ES2284266T3 - Composiciones terapeuticas liposomicas que se pueden obtener mediante el uso de un grandiente de sulfato amonico. - Google Patents
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Abstract
Utilización de una composición liposómica que comprende una sustancia terapéutica para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica, en la que dicha composición puede obtenerse (i) incubando una solución que comprende dicha sustancia terapéutica, a un pH que impida la precipitación de dicha sustancia terapéutica en la solución, con una suspensión de liposomas que tiene una concentración de iones amonio mayor dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas, y (ii) retirar una sustancia terapéutica no encapsulada, en la que dichos liposomas son liposomas multivesiculares gigantes (GMV) que pueden obtenerse (a) agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico, (b) homogeneizando la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y (c) congelando y descongelando repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua.
Description
Composiciones terapéuticas liposómicas que se
pueden obtener mediante el uso de un gradiente de sulfato
amónico.
La presente invención se refiere a composiciones
liposómicas que comprenden una sustancia terapéutica, útiles para
la administración prolongada de dicha sustancia terapéutica, que se
preparan utilizando un procedimiento de carga con gradiente de
sulfato amónico. La invención proporciona también la utilización de
dichas composiciones para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a producir la administración prolongada de
dicha sustancia terapéutica. Las suspensiones liposómicas
comprenden liposomas (multivesiculares gigantes) "GMV" y
también se dan a conocer métodos para su preparación.
Boogaerts. J. G. et al., Can J
Anaesth 40(12):1201-1204
(1993).
Grant, G. J. et al., Reg Anesth
19(4):264-269 (1994).
Haran, G. et al., Biochem
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(1993).
Kim, S. et al., Patente U.S. nº
5.723.147 (1998).
Legros, F. et al., Patente U.S. nº
5.244.678 (1993).
Mowat, J. J. et al.,
Anesthesiology 85(3):635-643
(1996).
Stewart, J. C. M., Anal. Biochem
104, 10 (1959).
Se ha demostrado que la encapsulación liposómica
de anestésicos locales aumenta la duración del alivio del dolor.
Los factores críticos en la eficacia de las formulaciones
liposómicas de bupivacaína incluyen la encapsulación de la máxima
cantidad de fármaco, así como una tasa de liberación adecuada tras
la inyección. Los inconvenientes principales de las formulaciones
liposómicas de bupivacaína descritas anteriormente (p. ej.
Boogaerts, Grant, Legros) son la oclusión del fármaco relativamente
ineficaz y las proporciones bajas de fármaco/lípido. Esto puede
conducir a un depósito indeseable de material lipídico graso en el
punto de inyección.
Recientemente, se describió (Mowat) la carga
activa de bupivacaína utilizando un gradiente de pH. Se utilizó una
solución de citrato sódico para crear un gradiente transmembranario,
y se consiguió una relación fármaco/lípido de 0,26, mayor que la
obtenida anteriormente por técnicas de carga "pasiva" (p. ej.
Legros). Sin embargo, en Mowat, se mantuvo el pH extraliposómico a
aproximadamente 7,4, lo que limita potencialmente la cantidad de
fármaco disponible para la carga, ya que la bupivacaína es poco
soluble a este pH.
El documento
EP-A2-0 361 894 da a conocer un
sistema para cargar una molécula anfifática en liposomas que
comprende la formación de una suspensión de liposomas en presencia
del compuesto de amonio o de la sal de amonio en la que dicha
suspensión se diluye con tampón o sal para proporcionar un gradiente
de amonio de dentro a fuera entre las fases acuosa interna y acuosa
externa y un gradiente de pH en el que el pH interno de los
liposomas es más ácido que el pH externo. Dicho documento no da a
conocer la implicación de los liposomas multivesicuulares gigantes
(GMV).
La presente invención incluye, en un aspecto, la
utilización de una composición liposómica que comprende una
sustancia terapéutica para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a la administración prolongada de dicha
sustancia terapéutica, en la que dicha composición puede
obtenerse
- (i)
- incubando una solución que comprende dicha sustancia terapéutica, a un pH que impida la precipitación de dicha sustancia terapéutica en la solución, con una suspensión de liposomas que tiene una concentración de iones amonio mayor dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas, y
- (ii)
- retirar la sustancia terapéutica no encapsulada,
- \quad
- en la que dichos liposomas son liposomas multivesiculares gigantes (GMV) que pueden obtenerse
- (a)
- agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,
- (b)
- homogeneizando la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y
- (c)
- congelando y descongelando repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua.
