ES2288777T3

ES2288777T3 - Utilizacion de agentes anti-prolactina para el tratamiento del cancer.

Info

Publication number: ES2288777T3
Application number: ES99921843T
Authority: ES
Inventors: Wen Y. Chen; Thomas E. Wagner
Original assignee: GHC Research Development Corp
Current assignee: GHC Research Development Corp
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: JP5259896B2; JP2013224309A; EP1079851B1; JP2012020996A; JP5453355B2; EP1079851A4; WO1999058142A1; JP2002515404A; US7115556B2; US20070060520A1; AU3895299A; ATE366114T1; US20030022833A1; EP1079851A1; DK1079851T3; WO1999058142A9; JP2011079821A; CA2328520A1; DE69936451D1; EP2316467A1

Abstract

Uso de una variante de prolactina humana, que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de cáncer de mama o próstata, que expresa un receptor de prolactina.

Description

Utilización de agentes anti-prolactina para el tratamiento del cáncer.

1. Introducción

La presente invención se refiere a la inhibición de los efectos estimulantes de la proliferación celular de la prolactina en su receptor. La invención se puede utilizar en el tratamiento de afecciones tanto benignas como malignas que comprenden una proliferación celular no deseada.

2. Antecedentes de la invención

La prolactina ("PRL") es una hormona neuro-endocrina de 23 kDa, relacionada estructuralmente con la hormona del crecimiento y, en menor medida, con miembros de la familia de las interleuquinas (Reynolds et al., 1997, Endocrinol. 138:5555-5560, Cunningham et al., 1990, Science 247:1461-1465; Wells et al., 1993, Recent Prog. Horm. Res. 48:253-275). Actuando a través del receptor de prolactina, es necesaria para la proliferación y diferenciación terminal del tejido mamario (Mani et al., 1986, Cancer Res. 46:1669-1672; Malarkey et al., 1983, J. Clin. Endocrinol. Metab. 56:673-677; Biswas y Vonderhaar, 1987, Cancer Res. 47:3509-3514), estimular el crecimiento y diferenciación del epitelio ductal, la proliferación y diferenciación de unidades lobulares, y el inicio y mantenimiento de la lactancia (Kelly et al., 1993, Recent Prog. Horm. Res. 48:123-164; Shiu et al., 1987, Recent Prog. Horm. Res. 43:277-303). Se ha atribuido a la PRL una diversidad de efectos adicionales, incluidas funciones en la reproducción y en la respuesta inmunológica (Wennbo et al., 1997, Endocrinol. 138:4410-4415; Nicoll, 1974, en Handbook of Physiology, Knobil y Sawyer, eds., American Physiological Society, Washington, D.C.; Shiu y Friesen, 1980, Annu. Rev. Physiol. 42:83-96).

El receptor de prolactina ("PRLR") es miembro de la superfamilia de receptores de citoquinas y fija un grupo de hormonas, que incluye no sólo prolactina sino también lactógenos placentarios y hormona del crecimiento primaria ("GH") para producir un efecto mitógeno (Ormandy et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:3692-3699; Horseman, 1995, Endocrinol. 136:5249-5251; Clevenger et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6460-6464; Buckley et al., 1985, Life Sci. 37:2569-2575; Costello et al., 1994, Prostate 24:162-166). El PRLR es homólogo al receptor de GH ("GHR", también conocido como receptor somatógeno), y los dos pertenecen a la superfamilia de los receptores de citoquinas (Kelly et al., 1991, Endocrin. Rev. 12:235-251; Kelly et al. 1993, Recent Prog. Horm. Res. 48:123-164; Horseman y Yu-Lee, 1994, Endocrin Rev. 15:627-649).

Se ha propuesto una asociación entre la actividad de PRL y el cáncer de mama (Ormandy et al., 1997, J. Clin. Endocrin. Metab. 82:3692-3699). Se ha observado que los niveles elevados de PRL aceleran el crecimiento de tumores mamarios inducidos por 7,12-dimetil-benzo(\alpha)-antraceno en la rata, en tanto que se ha observado de la ablación de PRL ejerce un efecto inhibitorio (Welsch, 1985, Cancer Res. 45:3415-3443). En ratones transgénicos que sobre-expresan GH humana, que se fija al PRLR de roedores, se ha observado un incremento del crecimiento de tumores mamarios (Bartke et al., 1994, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 206:345-359). Se ha establecido que los receptores para esteroides sexuales y PRL se co-expresan y co-regulan, lo que podría explicar las acciones sinérgicas de estrógeno, progesterona y PRL en el control del crecimiento tumoral (Ormandy et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:3692-3699).

Sin embargo, hasta la fecha, las terapias dirigidas a reducir los niveles de PRL tales como hipofisectomía y administración de bromocriptina (ambas dirigidas a disminuir o eliminar la producción de PRL por parte de la glándula pituitaria) no han tenido éxito en el tratamiento del cáncer de mama (Peyrat et al., 1984, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 20:1363-1367; Heuson et al., 1972, Eur. J. Cancer 8:155-156). No obstante, se ha propuesto que PRL puede desempeñar una función en el cáncer de mama si existe un giro autocrino/paracrino regulador del crecimiento (es decir, que la pituitaria sea sólo una de varias fuentes de prolactina; véase Clevenger et al., 1995, Am. J. Pathol. 146:695-705; Fields et al., 1993, Lab. Invest. 68:354-360; Ginsburg y Vonderhaar, 1995, Cancer Res. 55:2591-2595; Fuh y Wells, 1995, J. Biol. Chem. 270:13133-13137). En este sentido, al analizar mediante técnicas de transcriptasa inversa/PCR para detectar los niveles de ARN de PRL y PRLR, se observó que PRL y PRLR estaban extensamente expresados en cánceres de mama (>95%) y en los tejidos mamarios normales (>93%), lo que indica que las intervenciones sobre PRL/receptor de PRL pueden ser de utilidad en el tratamiento del cáncer de mama (Reynolds et al., Endocrinol. 138:5555-5560). De hecho, se ha informado recientemente de que un régimen combinado que asocia un anti-estrógeno (tamoxifeno), un análogo de GH (octreotide) y un potente anti-prolactina (CV 205-502, un agonista de dopamina que inhibe la secreción de prolactina por parte de la pituitaria) exhibe mejores resultados clínicos en pacientes con cáncer de mama metastático, en comparación con la terapia de tamoxifeno sola (Botenbal et al., 1998, Br. J. Cancer 77:115-122).

Asimismo, se ha propuesto una asociación entre la expresión de PRL y la enfermedad prostática (Wennbo et al., 1997, Endocrinol. 138:4410-4415). En el tejido prostático se encuentran receptores de PRL (Aragona y Friesen, 1975, Endocrinol. 97:677-684; Leake et al., 1983, J. Endocrinol. 99:321-328). Se ha observado que los niveles de PRL se incrementan con la edad (Hammond et al., 1977, Clin. Endocrinol. 7:129-135; Vekemans y Robyn, 1975, Br. Med. J. 4:738-739), en coincidencia con el desarrollo de la hiperplasia prostática, y se ha encontrado que PRL tiene efectos tróficos y diferenciadores sobre el tejido de la próstata (Costello y Franklin, 1994, Prostate 24:162-166). Ratones transgénicos que sobre-expresan el gen PRL desarrollaron incrementos destacados de tamaño de la glándula prostática (Wennbo et al., 1997, Endocrinol. 138:4410-4415). Sin embargo, el papel de PRL en la enfermedad prostática sigue sin estar claro (Wennbo et al., 1997, Endocrinol. 138:4410-4415). En pacientes con hiperplasia prostática se ha informado de que los niveles de PRL están aumentados (Odoma et al., 1985, J. Urol. 133:717-720; Saroff et al., 1980, Oncology 37:46-52), aumentados sólo en pacientes con cáncer de próstata o no modificados (Harper et al., 1976, Acta Endocrinol. (Copenhague) 81:409-426). Janssen et al. han comunicado que la proliferación de líneas celulares de la próstata humana insensibles a andrógenos se puede modular de forma significativa por PRL (1996, Cancer 77:144-149). Para explicar estas discrepancias, se ha propuesto que la síntesis local de PRL en la próstata (Nevalainen et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:618-627) puede ser un factor importante. Se ha observado expresión de PRL, dependiente de andrógenos, en el epitelio prostático de la rata, lo que contribuye a confirmar el concepto de giro autocrino/paracrino de la acción de prolactina en la próstata, en donde podría mediar los efectos asociados a los andrógenos (Nevalainen et al., 1997, FASEB J. 11(4):1297-1307). Datos clínicos adicionales parecen ser prometedores: se ha observado que la hipofisectomía tiene un efecto terapéutico aditivo cuando se combina con castración y adrenalectomía en pacientes con cáncer de próstata (Brendler, 1973, Urology 2:99-102), y Rana et al., informan de que una supresión combinada máxima de andrógenos y prolactina tiene como resultado una respuesta clínica significativamente mejor con respecto a los tratamientos convencionales de pacientes afectos de cáncer de próstata avanzado (Habib et al., 1995, Eur. J. Cancer 31A:859-860).

A la vista de la relevancia biológica de la molécula de PRL y su receptor, numerosos investigadores han evaluado la actividad de variantes de PRL, portadoras de diferencias estructurales en relación con la molécula nativa no modificada. Se ha comunicado que la PRL fosforilada naturalmente de rata antagoniza los efectos estimulantes del crecimiento de la PRL no modificada, en un ensayo que mide la proliferación de células del linfoma Nb2T de rata, y en la regulación autocrina de la proliferación de células GH_{3} (Wang y Walker, 1993, Endocrinol. 133:2156-2160; Krown et al., 1992, Endocrinol. 122:223-229). Adicionalmente, análogos moleculares de PRL fosforilada, que tienen un aminoácido voluminoso con carga negativa (a saber, glutamato o aspartato) que sustituye la serina en la posición 179, antagonizaron los efectos estimulantes del crecimiento de PRL (Chen et al., 1998, Endocrinol. 139:609-616).

Otras estrategias para el diseño de variantes de PRL han estado dirigidas a interrumpir la interacción entre PRL y su receptor. Con este objetivo, los investigadores han establecido analogías entre el PRLR y el GHR, para el cual las relaciones de estructura/función están mejor comprendidas.

Determinadas características del GHR se han descubierto estudiando la base para la actividad antagonista total de GH de la variante de GH humana ("hGH"), en la que la glicina de la posición 120 está sustituida por un residuo de arginina (Chen et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87-5061-5065; Chen et al., 1991, Mol. Endocrinol. 5:1845-1852; Chen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897; Chen et al., 1995, Mol. Endocrinol. 9:1-7; Patente de Estados Unidos Nº 5.350.836, de Kopchick y Chen; Patente de Estados Unidos Nº 5.681.809 de Kopchick y Chen). Se dedujo que hGH forma un complejo con una forma dímera del hGHR. Fuh y colaboradores propusieron un modelo de dimerización secuencial, en el que GH se uniría inicialmente a un receptor a través de un primer sitio de unión (delimitado por porciones de la hélice 1, hélice 4 y giro 1 de GH), para formar un complejo intermedio inactivo 1:1 y, a continuación, la hGH unida al complejo interactuaría con un segundo receptor a través del sitio de unión 2 (que comprende la glicina de la hélice 3 de GH mutada en la variante G120R), para producir el complejo activo 1:2 hormona/receptor (Fuh et al., 1992, Science 256:1677-1680; Fuh et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:5376-5381; Goffin et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:32598-32606). Cuando la glicina de la hélice 3 en la posición 120 de esta GH se sustituye con un residuo de arginina, el segundo sitio de unión queda estéricamente impedido, y la GH ya no puede inducir la dimerización del receptor.

