ES2282125T3 - Peptidos que contienen d-aminoacidos n-sustituidos para prevenir la asociacion de cadenas beta. - Google Patents

Abstract

Un compuesto o composición química que comprende un péptido, en el que (a) dicho péptido comprende una sección de péptido que forma cadena beta que comprende una secuencia de al menos cuatro restos alfa-D-aminoácidos consecutivos, todos los cuales permiten estéricamente que la sección de péptido que forma cadena beta forme una cadena beta; -b) cada uno de los restos alfa-D-aminoácidos consecutivos en la sección de péptido que forma cadena beta tiene una cadena lateral; (c) dicha sección que forma cadena beta del péptido forma una cadena beta que tiene una cadena principal peptídica que toma la forma de una cinta extendida que tiene dos bordes, un primer borde y un segundo borde, de modo que los componentes NH y CO de los grupos peptídicos de la cadena principal quedan a lo largo de los dos bordes de la cinta, y en el que el primer borde se asocia con una cadena beta diana formada por una molécula que contiene péptido separada y las cadenas laterales de los restos alfa-D-aminoácidos consecutivos pueden formar interacciones no covalentes favorables con las cadenas laterales vecinas de la cadena beta diana formada por la molécula que contiene péptido separada; (d) al menos uno de los restos alfa-D-aminoácidos consecutivos en la cadena principal peptídica de la cadena beta está sustituido en Nalfa, de modo que el o los sustituyentes de Nalfa quedan sólo a lo largo de dicho segundo borde e impiden estéricamente la asociación del segundo borde con otra cadena beta; y (e) cualesquiera dos restos alfa-D-aminoácidos sustituidos en Nalfa sucesivos en la cadena principal peptídica de la cadena beta están separados por un número impar de restos de alfa-D-aminoácidos no sustituidos en Nalfa.

Description

Péptidos que contienen D-aminoácidos N-sustituidos para prevenir la asociación de cadenas beta.

La presente invención se refiere a una clase de compuestos basados en péptidos que se unen específicamente a cadenas \beta diana y así inhiben su asociación en láminas \beta y fibras \beta insolubles. En particular, la invención se refiere a péptidos compuestos de enantiómeros D de aminoácidos, algunos de los cuales al menos, están modificados por sustitución en N\alpha.

Un gran número de enfermedades neurodegenerativas actualmente incurables y tremendamente dolorosas son producidas por la agregación de proteínas o péptidos en inclusiones citotóxicas insolubles o placas de tipo amiloide en el cerebro: la enfermedad de Alzheimer (EA), que es la forma más común de demencia senil y la cuarta causa más común de muerte en el mundo desarrollado, es producida por la agregación de un fragmento del péptido A\beta de 39-43 restos de una proteína precursora de amiloide más grande (Forloni, 1996; Forloni y col., 1996; Joachim y Selkoe, 1992; Price y col., 1993; Selkoe, 1994; Verbeek y col., 1997; Wisniewski y col., 1997); la enfermedad de Parkinson (EP) y al menos una forma de demencia (demencia con cuerpos de Lewy o DCL) son producidas por la agregación e incorporación de \alpha-sinucleina en inclusiones intracitoplasmáticas llamadas cuerpos de Lewy (Arimay col., 1998; Babay col., 1998; Mezey y col., 1998; Polymeropoulos, 1998; Spillantini y col., 1998; Trojanowski y col., 1998; Trojanowski y Lee, 1998); las encefalopatías relacionadas con priones tales como la encefalopatía espongiforme bovina (EEB, o "enfermedad de las vacas locas") y sus formas humanas la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y el kuru son producidas por el mal plegamiento autocatalizado y la agregación de proteínas metaestables conocidas como priones (Forloni, 1996; Forloni y col., 1996; Horwich y Weissman, 1997; Price y col., 1993; Prusiner y Dearmond, 1995); algunas enfermedades neurodegenerativas predominantemente heredadas incluida la enfermedad de Huntington (EH), atrofia muscular bulboespinal (SBMA) ligada al cromosoma X, atrofia dentatorubral-palidoluisiana (DRPLA), y al menos cinco formas distintas de ataxia espinocerebelar (AEC de tipos 1, 2, 3, 6 y 7; AEC3 se conoce más como enfermedad de Machado-Joseph, o EMJ) son producidas por la agregación e incorporación de proteínas o fragmentos de proteínas que contienen repeticiones de glutamina anormalmente expandidas en las inclusiones intranucleares (Perutz, 1999; Ross, 1997).

Además de estas e indudablemente muchas otras, así como enfermedades neurodegenerativas todavía no identificadas, algunas enfermedades no neurodegenerativas pero igualmente dolorosas son producidas por la agregación de proteínas o péptidos en otras partes del cuerpo. Por ejemplo, la diabetes mellitus de tipo II es producida por la agregación del polipéptido amiloide de los islotes de 37 restos (IAPP o amilina en los islotes de Langerhans en el páncreas (Clark y col., 1996; Kahn y col., 1999; Obrien y col., 1993); la polineuropatía amiloide familiar y la amiloidosis sistémica senil son producidas por la agregación de transtiretina de longitud completa y fragmentos de la misma (Benson y Uemichi, 1996); y la amiloidosis relacionada con diálisis es producida por la agregación de \beta_{2}-microglobulina (Miyata y col., 1998).