\newpage
Preferentemente, la solución acuosa tiene una
concentración en sulfato amónico de aproximadamente 250 mM y, en la
etapa de incubación, la solución que comprende la sustancia
terapéutica tiene un pH eficaz para impedir la precipitación de la
sustancia terapéutica; típicamente alrededor de 6 o menos.
Preferiblemente, el punto de administración de
las composiciones liposómicas debe enfriarse. Preferiblemente, la
piel del paciente se enfría a una temperatura de aproximadamente
22ºC en el punto de inyección.
La presente invención proporcionar también un
método de preparación de liposomas GMV que comprende: (a) agitar
intensamente una película de lípido con una solución acuosa de
sulfato amónico, (b) homogeneizar la suspensión resultante para
formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y
(c) congelar y descongelar repetidamente dicha suspensión de SUV en
nitrógeno líquido seguido de agua. Preferentemente, la congelación
y descongelación se repite al menos cinco veces, y más
preferentemente alrededor de diez veces. El sulfato amónico
extraliposómico se retira a continuación, p. ej. por diálisis
frente a solución salina normal. Los liposomas GMV, por sí mismos
también proporcionan un aspecto adicional de la presente invención.
Preferentemente, el método de preparación incluye la encapsulación
de una sustancia terapéutica dentro de los liposomas, p. ej.
incubando una suspensión de los liposomas con una solución de la
sustancia terapéutica. Preferentemente, la sustancia es débilmente
básica, y la suspensión de liposomas GMV tiene una concentración
mayor de iones amonio en el interior de los liposomas que fuera de
los liposomas, como se describió anteriormente. Cuando la sustancia
es bupivacaína, en la etapa de incubación, la solución de
bupivacaína tiene un pH eficaz para prevenir la precipitación de la
bupivacaína; típicamente alrededor de 6 o menos.
Las composiciones liposómicas a base de GMV
tienen una proporción molar de fármaco a lípido, después de la
eliminación del fármaco no encapsulado, de al menos 0,5. Después de
la concentración adicional de la suspensión liposómica resultante
por ultrafiltración o centrifugación, la proporción molar de fármaco
a lípido es al menos 0,5, preferentemente al menos 1,0 y más
preferentemente al menos 1,5.
Estos y otros objetivos y características de la
invención serán completamente evidentes cuando al leer la siguiente
descripción detallada de la invención junto con los dibujos
adjuntos.
La Figura 1 es un dibujo lineal basado en una
fotomicrografía de los liposomas GMV descritos en la presente
memoria;
La Figura 2 presenta el efecto de pH en la
solubilidad de la bupivacaína (BUP) a tres concentraciones en
sulfato amónico 250 mM;
La Figura 3 presenta el tamaño y la distribución
de tamaños de los liposomas obtenidos durante 15 etapas sucesivas
de congelación y descongelación en la preparación de GMV;
La Figura 4 presenta el cambio de volumen
ocluido de los liposomas obtenidos durante 15 etapas sucesivas de
congelación y descongelación en la preparación de GMV;
Las Figuras 5A-5C presentan la
tasa de liberación de BUP de los liposomas GMV compuestos de
HPC/Chol (fosfatidilcolina de soja hidrogenada/colesterol) en
relaciones molares de 50:50 (3A), 67:33 (3B) y 75:25 (3C), a 4ºC,
temperatura ambiente (21ºC) y temperatura corporal (37ºC), durante
24 horas;
Las Figuras 6A-6C presentan los
perfiles de liberación de las composiciones de las Figs.