Aunque es menos lo que se conoce sobre la estructura del PRLR, se ha señalado que también éste está activado por una dimerización secuencial mediada hormonalmente (Cunningham et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:3407-3411; Fuh et al., 1992, Science 256:1677-1680; Fuh et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:5376-5381). Se produjeron variantes de PRL humana ("hPRL"), que contienen mutaciones en la región que se cree que corresponde con la interface de hélice 3/hélice 1 de GH, incluidas mutaciones de la alanina en posición 22, la leucina en posición 25, la serina en posición 26 y la glicina en la posición 129 de PRL a triptófano y/o arginina (específicamente, para crear A22W, L25R, L25W, S26R, S26W y G129R; Goffin et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:32598-32606). Se comunicó en ese estudio que las mutaciones puntuales en A22, S26 y G129 reducen drásticamente la potencia mitógena de la variante (en comparación con la PRL nativa) en 2-3 órdenes de magnitud (según se comprueba en el ensayo de proliferación Nb2), aun cuando se informó de que la variante G129R (análoga posicionalmente a G120R de GH) actúa como débil agonista y no como antagonista. Subsiguientemente, se informó de que, cuando se analiza en un ensayo de actividad del PRLR, en el cual al exponer a la variante de hPRL G129R células co-transfectadas con ácido nucleico que codifica el hPRLR y un gen informador bajo control de las secuencias de ADN que responden a PRL, se observó un efecto antagonista (Goffin et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:16573-16579).

Es posible que existan antagonistas de origen natural a la acción de GH. En el hombre y determinados animales se ha identificado una forma truncada y acelular del GHR (designado "GH-BP") (Baumann, 1991, Acta Endocrinol. 124 (supl.2): 21-26; Baumann et al., 1994, J. Endocrinol. 141:1-6; Baumann, 1995, Endocrinol. 136:377-378). La forma humana de GH-BP incluye el dominio extracelular del receptor, y podría ser resultado de la escisión proteolítica del receptor nativo o empalme alternativo de ARN. Se ha indicado que GH-BP actúa inhibiendo la unión de GH a sus receptores (Baumann, 1991, Acta Endocrinol. 124(Supl. 2):21-26; Baumann et al., 1994, J. Endocrinol. 141:1-6). La observación de que los niveles de GH-BP en pacientes afectos de acromegalia (debida a una sobre-expresión de GH) tienen una relación inversa con los niveles séricos de GH (es decir, cuanto menos GH-BP, mayor cantidad de GH sérica presente; Amit et al., 1992, Hormone Res. 37:205-211) contribuye a confirmar esta hipótesis. Los niveles menores de GH-BP pueden hacer que la GH sérica acromegálica sea relativamente más activa en el ensayo del receptor de GH y, por lo tanto, contribuir de manera negativa a la enfermedad (Hochberg et al., 1994, Acta Endocrinol. 125:23-27). También se han observado formas solubles de otros receptores en la superfamilia de receptores de citoquinas (Baumann, 1995, Endocrinol. 136:377-378). Sin embargo, antes de la presente invención, no ha habido ninguna prueba que demuestre la existencia de una forma acelular del PRLR de origen natural.

3. Resumen de la invención

La presente invención se refiere a la inhibición de los efectos estimulantes de la proliferación celular de prolactina sobre su receptor.

En un primer conjunto de realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una variante de prolactina humana que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para la preparación de un medicamento dirigido a inhibir la proliferación de una célula de cáncer de mama o próstata que expresa un receptor de prolactina. La invención se basa en la observación de que una variante de prolactina es capaz de inhibir la proliferación celular de manera dependiente de la dosis. Adicionalmente, se ha observado que la variante de prolactina es capaz de inducir la apoptosis de células cancerosas. La variante de prolactina es una forma mutada de prolactina humana, en la que el aminoácido glicina de la posición 129 está sustituido con otro aminoácido. En realizaciones específicas y no limitantes, la glicina de posición 129 de la prolactina humana está sustituida con arginina. La variante de prolactina se puede utilizar conjuntamente con un anti-estrógeno. Estos anti-estrógenos incluyen, pero sin estar limitados a ellos, tamoxifeno, raloxifeno, o ICI 164384 (Imperial Chemical Industries). Esto se basa en la observación de que la administración de una variante de prolactina junto con un anti-estrógeno induce un efecto inhibitorio sinérgico sobre la proliferación celular. Adicionalmente, la variante de prolactina se puede utilizar conjuntamente con un anti-andrógeno. Estos anti-andrógenos incluyen, pero sin estar limitados a ellos, flutamida, anadrona o acetato de ciproterona, para inducir una inhibición sinérgica de la proliferación celular (véanse Smith, D.C., 1997, Semin. Urol. Oncol. 15:3-12, como revisión de la terapia anti-andrógena; Gomella, I.M., 1997, 3:16-24; Suciu, S., 1993, Cancer 15:3841-6).

También se describe en este documento una forma truncada del receptor de prolactina, que es capaz de unirse a la prolactina y, de este modo, disminuye la disponibilidad de prolactina para unirse a su receptor. Las variantes de prolactina y los receptores truncados de prolactina se pueden utilizar en métodos que inhiben la proliferación de células que expresan receptores de prolactina.

La presente invención ofrece, además, el uso de una variante de prolactina humana que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para preparar un medicamento capaz de inducir la apoptosis celular en una célula de cáncer de mama o próstata que expresa un receptor de prolactina. La invención se basa en la observación de que una variante de prolactina es capaz de inducir apoptosis celular en células de cáncer de mama humano.

En todavía otras realizaciones de la invención, la presente invención proporciona un método in vitro para identificar un compuesto capaz de modular la actividad del receptor de prolactina, método que comprende:

a.: Poner en contacto un compuesto con una célula que expresa el receptor de prolactina;

b.: medir el nivel de apoptosis en la célula; y

c.: comparar el nivel de apoptosis obtenido en (b) con el nivel alcanzado en ausencia del compuesto;

de forma que si el nivel obtenido en (b) difiere al alcanzado en ausencia del compuesto, se ha identificado un compuesto capaz de modular la actividad del receptor de prolactina.

En todavía otra realización de la invención, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende una variante de la prolactina humana que está unida a otra proteína, en donde la variante tiene una sustitución de la glicina en posición 129.

En consecuencia, la invención se puede utilizar en el tratamiento de trastornos clínicos en humanos y animales que comprenden una proliferación celular no deseada. En realizaciones específicas, la presente invención se puede utilizar en el tratamiento del cáncer de mama y próstata en seres humanos.

4. Breve descripción de los dibujos

Figura 1A. Representación esquemática de la clonación y construcción del plasmidio de expresión pUCIG-MT-hPRLcDNA.

Figura 1B. Mapa del plasmidio y estrategia general de la mutagénesis dirigida por PCR. pcDNA3, el vector parental, contiene secuencias reguladoras de la transcripción inmediata-precoz de citomegalovirus (CMV), y la señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de transcripción del gen bovino de GH (BGH pA). El ADNc de hPRL se clonó utilizando PCR-RT de ARNm pituitario humano, y se insertó en sitios BstX1. La mutación se diseñó diseñando cebadores de PCR en sitios Xba I.

Figura 2. Datos de experimentos de fijación competitiva de radiorreceptores para hGH y hPRL, usando diversas líneas celulares de cáncer humano (enumeradas en el eje x). HTB123 y T47D son líneas celulares de cáncer de mama humano. El eje y representa el porcentaje de fijación específica. Cada punto representa la media de tres experimentos, cada uno de los cuales se llevó a cabo por duplicado.

Figura 3. Análisis por transferencia de western que muestra la fosforilación de proteínas STAT (banda en la flecha) en células de cáncer de mama humano T47D bajo diversas condiciones. De izquierda a derecha, la pista 1 muestra el cultivo de control, la pista 2 muestra un cultivo que recibe 5 nM de hPRL, la pista 3 muestra un cultivo que recibe 5 nM de hPRLA, la pista 4 muestra los efectos competitivos cuando el cultivo se expone a 5 nM de hPRL y 5 nM de hPRLA, y la pista 5 muestra los efectos competitivos cuando el cultivo se expone a 5 nM de hPRL y 25 nM de hPRLA.

Figura 4. Efectos de la hormona del crecimiento y prolactina sobre la proliferación celular en el cáncer de mama. El eje x representa la concentración de hGH o hPRL presente en los medios de cultivo de células de cáncer de mama humano T47D. El eje y representa el número total de células al final del período de incubación. Los puntos son la media (+ SD/DE) de tres experimentos, cada uno de los cuales se llevó a cabo por duplicado.

Figura 5A-B. (A) Efectos de diversas concentraciones de hPRL sobre la variante de prolactina G129R hPRLA sobre la proliferación de células de cáncer de mama humano T47D en cultivo. (B) Efectos de diversas concentraciones de estrógeno (E2) y tamoxifeno (Tam) sobre la proliferación de células T47D durante un período de 24 ó 72 horas.

Figura 6. Diagrama de un ensayo de cultivo celular mixto para evaluar los efectos de hPRL recombinante y de la variante de prolactina G129R hPRLA sobre la proliferación de células T47D.

Figura 7. Efectos de hPRL expresada de forma recombinante (L-PRL) y de la variante de prolactina G129R hPRLA (L-PRLA) sobre la proliferación de células de cáncer de mama T47D en un ensayo de cultivo celular mixto, después de 24 y 72 horas.

Figura 8. Efectos de hPRL expresada de forma recombinante (L-PRL) y de la variante de prolactina G129R (L-PRLA) sobre la proliferación de células de cáncer de mama T47D en un ensayo de cultivo celular mixto, después de uno (D1), dos (D2), tres (D3) o cinco (D5) días.

Figura 9A-B. Proliferación de (A) células de cáncer de mama humano T47D, o (B) células de cáncer de mama humano MCF-7 en ensayos de cultivo celular mixto con células L, que expresan la variante de prolactina humana G129 recombinante hPRLA, después de tres días en cultivo.

Figura 10A-B. Secuencias de aminoácidos de diversas formas humanas y no humanas de prolactina.

Figura 11. Ilustración esquemática del mecanismo de antagonista de GH o hPRL (ligando). Cuatro regiones helicoidales en el ligando (óvalos de líneas punteadas) se marcan como I, II, III y IV. Se muestran también en la figura dos receptores unidos a membrana (óvalos sombreados). Arg representa la mutación de sustitución en la tercera hélice \alpha, que da como resultado un impedimento para que el segundo receptor forme un complejo funcional (de A a B).

Figura 12. Análisis por inmuno-transferencia de la expresión génica de hPRL-G129R por parte de células L de ratón transfectadas con el vector pcDNA3, manipulada por ingeniería genética para codificar la variante G129R. Las pistas A-D representan muestras que contienen hPRL purificada (de NIH) como estándares. Las pistas E-H representan medios de cultivo de células L de ratón transfectadas de forma estable.

Figura 13. Efectos antagonistas de hPRL-G129R sobre la fosforilación de tirosina de proteínas STAT inducidas por hPRL en células de cáncer de mama humano (T47D). Las asignaciones de pista fueron A, control negativo; B, células estimuladas con 100 ng/ml de hPRL; C, células tratadas con 100 ng/ml de hPRL-G129R; D, células tratadas con 100 ng/ml de hPRL y 100 ng/ml de hPRL-G129R; E, células tratadas con 100 ng/ml de hPRL y 500 ng/ml de hPRL-G129R. La flecha indica la posición de proteínas de 95 kDa.

Figura 14A-E. Examen a microscopia óptica de células de cáncer de mama humano T47-D después de una dosis única de 200 ng/ml de hPRL (15B); 200 ng/ml de hPRL-G129R (15C); 200 nM de E2 (15D); o tratamiento con 200 nM de 4-OH-Tamoxifeno (15E), después de una incubación de 4 días, comparado con el control (15A). x200.

Figura 15. Efectos de respuesta a la dosis de hPRL y sus efectos sinérgicos con E2 en el ensayo de proliferación de células de cáncer de mama humano T47-D. El eje x representa la concentración de hPRL en ausencia (barras abiertas) o en presencia de E2. Cada punto de datos representa una media de al menos tres experimentos independientes con pocillos triplicados. Barras, SD (DE).

