ES2289471T3

ES2289471T3 - Derivados de acido hidroxamico que presentan accion antiinflamatoria.

Info

Publication number: ES2289471T3
Application number: ES04700499T
Authority: ES
Inventors: Massimo Pinori; Paolo Mascagni; Rocco Mazzaferro; Barbara Vergani
Original assignee: Italfarmaco SpA
Current assignee: Italfarmaco SpA
Priority date: 2003-01-10
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2024-01-07
Also published as: DE602004007352D1; US7235689B2; DE602004007352T2; ITMI20030025A1; EP1581484A1; WO2004063146A1; JP4425905B2; US20060100285A1; JP2006515609A; EP1581484B1

Abstract

Compuestos de fórmula (I): en los que: R es hidrógeno, alquilo C1-4 o fenilo; R'' es hidrógeno o alquilo C1-4; A es fenilo sustituido con uno o más grupos seleccionados de: alcoxilo, nitro, perfluoroalquilo, fenoxilo, fenilo, fenilalcoxilo, benzoiloxilo y tioalcoxilo; L está ausente; X está ausente; r y m son, independientemente 0, 1 ó 2; B es fenilo.

Description

Derivados de ácido hidroxámico que presentan acción antiinflamatoria.

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Campo de la invención

La presente invención se refiere a derivados de ácido hidroxámico, en particular derivados de N-hidroxibenzamida, con actividad antiinflamatoria y antitumoral.

Antecedentes de la invención

En la patente estadounidense 6.034.096 se describen derivados de ácido hidroxámico con actividad antiinflamatoria e inmunosupresora. Estos compuestos pueden inhibir la producción de citocinas proinflamatorias, en particular de TNF\alpha (factor de necrosis tumoral) y de interleucina-1-beta y pueden usarse por tanto en el tratamiento de estados que implican la producción excesiva de esas sustancias, tales como enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias o formas tumorales.

Los compuestos descritos en la patente estadounidense 6.034.096 se caracterizan porque contienen dos estructuras cíclicas que están unidas por un grupo urea o carbamato y a su vez uno de ellos está unido a un grupo N-hidroxi-carboxiamida (ácido hidroxámico).

Sumario de la invención

Se ha encontrado ahora que, introduciendo grupos sustituyentes adecuados, distintos de los descritos en el documento US 6.034.096, en la primera estructura cíclica, es posible modular la potencia de la actividad inhibidora de TNF\alpha y obtener compuestos que son metabólicamente estables y sólo ligeramente citotóxicos. Estos compuestos pueden por tanto usarse de manera útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias en las que la producción de TNF\alpha y de otras citocinas proinflamatorias realiza un papel patológico.

Se ha encontrado también que los compuestos de la presente invención son inhibidores de enzimas histona desacetilasas (HDAC) y, como tal pueden usarse de manera útil en el tratamiento de diversos estados patológicos neurodegenerativos, autoinmunitarios o tumorales para los que es útil la inhibición de esas enzimas.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención son los derivados de ácido hidroxámico de fórmula (I):

1

en la que

R: es hidrógeno, alquilo C_{1-4} o fenilo;

R': es hidrógeno o alquilo C_{1-4};

A: es fenilo, preferiblemente sustituido con uno o más grupos seleccionados de: alcoxilo, nitro, perfluoroalquilo, fenoxilo, fenilo, fenilalcoxilo, benzoiloxilo, tioalcoxilo;

L: está ausente;

X: está ausente;

r y m son, independientemente 0, 1 ó 2;

B: es fenilo.

Los compuestos preferidos según la presente invención son aquellos en los que:

R es hidrógeno o metilo, más preferiblemente hidrógeno,

m y r son iguales a cero;

R1 es hidrógeno.

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Además se prefieren particularmente los siguientes compuestos:

N-hidroxi-4-[2-(4-trifluorometil-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-metoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-etoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3-trifluorometil-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(difenil-4-il)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2,3-dimetoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2-fenoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4,5-dimetoxi-2-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2-benciloxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida.

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Los compuestos de fórmula general (I), y esto es un primer aspecto de la invención, pueden inhibir in vitro e in vivo, en concentraciones nanomolares, la producción de TNF\alpha y de otras citocinas proinflamatorias.