3A-3C durante 7 días;
Las Figuras 7A-7C presentan la
tasa de liberación de BUP de los liposomas GMV compuestos de
DMPC/colesterol en relaciones molares de 50:50 (3A), 67:33 (3B) y
75:25 (3C), a 4ºC, 21ºC y temperatura corporal (37ºC), durante 24
horas;
La Figura 8 presenta el efecto de BUP en las
formas no liposómicas y varias liposómicas, que contienen una
proporción de HPC/Chol lípido 67:33, cargada con un gradiente de
sulfato amónico, sobre la duración del bloqueo sensorial tras la
inyección subcutánea en ratones;
La Figura 9 presenta el efecto de la estructura
del liposoma y del contenido en Chol sobre la duración de la
analgesia;
La Figura 10 presenta los datos de respuesta a
la dosis para 0,5%, 1% y 2% de BUP en MLV que contiene HPC/Chol
67:33 o 50:50;
Las Figuras 11-12 presentan los
datos de respuesta a la dosis para 0,5%, 1% y 2% de BUP en GMV que
contiene, respectivamente, HPC/Chol 67:33 o 50:50;
La Figura 13 presenta el efecto de BUP en las
formas no liposómicas y liposómicas, que contienen una proporción
de HPC/Chol lípido 67:33, cargada con un gradiente de sulfato
amónico, sobre la duración del bloqueo sensorial tras la inyección
subcutánea en ratones, con y sin enfriamiento en el punto de
inyección o adyacente al mismo; y
Las Figuras 14A y 14B presentan el cambio en la
temperatura corporal durante el tiempo de administración de
bupivacaína GMV a ratones (Fig. 14A; duración del enfriamiento 9
horas) o de bupivacaína pura (Fig. 14B; duración del enfriamiento 1
hora) con enfriamiento en el punto de administración (ipsolateral) o
adyacente al mismo (contralateral).
Se prepararon una gama de estructuras y
composiciones liposómicas. El lípido de la matriz utilizado para
todas las formulaciones fue fosfatidilcolina de soja hidrogenada
(HPC), adquirido en Lipoid, Ludwigshafen, Alemania, constituido por
>98% de
diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
(DSPC) y que tiene una temperatura de transición de fase de
aproximadamente 52,5ºC. Este lípido se utilizó solo o en combinación
con colesterol (Chol) 50 ó 33 por ciento molar.
Las estructuras liposómicas preparadas eran
vesículas unilaminares pequeñas (SUV), vesículas unilaminares
grandes (LUV), vesículas multilaminares (MLV) y una estructura
indicada en la presente memoria como GMV (véase la Fig. 1, basada
en una microfotografía de estas vesículas). Se prepararon varias
estructuras de la forma siguiente. Aunque solamente las GMV están
comprendidas en la composición, utilizaciones y métodos de la
presente invención, la descripción de las demás vesículas se ha
mantenido a título de referencia.
Se formó una película fina de lípido disolviendo
el/los componente(s) lipídico(s) en cloroformo y
eliminando el disolvente en un evaporador rotativo. Se formaron
MLV, según los procedimientos conocidos, hidratando la película con
una solución de sulfato amónico (véase la exposición del gradiente
de sulfato amónico a continuación) y agitando a 60ºC, dando una
composición lipídica final de aproximadamente 4%. Preferiblemente,
la concentración de la solución es 250 mM de
(NH_{4})_{2}SO_{4}. No se obtuvieron concentraciones
mayores (400-500 mM) que fueran más eficaces.
Una parte de la preparación de MLV se utilizó
para formar SUV, de nuevo según métodos conocidos, mediante
homogeneización a alta presión a 680-1.020 atm
(10.000-15.000 psi) (EmulsiFlex-C5,
Avestin, Ottawa, ON).
Se prepararon GMV (Fig. 1) congelando y
descongelando una parte de la preparación de SUV, en suspensión
todavía en la solución de sulfato amónico, en nitrógeno líquido
seguido de inmersión en agua a 37ºC. Se repitió el proceso de
congelación y descongelación diez veces.
Se formaron LUV por extrusión de una parte de
las MLV a través de membranas de policarbonato dimensionadas
sucesivamente (0,6, 0,4 y 0,2 \mum; Nucleopore, Pleasanton, CA),
utilizando un extrusor de biomembranas Lipex (Vancouver, BC).
Para cada formulación, se lavó a continuación el
medio extraliposómico de sulfato amónico por diálisis frente a
solución salina normal a 4ºC, cambiando el dializado tres veces.
Esto es eficaz para crear un gradiente de ión amonio de dentro a
afuera a través de la membrana liposómica (Haran). Las suspensiones
liposómicas tienen de este modo una concentración mayor de iones
amonio en el interior de los liposomas que fuera de los liposomas;
preferiblemente,
[(NH_{4})_{2}SO_{4}]_{int}/[(NH_{4})_{2}SO_{4}]_{ext}
> 300. El pH interno es inferior al pH externo, aunque puede
permanecer lo suficientemente alto para permitir la formación de
amoniaco a partir del ión amonio durante el proceso de carga. El
gradiente de concentración de ión amonio proporciona motivación
para la carga de bases anfífilas débiles tal como la bupivacaína.