Figura 16A-B. Efectos de respuesta a la dosis de 4-OH-Tamoxifeno (16A) y hPRL-G129R (16B). El eje x representa la concentración de 4-OH-Tamoxifeno (16A) y hPRL-G129R (16B). Cada punto de datos representa una media de al menos tres experimentos independientes con pocillos triplicados. Barras, SD (DE).

Figura 17. Efectos inhibitorios de respuesta a la dosis de hPRL-G129R sobre la proliferación inducida por hPRL de células T47-D. El eje x representa la concentración de hPRL-G129R en ausencia de hPRL (barras abiertas) y en presencia de hPRL. Cada punto de datos representa una media de al menos tres experimentos independientes con pocillos triplicados. Barras, SD (DE).

Figura 18. Efectos inhibitorios de respuesta a la dosis de hPRL-G129R y sus efectos sinérgicos con 4-OH-Tamoxifeno en el ensayo de proliferación de células de cáncer de mama humano T47-D. El eje x representa la concentración de hPRL-G129R en ausencia (barras abiertas) o en presencia de 4-OH-Tamoxifeno. Cada punto de datos representa una media de al menos tres experimentos independientes con pocillos triplicados. Barras, SD (DE).

Figura 19A-B. Efectos inhibitorios de respuesta a la dosis de hPRL-G129R en dos líneas de células de cáncer de mama humano, utilizando el método de co-cultivo. El eje x representa la célula L co-cultivada (control) o los números de células L-hPRL-G129R. Cada punto de datos representa una media de al menos tres experimentos independientes con pocillos triplicados. Barras, SD (DE).

Figura 20A-F. Respuestas a la dosis de células de cáncer de mama humano T47-D a hPRL-G129R después de 24 horas de tratamiento, utilizando el ensayo TUNEL (paneles A-F). Los paneles (G) y (H) muestran los resultados de competición entre hPRL y hPRL-G129R en una relación de 1:1 (125 ng/ml de hPRL + 125 ng/ml de hPRL-G129R; panel G) y una relación de 1:4 (125 ng/ml de hPRL-G129R+500 ng/ml de hPRL, panel H).

Figura 21A-E. Evolución en el tiempo de la respuesta de las células de cáncer de mama humano T47-D al tratamiento de hPRL-G129R (50 ng/ml), utilizando el ensayo TUNEL.

Figura 22A-H. Respuesta de múltiples células de cáncer de mama a tratamiento de 4-OH-Tamoxifeno (1\muM durante 24 horas), utilizando el ensayo TUNEL. Las marcas C y T indican células de control y tratadas, respectivamente.

Figura 23A-F. Respuesta de múltiples células de cáncer de mama al tratamiento con 250 ng de hPRL-G129R durante 24 horas, utilizando el ensayo TUNEL. Las marcas C y T indican células de control y tratadas, respectivamente.

Figura 24. Inducción de caspasa por hPRL-G129R. Se muestra el efecto de hPRL-G129R sobre la activación de Caspasa-3 en células T47-D, utilizando un kit de ensayo ApopAlert CPP32/Caspasa-3 (Clontech, Palo Alto, CA). Las células T47-D se trataron con 250 ng/ml de hPRL-G129R durante 2 h. El ensayo se llevó a cabo en presencia de DEVD-CHO (inhibidor de caspasa-3) para poner de manifiesto que la inducción de Caspasa-3 por medio de hPRL-G129R es un evento específico. Las muestras se realizaron por duplicado y cada muestra estuvo constituida por aproximadamente 2 millones de células.

Figura 25. Respuesta de dos células de cáncer de próstata al tratamiento con 250 ng de hPRL-G129R durante 24 horas, utilizando el ensayo TUNEL.

5. Descripción detallada de la invención

Con fines de claridad, pero no de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes sub-secciones:

(i): variantes de prolactina

(ii): receptores de prolactina truncados; y

(iii): utilidad de la invención.

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5.1 Variantes de prolactina

En este documento se describen variantes de prolactina (PRL) que antagonizan la acción de PRL en su receptor.

El término prolactina (PRL) hace referencia, en el presente documento, a formas humanas y no humanas de la hormona prolactina. Estas prolactinas incluyen, pero sin estar limitadas a las mismas, prolactinas cuyas secuencias de aminoácidos se exponen en la Figura 10 (véanse también Cooke et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:4007; Cooke et al., 1980, J. Biol. Chem. 225:6502; Kohmoto et al., 1984, Eur. J. Biochem. 138:227; Tsubokawa et al., 1985, Int. J. Peptide Protein Res. 25:442; Bondar et al., 1991, Nº de Acceso a GenBank X63253; Sasavage et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:678; Miller et al., 1980, Endocrinol. 107:851; Li et al., 1970, Arch. Biochem. Biophys. 141:705; Li, 1976, Int. J. Peptide Protein Res. 8:205; Martinant et al., 1991, Biochem. Biophys. Acta 1077:339; Lehrman et al., 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31:544; Li et al., 1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33:67; Hanks et al., 1989, J. Mol. Endocrinol. 2:21; Watahiki et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:5535; Karatzas et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18:3071; Yasuda et al., 1990, Gen. Comp. Endocrinol. 80:363; Noso et al., Int. J. Peptide Protein Res. 39:250; Buckbinder et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3820; Takahashi et al., J. Mol. Endocrinol. 5:281; Yamaguchi et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:9113; Rentler-Delrue et al., DNA 8:261; Yasuda et al., 1987, Gen. Comp. Endocrinol. 66:280; Chang et al., 1991, Nº de Acceso a GenBank X61049; Chang et al., 1991, Nº de Acceso a GenBank X61052; Yasuda et al., 1986, Arch. Biochem. Biophys. 244:528; Kuwana et al., 1988, Agric. Biol. Chem. 52:1033; Song et al., 1988, Eur. J. Biochem. 172:279; Mercier et al., 1989, DNA 8:119).

La expresión variante de prolactina (PRL) se refiere a una forma de prolactina que ha sido modificada estructuralmente en relación con su forma nativa, incluidos los casos en los que la secuencia de aminoácidos de la forma nativa ha sido alterada por inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos.

La capacidad de esta variante para antagonizar la acción de PRL en su receptor se define como la capacidad de la variante para inhibir un efecto mediado, bajo condiciones normales, por PRL. Por ejemplo, cuando PRL tiene un efecto proliferativo sobre una especie celular, una variante de PRL inhibe la proliferación de la especie celular; sin limitarse a la siguiente teoría, se cree que PRL se encuentra presente en algún nivel para que se pueda observar un efecto inhibitorio. La Figura 5A ilustra un ejemplo de trabajo de la invención, en el cual la prolactina humana (hPRL) induce la proliferación de células del cáncer de mama humano T47-D, en tanto que una variante de hPRL, que exhibe una sustitución de la glicina en posición 129 por un residuo de arginina, denominada hPRLA, inhibe la proliferación de células T47-D en relación con las células T47-D que carecen de hPRL o hPRLA agregada; se considera que niveles de T47-D producen PRL (Ginsberg y Vonderharr, 1995, Cancer Res. 55:2591-2595).

Como ejemplo específico, es posible identificar una variante de PRL como antagonista de PRL mediante la determinación de la capacidad de la variante para bloquear la capacidad de PRL para actuar a través de su receptor, cuando se encuentran presentes tanto PRL como la variante de PRL. Por ejemplo, cuando una concentración determinada X de PRL se asocia con un incremento Y de la proliferación de células que expresan la PRLR en cultivo, al exponer una muestra comparable de células a PRL a una concentración X, y a una variante de PRL a una concentración V, la proliferación de células aumentará en Z, en donde Z es menor que Y y puede ser una cifra negativa.

En la invención, la variante de PRL es una variante de PRL humana que posee una sustitución de la glicina en posición 129 por otro aminoácido. La sustitución, representada de manera abreviada como G129*, en donde * es un aminoácido de origen natural o sintético diferente de glicina, puede ser la única variación con respecto a la secuencia nativa, o una de múltiples alteraciones (incluidas inserciones, deleciones, y/o sustituciones de aminoácidos). El aminoácido sustituyente puede ser aminoácidos neutros polares tales como alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, prolina, metionina; aminoácidos neutros no polares tales como serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano, asparagina, glutamina, ácido aspártico; aminoácidos ácidos tales como ácidos aspártico y glutámico; y aminoácidos básicos tales como arginina, histidina o lisina. En realizaciones preferidas de la invención, la glicina en posición 129 de hPRL puede estar sustituida con valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, prolina, tirosina, cisteína, metionina, arginina, histidina, triptófano, fenilalanina, lisina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, y ácido glutámico. En una realización de la invención especialmente preferida, la sustitución de la glicina en posición 129 se lleva a cabo con arginina (G129R); también se describe en este documento una variante de prolactina en la glicina de posición 129 ha sido eliminada.

En todavía otras realizaciones, una variante de prolactina que muestra una sustitución de la glicina de la posición 129 se enlaza con otra proteína como parte de una proteína de fusión. Como realización específica, la variante de prolactina puede estar enlazada con interleuquina 2. Un ejemplo no limitante de una realización de este tipo es una variante G129R de prolactina humana unida a interleuquina 2.

Las variantes de PRL usadas en la invención se pueden preparar por síntesis química o por técnicas de ADN recombinante. Por lo general, es posible preparar un ADNc de PRL usando técnicas de amplificación por PCR estándares, ARN o ADNc preparado a partir de una célula que produce PRL (tal como una célula pituitaria) como molde, y cebadores oligonucleótidos diseñados sobre la base de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos conocidas de PRL. En la siguiente Sección 7 se expone un ejemplo no limitante de la preparación de un ADNc que codifica hPRL. A continuación, se pueden introducir alteraciones en el ADNc de PRL ya sea al azar o por mutagénesis directa. Un ejemplo del uso de mutagénesis dirigida a un sitio y mediada por oligonucleótidos se expone también en el Ejemplo 7, e ilustra la introducción de la sustitución G129R en hPRL.

Cuando la variante de PRL se vaya a producir por técnicas recombinantes, puede incorporarse un ácido nucleico que codifica la variante de PRL en un vector de expresión, enlazado de forma operativa con una secuencia de promotor/potenciador apropiada. El vector de expresión puede contener, adicionalmente, uno o múltiples elementos que contribuyen a la expresión de la variante de PRL, incluido un sitio de terminación de la trascripción, un sitio de poliadenilación, un sitio de fijación de ribosomas, una secuencia de señal, etc. Sistemas de expresión adecuados incluyen células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, células de levaduras, moho de fango, y organismos, incluidos plantas y animales transgénicos. Vectores de expresión apropiados incluyen vectores basados en el herpes simple viral tales como pHSV1 (Geller et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8950-8954); vectores retrovirales tales como MFG (Jaffee et al., 1993, Cancer Res. 53:2221-2226) y, en particular, vectores retrovirales de Moloney tales como LN, LNSX, LNCX, LXSN (Miller y Rosman, 1989, Biotechniques 7:980-989); vectores virales de vaccinia tales como MVA (Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847-10851); vectores de adenovirus tales como pJM17 (Ali et al., 1994, Gene Therapy 1:367-384; Berker, 1988, Biotechniques 6:616-624; Wand y Finer, 1996, Nature Medicine 2:714-716); vectores de virus adeno-asociados tales como AAV/neo (Mura-Cacho et al., 1992, J. Immunother. 11:231-237); vectores de lentivirus (Zufferey et al., 1997, Nature Biotechnology 15:871-875); vectores de plasmidio tales como pCDNA3 y pCDNA1 (InVitrogen), pET11a, pET3a, pET11d, pET3d, pET22d, y pET12a (Novagen); plasmidio AH5 (que contiene el origen SV40 y el principal promotor tardío de adenovirus), pRC/CMV (InVitrogen), pCMU II (Paabo et al., 1986, EMBO J. 5:1921-1927), pZipNeo SV (Cepko et al., 1984, Cell 37:1053-1062), pSR\alpha (DNAX, Palo Alto, CA), y pBK-CMV; y vectores de expresión de baculovirus (O'Reilly et al., 1995, Baculovirus Expression Vectors, Oxford University Press), tales como p2Bac.