Un segundo aspecto de la presente invención consiste en el uso de compuestos de fórmula general (I), solos o en combinación con otros principios activos, para el tratamiento de estados patológicos inflamatorios o autoinmunitarios que se caracterizan por la producción excesiva de TNF\alpha y/o de otras citocinas proinflamatorias tales como, por ejemplo, espondiloartropatía (Expert Opin. Emerging Drugs (2002) 7(2): 235-246), artritis reumatoide (Lancet (1999) 354 (9194): 1932), hepatitis alcohólica aguda (Am. J. Gastroenterology (2001) 96 (12):3361-3367), síndromes inflamatorios del intestino tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Drugs of Today (2000) 36(5):281-293), insuficiencia cardiaca (Heart Fail. Rev. (2001) 6(2): 143), asma (Int. J. Biochem. Cell Biol. (2000) 32 (8): 833), hemorragia cerebral (Stroke (2001) 32:240-248), psoriasis (Drugs Today (1999) 35(12):913), diabetes (J. Autoimmun. (2003) 20 (4): 303-312 Pancreas. (2003) 26 (4): E99-E104), etc.

En un tercer aspecto de la invención, los compuestos de fórmula general (I) son inhibidores de la actividad de enzimas histona desacetilasas.

Un aspecto adicional de la invención consiste por tanto en el uso de compuestos de fórmula general (I), solos o en combinación con otros principios activos, para el tratamiento de estados patológicos tumorales (TRENDS in Endocrinology & Metabolism (2001) 12 (7): 294-300), estados patológicos neurodegenerativos (Nature (2001) 413:739-743), y estados patológicos autoinmunitarios (J. Clinical Investigation (2003) 111:539-552).

Los compuestos (I) son también inhibidores de la enzima histona desacetilasa y por tanto pueden ser útiles en enfermedades tumorales, solos o en combinación con otros principios activos antitumorales; para maximizar el efecto antitumoral, los compuestos (I) se administran preferiblemente en combinación con principios activos antitumorales que presentan un mecanismo de acción distinto de la inhibición de HDAC, por ejemplo, principios activos antiproliferativos.

Por tanto, también son objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula (I); estas composiciones pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, comprimidos recubiertos, cremas, ungüentos o ampollas para administración oral, intramuscular o intravenosa.

En las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente, los compuestos de fórmula (I), solos o en combinación con otros principios activos, pueden mezclarse opcionalmente con vehículos o excipientes convencionales, por ejemplo, los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII, ed. Mack Pub., N.Y., EE.UU.

Los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse mediante el método descrito en el documento US 6.034.096. Alternativamente, los compuestos de la invención pueden prepararse mediante síntesis orgánica en "fase sólida" con el uso de una de las resinas especiales comercialmente disponibles para N-hidroxiamidas. Por ejemplo, puede usarse una resina de poliestireno reticulada con divinilbenceno, funcionalizada con grupos hidroxilamina O-alquilados de residuos de para-alcoxibencilo (resinas de tipo Wang) [véase por ejemplo Richter, L.S. y Desai M. C., Tetrahedron Letters (1996) 38 (3): 321-322].

Los grupos amina que están presentes en la resina pueden acilarse mediante aminoácidos protegidos de manera adecuada en presencia de agentes de condensación adecuados para dar los productos intermedios de fórmula

(II)G-NH-(CH_{2})_{m}-B-(CH_{2})_{r}-CONHO-resina

en la que G es un grupo protector adecuado m, r y B tienen los significados definidos para la fórmula general (I).

Tras la eliminación del grupo protector G, el grupo amina puede acilarse adicionalmente con el uso, tras la activación o en presencia de agentes de condensación adecuados, de ácidos de fórmula (III):

2

en la que R, A, L y X tienen los significados definidos por la fórmula general (I).

Finalmente, los productos de la invención pueden liberarse de la resina mediante tratamiento con ácidos de fuerza media (por ejemplo, ácido trifluoroacético), filtración y posiblemente purificación final.

La presente invención se ilustrará a continuación por medio de algunos ejemplos que tienen meramente el fin de describir de manera adicional los objetos de la presente invención y no están destinados en ningún modo a limitar los objetos de la misma.

Ejemplos

En los ejemplos proporcionados a continuación se utilizan las siguientes abreviaturas:

ACN: acetonitrilo

PVDF: difluoruro de polivinilideno

DCM: diclorometano

DMF: dimetilformamida

HOAt: 1-hidroxi-7-azabenzotriazol

HATU: hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio

TFA: ácido trifluoroacético.

