli

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<400> 4

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gugaaauuau cgaugagcgu g

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<211> 24

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 5

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<211> 24

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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aucaugcgaa acgauccuca uccu

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Virus de Hepatitis C

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<400> 7

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 8

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57

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Ribopharma AG

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<120> Ácido ribonucleico bicatenario con actividad mejorada

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<130> 422517EH

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 23

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<212> ARN

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<213> Virus de Hepatitis C

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<400> 1

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ggaccuuuca cagcuagccg uga

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23

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<210> 2

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<211> 21

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<212> ARN

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<213> Virus de Hepatitis C

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<400> 2

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acggcuagcu gugaaagguc c

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21

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<210> 3

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<211> 23

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<212> ARN

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<213> Escherichia coli

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<400> 3

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cacgcucauc gauaauuuca ccg

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23

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ARN

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<213> Escherichia coli

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<400> 4

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gugaaauuau cgaugagcgu g

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21

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<210> 5

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<211> 24

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 5

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gaugaggauc guuucgcaug auug

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24

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<210> 6

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<211> 24

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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aucaugcgaa acgauccuca uccu

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24

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<210> 7

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Virus de Hepatitis C

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<400> 7

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gtcacggcta gctgtgaaag gtcc

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24

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<210> 8

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<400> 8

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gtcaccttgt cgtcacggct agctgtgaaa ggtccagtca ccatgtcgtt tactttg

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Claims

1. Un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN), comprenden una hebra de ARN complementario, una hebra de ARN codificante y solo un grupo lipófilo que tiene un logK_{ow} que excede en 1, en donde la hebra de ARN complementario tiene una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ARN objetivo, y en donde el ARN objetivo es un mARN transcrito de un gen objetivo o de un virus de ARN de hebra (+), en donde le grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5' de la hebra de ARN complementario y el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra de ARN complementario comprende un grupo fosfodiéster o en donde el grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5' de la hebra de ARN codificante.

2. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra de ARN codificante comprende un grupo fosfodiéster.

3. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5' de la hebra de ARN codificante y el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra de ARN codificante no comprende un grupo fosfodiéster.

4. El dsARN de la reivindicación 1, en donde la hebra de ARN complementario comprende un extremo 3' y un extremo 5', y en donde el extremo 3' tiene un nucleótido saliente de 1 a 4 nucleótidos.

5. El dsARN de la reivindicación 1, en donde la hebra de ARN complementario comprende un extremo 3' y un extremo 5', y en donde el extremo 3' tiene un nucleótido saliente de 1 o 2 nucleótidos.

6. El dsARN de la reivindicación 1, en donde cada una de la hebra de ARN complementario y la hebra de ARN codificante comprende un extremo 3' y un extremo 5', en donde el grupo lipófilo está covalentemente adherido al extremo 5' de la hebra de ARN codificante, y en donde el extremo 3' de la hebra de ARN complementario comprende un nucleótido saliente de 1 a 4 nucleótidos.

7. El dsARN de la reivindicación 6, en donde el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra codificante no comprende un grupo fosfodiéster.

8. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el dsARN está entre 16 y 30 nucleótidos en longitud.

9. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el dsARN está entre 16 y 25 nucleótidos en longitud.

10. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el dsARN está entre 20 y 25 nucleótidos en longitud.

11. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo se selecciona del grupo que consiste de una porción aromática, alifática o alicíclica, o una combinación de estas.

12. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo es un esteroide o un hidrocarburo alifático ramificado, o una combinación de estos.

13. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo es un esterol.

14. El dsARN de la reivindicación 13, en donde el esterol es colesterol o un derivado de colesterol.

15. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo es colesteril (6-hidroxihexil) carbamato o bisdecilamida de ácido 12-hidroxidodecanoico.

16. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el gen objetivo se expresa en una célula seleccionada del grupo que consiste de un hepatocito, una célula pancreática, una célula de útero, una célula de cuello, y una célula de vejiga.

17. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el gen objetivo se expresa en una célula de hígado seleccionada del grupo que consiste de una célula endotelial, una célula Kupffer, y una célula parenquimal.

18. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el virus ARN de hebra (+) es un Virus de Hepatitis C (HCV).

19. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el gen objetivo es al menos una porción de una región 3'-no traducida (3'-UTR) de un Virus de Hepatitis C (HCV).

20. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 1.5.

21. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 2.