Entonces, una variante de PRL producida en un sistema de expresión recombinante se puede purificar por técnicas estándares, incluida electroforesis, cromatografía (incluida cromatografía de afinidad), y ultrafiltración.

5.2 Receptores de prolactina truncados

En este documento se describen receptores de prolactina truncados acelulares (a los que se designa PRL-BP(s)), que conservan la capacidad de unirse a PRL y son capaces, por lo tanto, de competir con las formas de la superficie celular de PRLR por la fijación de PRL, inhibiendo de esta manera la capacidad de PRL de interactuar con su receptor.

Un PRL-BP se puede preparar eliminando todo o parte de los dominios transmembranosos y/o intracelulares del PRLR, de forma enzimática o utilizando técnicas de ADN recombinante. En un ejemplo específico, el PRLR que se debe truncar es como el descrito en Boutin et al., 1989, Mol. Endocrinol. 3:1455-1461.

Para la preparación recombinante, se pueden preparar moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de prolactina nativo y, a continuación, se alteran para codificar un PRL-BP. Por ejemplo, el PRLR se puede clonar usando técnicas como las que se describen en el siguiente Ejemplo 9.

Se conoce la secuencia de aminoácidos de PRLR de una diversidad de diferentes organismos. La secuencia del PRLR humano está disponible en GenBank on el Nº de Acceso 13032. Adicionalmente, los residuos de aminoácidos que delinean los dominios extracelular, transmembranoso y citoplásmico del PRLR también son conocidos (véase, por ejemplo, Kelly et al., 1989, Biol. Reprod. 40:27-32). Dada la elucidación de estos dominios, un experto en la técnica podría producir fácilmente una forma truncada de PRLR que conserve la capacidad de fijar PRL, pero que se pueda utilizar para inhibir los efectos de PRL.

En la construcción de vectores de expresión que contengan las secuencias de codificación de PRL-BP y las señales de control apropiadas de trascripción/traducción se pueden utilizar métodos de ADN recombinante bien conocidos para los expertos en la técnica. La eficacia de expresión se puede potenciar por la inclusión de elementos potenciadores de la trascripción, terminadores de trascripción apropiados, etc. Los métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., y Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Reino Unido, Vol. I, II).

Cuando se utiliza tecnología de ADN recombinante para producir PRL-BP, puede ser conveniente preparar por ingeniería proteínas de fusión que pueden facilitar, por ejemplo, la solubilidad o purificación. Estas proteínas de fusión se pueden fabricar ligando entre sí las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas, que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas, por métodos conocidos en la técnica, en el marco de lectura apropiado, y expresando la proteína de fusión por métodos conocidos normalmente en la técnica. El producto génico de PRL-BP contenido en el interior de estas proteínas de fusión puede comprender, por ejemplo, uno o múltiples de los dominios o porciones extracelulares, preferentemente la porción de unión al ligando.

En un ejemplo específico, se puede utilizar para la expresión de hPRL-BP un vector de expresión de mamífero tal como pcDNA3.1/His Xpress (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Este vector contiene un promotor de citomegalovirus humano inmediato-precoz y una señal de adición de bGH poli A. Además, ofrece un péptido en marco (His)6 en el extremo N, que permite una fácil detección tras la purificación de hPRL-BP. El hPRL-BP recombinante producido con el uso de este vector en cultivo celular se puede concentrar por ultrafiltración, empleando técnicas como las expuestas en la siguiente Sección 7. La concentración de hPRL-BP tras la ultrafiltración se puede determinar por ensayo de proteínas y confirmarse por análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo anti-His (Santa Cruse, CA), y se puede cuantificar por métodos de densitometría (Fernández y Kopchick, 1990, Anal. Biochem. 191:268-271).

De manera alternativa, se puede preparar un hPRL-BP truncado por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos. Además, es posible preparar un hPRL-BP truncado por la purificación de una proteína PRLR de longitud total a partir de células productoras de PRLR de origen natural o modificadas por ingeniería genética, seguida por la escisión enzimática de la proteína purificada usando enzimas proteolíticas tales como tripsina, para formar PRL-BP.

5.3 Ensayos de rastreo para la identificación de agonistas y antagonistas de PRLR

La presente invención proporciona el uso de un sistema de ensayo in vitro, de base celular, para identificar compuestos o composiciones que modulan la actividad de PRLR y, por lo tanto, puede ser de utilidad para la regulación de la proliferación celular y en el tratamiento de enfermedades asociadas con una proliferación celular aberrante. El sistema de ensayo de base celular ha sido diseñado para analizar la apoptosis celular. El sistema de ensayo se basa en la observación de que el antagonista de PRLR, G129R, es capaz de inducir apoptosis en las células que expresan el PRLR.

De acuerdo con la presente invención, se utiliza un sistema de ensayo in vitro, de base celular, para el rastreo de compuestos que modulan la actividad de PRLR y, de esta forma, modulan la proliferación celular. Los compuestos que pueden afectar a la actividad de PRLR incluyen, pero no están limitados a ellos, compuestos que se fijan al PRLR y activan la transducción de señales (agonistas), o bloquean la activación (antagonistas). Los sistemas de ensayo de la invención ofrecen métodos rápidos y fiables para identificar compuestos que interactúan con - y, por consiguiente, afectan - la función de PRLR.

Un método in vitro para identificar un compuesto capaz de modular la actividad del receptor de prolactina comprende las siguientes etapas:

a: poner en contacto un compuesto con una célula que expresa el receptor de prolactina;

b.: medir el nivel de apoptosis en la célula; y

c: comparar el nivel de apoptosis obtenido en (b) con el nivel obtenido en ausencia del compuesto;

de manera que si el nivel obtenido en (b) difiere del que se alcanza en ausencia de un compuesto, se ha identificado un compuesto capaz de modular la actividad del receptor de prolactina. Si el nivel de apoptosis aumenta en un ensayo de este tipo, se ha identificado, entonces, un antagonista del receptor de prolactina.

En todavía otra realización de la invención, se ofrece un método in vitro para identificar un compuesto capaz de inducir la actividad del receptor de prolactina, y que comprende las siguientes etapas:

a.: poner en contacto un compuesto con una célula que expresa el receptor de prolactina, en presencia y en ausencia de un compuesto que induce apoptosis mediada por el receptor de prolactina;

b.: medir el nivel de apoptosis en la célula, en presencia y en ausencia del compuesto que induce la apoptosis mediada por el receptor de prolactina; y

c.: comparar los niveles de apoptosis obtenidos en (b);

de manera que si el nivel de apoptosis ha disminuido en presencia del compuesto que induce la apoptosis mediada por el receptor de prolactina, se ha identificado un compuesto capaz de activar la actividad del receptor de prolac-
tina.

Con este fin, se pueden utilizar células que expresan PRLR de forma endógena para el rastreo de compuestos que modulan la actividad del receptor. En una realización de la invención preferida, las células son células transformadas tales como, por ejemplo, células de cáncer de mama o células de cáncer de próstata. Además, células que normalmente no expresan PRLR pueden ser modificadas por ingeniería genética para que expresen el gen de PRLR, siendo posible utilizar estas células con fines de rastreo. Los expertos en la técnica reconocerán que resulta aceptable cualquier línea celular capaz de transfección y que posee un nivel de base bajo a nulo de PRLR.

Durante el uso de estos sistemas de ensayo de base celular, las células que expresan PRLR se exponen a un compuesto de ensayo o a controles de vehículo (por ejemplo, placebos). En los ensayos diseñados para identificar agonistas de PRLR, se agregan también al ensayo compuestos que induce apoptosis mediada por PRLR, tales como G129R. Después de la exposición, se pueden analizar las células para medir el nivel de apoptosis. Los ensayos diseñados para medir la apoptosis incluyen en ensayo de marcaje de los cortes finales con dUTP, mediado por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) (Kebers et al., 1998, Experimental Cell Research 240:197-205); ensayos para detectar caspazas activadas (Janicke et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:9357-9360); ensayos de ADN por gel en escalera para detectar ADN fragmentado por electroforesis sobre gel (Bursch et al., 1996, Carcinogenesis 17:1595-1607); ensayos para detectar niveles de las proteínas bcl-2 y bax (Wuerzberger et al., 1998, Cancer Research 58:1876-1885); tinción DAPI de Hoechst para detectar la condensación nuclear en células apoptóticas (Bursch et al., 1998, Carcinogenesis 17:1595-1607); tinción de anexina V de fosfatidil-serina sobre la membrana citoplasmática (van Engeland et al., 1996, Cytometry 24:131-139); análisis de contenido en ADN por tinción con yoduro de propidio, seguida de flujocitometría (Sherwood et al., Methods in Cell Biology 46:77-97); y estudios morfológicos que utilizan microscopia electrónica y de contraste de fases (Bursch et al., Carcinogenesis 17:1595-1607).

La capacidad de un compuesto de ensayo para inducir un nivel de apoptosis superior a los niveles registrados en células tratadas con un control de vehículo, indica que el compuesto de ensayo actúa como antagonista, inhibiendo la transducción de la señal mediada por PRLR. Por el contrario, la capacidad de un compuesto de ensayo para reducir el nivel de apoptosis en presencia de compuestos tales como G129R, por encima de los niveles observados en células tratadas con un control de vehículo, indica que el compuesto de ensayo induce una transducción de la señal mediada por PRLR.

Es posible alcanzar un rastreo de alta productividad sembrando las células de ensayo en pocillos de placas de microtitulación, cada uno de los cuales contendrá un antagonista o agonista potencial de PRLR. Asimismo, los pocillos contendrán medio completo y, en casos en los que se deba identificar un agonista, se incluye un compuesto tal como G129R. Después de la incubación con antagonistas o agonistas potenciales, se analiza la apoptosis en las células usando métodos como los descritos anteriormente. Antagonistas potenciales son aquellos compuestos que inducen apoptosis en células que expresan el PRLR. Agonistas potenciales son aquellos compuestos que compiten con G129R por la fijación al receptor y, de esta forma, inhiben la apoptosis inducida por G129R.

Los compuestos que se pueden rastrear de acuerdo con la invención incluyen, pero no están limitados a los mismos, compuestos inorgánicos, péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, y otros compuestos orgánicos (por ejemplo, péptido-miméticos) que se fijan a PRLR y activan la actividad de PRLR (es decir, agonistas), o inhiben la actividad de PRLR (es decir, antagonistas). Los compuestos pueden incluir, sin limitaciones, Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86), y bibliotecas moleculares, derivadas de química de combinación, miembros de bibliotecas de péptidos aleatorios (véanse, por ejemplo, Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; preparadas a partir de aminoácidos en configuración D y/o L, fosfopéptidos (incluidos, sin limitaciones, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos aleatorios o parcialmente degenerados; véase, por ejemplo, Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778). El rastreo de bibliotecas se puede llevar a cabo por una diversidad de métodos normalmente conocidos. En una realización específica de la invención, es posible rastrear la capacidad de variantes de péptidos de PRLR para regular la actividad del PRLR.

Los compuestos identificados mediante ensayos tales como los descritos en este documento pueden ser útiles, por ejemplo, para mejorar enfermedades asociadas con una proliferación celular aberrante. Los ensayos para analizar la eficacia de los compuestos identificados en los rastreos se pueden experimentar en sistemas de modelos animales de trastornos proliferativos tales como el cáncer.

5.4 Utilidades de la invención

La presente invención proporciona el uso de una variante de la prolactina humana, que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de cáncer de mama o de próstata, que expresa un receptor de prolactina. Se puede usar una forma truncada del PRLR (que compite con el receptor endógeno por la fijación de PRL) para inhibir los efectos de PRL y, en particular, se le puede utilizar para inhibir la proliferación celular mediada por PRL. La variante de prolactina, o forma truncada del PRLR, se administra a un sujeto afecto de un trastorno proliferativo, en el cual las células en proliferación expresan un receptor de prolactina.