Durante la incubación con una solución de la base, el compuesto no
protonado atraviesa la membrana y se protona en el pH inferior del
interior. Esto aumenta el pH dentro de las vesículas, lo que conduce
a la liberación de amoniaco a través de la membrana. El proceso
continua siempre que exista un gradiente de ión amonio a través de
las membranas liposómicas.
En el presente caso, los liposomas se incubaron
con una solución de 50 mg/ml de BUP HCl durante 45 minutos a 60ºC.
Durante este procedimiento, el pH extraliposómico debería mantenerse
a un pH inferior a aproximadamente 6, p. ej. aproximadamente 5,5,
para asegurar la solubilidad de la BUP e impedir su precipitación.
Véase, por ejemplo, la Fig. 2, que presenta la solubilidad acuosa
de BUP dependiente de pH. Los datos se produjeron añadiendo varias
concentraciones de BUP, como las indicadas, a sulfato amónico 250 mM
a diferentes pH. Las muestras se agitaron intensamente y se
centrifugaron, y se determinó la cantidad de BUP disuelta en el
sobrenadante. Como se muestra en la Figura, grandes cantidades de
BUP precipitaron en las soluciones más concentradas a pH superiores
a aproximadamente 6. Además, la Tabla I presenta los coeficientes de
reparto de BUP en octanol/sulfato amónico acuoso a varios pH. De
nuevo, la solubilidad acuosa disminuye sustancialmente entre pH 6 y
8. (La solubilidad acuosa se reduce también ligeramente a pH
2).
La BUP no ocluída se retiró de las suspensiones
liposómicas por diálisis frente a solución salina normal. Los
liposomas (SUV y LUV) se concentraron por ultrafiltración
(Centriprep-10 concentrator, Amicon, Beverly, MA) o
por centrifugación a 3.000 G (GMV y MLV). Las características de
estas preparaciones se dan en la Tabla II.
Se prepararon también lotes por separado de GMV
y MLV en los que se utilizó centrifugación en lugar de diálisis
para retirar tanto el sulfato amónico como la BUP del medio
extraliposómico. Estas formulaciones se describen en la Tabla
III.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra a continuación, las
formulaciones de liposomas de GMV con 33 a 50 por ciento molar de
colesterol y de HPC restantes son particularmente eficaces para
proporcionar analgesia prolongada (p. ej. Figura 5), como lo eran
las formulaciones con 40 por ciento molar de colesterol y las
restantes de DMPC, DSPC o DPPC (datos no mostrados). Sin embargo,
los liposomas no se limitan a estas formulaciones, y pueden formarse
de varias combinaciones de lípidos formadores de vesículas, es
decir, lípidos anfipáticos que tienen restos de grupos principales
hidrófobos y polares y que pueden formar vesículas bicapa en agua,
ejemplificados por fosfolípidos, o que pueden incorporarse de forma
estable en bicapas de lípido, tales como los esteroles. Los lípidos
incluyen típicamente una o dos cadenas hidrocarbonadas de acilo
hidrófobo o un grupo esteroideo, y pueden contener un grupo
químicamente reactivo, tal como una amina, ácido, éster, aldehído o
alcohol, en el grupo polar principal. En los fosfolípidos, las dos
cadenas hidrocarbonadas son típicamente de aproximadamente 14 a 22
átomos de carbono de longitud, y tienen grados variables de
insaturación. Ejemplos representativos son varias fosfatidilcolinas
(PC), fosfatidiletanolaminas (PE), ácido fosfatídico (PA),
fosfatidilinositol (PI), esfingomielina (SM), lípidos con carga
negativa tales como dimiristoil fosfatidil glicerol (DMPG) y lípidos
con carga positiva tal como
1,2-diestearoil-3-trimetilamonio
propano (DSTAP).
La distribución de tamaño de los liposomas se
determinó por espectroscopia de correlación de fotones (N4Plus,
Coulter, Miami, FL). El intervalo de tamaño de las formulaciones de
Chol al 33% lavadas por diálisis y concentradas por centrifugación
(Tabla 2) fueron, en nm ± S.D.: SUV, 90 ± 150; LUV, 175 ± 70; GMV,
2.440 ± 545; MLV, 6.260 ± 1310. La distribución de tamaños de GMV y
MLV preparadas utilizando centrifugación solamente se dan en la
Tabla 3; estos tamaños se observaron que variaban considerablemente
con la composición del lípido.
El tamaño y la distribución de tamaño de los
liposoma se midieron también durante la preparación de GMV después
de cada uno de los quince ciclos sucesivos de congelación y
descongelación; los resultados se dan en la Figura 3. Como se
muestra en la Figura, el tamaño final y la distribución se
aproximaron después de aproximadamente cinco ciclos.