En todas estas enfermedades, que se conocen colectivamente como amiloidosis, las proteínas o péptidos implicados se agregan en fibras \beta insolubles mediante la asociación intramolecular de cadenas \beta en láminas \beta extendidas; estas fibras \beta se depositan en inclusiones o placas de tipo amiloide que provocan la muerte celular progresiva por algún mecanismo desconocido. Para revisiones más generales sobre las amiloidosis y sus mecanismos, véanse las referencias (Kakizuka, 1998; Kisilevsky y Fraser, 1997; Serpell y col., 1997; Sunde y Blake, 1998; Wisniewski y col.,
1998).

Aunque queda por determinar cómo la agregación de péptidos y proteínas en inclusiones insolubles da como resultado la muerte progresiva de las células, está claro que el modo general más eficaz para tratar estas enfermedades sería prevenir la formación de estas inclusiones citotóxicas usando algún agente que inhiba específicamente la agregación de proteínas y péptidos en fibras \beta insolubles. Sin embargo, por una u otra razón, ninguno de los inhibidores existentes de la agregación de proteínas y péptidos son adecuados para usar como agentes terapéuticos:

1) Los compuestos orgánicos sencillos que actúan como desnaturalizantes de proteínas tales como el cloruro de guanidinio, urea, detergentes o muchos disolventes orgánicos son inhibidores muy eficaces de la agregación de proteínas y péptidos. Sin embargo, tienden a desestabilizar las proteínas correctamente plegadas y alteran las interacciones proteína-proteína sensibles en la célula con las concentraciones de trabajo, porque tienen una forma demasiado sencilla para inhibir la agregación de proteínas y péptidos de forma específica. Como consecuencia son tóxicos para las células y por lo tanto no son adecuados para usar como agentes terapéuticos.

2) Se ha encontrado que una serie de compuestos orgánicos más complejos inhiben la agregación de proteínas y péptidos de forma algo más específica. Incluyen \beta-ciclodextrina (Camilleriy col., 1994), rojo congo red y otros tintes sulfatados (Burgevin y col., 1994; Lorenzo y Yankner, 1994; Pollack y col., 1995), nicotina (Salomon y col., 1996), hemina y porfirinas relacionadas (Howlett y col., 1997), antraciclina 4'-yodo-4'-desoxidoxorrubicina (Merlini y col., 1995), bromuro de hexadecil-N-metilpiperidinio (Wood y col., 1996), melatonina (Pappolla y col., 1998), y rifampicina (Tomiyama y col., 1994). No se ha encontrado que ninguno de estos compuestos sea adecuado para usar como agentes terapéuticos, sin embargo, se consideran aciertos estructurales en la búsqueda de compuestos más activos y farmacológicamente útiles. Para una revisión sobre estos compuestos como inhibidores de la agregación de péptidos A\beta, véase la referencia (Bandiera y col., 1997).

3) Las proteínas grandes tales como las chaperoninas o proteínas de choque térmico (Kudva y col., 1997), \alpha2-macroglobulina (Hughes y col., 1998), laminina (Bronfman y col., 1996), y anticuerpos monoclonales (Hanan and Solomon, 1996; Solomon y col., 1996) pueden ser extremadamente eficaces y específicas como inhibidores de la agregación de proteínas y péptidos debido a su tamaño y complejidad. Sin embargo, son demasiado grandes para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, son susceptibles de agregación y proteolisis y tienden a ser inmunógenas.

4) Los péptidos sencillos también pueden inhibir la agregación de proteínas y péptidos de forma eficaz y específica, y al menos son suficientemente pequeños para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, lo cual también hace que sea menos probable que sean inmunógenos que las proteínas grandes. Sin embargo, actualmente hay un conflicto entre la solubilidad, hidrofobicidad y potencia de estos péptidos, así como un problema de degradación proteolítica.