Es posible analizar la capacidad de la variante de PRL del PRLR truncado (también designada PRL-BP) para antagonizar la actividad de PRL en un panel de líneas celulares que expresan diferentes niveles de PRLR y/o PRL, de forma que permite inferir un efecto que varía en función de la disponibilidad de PRL/PRLR. Por ejemplo, se puede analizar la actividad de una variante de hPRL o un hPRLR truncado en todos o en un subconjunto de las cinco líneas celulares humanas diferentes de cáncer de mama (T-47-D, MCF-7, HTB19, HTB20 y HTB123 de ATCC). Se ha comunicado que los números de receptores de hPRL en estas líneas celulares son: T-47-D (25.800/célula), MCF-7 (8.300/célula), HTB19 (6.453/célula), HTB20 (5.480/célula), HTB123 (1.084/célula, célula mamaria normal = 1.700/célula). Por lo tanto, estas líneas representan un espectro de niveles de receptores de hPRL en células de cáncer de mama humano. Se debe destacar que el uso de líneas celulares de cáncer de mama humano es preferible al uso de la línea celular del linfoma de células T Nb-2 de rata, que se utiliza ampliamente en estudios de hormonas lactogénicas, con el fin de evitar los potenciales efectos de confusión causados por la especificidad de las especies. Los ensayos que se pueden utilizar para determinar el efecto de la variante de PRL o del PRLR truncado incluyen (i) (para la variante de PRL) un ensayo de fijación competitiva al receptor, para examinar si los antagonistas compiten a nivel del receptor; (ii) detección/cuantificación de fosforilación de la proteína STAT5 para examinar si el supuesto antagonista inhibe la transducción intracelular de señales inducida por PRL; y (iii) un ensayo de proliferación celular, que se utiliza como ensayo global de los efectos inhibitorios potenciales de la variante de PRL o del PRLR truncado. Un método preferido para analizar los efectos sobre la proliferación o antiproliferativos de PRL, la variante de PRL o del PRLR truncado es un ensayo de cultivo celular mixto, tal como el que se muestra en diagrama en la Figura 6, y que se explica en la siguiente Sección 8.

Las enfermedades que podrían beneficiarse de la administración de una variante de PRL o un PRL-BP incluyen la proliferación, tanto benigna como maligna, de células que expresan en PRLR. Estas enfermedades incluyen, sin limitaciones, trastornos proliferativos de la mama, incluidos trastornos benignos tales como adenomas y enfermedad fibroquística de la mama, y enfermedades malignas tales como cáncer de mama, incluidos los carcinomas ductal, escirro, medular, coloide y lobular (locales o metastáticos); y enfermedades proliferativas de la próstata, incluidos la hipertrofia prostática benigna y el cáncer de próstata (local o metastático). Igualmente, se pueden tratar trastornos proliferativos que afectan a células que expresan un receptor homólogo a PRLR, incluidos aquellos trastornos que comprenden células que expresan un receptor de la hormona del crecimiento.

Tal como se demuestra en el siguiente Ejemplo 11, las variantes de prolactina son capaces de inducir la apoptosis celular en células de cáncer de mama humano y células de cáncer de próstata. De este modo, la presente invención proporciona el uso de una variante de la prolactina humana, que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para la preparación de un medicamento capaz de inducir la apoptosis celular en células cancerosas de mama o próstata que expresan el receptor de prolactina. En una realización de la invención, la expresión del receptor PRLR se puede dirigir a una población de células específicas, elegidas como objetivo para la apoptosis, tales como la población de células cancerosas. Se pueden transferir moléculas de ácidos nucleicos que expresan PRLR a la población celular seleccionada como objetivo, usando métodos tales como los empleados en los protocolos de terapia génica. Una vez expresado en la superficie de la población de células diana, el receptor se puede activar por medio del contacto con variantes de prolactina para inducir la apoptosis de la célula marcada como objetivo.

En el tratamiento de trastornos proliferativos, la variante de PRL o el PRL-BP se puede administrar solo, o como parte de un régimen terapéutico secuencial o combinado. Como ejemplos no limitantes, en los que el trastorno a tratar es cáncer de mama, los agentes adicionales usados en un régimen combinado incluyen anti-estrógenos tales como tamoxifeno y/o un agente quimioterapéutico. Cuando el trastorno a tratar es cáncer de próstata, los agentes adicionales usados en un régimen combinado pueden incluir un anti-andrógeno y/o un agente quimioterapéutico. Un régimen terapéutico combinado se basa en la observación de que el uso de una variante de prolactina, en combinación con un anti-estrógeno, tal como 4-OH-tamoxifeno, exhibe un efecto inhibitorio sinérgico.

También se describen en este documento composiciones que comprenden una variante de PRL o un PRL-BP, en un vehículo farmacéutico aceptable. Estas composiciones se pueden administrar a través de cualquier técnica apropiada, incluida la administración local, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraperitoneal, oral, etc.

Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones que contienen una variante de PRL o un PRL-BP en una cantidad eficaz para alcanzar su propósito previsto. De manera más específica, una dosis eficaz se refiere a la cantidad de variante de PRL o PRL-BP necesaria para inhibir la proliferación de células que expresan el PRLR, disminuyendo, de esta forma, los síntomas asociados con una enfermedad proliferativa. La determinación de cantidades eficaces entra dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

Las concentraciones efectivas de los compuestos se pueden establecer en sistemas de cultivo celular y/o en animales transgénicos. La dosis eficaz se puede determinar usando una variedad de ensayos diferentes. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de proliferación celular para cuantificar la concentración de variante de PRL o PRL-BP requerida para inhibir la proliferación celular. Además, se pueden efectuar ensayos para cuantificar la concentración de variante de PRL p PRL-BP necesaria para inducir la apoptosis celular. Se puede analizar la inhibición del crecimiento de células tumorales para detectar la inhibición mediada por la variante de PRL o PRL-BP de la proliferación de células tumorales. En tales casos, la dosis eficaz de variante de PRL o de PRL-BP es la cantidad requerida para inhibir la proliferación de células cancerosas e inhibir el crecimiento de un tumor en un paciente. En determinados casos, puede ser deseable co-administrar a un sujeto que exhibe un trastorno proliferativo, variantes de prolactina o PRL-BP junto con uno o múltiples agentes adicionales. Estos agentes incluyen, por ejemplo, anti-estrógenos tales como tamoxifeno, o anti-andrógenos. La determinación de las cantidades eficaces de estos compuestos adicionales entra dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

Evidentemente, la cantidad de la composición dependerá también del sujeto bajo tratamiento, del trastorno proliferativo tratado, de la gravedad de los síntomas de dicho trastorno, y del juicio del médico prescriptor. En algunos casos, puede ser necesario ajustar el tratamiento a dosis menores debido a los efectos secundarios indeseables, así como ajustarlo a niveles superiores si la respuesta clínica no es la adecuada.

6. Ejemplo Diseño de una variante de prolactina con actividad antagonista

Dado que en la actualidad no se dispone de datos sobre la estructura cristalina de hPRL, se utilizó un programa de algoritmos informático, desarrollado por Garnier et al., 1978, J. Mol. Biol. 120:97-120, para analizar y comparar la estructuras secundarias de hPRL y hGH. Los resultados demostraron que las regiones de hélice \alpha globales son muy similares, lo que sugiere que estas hormonas comparten una conformación global similar. Al comparar las secuencias de aminoácidos en la tercera hélice \alpha entre GHs y PRLs, resulta evidente que la Gly 129 de hPRL corresponde a Gly 120 de hGH, y se encuentra absolutamente conservada en la familia GH/PRL (Chen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897). Por lo tanto, se preparó una mutación de sustitución de Gly a Arg en hPRL para generar un antagonista específico del receptor de hPRL.

7. Ejemplo Preparación de la variante de prolactina G129R 7.1 Clonación del gen de prolactina humana

Se clonó eficazmente la PRL humana usando transcripción inversa (RT), seguida de una reacción de cadena de la polimerasa (PCR). En pocas palabras, se usó como molde ARN poli A de la pituitaria humana /Clone Tech, Ins. Palo Alto, CA). Se diseñó un cebador antisentido de hPRL que comenzó 2 bases del codón de detención (TAA) del ADNc (5' GCTTAGCAGTTGTTGTTGTG 3') de hPRL, y se diseñó un cebador sentido a partir de ATG (5' ATGAACATCAAAGGAT 3'). Se llevó a cabo la RT/PCR utilizando un kit de Perkin-Elmer Cetus, Inc. (Norwalk, CT). La secuencia de nucleótidos de la hPRL resultante se determinó por el método de terminación en cadena de dideoxi usando ADN-polimerasa T7 (Esquinase, United States Biochemical), y se encontró que era idéntica a la comunicada en GenBank, con la excepción de una base de diferencia, que tiene como consecuencia una mutación silenciosa en el codón 21 (CTG \rightarrow CTC). En la Figura 1 se resume, en una representación esquemática, el proceso de clonación, incluida la preparación del vector de expresión pUCIG-Met.

7.2 Creación de la variante de prolactina G129R

El plasmidio parental que contiene el ADNc de hPRL y un origen M13F1 de replicación (Figura 1) se transformó en E. coli (CJ236). A partir de la bacteria CJ236 transformada se aisló un ADN de plasmidio de cadena sencilla, que contiene uridina, utilizando el bacteriófago auxiliar M13k07. En tampón de hibridación (Tris-HCl 200 mM, MgCl_{2} 20 mM, NaCl 100 mM), se hibridaron 6 pmol de una secuencia que contiene oligonucleótidos, que dirigen la mutación de G129R, con 0,2 pmol de ADN de cadena sencilla, por medio de calentamiento a 70ºC durante 5 minutos, seguido de enfriamiento lento. El oligonucleótido (5' CGGCTCCTAGAGAGGATG-GAGCT 3'), que codifica la mutación de G129R, se usó para cebar la síntesis de una cadena complementaria de ADN, utilizando ADN de cadena sencilla como molde, que es catalizado por ADN-polimerasa T4. Tras la síntesis, el ADN de cadena doble se usó para transformar E. coli (DH5a). Se aislaron clones individuales, que se analizaron en busca de hPRL-G129R por secuenciación de nucleótidos de ADN. En lo sucesivo, se hará referencia a la variante de hPRL G129R como hPRLA, en donde la letra "A" se refiere a su actividad antagonista.

7.3 Expresión de proteínas clonadas

Los ácidos nucleicos que codifican hPRL y hPRLA se insertaron en un vector de expresión de mamífero, en el que la transcripción de los ADNc está controlada por la secuencia del potenciador/promotor de metalotioneína de ratón y la señal de adición de bGH poli A (Chen et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:2252-2258; Chen et al., 1991, Endocrinol. 129:1402-1408; Chen et al., 1991, Mol. Endocrinol. 5:1845-1852; Chen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897). Para establecer líneas celulares L estables de ratón que producen hPRL y hPRLA, se seleccionaron células L de ratón [timidín-quinasa (TK)-negativas y adenina fosforibosil-transferasa (ARRT)-negativas] como un sistema de expresión in vitro. Se prepararon líneas celulares estables que expresan hPRL (que se utilizarán como controles positivos) y hPRLA (\sim5-10 mg/1/24 h/millón de células).

Se utilizó ultrafiltración de membrana para purificar parcialmente y concentrar hPRL y hPRLA a partir de los medios de cultivo celular acondicionados, usando técnicas como las mencionadas en Chen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897. La separación se basa en el tamaño molecular relativo y el tamaño de poro de la membrana. Las membranas de ultrafiltración se adquirieron en Amicon, Inc. (Northorough, MA). Se usaron dos tipos de membranas, YM10 e YM100. En primer lugar, se utilizó una célula agitada con 200 ml con Amicon YM10, bajo una presión transmembranosa de 20 psia, para eliminar las impurezas grandes del medio de cultivo. El permeato (>90% de recuperación de hPRL) se aplicó a un segundo protocolo de filtración, que utiliza membrana YM10 para reducir el volumen de solución y, de esta forma, concentrar la proteína. La concentración de hPRL o hPRLA se determinó utilizando un kit de ensayo inmuno-radiométrico (IRMA) de Diagnostic Products Corp. (Los Ángeles, CA).