Método de purificación general

A menos que se indique lo contrario, todas las purificaciones finales se realizaron mediante un sistema de preparación de HPLC/EM de Waters con una columna Waters Symmetry C18, 5 \mum, 19 x 50 mm, equipada con un espectrómetro de masas Waters ZQ.

Condiciones operativas:

Ionización centroide ES+, tiempo de barrido 15 min., m/z de barrido 120-1000, voltaje de cono 15V, temperatura de la fuente 120ºC, temperatura de solvatación 250ºC.

Eluyentes de HPLC:

A = H_{2}O,

\hskip0.2cm

B = ACN,

\hskip0.2cm

C = HCOOH

\hskip0.2cm

al 1% en H_{2}O. Gradiente

3

Se disolvió una alícuota del producto bruto que iba a purificarse (30-50 mg) en 0,1 ml de MeOH y se diluyó con 0,4 ml de mezcla de ACN/H_{2}O (1:1; v/v). Se filtró la disolución sobre una membrana de PVDF de 0,45 \mum y se inyectó en el sistema de preparación descrito anteriormente. Para cada serie se recogieron las fracciones correspondientes al pico asociado al ion molecular esperado ([M + H]^{+}), se recombinaron y se concentraron hasta sequedad.

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Ejemplo 1 N-hidroxi-4-[2-(4-trifluorometil-fenil)-acetilamino]-benzamida

Etapa A

Se añadió una mezcla de HOAt (55 mg, 0,4 mmoles) y HATU (152 mg, 0,4 mmoles) en DMF anhidro (0,5 ml), seguido de diisopropiletilamina (0,14 ml, 0,8 mmoles), a una disolución de ácido 4-(9H-fluoren-9-il-metoxicarbonilamino)-benzoico (150 mg, 0,4 mmoles) en DMF anhidro (0,5 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y entonces se transfirió a un reactor que contenía una resina de poliestireno de tipo Wang, funcionalizada con hidroxilamina (0,1 g; 0,1 mmoles), y se agitó la suspensión a temperatura ambiente durante 16 horas. Se filtró la resina y se lavó, por orden, con DMF (5 x 2 ml), DCM (2 x 2 ml), MeOH (2 x 2 ml), DCM (2 x 2 ml), MeOH (2 x 2 ml), DCM (2 x 2 ml) y DMF (5 x 2 ml); finalmente, se filtró la resina y se secó a vacío.

Etapa B

Se expandió la resina obtenida en A en una disolución al 20% de piperidina en DMF (1 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante una hora y luego se filtró, se lavó con DMF (5 x 2 ml), y se secó a vacío.

Etapa C

Se añadieron HATU (381 mg, 1 mmol) y diisopropiletilamina (262 \mul, 1,5 mmoles) a una disolución de ácido (4-trifluorometil-fenil)-acético (184 mg, 0,9 mmoles) en DMF anhidro (1 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y entonces se añadió a la resina obtenida en B y se agitó de nuevo a temperatura ambiente durante 20 horas. Se filtró la resina y se lavó, por orden, con DMF (5 x 2 ml), DCM (2 x 2 ml), MeOH (2 x 2 ml), DCM (2 x 2 ml), MeOH (2 x 2 ml), DCM (5 x 2 ml) y, finalmente, se filtró y se secó a vacío.

Etapa D

Se expandió la resina obtenida en C en una disolución al 50% de TFA en DCM (1 ml) y se sometió a agitación a temperatura ambiente durante una hora y luego se filtró y se evaporó la disolución hasta sequedad. Se recogió el residuo con t-BuOMe y se volvió a evaporar hasta sequedad cinco veces. Se purificó el producto bruto así obtenido mediante HPLC/EM de preparación, seguido del método general descrito anteriormente.

Se obtuvieron 10,5 mg; [M + H]^{+} = 339,3. (calc. 339,1).

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Ejemplo 2

(Comparativo)

N-hidroxi-4-(3-fenilo-butirilamino)-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito en el ejemplo 1, con el uso de ácido 3-fenil-butírico en la etapa C.

Se obtuvieron 8,9 mg; [M + H]^{+} = 299,3 (calc. 299,1).

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Ejemplo 3

(Comparativo)

N-hidroxi-4-[3-(3-metoxi-fenil)-propionilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 3-(3-metoxi-fenil)-propiónico en la etapa C.

Se obtuvieron 15,7 mg; [M + H]^{+} = 315,3 (calc. 315,1).