El volumen ocluído se determinó también
utilizando inulina radiomarcada. El aumento de volumen ocluído es
evidente para aproximadamente los siete primeros ciclos, como se
muestra en la Fig. 4. La proporción de volumen ocluído a tamaño se
observó que permanece constante a lo largo de los quince ciclos (a
aproximadamente 5.000 CPM/\mumoles de fosfolípido), lo que
demuestra que el aumento de tamaño no conducía a ninguna pérdida
significativa de contenidos.
En la Fig. 1 se representa en dibujo lineal una
fotomicrografía de los liposomas GMV. El campo de visión de la
fotomicrografía abarca el intervalo de aproximadamente 1.300 a 1.400
nm (fotomicrografía original tomada a 45.000\times y ampliada
aproximadamente 2\times). Dado el intervalo de tamaño de los
liposomas GMV, anteriormente, es probable por consiguiente que las
estructuras presentadas estén realmente dentro de una vesícula aún
mayor. Las estructuras liposómicas parecen MVV (vesículas
multivesiculares) porque las vesículas externas grandes contienen
múltiples vesículas más pequeñas, no concéntricas. En comparación
con MVV descrito anteriormente, sin embargo, preparadas por un
procedimiento diferente (p. ej. Kim et al.), la proporción
área/volumen de lípido total dentro de estas estructuras es
considerablemente más pequeña.
La concentración de BUP en liposomas se
determinó por HPLC como se describe en el Ejemplo 1. Se determinó
la concentración de lípido utilizando el análisis de Stewart
(Stewart, 1959). Se calculó la proporción molar fármaco/lípido
(D/PL) para cada formulación dividiendo los moles de BUP por los
moles de fosfolípido.
\newpage
Las Tablas II y III dan las características de
los liposomas lavados por diálisis y por centrifugación,
respectivamente. Como se muestra en la Tabla II, D/PL disminuyó
una vez que se concentraron las formulaciones por ultrafiltración,
pero los valores fueron todavía significativamente mayores que los
dados a conocer anteriormente (es decir, 0,26 en Mowat, utilizando
un gradiente de citrato sódico, y de aproximadamente 0,1 en Legros,
utilizando técnicas de carga normales). La concentración total de
BUP en las suspensiones liposómicas fue tan alta como 3,9% en peso
para los liposomas GMV, de nuevo significativamente mayor que la
dada a conocer anteriormente. (Mowat comunicó una concentración de
BUP HCl "intravesicular" de aproximadamente 100 mM. Este valor
corresponde a aproximadamente 3,25% en peso, pero no tiene en
cuenta el volumen del medio en el que están suspendidas las
vesículas. Por consiguiente, la concentración total en la suspensión
sería significativamente inferior).
Una D/PL alta es especialmente importante para
la administración de anestésicos locales en puntos tal como el
tejido subcutáneo. En una zona visible, no es deseable que una gran
masa de lípido se retenga en el punto de inyección durante un
periodo prolongado. La utilización de formulaciones tales como las
descritas en la presente memoria permite la analgesia prolongada,
como se demuestra a continuación, con una carga mínima de
lípido.
D/PL fue inferior en conjunto para las
formulaciones lavadas por centrifugación; es de esperar que se
produjera alguna pérdida de fármaco como resultado de la distorsión
de la membrana en estas condiciones. La pérdida mayor se observó en
los liposomas MLV y GMV que tiene un contenido menor en colesterol
(Tabla 2, columnas 3 frente a 6 y 5 frente a 8). Sin embargo, no se
observó ningún efecto constante del contenido de colesterol sobre
las concentraciones de BUP extremas o sobre la proporción D/PL
(columnas 6 y 8).
La tasa de liberación de BUP de los liposomas
GMV (HPC/Chol a diferentes proporciones) se evaluó a 4ºC, a
temperatura ambiente (21ºC) y a la temperatura corporal (37ºC). Como
se muestra en las Figs. 5A-5C, se liberó poco o
nada de fármaco en el sobrenadante tras el almacenamiento a 4ºC
durante 24 h. A temperatura ambiente, hubo una liberación gradual y
estacionaria del fármaco, con aproximadamente el 25% liberado
después de 24 h., en los liposomas compuestos de HPC/Chol 50:50,
pero poca liberación en aquellos que tienen concentraciones
inferiores de colesterol. A 37ºC, una tasa de liberación
significativamente mayor se observó inicialmente, en particular
para los liposomas con HPC/Chol 50:50, seguido de más liberación
gradual. Aproximadamente del 50 al 70% del fármaco estaba presente
en el sobrenadante tras 24 h.