8. Ejemplo Actividad inhibitoria de la variante de prolactina G129R 8.1 Materiales y métodos

Ensayo de fijación a radio-receptores. Se marcó hPRL purificada con Na^{125}I mediante el método de lactoperoxidasa hasta una actividad específica de 80-105 \muCi/\mug, de la forma descrita en Harding et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:6708-6712. En resumen, se agregó 1,0 mCi de Na^{125}I a 1 mg de hPRL. A continuación, se agregaron lactoperoxidasa (10 \mug disueltos en 10 \mul de 0,4 mol/litro de tampón acetato, pH 5,6) y H_{2}O_{2} (5 \mul de 1,76 mmol/litro). Después de 30 min, se finalizó la reacción por la adición de 100 \mul de tampón de transferencia (0,47 mol/litro de sacarosa, 0,06 mol/litro de KI, azida sódica al 0,02%, pH 7,6). Seguidamente, la hPRL radiomarcada se separó por cromatografía sobre Sephadex G-100. Se sembraron células de cáncer de mama humano en placas de 6 pocillos. Tras la incubación en DMEM libre de suero durante 2-3 horas para eliminar el suero, la monocapa celular se expuso de medio acondicionado exento de suero que contuvo ^{125}I-hPRL (50.000 cpm) en presencia de diversas concentraciones de hPRL o hPRLA durante 2-3 h a 37ºC. Después de incubar a temperatura ambiente durante 3 horas, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y, a continuación, se lisaron en 1 ml de SDS al 1%/NaOH 0,1N. Se determinó, entonces, la cpm de lisados. La fijación no específica se midió agregando 5 \mug/ml de hPRL no marcada en medio acondicionado regular para células L de ratón, para controlar el desplazamiento no específico.

Ensayo de la inducción por hPRL de la fosforilación de tirosina de proteínas STAT5. Las proteínas STAT representan una familia de proteínas que tienen pesos moleculares de aproximadamente 92-95 kDa, que han demostrado experimentar una fosforilación de la tirosina cuando las células que contienen GHR o PRLR se tratan con GH o PRL, respectivamente. La fosforilación de tirosilo de STAT5 es un suceso mediado por el receptor y se piensa que constituye una etapa importante en la transducción de la señal inducida por el ligando (Wakao et al., 1994, EMBO J. 13:2182-2191; Kazansky et al., 1995, Mol. Endocrinol. 9:1598-1609; Waxman et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:13262-13270). Se utilizó este ensayo para evaluar la capacidad de hPRL y hPRLA para inhibir la inducción de fosforilación de STAT5 por PRL de tipo salvaje.

De manera resumida, se sembraron células de cáncer de mama humano en placas de 12 pocillos. Después de la pre-incubación en DMEM libre de suero durante 2-3 horas, las células se expusieron a diversas concentraciones de hPRL y hPRLA en DMEM libre de suero. Las células se incubaron durante 15 min a 37ºC, se lavaron una vez con PBS, y se lisaron en 300 \mul de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, SDS al 1%, \beta-mercaptoetanol al 1%, DTT 0,1 M, Sacarosa al 5%, ortovanadato sódico 100 \muM, y azul bromofenol al 0,6%). 30 microlitros de lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE al 4-12,5% y análisis de inmunotransferencia, usando el kit de anticuerpo anti-fosfotirosina PY20 y ECL conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Amersham, IL.). A continuación, las transferencias se expusieron a películas de rayos X y se revelaron usando procedimientos convencionales (Kodak, Rochester, NY). Este ensayo ha sido descrito en Chen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897; Chen et al., 1995, Endocrinol. 136:660-667; Wang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1391-1395; Chen et al., 1995, Mol. Endocrinol. 9(3):292-302; Harding et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(12):6708-6712.

Ensayos de proliferación celular. Se analizó la capacidad de hPRLA para inhibir la proliferación de células de cáncer de mama en cultivos de tejidos. Las células de cáncer de mama humano se cultivaron en los correspondientes medios de cultivo, de acuerdo con las recomendaciones de la ATCC. Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire. Las condiciones experimentales fueron, básicamente, las descritas por Ginsburg y Vonderharr (1995, Cancer Res. 55:2591-2595). Para los experimentos de crecimiento individual, las células se sembraron a placas de cultivo de 12 pocillos, con una densidad de aproximadamente 2x10^{4}/ml, 1 ml/pocillo). Seguidamente, se permitió las fijación celular durante un día (células T-47D, MCF-7, HTB19, y HTB20, con la excepción de HTB123, que es una suspensión celular) y, a continuación, se retiró el medio sobrenadante y se cambió a condiciones exentas de suero con medio que contuvo ITS* (suplemento para cultivo selenio-BSA-ácido linoleico para la transferencia de insulina; Collaborative Research Bedford, MA). Se introdujeron concentraciones diversas de hPRL sola o en combinación con hPRLA. Después de tres días de cultivo adicionales, las células se cosecharon tras una breve tripsinización y se sometieron a recuento en un contador de células.

Para determinados experimentos, se utilizó un ensayo de células mixtas, representado en forma de diagrama en la Figura 6. En este ensayo, se co-cultivaron células de cáncer de mama con células de expresión que habían sido transfectadas con ácido nucleico que codifica PRL o una variante de PRL, y que expresan estas proteínas recombinantes. Mediante la variación del número de células se expresión, se aumentó o redujo la cantidad de PRL o variante de PRL presente en el cultivo celular mixto. Tal como se muestra en la Figura 6, se agregó un número fijo de células de cáncer de mama (T47D) a los pocillos de una placa de cultivo de múltiples pocillos. En determinados pocillos, que actuaron como control, no se agregaron células de expresión. A continuación, se agregaron números crecientes de células de expresión (células L transfectadas que expresan hPRL (L-PRL) o hPRLA (L-PRLA)) a los pocillos que contuvieron células de cáncer de mama para crear cultivos mixtos. De forma paralela, se cultivaron las mismas cantidades de células de expresión (sin células T47D) para actuar como controles. Después de cultivar bajo condiciones convencionales durante un período de tiempo determinado, se contó el número de células presentes en los pocillos, y se restó el número de células L en el correspondiente cultivo de control. La cifra resultante se pudo comparar, entonces, con el número de células T47D en el cultivo de control de T47D para evaluar los efectos del producto recombinante sobre la proliferación de células de cáncer de mama.

8.2 Resultados y discusión

Resultados del ensayo de fijación a radio-receptores. Los resultados del ensayo que se llevó a cabo usando células T-47D y HTB123, junto con un panel de células de cáncer de mama humano, se muestran en la Figura 2. Demuestran que dos líneas celulares (T-47D y HTB123), entre las ensayadas, contienen una fijación específica mínima a receptor hGH en comparación con células de leucemia, linfoma y retinoblastoma.

Fosforilación de proteínas STAT5. Los experimentos que analizan las capacidades de hPRL y hPRLA, y de sus combinaciones, para inducir la fosforilación de proteínas STAT5 en células de cáncer de mama humano T-47D han demostrado que hPRLA es capaz de bloquear la transducción de la señal inducida por hPRL (Figura 3), demostrando, de este modo, la actividad antagonista de PRLA. En particular, la Figura 3 demuestra que la inducción de fosforilación de proteínas STAT5 inducidas por hPRL (pista 2) estuvo ausente en presencia de hPRLA solamente (pista 3), ha sido parcialmente eliminada en presencia de cantidades iguales de hPRL y hPRLA (pista 4), y es indetectable con un exceso de hPRLA (pista 5).

Ensayos de proliferación celular. Los resultados de ensayos de proliferación celular de los experimentos, en los se expusieron células T-47D a hPRL o hPRLA, se muestran en la Figura 4. Las curvas de respuesta a la dosis, en forma de campana, indican que la transducción de la señal de GH y PRL utiliza mecanismos similares (es decir, un ligando que conduce a la dimerización de los receptores). Dado que la afinidad por el sitio de fijación uno de los ligandos es, aparentemente, muy superior a la afinidad por el sitio de fijación dos, a concentraciones elevadas de la hormona todos los receptores están ocupados por un único ligando a través del sitio de alta afinidad (el fenómeno de "auto-antagonismo"). La Figura 5A-B compara los efectos de hPRL y hPRLA (la variante G129R de la prolactina humana) (Figura 5A) con los efectos del estrógeno y del antagonista del estrógeno tamoxifeno (Figura 5B). En tanto que hPRL y el estrógeno aumentaron la proliferación de células T47D (en relación con cultivos de control no tratados), hPRLA y tamoxifeno tuvieron un efecto inhibitorio comparable.

Las Figuras 7 y 8 muestran los resultados de ensayos de cultivos celulares mixtos, en los que co-cultivó un número variable de células L transfectadas (que se muestran en el eje y) que expresan hPRL o hPRLA (la variante G129R de prolactina humana), con células T47D de cáncer de mama humano durante 24 ó 72 horas (Figura 7) o durante uno, dos, tres o cinco días (Figura 8). Mientras que el resultado de hPRL fue un incremento de la proliferación de T47D (en relación con cultivos celulares de T47D no tratados), hPRLA inhibió la proliferación hasta en 100%.

La Figura 9A-B compara los efectos inhibitorios de hPRLA en el cultivo celular mixto sobre las dos líneas celulares de cáncer de mama humano T47D y MCF-7 (Figuras 9A y 9B, respectivamente). El hPRLA expresado por las células L transfectadas tuvo un efecto inhibitorio sobre ambas líneas celulares, pero el efecto fue mayor sobre las células T47D, probablemente porque existe un número superior de receptores de prolactina en las células T47D con respecto a las células MCF-7 (Shiu et al., 1979, Cancer Res. 39:4381-4386; Ormandy et al., 1997, J. Clin Endocrinol. Metab. 82:3692-3699).

9. Ejemplo Clonación del receptor de prolactina

El ADNc de hPRL-BP se clonó usando transcripción inversa (RT), seguida de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El cebador antisentido de hPRL-BP se diseñó en un sitio de corte de la enzima de restricción NcoI, localizado a 66 bases del dominio transmembranoso putativo, y se incorporó un codón de detención (TGA) (5' GCACT TCA GTATCCATGGTCTGGT 3'). El cebador sentido se diseñó incluyendo un codón de inicio de la traducción ATG (5' AGAAGGCAGCCAAC ATG AAG 3'). RT/PCR se llevaron a cabo usando un kit de Perkin-Elmer Cetus, Inc. (Norwalk, CT). La secuencia de nucleótidos de hPRL-BP se determinó por el método de terminación de la cadena de dideoxi usando ADN-polimerasa T7 modificada (Sequensae, United States Biochemical).

10. Ejemplo Efectos inhibitorios de un antagonista de prolactina y su acción sinérgica junto con tamoxifeno

La siguiente sub-sección describe los datos derivados de ensayos de proliferación celular, que demuestran que una variante de la prolactina, cuando se agrega unida a un agente anti-estrógeno, induce un efecto inhibitorio sinérgico sobre la proliferación celular.

10.1 Materiales y métodos

RT-PCR. Para clonar el ADNc de hPRL se utilizó la técnica RT-PCR. Se adquirió ARNm de pituitaria humana en Clontech Laboratory, Inc. (Palo Alto, CA 94303). En Perkin-Elmer, Inc. (Norwalk, CT) se adquirió un kit de RT-PCR. El cebador antisentido de hPRL (para la reacción RT) se diseñó a 2 bases a partir del codón de detención (en negrita) del ADNc de hPRL (5' GCTTAGCAGTTGTTGTTGTTG 3') y el cebador sentido se diseñó a partir del codón de inicio de traducción ATG (5' ATGAACATCAAAGGAT 3'). La reacción RT-PCR se llevó a efecto siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, el producto de PCR se clonó en un vector de expresión pcDNA3.1 de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). La expresión del ADNc de hPRL se controló por medio del potenciador/promotor del citomegalovirus (CMV) inmediato-precoz humano, y una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción del gen GH bovino. Este vector contiene también un gen de neomicina que permite la selección de células de mamífero resistentes a neomicina (Figura 1B).