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Ejemplo 4 N-hidroxi-4-[2-(4-metoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Etapa A

Se suspendió ácido 4-metoxi-fenil-acético (5g) en cloroformo (150 ml); se añadió cloruro de tionilo (10,8 g) a la suspensión y se calentó a reflujo, dando una disolución clara. Tras cuatro horas a reflujo, se evaporó el disolvente a vacío y se recogió el residuo con cloroformo adicional y se evaporó de nuevo. Se disolvió el residuo en tetrahidrofurano (100 ml) y se añadió a la disolución ácido p-amino-benzoico (4,1 g) disuelto en tetrahidrofurano (100 ml). Se dejó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Luego se evaporó a vacío la mezcla de reacción y se cristalizó el residuo en etanol al 70% (250 ml). Se obtuvieron 5,1 g de producto (rendimiento 60%) con una pureza por HPLC superior al 97%.

[M + H]^{+} = 286,3 (calc. 286,1).

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Etapa B

Se suspendió el producto obtenido en la etapa anterior (5 g) en cloroformo (150 ml); se añadió cloruro de tionilo (6,3 g) a la suspensión y se calentó a reflujo dando una disolución clara. Tras cuatro horas a reflujo, se evaporó el disolvente a vacío y se recogió el residuo con cloroformo adicional y se evaporó de nuevo. Se disolvió el residuo en tetrahidrofurano (100 ml) y se añadió a una disolución acuosa de hidroxilamina (50% p/p; 6,5 ml) en tetrahidrofurano (100 ml). Se dejó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Entonces se evaporó a vacío la mezcla de reacción y se cristalizó el residuo en etanol al 70% (100 ml). Se obtuvieron 4,14 g de producto (rendimiento 78%) con una pureza por HPLC superior al 99%; p.f. = 197,6-200ºC (desc.); [M + H]^{+} = 301,3
(calc. 301,1)

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Ejemplo 5 N-hidroxi-4-[2-(4-etoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(4-etoxi-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 14,9 mg; [M + H]^{+} = 315,3 (calc. 315,1).

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Ejemplo 6

(Comparativo)

N-hidroxi-4-[3-(3,5-bis-trifluorometil-fenil)-propionil-amino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 3-(3,5-bis-trifluorometilfenil)-propiónico en la etapa C.

Se obtuvieron 14,9 mg; [M + H]^{+} = 421,3 (calc. 421,1).

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Ejemplo 7 N-hidroxi-4-[2-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 11,4 mg; [M + H]^{+} = 361,4 (calc. 361,1).

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Ejemplo 8

(Comparativo)

N-hidroxi-4-[2-(4-metilsulfanil-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(4-metilsulfanilfenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 10,6 mg; [M + H]^{+} = 317,4 (calc. 317,1).

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Ejemplo 9 N-hidroxi-4-[2-(3-trifluorometil-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(3-trifluorometilfenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 7,9 mg; [M + H]^{+} = 339,3 (calc. 339,1).

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Ejemplo 10 N-hidroxi-4-[2-(3-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(3-nitro-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 16,1 mg; [M + H]^{+} = 316,3 (calc. 316,1).

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Ejemplo 11 N-hidroxi-4-[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(3-fenoxi-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 14,3 mg; [M + H]^{+} = 363,4 (calc. 363,1).

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Ejemplo 12 N-hidroxi-4-[2-(difenil-4-il)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(difenil-4-il)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 9,1 mg; [M + H]^{+} = 347,3 (calc. 347,1).

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Ejemplo 13 N-hidroxi-4-[2-(2,3-dimetoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(2,3-dimetoxi-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 10,8 mg; [M + H]^{+} = 331,3 (calc. 331,1).

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Ejemplo 14

(Comparativo)

Éster 2-[2-(4-hidroxicarbamoil-fenilcarbamoil)-etil]-fenílico del ácido benzoico

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de éster 2-(2-carboxi-etil)-fenílico del ácido benzoico en la etapa C.

Se obtuvieron 18,1 mg; [M + H]^{+} = 405,4 (calc. 405,1).

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Ejemplo 15 N-hidroxi-4-[2-(4-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(4-nitro-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 7,2 mg; [M + H]^{+} = 316,3 (calc. 316,1).

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Ejemplo 16 N-hidroxi-4-[2-(2-fenoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(2-fenoxi-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 14,2 mg; [M + H]^{+} = 363,4 (calc. 363,1).

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Ejemplo 17 N-hidroxi-4-[2-(4,5-dimetoxi-2-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 8,6 mg; [M + H]^{+} = 376,3 (calc. 376,1).