Las Figuras 6A-6C presentan la
liberación de las mismas composiciones durante un periodo de siete
días. La liberación continuó siendo despreciable a 4ºC, asegurando
de este modo buena estabilidad al almacenaje, y continuó a una tasa
gradual a 21ºC y 37ºC.
Estos resultados demuestran que el fármaco se
libera a una tasa adecuada a la temperatura corporal, y que la tasa
de liberación del fármaco puede ser controlada alterando la
temperatura. Ambos de estos aspectos se añaden a la utilidad
clínica de las composiciones.
La tasa de liberación debería ser también
adecuada para la manipulación alterando los lípidos constituyentes.
En general, es de esperar una tasa de liberación más lenta para los
liposomas compuestos de lípidos más "rígidos", que tienen
temperaturas más altas en la fase de transición, tales como HPC,
DSPC (diestearoil PC) o DPPC (dipalmitoil PC), que un lípido más
"fluido", tal como DMPC (dimiristoil PC). Este efecto se
demuestra en las Figs. 7A-7C, que presentan la
liberación de bupivacaína a las tres mismas temperaturas de
liposomas GMV compuestos de colesterol y DMPC del 50 al 75%. La
liberación fue significativamente más rápida en los liposomas con
DMPC/Chol 67:33 que en los liposomas HPC/Chol 50:50 (Fig. 7B frente
a Fig. 5B) y los liposomas DMPC/Chol 75:25 liberados del fármaco
incluso en frío (Fig. 7C). Por consiguiente, tanto la temperatura
como la composición del lípido pueden manipularse para controlar la
tasa de liberación del fármaco. La manipulación de la temperatura en
una composición in vivo se expone con más detalle a
continuación.
Se evaluó la analgesia en ratones
Swiss-Webster macho, como se describe en el Ejemplo
2, utilizando la respuesta a la estimulación eléctrica cutánea.
Antes de la administración analgésica, se determinó el umbral de
vocalización de referencia (corriente requerida para producir una
respuesta a la vocalización). Los ratones que no pudieron responder
a una corriente de admisión (15 mA) se excluyeron del estudio.
Para experimentar, se inyectaron por vía
subcutánea 150 \mul de la solución de ensayo en el abdomen, y se
evaluó el bloqueo sensorial a intervalos regulares, es decir, 15
min. para las formulaciones de BUP al 0,5% y 30 min. para las
formulaciones al 1% y 2%. La incapacidad de vocalizar en respuesta a
la corriente umbral se consideró prueba de analgesia. El
experimento se terminó cuando dos estímulos sucesivos provocaron una
vocalización. La duración de la analgesia se consideró como el
tiempo desde la inyección hasta el último estímulo en el que no se
producía vocalización.
Para los datos mostrados en las Figs. 8 y 9, se
diluyeron todas las formulaciones hasta una concentración final de
BUP del 0,5%. (Las concentraciones mayores de BUP no liposómica se
demostraron tóxicas). Se obtuvieron las curvas de respuesta a la
dosis, presentadas en las Figs. 10-12, para las
formulaciones de MLV y GMV que contienen BUP al 1% y 2%.
Los resultados para varias formulaciones que
contienen Chol al 33%, como las caracterizadas en la Tabla II, se
presentan en la Fig. 8. Como se muestra, todas las formulaciones,
excepto para SUV, prolongaron significativamente el efecto
analgésico en comparación con la referencia (BUP "pura").
La Fig. 9 presenta el efecto de las
formulaciones caracterizadas en la Tabla III. (Los datos mostrados
en las Figs. 10 a 12 corresponden también a las formulaciones
descritas en la Tabla III). Como se muestra, los liposomas GMV
fueron más eficaces que MLV en la prolongación de la analgesia,
particularmente para la formulación de Chol al 33%. Las curvas de
respuesta a la dosis para MLV que contenía Chol al 33% y 50% se
presentan en la Fig. 10. Se observaron diferencias no constantes
entre las diferentes composiciones de lípido en este caso. Datos
similares para los liposomas GMV, en las Figs. 11 a 12, presentan un
efecto prolongado para la composición de Chol al 33%. La
comparación de las Figs. 11 a 12 con la Fig. 10 presenta también un
efecto (prolongado) significativamente mayor para los liposomas GMV
en comparación con la MLV.