Diseño racional de hPRL-G129R. Las secuencias de aminoácidos de todas las PRL conocidas en la tercera región de hélice \alpha y se alinearon con secuencias GH. Resulta evidente que Gly 129 de hPRL es invariable entre las PRL y corresponde a hGH 120, lo que indica un papel potencialmente importante en su función. Los presentes inventores decidieron, por lo tanto, realizar una mutación por sustitución de un único aminoácido en Gly 129 de hPRL (hPRL-G129R). Los inventores han utilizado un método similar al utilizado eficazmente con anterioridad en el descubrimiento de antagonistas de hGH, con la esperanza de producir un antagonista específico de hPRLR (Figura 11).

Mutagénesis Dirigida a Oligonucleótidos. El ADNc de hPRL-G129R se generó usando el protocolo de mutagénesis por PCR. Los oligonucleótidos que contienen la mutación deseada (5' CTTCTAGAGCGCATGGAGCTCATA 3'); y (5' CCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCC 3') fueron sintetizados por National Biosciences, Inc. (Plymouth, MN). El codón para ARG 129 aparece marcado en negrita y el sitio de restricción XbaI está subrayado. El producto de PCR se digirió con XbaI y se volvió a ligar en el vector anteriormente descrito (Figura 1B). La mutación se confirmó entonces por secuenciación de nucleótidos de ADN.

Líneas celulares. Se adquirieron de ATCC dos líneas celulares de cáncer de mama humano (T47-D y MCF-7) y una línea celular de fibroblastos L de ratón. Ambas líneas celulares de cáncer de mama humano han sido caracterizadas como líneas celulares positivas para receptor de estrógeno (ER) y positivas para PRLR (Ormandy, C.J. et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metabo. 82:3692-99). Las células se cultivaron, de manera rutinaria, en forma de cultivo monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) para las células MCF-7 y L, y se utilizó el medio RPMI-1640 para T47-D, tras un suplemento de suero fetal bovino al 10%, tratado con carbón recubierto con dextrano (DCC-FCS). Los medios para las células de cáncer de mama humano se usaron sin rojo fenol (para evitar sus potenciales actividades semejantes al estrógeno). Los cultivos celulares se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%, y se agitaron dos veces por semana.

Expresión y producción de las proteínas hPRL y hPRL-G129R. La transfección de células L de ratón y la selección de células estables se llevaron a cabo de la forma descrita anteriormente, con mínimas modificaciones (Zhou, Y. et al., 1996, Gene 177:257-129; Sun, X.Z. et al., 1997, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 63:29-36). En resumen, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se cultivaron hasta una confluencia del cultivo de 50%. El día de la transfección, las células se lavaron una vez con medio libre de suero y se cultivaron en 1 ml de medio libre de suero que contuvo 1 \mug de pcDNA3-hPRL o pcDNA3-hPRL-G129R, y 10 \mul de LipofectAmine (Gibco BRL) durante 5 h. Se agregaron 2 ml de medio de crecimiento a la solución de ADN/LipofectAmine, y la incubación continuó. Después de 18-24 horas de incubación, se usó medio de crecimiento nuevo para sustituir el medio que contuvo la mezcla de ADN/LipofectAmine. 72 horas después de la transfección, las células se diluyeron 1:10 y se hicieron pasar al medio selectivo (400 \mug/ml de G418) para seleccionar la expresión del gen neo. Las colonias individuales se aislaron y expandieron. Los niveles de expresión de las líneas celulares individuales se determinaron usando un kit de ensayo inmuno-radiométrico de Diagnostics Products Corp. (Los Ángeles, CA). Se expandieron las líneas celulares con altos niveles de
expresión.

Los medios acondicionados que contuvieron hPRL y hPRL-G129R se prepararon de la forma siguiente. Células estables se sembraron en matraces de cultivo T-150 a una confluencia de 85 a 90%. A continuación, el medio de crecimiento se sustituyó con 50 ml de RPMI-1640 que contuvo DCC-FCS al 1%, y se recogió en días alternos en tres ocasiones. A continuación, los medios recogidos se combinaron y filtraron a través de una unidad de filtro de 0,2 \mum para eliminar los desechos celulares, y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. La concentración de hPRL y hPRL-G129R se determinó por IRMA para hPRL. Cada lote de producto se verificó usando un protocolo de análisis por transferencia de western (Fernández, E. et al., 1990, Anal. Biochem. 191:268-271). Los presentes inventores han utilizado este protocolo en estudios análogos de hPRL, incluyendo antagonistas de hPRL para estudios in vitro (Chen, W.Y. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897).

Fosforilación de tirosina de proteínas STAT en células T47-D. Este ensayo está diseñado para examinar los efectos de hPRL y hPRL-G129R sobre la transducción de señales, usando células T47-D como células diana de modelo. En resumen, se sembraron células T47-D en placas de 12 pocillos. Tras la pre-incubación en medio libre de suero durante 2-3 horas, las células se expusieron a diversas concentraciones de hPRL o hPRL-G129R, o una combinación de hPRL y hPRL-G129R en medio libre de suero. Las células se incubaron durante 15 min a 37ºC, se lavaron una vez con PBS, y se lisaron en 200 \mul de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, SDS al 1%, \beta-mercaptoetanol al 1%, DTT 0,1M, sacarosa al 5%, ortovanadato sódico 100 \muM, y azul de bromofenol al 0,6%). A continuación, 30 ml de lisado celular se someten a SDS-PAGE al 4-12,5% usando el sistema de Proteína II de Bio-Rad. Después de la electroforesis, los geles se transfirieron a una membrana Hybond-ECL (Amersham, IL) a un voltaje constante de 100 voltios durante 2 horas. Las transferencias se incubaron en una solución de bloqueo de BSA al 4% (Boehringer Mannheim, IN) en tampón de enjuague (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 75 mM, Tween 20 al 0,1%, EDTA 1 mM) durante 2 horas y, subsiguientemente, se lavaron dos veces con tampón de enjuague durante 15 min. Las transferencias se incubaron con anticuerpo PY20 anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Amersham, IL), a una concentración de 0,1 \mug/ml en la solución de bloqueo durante 1 hora. Después de la incubación, las transferencias se lavaron con tampón de enjuague (15 min cada una, 2 veces) y se revelaron con un kit de reactivo ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham, IL). A continuación, las transferencias se expusieron a película de rayos X y se revelaron usando procedimientos convencionales (Kodak, Rochester, NY).

Medio acondicionado de hPRL-G129R. Las condiciones de ensayo se modificaron en relación con las descritas por Ginsburg y Vonderharr (1995, Cancer Res. 55:2591-2595). Las células T47-D se sometieron a tratamiento de tripsinización y se transfirieron a placas de 96 pocillos en medio RPMI-1640 que contuvo DCC-FCS al 1%, en un volumen de 100 \mul/pocillo. El número óptimo de células por pocillo para cada línea celular se predeterminó tras un ensayo de titulación. Para las células T47-D, se sembraron 15.000 células/pocillo. Se permitió que las células se asentaran y adhirieran durante la noche (12-18 horas) y, subsiguientemente, se agregaron diversas concentraciones de hPRL, hPRL-G129R, E2 o 4-OH-Tamoxifeno, en un volumen total de 100 \mul de medio de cultivo. Se utilizó hPRL purificado (cedido amablemente por el Dr. Parlow, National Hormone & Pituitary Program, NIH) como control positivo de la hPRL producida a partir de células L estables. Las células se incubaron durante 96 horas adicionales a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2} al 5%. Después de la incubación, se agregó a cada pocillo solución MTS-PMS (kit Cell Titer 96 Aqueous de Promega Corp.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas se analizaron utilizando un lector de microplacas Benchmark® de BIO-RAD. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron tres a seis veces para cada línea celular.

10.2 Resultados

Clonación y mutagénesis de hPRL. Se clonó ADNc de hPRL a partir de ARNm de pituitaria humana, usando la técnica RT-PCR. El tamaño del correspondiente producto de PCR fue de 633 pares de bases de longitud, y se clonó en el vector de expresión pcDNA 3.1. La secuencia de nucleótidos de hPRL se determinó por el método de terminación de cadena de dideoxi usando un secuenciador automático (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Se encontró que la secuencia del ADNc de hPRL fue idéntica a la comunicada por GenBank, con la excepción de una diferencia de una base cuyo resultado es una mutación silente en el codón 21 (CTG \rightarrow CTC). El ADNc de hPRL-G129R también se generó por PCR y se secuenció.

Expresión de hPRL y hPRL-G129R. Células L de ratón se transfectaron de manera estable con ADNc de hPRL o hPRL-G129R, y se seleccionaron y expandieron los clones reo-resistentes. Se recogieron los medios acondicionados y se analizó en los mismos la expresión, mediante el uso de un kit RIMA. Se generaron líneas de células L estables de ratón con hPRL y hPRL-G129R, que produjeron hPRL y hPRL-G129R en una cantidad de aproximadamente \sim1 mg/L/24 h/millón de células (Figura 12).

Inhibición de la fosforilación de tirosina de la proteína STAT por hPRL-G129R. Las proteínas STAT representan una familia de proteínas con un peso molecular de aproximadamente 92-95 kDa. Los efectos inhibitorios del antagonista de GH se pueden analizar midiendo los niveles de inhibición de la fosforilación de tirosina de la proteína STAT (Chen et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:15892; Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1391-1395; Silva, 1993, Endocrinology 133:2307-2312). Usando este ensayo, se demostró que el antagonista de GH hGH-G120R inhibe la inducción de GH de la fosforilación de la proteína STAT de forma dependiente de la dosis.

Los resultados utilizando hPRL y hPRL-G129R en células de cáncer de mama humano T47-D han demostrado que hPRL-G129R no fue activo en la estimulación de la fosforilación de la proteína STAT. Sin embargo, al agregar hPRL-G129R junto con hPRL, fue capaz de bloquear la transducción de señal inducida por hPRL de forma dependiente de la dosis (Figura 13), lo que indica que funciona como antagonista de hPRL. En una relación de 5:1, hPRL-G129R inhibió completamente la fosforilación de la proteína STAT inducida por hPRL.

Ensayos de proliferación celular en el cáncer de mama humano. Adicionalmente, se analizó la capacidad de hPRL y hPRL-G129R humanos para estimular/inhibir la proliferación celular del cáncer de mama en cultivos celulares. El examen a microscopia óptica de la proliferación celular del cáncer de mama tras la administración de hPRL, hPRL-G129R, E2 y 4-OH-Tamoxifeno se muestra en la Figura 14A-E. Es evidente que existe una diferencia significativa en la densidad celular entre las células tratadas con hPRL (15B), hPRL-G129R (15C) y E2 (15D), y 4-OH-Tamoxifeno (15E). También es necesario destacar que el estado general de las células tratadas con hPRL-G129R no fue tan saludable al examen de microscopia óptica.

Los resultados de los ensayos de proliferación celular en 96 pocillos se muestran en las Figuras 15-18. hPRL estimuló la proliferación de T47-D de manera dependiente de la dosis. La estimulación máxima de hPRL (250 ng/ml) fue aproximadamente 20% mayor que los niveles basales tras una dosis única / incubación durante cuatro días. Sin embargo, al aplicar simultáneamente hPRL y E2, se observó un efecto sinérgico. La respuesta máxima de hPRL (100 ng/ml) en presencia de E2 10 nM más que se triplicó en comparación con hPRL sola.