22. El dsARN de la reivindicación 1, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 3.

23. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen objetivo en un mamífero, que comprende:

a) un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) que comprende una hebra de ARN complementario, una hebra de ARN codificante y solo un grupo lipófilo que tiene un logK_{ow} que excede en 1, en donde la hebra de ARN complementario tiene una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ARN objetivo, y en donde el ARN objetivo es un mARN transcrito de un gen objetivo o de un virus de ARN de hebra (+), en donde le grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5' de la hebra de ARN complementario y el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra de ARN complementario comprende un grupo fosfodiéster o en donde el grupo lipófilo está covalentemente adherido a un extremo 5' de la hebra de ARN codificante; y

b) un portador farmacéuticamente aceptable.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra de ARN codificante comprende un grupo fosfodiéster.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra de ARN codificante no comprende un grupo fosfodiéster.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde la hebra de ARN complementario comprende un extremo 3' y un extremo 5', y en donde el extremo 3' tiene un nucleótido saliente de 1 a 4 nucleótidos.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde cada una de la hebra de ARN complementario y la hebra de ARN codificante comprende un extremo 3' y un extremo 5', en donde el grupo lipófilo está covalentemente adherido al extremo 5' de la hebra de ARN codificante, y en donde el extremo 3' de la hebra de ARN complementario comprende un nucleótido saliente de 1 a 4 nucleótidos.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde el enlace entre el grupo lipófilo y el extremo 5' de la hebra codificante no comprende un grupo fosfodiéster.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el dsARN está entre 16 y 30 nucleótidos en longitud.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el dsARN está entre 16 y 25 nucleótidos en longitud.

31. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el dsARN está entre 20 y 25 nucleótidos en longitud.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el grupo lipófilo se selecciona del grupo que consiste de una porción aromática, alifática o alicíclica, o una combinación de estas.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el grupo lipófilo es un esteroide o un hidrocarburo alifático ramificado, o una combinación de estos.

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el grupo lipófilo es colesteril (6-hidroxihexil) carbamato o bisdecilamida de ácido 12-hidroxidodecanoico.

35. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el gen objetivo se expresa en una célula seleccionada del grupo que consiste de un hepatocito, una célula pancreática, una célula de útero, una célula de cuello, y una célula de vejiga.

36. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el gen objetivo es un Virus de Hepatitis C (HCV).

37. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el gen objetivo es al menos una porción de una región 3'-no traducida (3'-UTR) de un Virus de Hepatitis C (HCV).

38. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el portador farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa.

39. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el portador farmacéuticamente aceptable no contiene un agente que media la toma del dsARN en una célula.

40. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 1. 5.

41. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 2.

42. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 3.

43. Un método para elaborar un ácido ribonucleico bicatenario (dsARN), comprende las etapas de:

a) preparar una hebra de ARN (complementaria) y una segunda hebra de ARN (codificante) en donde la preparación de las hebras de ARN comprenden síntesis de fase sólida en la dirección 3' y 5', en donde una de las hebras de ARN comprende un grupo lipófilo que tiene un logK_{ow} que excede en 1, en donde el grupo lipófilo está adherido a la primera (complementaria) o segunda (codificante) hebra de ARN, en donde la etapa comprende hacer reaccionar una molécula lipófila que tiene un grupo foramidita con un grupo 5'-hidroxilo de la primera o segunda hebra de ARN; y

b) y mezclar la primera hebra de ARN (complementaria) y la segunda hebra de ARN (codificante) para formar un dsARN.

44. El método de la reivindicación 43, en donde el grupo fosforamidita en la molécula lipófila se forma mediante fosfitilación de un grupo hidroxi.

45. El método de la reivindicación 43, en donde la molécula lipófila tiene un grupo fosforamidita que se forma al convertir un cloroformada de colesterilo en una amida.

46. El método de la reivindicación 43, en donde la molécula lipófila tiene un grupo fosforamidita que se forma al hacer reaccionar un ácido 12-hidroxilaúrico con una di-n-decilamina para formar una amida.

47. El método de la reivindicación 43, en donde la molécula lipófila que tiene un grupo fosforamidita es colesteril N-[6-(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilaminofosfaniloxi]-hexil carbamato o bisdecilamida de ácido 12-[(2-cianoetoxi)-N,N-diisopropilamino-fosfaniloxi] dodecanoico.

48. El método de la reivindicación 43, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow}, que excede 1. 5.

49. El método de la reivindicación 43, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 2.

50. El método de la reivindicación 43, en donde el grupo lipófilo tiene un logK_{ow} que excede 3.