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Ejemplo 18 N-hidroxi-4-[2-(2-benciloxi-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(2-benciloxi-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 10,1 mg; [M + H]^{+} = 377,4 (calc. 377,1).

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Ejemplo 19 N-hidroxi-4-[2-(2-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida

Se preparó el producto mediante el método descrito para el ejemplo 1, con el uso de ácido 2-(2-nitro-fenil)-acético en la etapa C.

Se obtuvieron 12,5 mg; [M + H]^{+} = 316,3 (calc. 316,1).

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Ejemplo 20 Inhibición de la producción de TNF\alpha - determinación in vitro

Se disolvieron los compuestos en DMSO hasta una concentración final de 120 mM y se almacenaron a -80ºC. Se prepararon las disoluciones para la prueba diluyendo las disoluciones madre en RPMI 1640 con la adición de SBF al 1% y DMSO al 0,01% y se filtraron con filtros de 0,2 \mum.

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de "capas leucocíticas" de donantes sanos mediante la separación en un gradiente de Ficoll-Hypaque. Se extendieron las células en placas de 96 pocillos a una concentración de aproximadamente 500.000 células por pocillo, suspendidas en RPMI 1640 que contenía SBF al 1% y se incubaron a 37ºC en presencia de diversas concentraciones (desde 10^{-6} hasta 10^{-11} M) de los compuestos que iban a someterse a prueba.

Tras 1 hora, se añadió LPS (hasta una concentración final de 10 ng/ml; obtenido de E. coli 055:B5) y se incubaron las placas a 37ºC durante 24 horas adicionales.

Tras la finalización, se recogieron los líquidos sobrenadantes y se usaron para la determinación del contenido en TNF\alpha mediante ELISA (kit de ELISA de Duoset; R&D systems, Minneapolis, MN, EE.UU.).

Se calculó la concentración de TNF\alpha con el uso de una curva de calibración y se calcularon los valores de CI_{50} (la concentración que inhibe la producción de la citocina al 50%) a partir de la curva obtenida, dando el porcentaje de los valores de inhibición para cada concentración individual de compuesto sometido a prueba.

Los valores obtenidos para los compuestos descritos en los ejemplos anteriores se proporcionan en la siguiente tabla (los valores son el promedio de los resultados obtenidos en al menos dos determinaciones, realizadas con células de diferentes donantes).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Inhibición de la producción de TNF\alpha en monocitos humanos estimulados con LPS

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Ejemplo 21 Inhibición de la producción de TNF\alpha - determinación in vivo

Para los compuestos de la presente invención, se evaluó en ratones la capacidad para inhibir la producción de TNF\alpha inducida por la administración de LPS.

Se administró una cantidad letal de LPS (E. coli 055:B5; 2 mg/kg) a los animales (ratones hembra CD1) por una vía intraperitoneal; se sacrificaron los animales 90 min. tras la administración y se determinó el contenido en TNF\alpha presente en la sangre mediante un ensayo ELISA.

Los compuestos sometidos a prueba, suspendidos en Metil Cellosolve (al 0,5% en agua), se administraron por vía oral, 60 min. antes de la administración de LPS, a una dosis de 1 mg/kg.

Los resultados se proporcionan en la siguiente tabla; los valores se expresan como porcentaje de la inhibición de la producción de TNF\alpha en comparación con el grupo control.

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TABLA 2 Inhibición de la producción de TNF\alpha en ratones

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Ejemplo 22 Resistencia metabólica in vitro

Se evaluó la resistencia metabólica de algunos compuestos descritos en los ejemplos anteriores incubando las sustancias con la fracción S9 de una preparación microsomal de células hepáticas. Se incubó cada compuesto (6 \mug/ml) a 37ºC durante 30 min. en tampón fosfato (pH 7,4) que contenía la fracción S9 (contenido en proteínas 2 mg/ml). Se paró la reacción enfriando en un baño de hielo y añadiendo un volumen igual de agua/acetonitrilo (50:50) que contenía el 0,2% de ácido trifluoroacético. Tras centrifugar, se analizó una alícuota del líquido sobrenadante mediante HPLC para evaluar el porcentaje de producto que había permanecido intacto.

Los porcentajes de producto que no había cambiado que estaban presentes tras la incubación durante 30 min. se proporcionan en la siguiente tabla.