Por otra parte, hPRL-G129R exhibió efectos inhibitorios dependientes de la dosis sobre la proliferación celular (Figura 16A). Cabe destacar que el efecto inhibitorio de hPRL-G129R (150 ng/ml) fue más potente que la dosis máxima de 500 nM de 4-OH-Tamoxifeno en el sistema de ensayo (Figura 16B). La inhibición máxima de una dosis única de 4-OH-Tamoxifeno (500 nM) es de aproximadamente 15% del control (Figura 16B), en tanto que la inhibición máxima con una dosis única de hPRL-G129R dio como resultado 25% del control (Figura 16A). hPRL-G129R fue también capaz de inhibir de manera competitiva la proliferación celular inducida por hPRL. En una relación molar de 1:1, hPRL-G129R fue capaz de detener el efecto estimulante de hPRL y, en una relación molar de 2:1, inhibió la proliferación celular (Figura 17). De manera más importante, al aplicar hPRL-G129R junto con 4-OH-Tamoxifeno, se duplicaron los efectos inhibitorios en comparación con la dosis máxima de hPRL-G129R o de 4-OH-Tamoxifeno (Figura 18). Por ejemplo, 100 nM de 4-OH-Tamoxifeno produjeron una inhibición de 15%, pero, en presencia de 100 ng/ml de hPRL-G129R, el efecto inhibitorio fue de aproximadamente 32% del control.

Experimentos de co-cultivo. Las líneas de células L estables de ratón crecen a una velocidad similar a las células L normales, independientemente de que produzcan hPRL o hPRL-G129R, debido a que las células L de ratón poseen PRLR no detectable (Chen, 1994, J. Biol. Chem. 269:15892-15897). Los experimentos de co-cultivo ofrecen una presencia sostenida de hPRL-G129R biológicamente activa, lo que da como resultado una respuesta máxima en estas células tumorales.

Las dos líneas celulares de cáncer humano, tras co-cultivo con células L-G129R, demostraron una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis (Figura 19A-B). Las respuestas fueron bastante llamativas en comparación con los experimentos con medios acondicionados. Se alcanzó una completa inhibición de la proliferación celular en ambas líneas celulares. Se debe destacar que el patrón de respuesta de las células MCF-7 se desvió a la derecha en comparación con el de las células T47-D, es decir, requirió más hPRL-G129R para producir los mismos efectos inhibitorios. Estos resultados se pueden explicar por el hecho de que el número total de hPRLR en las células MCF-7 es mucho menor que el hallado en las células T47-D (Ormandy et al., Genes Dev. 15:167-178; Shih, 1981, en: Hormones and Breast Cancer, Cold Spring Harbor Laboratory, Pike, Siiteri y Walsh (eds.), págs. 185-194).

11. Ejemplo El antagonista G129R del receptor de prolactina humana induce la apoptosis en múltiples líneas celulares de cáncer de mama y células de cáncer de próstata humanos 11.1 Materiales y métodos

Líneas celulares. Las líneas celulares de cáncer de mama humanos MDA-MB-134, T-47D, BT-474 y MCF-7 se obtuvieron de ATCC. Se seleccionaron estas líneas celulares de cáncer de mama basándose en sus niveles de PRLR. La línea celular MDA-MB-134 exhibe el nivel máximo de PRLR, seguida de T-47D, BT-474, MCF-7 en orden decreciente de niveles de PRLR (Ormundy, J. Clinical Endocrinology and Metabolism 82:3692-3699).

Cultivo celular. Las células T-47D obtenidas de ATCC se cultivaron en RPMI-1640 (exento de rojo fenol), suplementado con FBS al 10% (GIBCO BRL). Las células BT-474 se cultivaron en medio RPMI-1640 (exento de rojo fenol), suplementado con FBS al 10% y los suplementos recomendados por ATCC. Las células MCF-7 se cultivaron en medio DMEM (exento de rojo fenol), suplementado con FBS al 10%. Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera húmeda, en presencia de CO_{2} al 5%. Las células MDA-MB-134 se cultivaron en medio de Leibovitz L-15, suplementado con FBS al 20%, y se cultivaron en una atmósfera libre de CO_{2}. Las células de cáncer de mama se sometieron a tripsinización (tripsina al 0,02% - EDTA) y se cultivaron en sus medios respectivos (exentos de rojo fenol), suplementados con CSS (suero purificado con carbono) al 10% durante una semana. A continuación, las células se sometieron a un nuevo tratamiento de tripsina y se sembraron sobre un sistema de placa de 8 cámaras (Lab Tek II), con una confluencia de 60-70% por cámara. Al día siguiente, se llevaron a cabo los tratamientos en las células de cáncer de mama usando sus respectivos medios (libres de rojo fenol), suplementados con CSS al 1%. Las células MDA-MB-134 V1 se cultivaron en medio que contuvo rojo fenol, pero con las mismas condiciones de suero que las restantes células de cáncer de mama.

Ensayo de marcaje de los cortes finales con dUTP, mediado por la desoxinucleotidil-transferasa terminal (TUNEL). Los cortes finales de ADN fragmentado se marcan en sus extremos 3-OH. Se incorpora dUTP marcado con fluoresceína en los extremos 3-OH utilizando la enzima desoxinucleotidil-transferasa. Después del período asignado de tratamiento, las cámaras se desensamblaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se llevó a cabo el ensayo TUNEL (sistema de detección de apoptosis, Fluorescein-Promega) según las instrucciones del fabricante. La placa se examinó bajo un filtro FITC usando un sistema de microscopia Olympus IX 70.

11.2 Resultados

La apoptosis (muerte celular programada) es uno de los mecanismos fisiológicos centrales que regulan la lisis oportuna y ordenada de las células (Stellar, H., 1995, Science 267:1445). La característica bioquímica de la apoptosis es la escisión internucleosómica de ADN (Wyllu, 1980, Nature 284:555; Roy et al., 1992, Exp. Cell Res. 200:416-424; Wyllu, 1980, Int. Rev. Cytol. 68:251-306), y se puede detectar por medio del ensayo TUNEL o por electroforesis sobre gel convencional (Chen, 1886, J. Cell Biochem. 61:9-17). El cáncer es una enfermedad en la que las células exhiben una capacidad reducida para sufrir apoptosis en respuesta a al menos algunos estímulos fisiológicos (Hoffman et al., 1994, Oncogene 9:1807). Los medicamentos capaces de inducir a que las células cancerosas sufran apoptosis podrían demostrar ser eficaces en la terapia del cáncer.

Tal como se ha demostrado en este documento, el antagonista PRLR G129R es capaz de inducir la apoptosis, como se ha detectado, por fragmentación del ADN es múltiples líneas celulares de cáncer de mama humano. La Figura 20A-F demuestra que G129R indujo la apoptosis de forma dependiente de la dosis después de 24 h de tratamiento, y que la apoptosis se produce incluso a concentraciones fisiológicas (50 ng/ml, Figura 20C). Al objeto de determinar la especificidad de G129R frente al PRLR, s utilizaron simultáneamente hPRL (cedida amablemente por el Dr. Parlow de NIH) y G129R para tratar las células en una relación de 1:1 y de 1:4 (Figura 20G-H). Es evidente que el G129R fue capaz de competir con hPRL en una relación de 1:1 (Figura 20E) y es capaz de invertir de manera competitiva la fragmentación de ADN inducida por G129R en una relación de 1:4 (Figura 20F). El efecto de rescate mitógeno de hPRL es todavía una indicación adicional de que G129R induce apoptosis. Se obtuvieron los mismos resultados usando células BT-474.

La fragmentación celular en células de cáncer de mama resulta obvia incluso después de 2 horas de tratamiento con G129R a una concentración de 50 ng/ml (Figura 21A-D). En estudios anteriores, se demostró que 4-OH-Tamoxifeno inhibe de manera sinérgica la proliferación de células de cáncer de mama junto con G129R. Por lo tanto, en este estudio se incluyó 4-OH-Tamoxifeno para verificar que 4-OH-Tamoxifeno también indujo apoptosis en las células de cáncer de mama por fragmentación de ADN. Sorprendentemente, 4-OH-Tamoxifeno no indujo apoptosis en células T-47D, MCF-7 o BT-474 a una concentración de hasta 1 \muM, tal como se ha ensayado con el mismo protocolo, a pesar del hecho de que 4-OH-Tamoxifeno fue capaz de inhibir la proliferación celular (Figura 22A-H). En contraste con 4-OH-Tamoxifeno, 250 ng de G129R indujeron apoptosis por fragmentación de ADN en las cuatro líneas celulares de cáncer de mama, positivas para PRLR, después de 24 horas de tratamiento (Figura 23A-F).

Además, se analizó el efecto de hPRL-G129R sobre la activación de Caspasa-3 en células T-47D, usando un kit de ensayo ApopAlert CPP32/Caspasa-3 (Clontech, Palo Alto, CA), como se muestra en la Figura 24. Células T-47D fueron tratadas con 250 ng/ml de hPRL-G129R durante 2 horas. El ensayo se llevó a cabo en presencia de DEVD-CHO (inhibidor de caspasa-3) para demostrar que la inducción de Caspasa-3 por parte de hPRL-G129R es un suceso específico.

Los datos descritos anteriormente indican que las células del cáncer de mama están adaptadas para utilizar prolactina como un importante factor de crecimiento, y sufren apoptosis cuando resultan privadas de ella por la fijación competitiva de G129R al PRLR, lo que conduce al bloqueo de la señal de crecimiento de PRL. De esta forma, la señal mitógena continua producida por hPRL puede superar las señales apoptóticas existentes en el interior de las células del cáncer de mama, permitiendo que tenga lugar el proceso de apoptosis retardado. Los datos expuestos en este documento indican que el antagonista del receptor de prolactina G129R se puede utilizar en terapia endocrina, junto con tamoxifeno, o por si solo, en el tratamiento del cáncer de mama.

Adicionalmente, dos células de cáncer de próstata sufrieron apoptosis en respuesta al tratamiento con 250 ng de hPRL-G129R durante 24 horas, tal como se ha detectado usando el ensayo TUNEL (Figura 25). Las muestras estuvieron duplicadas y cada muestra estuvo constituida por aproximadamente 2 millones de células.

<110> CHEN, WEN Y.

\hskip1cm WAGNER, THOMAS E.

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<120> USO DE AGENTES ANTI-PROLACTINA PARA TRATAR TRASTORNOS PROLIFERATIVOS

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<130> 31701-PCT

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<150> 60/085,128

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<151> 1998-05-12

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<150> 09/246,041

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<151> 1999-02-05

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<160> 9

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<212> ADN

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ccctctagac tcgagcggcc gcc

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23

Claims

1. Uso de una variante de prolactina humana, que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para la preparación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula de cáncer de mama o próstata, que expresa un receptor de prolactina.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la variante de prolactina humana tiene la glicina en posición 129 sustituida con arginina (G129R).

3. Uso de una variante de prolactina humana, que tiene una sustitución de la glicina en posición 129, para la preparación de un medicamento para inducir la apoptosis celular en una célula de cáncer de mama o próstata, que expresa el receptor de prolactina.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que la variante de prolactina humana tiene la glicina en posición 129 sustituida con arginina.

5. Uso según la reivindicación 3 ó 4, en el que la célula ha sido sometida a un procedimiento de ingeniería genética para expresar el receptor de prolactina.

6. Un método in vitro para identificar un compuesto capaz de modular la actividad del receptor de prolactina, en donde el método comprende:

a): poner en contacto un compuesto con una célula que expresa el receptor de prolactina;

b): medir el nivel de apoptosis en la célula; y

c): comparar el nivel de apoptosis obtenido en (b) con el nivel obtenido en ausencia del compuesto;

de manera que si el nivel obtenido en (b) difiere del alcanzado en ausencia del compuesto, se ha identificado un compuesto capaz de modular la actividad del receptor de prolactina.

7. El método según la reivindicación 6, en el que el compuesto incrementa el nivel de apoptosis en la célula.

8. El método según la reivindicación 6 ó 7, en el que el compuesto reduce el nivel de apoptosis en una célula en presencia de un antagonista del receptor de prolactina.

9. Una proteína de fusión que comprende una variante de prolactina humana, que está unida a otra proteína, en donde la variante tiene una sustitución de la glicina en posición 129.

10. Una proteína de fusión según la reivindicación 9, en donde la variante de prolactina está unida a interleuquina 2.

11. Una proteína de fusión según la reivindicación 9 ó 10, en donde la variante tiene la glicina en posición 129 sustituida con arginina.

12. Uso de una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama o próstata.