La duración prolongada de la acción analgésica
para la GMV en comparación con MLV puede estar relacionada con la
estructura de GMV, como se presenta en la Fig. 1. Los liposomas de
GMV proporcionan un volumen encapsulado mayor con pocas membranas
para ser atravesadas por el fármaco. La tasa de liberación puede
regularse también alterando la composición del lípido, como se
sugiere diferenciando los resultados de las formulaciones de Chol
al 33 y 50% mostradas en las Figs. 11 y 12, y por los resultados
expuestos para varios lípidos de PC anteriormente.
Se descubrió también que el enfriamiento local
de la piel en el punto de administración de las formulaciones
liposómicas aumentaba la duración de la analgesia. En un grupo de
referencia, se inyectaron ratones con 0,15 ml de bupivacaína no
liposómica a una concentración del 0,5%, la máxima tolerada
normalmente. Se aplicó enfriamiento sobre el punto de inyección o
sobre el abdomen contralateral al punto de inyección. (Se aplicó el
enfriamiento aplicando un depósito metálico pequeño, de
aproximadamente 15 mm de diámetro, al abdomen del ratón; se bombeó
agua con hielo a través del depósito para mantener la piel a una
temperatura de aproximadamente 22ºC). No hubo diferencia entre
estos dos grupos y un grupo en el que no se aplicó enfriamiento. La
analgesia remitió en dos horas (véase la Fig. 13).
La misma prueba se realizó a continuación
utilizando una formulación de bupivacaína liposómica al 1,5% (GMV;
HPC/Chol 67:33). La analgesia se prolongó de manera significativa en
todos los casos, como era de esperar, pero en el grupo que recibió
enfriamiento en el punto de inyección, se prolongó más, hasta 19
horas frente a 13 a 14 horas (Fig. 13).
Para determinar el efecto sobre la temperatura
general del cuerpo de este tratamiento, se midió la temperatura
rectal en todos los animales enfriados en el punto de inyección
(ipsolateral) o sobre el abdomen contralateral, utilizando tanto
bupivacaína encapsulada en GMV como bupivacaína (pura) no
encapsulada. Estos resultados se ilustran en las Figs. 14A y 14B,
respectivamente. En la Fig. 14A, se inició el enfrimiento a las cero
horas (con administración) y se interrumpió a las nuevo horas; en
la Fig. 14B, se inició el enfriamiento a las cero horas y se
interrumpió en una hora. No existieron diferencias significativas
observadas en función del punto de enfriamiento. Los animales
inyectados con bupivacaína pura y enfriados durante una hora (Fig.
14B) presentaron un retorno retardado a la temperatura corporal
normal (aproximadamente 25 a 35 minutos), debido más probablemente
a un trastorno de termorregulación inducido por la dosis elevada de
bupivacaína. Los animales del grupo GMV (Fig. 14A) retornaron a la
temperatura corporal de referencia en aproximadamente 10 minutos
tras la interrupción del enfriamiento.
Aunque la analgesia utilizando bupivacaína se
demuestra en la presente memoria, estos métodos y composiciones
pueden utilizarse también para la carga eficaz y la administración
prolongada de otras sustancias, particularmente fármacos anfífilos,
débilmente básicos. Dichos fármacos incluyen otros compuestos
analgésicos, tales como, por ejemplo, lidocaína o ropivacaína.
Los liposomas lavados se disolvieron en
isopropanol (1:1.000) y se inyectaron alícuotas en una columna de 8
mm \times 100 mm (Radial-Pak bNVCN, 4 \mum,
Waters, Milford, MA). Se utilizó una fase móvil de tampón de
acetonitrilo:fosfato 75:25) 25 mM, pH 4,0, y se midió la absorción a
210 nm. El tiempo de retención de BUP fue aproximadamente de 4,7
minutos. Se expresaron los resultados (véase las Tablas II y III) en
mg/ml.
El Institutional Animal Care and Use Committee
aprobó todos los experimentos. Se utilizaron ratones
Swiss-Webster macho que pesaban 28 ± 3 g. Los
animales tuvieron libre acceso al pienso y al agua, y se mantuvieron
en un ciclo de oscuridad-luz de 12 horas. Antes del
ensayo, se rasuró el pelo que cubría al abdomen. Se evaluó la
analgesia utilizando la respuesta al estímulo eléctrico cutáneo. Se
utilizó un generador de corriente (modelo S48, Grass Instruments,
Quincy, MA) acoplado a una unidad de corriente contínua (modelo
PSIU6F, Grass Instruments). Se administró corriente a la superficie
de la piel aplicando suavemente dos electrodos formados por agujas
del calibre nº 25. Se evaluó el umbral de vocalización antes de la
prueba, y se realizó la prueba como se describió anteriormente.