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TABLA 3 Transformación metabólica por medio de la fracción S9 de hígado

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Ejemplo 23 Citotoxicidad in vitro

Se evaluó la citotoxicidad de algunos compuestos descritos en los ejemplos anteriores in vitro sobre la línea de células de hepatoma HEP-G2 mediante un método colorimétrico comercial (Cell Titer 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay - Promega); el método determina el número de células vivas en base a su capacidad para metabolizar una sal de tetrazolio que produce formazán. La cantidad producida de formazán es proporcional al número de células vivas.

Se distribuyeron las células HPE-G2 en microplacas de 96 pocillos a una densidad de 4 x 10^{4} células/pocillo (100 \mul) en medio M199 que contenía el 10% de suero bovino fetal y complementos (medio completo).

Tras la incubación durante 24 h (37ºC, CO_{2} al 5%, humedad del 90%) se lavaron las células una vez y se sustituyó el medio por 200 \mul de medio completo que contenía las sustancias que iban a someterse a prueba a concentraciones finales de 10^{-5}, 10^{-6} y 10^{-7} M. La prueba se realizó por triplicado.

Se incubaron las placas durante 48 h adicionales, tras lo que se eliminaron 100 \mul de medio y se añadieron 20 \mul por pocillo de disolución de tinte de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se leyó la densidad óptica (\lambda = 490 nm) tras la incubación durante 1 h a 37ºC con el uso de un lector de placa (Victor 2 - Wallace Perkin Elmer).

Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición de la formación de formazán en comparación con el control. Los valores obtenidos a la concentración de 10^{-6} M se proporcionan en la siguiente tabla.

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TABLA 4 Porcentajes de citotoxicidad hacia las células HEP-G2

7

Ejemplo 24 Inhibición de la actividad enzimática de la histona desacetilasa

Se evaluó la capacidad de los compuestos de la invención para inhibir la actividad de la enzima histona desacetilasa con el uso de la enzima HADC-1 de ratón. El ensayo se realizó mediante el método ya descrito en la bibliografía [Biochem. Biophys. Acta, 1996, vol. 1296, pág. 181]. Los valores de CI_{50} (la concentración que inhibe la actividad de la enzima al 50%) se derivaron de los porcentajes de inhibición obtenidos con diversas concentraciones del compuesto sometido a prueba; estos valores se proporcionan en la siguiente tabla.

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TABLA 5

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Claims

1. Compuestos de fórmula (I):

10

en los que:

R es hidrógeno, alquilo C_{1-4} o fenilo;

R' es hidrógeno o alquilo C_{1-4};

\quad: A es fenilo sustituido con uno o más grupos seleccionados de: alcoxilo, nitro, perfluoroalquilo, fenoxilo, fenilo, fenilalcoxilo, benzoiloxilo y tioalcoxilo;

L está ausente;

X está ausente;

r y m son, independientemente 0, 1 ó 2;

B es fenilo.

2. Compuestos según la reivindicación 1, en los que R es hidrógeno.

3. Compuestos según la reivindicación 1, en los que R es metilo.

4. Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en los que m y r son iguales a cero.

5. Compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en los que R' es hidrógeno.

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6. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, seleccionado de:

N-hidroxi-4-[2-(4-trifluorometil-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-metoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-etoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3-trifluorometil-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(difenil-4-il)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2,3-dimetoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2-fenoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4,5-dimetoxi-2-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2-benciloxi-fenil)-acetilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(2-nitro-fenil)-acetilamino]-benzamida.

7. Un compuesto según la reivindicación 6, que es N-hidroxi-4-[2-(4-metoxi-fenil)-acetilamino]-benzamida.

8. Compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso como medicamentos.

9. Uso de compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para la preparación de medicamentos con actividad autoinmunitaria y/o antiinflamatoria para el tratamiento de enfermedades tales como espondiloartropatía, artritis reumatoide, hepatitis alcohólica aguda, síndromes inflamatorios del intestino (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), asma, diabetes, insuficiencia cardiaca, hemorragia cerebral, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, glomerulonefritis, lupus eritematoso sistémico, obstrucción pulmonar crónica, fibrosis pulmonar, esclerosis múltiple, septicemia, choque septicémico, etc.

10. Uso de los compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y/o tumorales.

11. Uso de los compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y al menos un principio activo con acción antitumoral, para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y tumorales.

12. Composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, mezclados con vehículos y/o excipientes adecuados.

13. Composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y al menos un principio activo con acción antitumoral, mezclados con vehículos y/o excipientes adecuados.