Claims (21)
1. Utilización de una composición liposómica que
comprende una sustancia terapéutica para la preparación de una
composición farmacéutica destinada a la administración prolongada de
dicha sustancia terapéutica, en la que dicha composición puede
obtenerse
- (i)
- incubando una solución que comprende dicha sustancia terapéutica, a un pH que impida la precipitación de dicha sustancia terapéutica en la solución, con una suspensión de liposomas que tiene una concentración de iones amonio mayor dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas, y
- (ii)
- retirar una sustancia terapéutica no encapsulada,
- \quad
- en la que dichos liposomas son liposomas multivesiculares gigantes (GMV) que pueden obtenerse
- (a)
- agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,
- (b)
- homogeneizando la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y
- (c)
- congelando y descongelando repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua.
2. La utilización de la reivindicación 1, en la
que dicho pH es 6 o menos.
3. La utilización de la reivindicación 1 ó 2, en
la que dicha congelación-descongelación se repite al
menos cinco veces.
4. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha preparación de dicha
composición liposómica comprende además concentrar la suspensión
liposómica por ultrafiltración o centrifugación.
5. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que la relación molar de sustancia
terapéutica encapsulada a lípido en dicha composición liposómica es
al menos 1,0.
6. La utilización según la reivindicación 5, en
la que la relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a
lípido en dicha composición liposómica es al menos 1,5.
7. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el punto de administración de
dicha composición liposómica debe enfriarse.
8. La utilización según la reivindicación 7, en
la que dicho punto debe enfriarse de modo que la temperatura local
de la piel es aproximadamente de 22ºC.
9. La utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha sustancia terapéutica es un
fármaco analgésico y la asm prolongada de la misma produce analgesia
prolongada.
10. La utilización según la reivindicación 9, en
la que dicho fármaco analgésico es la bupivacaína.
11. Un método de preparación de liposomas de
GMV, que comprende,
- (a)
- agitar intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,
- (b)
- homogeneizar la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y
- (c)
- congelar y descongelar repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua
- \quad
- en el que dicha GMV debe cargarse con una sustancia terapéutica que tenga una relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a lípido que sea al menos 0,5.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
dicha congelación-descongalación se repite al menos
cinco veces.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 o 12, que comprende además encapsular una
sustancia terapéutica dentro de dichos liposomas, incubando dicha
suspensión de GMV con una solución de dicha sustancia
terapéutica.
\newpage
14. El método de la reivindicación 13, en el que
dicha sustancia terapéutica es débilmente básica y dicha suspensión
de liposomas de GMV tiene una concentración mayor de iones amonio
dentro de dichos liposomas que fuera de dichos liposomas.
15. El método de la reivindicación 14, en el que
dicha sustancia es la bupinacaína, y dicha incubación se realiza a
un pH que impide la precipitación de la bupinacaína en la
solución.
16. Una composición liposómica que comprende
liposomas de GMV, GMV que puede obtenerse
- (a)
- agitando intensamente una película de lípido con una solución acuosa de sulfato amónico,
- (b)
- homogeneizar la suspensión resultante para formar una suspensión de pequeñas vesículas unilaminares (SUV), y
- (c)
- congelar y descongelar repetidamente dicha suspensión de SUV en nitrógeno líquido seguido de agua
- \quad
- en el que dicha GMV esta destinada a encapsular en la misma una sustancia terapéutica con una relación molar de sustancia terapéutica encapsulada a lípido que sea al menos 0,5.
17. La composición según la reivindicación 16,
en la que dicha congelación-descongalación se
repite al menos cinco veces.
18. La composición según cualquiera de las
reivindicaciones 16 o 17, que comprende además una sustancia
terapéutica encapsulada dentro de dichos liposomas.
19. La composición según la reivindicación 18,
en la que dicha sustancia es un fármaco analgésico.
20. La composición según la reivindicación 19,
en la que dicho fármaco analgésico es la bupivacaína.
21. Composición según la reivindicación 20, con
una relación molar de bupivacaína encapsulada a lípido de al menos
1,5.
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