En la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, el péptido A\beta de 39-43 restos forma agregados de fibrillas amiloides mediante asociación intramolecular de segmentos de péptidos de 5 restos que comprenden la secuencia KLVFF (ID SEC Nº 1) (correspondiente a los restos 16-20 del péptido A\beta) (Tjernberg y col., 1997; Tjernberg y col., 1996). Los segmentos de péptidos forman cadenas \beta que se asocian para formar una lámina \beta antiparalela extendida mediante interacciones hidrófobas entre sus cadenas laterales y enlaces de hidrógeno entre los grupos amida de la cadena principal. Esta asociación fibrogénica se puede inhibir mediante péptidos cortos que también contienen la secuencia KLVFF (ID SEC Nº 1) o una secuencia homóloga, tal como Ac-QKLVFF-NH_{2} (Tjernberg y col., 1996), GQKLVFFAEDVGG-[NH(CH_{2})_{5}CO]-K_{6} (Ghanta y col., 1996), y KKLVFFA (Tjernberg y col., 1997).Estos péptidos forman cadenas \beta que compiten por la asociación con la secuencia homóloga en el péptido A\beta y de esta forma dificultan su agregación. El primero de estos péptidos tiene una solubilidad limitada en soluciones acuosas, debido a lo cual puede formar agregados en láminas \beta extendidas. Por otra parte, los dos últimos péptidos, son más solubles en agua porque contienen más grupos polares, pero, por consiguiente, son demasiado hidrófilos para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica. Los péptidos se pueden hacer más solubles sin comprometer su hidrofobicidad incluyendo restos de prolina en lugar de restos polares. Por ejemplo, los péptidos RDLPFF-PVPID, LPFFPVD y LPFFD tienen un grado de hidrofobicidad similar al péptido A\beta, pero son muy solubles en soluciones acuosas porque sus restos de prolina impiden estéricamente que formen cadenas \beta que se agregan en láminas \beta extendidas (Soto y col., 1996; Soto y col., 1998). Sin embargo, estos péptidos son inhibidores menos potentes de la agregación del péptido A\beta porque realmente es necesaria la conformación de cadena \beta para producir interacciones fuertes y específicas con las cadenas \beta formadas por el péptido A\beta, con el fin de inhibir su agregación. En resumen, nadie ha descubierto como evitar que los péptidos formen agregados en tampones acuosos sin comprometer su hidrofobicidad, que es necesaria para la penetración eficaz de las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, o su potencia como inhibidores de agregación de proteínas y péptidos.

Además de este problema de solubilidad frente a hidrofobicidad y potencia, todos los péptidos mencionados antes son extremadamente susceptibles a la degradación por enzimas proteolíticas porque consisten enteramente en restos \alpha-L-aminoácidos no sustituidos en N\alpha, y por lo tanto no son adecuados para usar como agentes terapéuticos. Este problema particular se ha abordado diseñando péptidos que consisten solo en restos \alpha-D-aminoácidos, que no son reconocidos por enzimas proteolíticas (Miller y col., 1995). Por ejemplo, todo-D-[RDLPFFPVPID] (Soto y col., 1996) y todo-D-[LFLRR] (Tjernberg y col., 1997) son muy resistentes a la proteolisis catalizada por enzimas como se esperaba, pero estos péptidos todavía tienen el problema de conflicto entre la solubilidad en tampones acuosos, la capacidad para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, y la capacidad para inhibir la agregación de otras proteínas y péptidos en fibras \beta insolubles.

El documento WO 96/28471 contiene dos compuestos que pueden modular la agregación de proteínas y péptidos amiloidogénicos mediante la unión de grupos moduladores al extremo N o C del péptido \beta-amiloide y/o mediante la unión de grupos modificadores a las cadenas laterales de los aminoácidos en los péptidos \beta-amiloides.

Se sabe que los péptidos que contienen restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha son mucho menos susceptibles de proteolisis catalizada por enzimas que los péptidos que consisten sólo en restos \alpha-L-aminoácidos no sustituidos en N\alpha, porque ni los restos D-aminoácidos ni los sustituidos en N\alpha son reconocidos por las enzimas proteolíticas (Miller y col., 1995). Los péptidos que contienen restos aminoácidos sustituidos en N\alpha también es mucho menos probable que formen agregados de fibras \beta insolubles en soluciones acuosas porque los átomos N\alpha de estos restos no están disponibles para la formación de enlaces de hidrógeno, y además porque sus sustituyentes en N\alpha no permiten estéricamente la asociación de cadenas \beta. Se ha diseñado un péptido que contiene restos N\alpha-metil-aminoácidos que se pliegan en una lámina \beta de tres cadenas, pero que no forman agregados en láminas \beta extendidas porque los grupos N\alpha-metilo de estos restos impiden estéricamente que se formen (Doig, 1997). En este péptido, cada una de las dos cadenas \beta periféricas contiene una secuencia de dos restos N\alpha-metil-alanina separados por un solo resto alanina no sustituida en N\alpha, de modo que los 4 grupos N\alpha-metilo quedan a lo largo de los bordes exteriores de estas dos cadenas \beta, mientras que los bordes interiores permanecen sin asociarse con la cadena \beta central, formando así la lámina \beta de tres cadenas. Sin embargo, no se ha descrito previamente que dicho péptido, al aislarlo pueda asociarse con cadenas \beta formadas por otras proteínas o moléculas de péptidos e inhibir de este modo su agregación en láminas \beta extendidas y fibras \beta insolubles. Además, no se ha descrito previamente que un péptido que comprende restos de \alpha-D-aminoácidos no sustituidos en N\alpha pueda asociarse específicamente con cadenas \beta formadas por otras proteínas o moléculas de péptido e inhibir de esta forma su agregación en láminas \beta extendidas y en fibras \beta insolubles.

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto o composición química que comprende un péptido, en el que

(a) dicho péptido comprende una sección de péptido que forma cadena \beta que comprende una secuencia de al menos cuatro restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos, los cuales permiten todos estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta;

(b) cada uno de los restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos en la sección de péptido que forma cadena \beta tiene una cadena lateral;

(c) dicha sección de péptido que forma cadena \beta forma una cadena \beta que tiene una cadena principal peptídica que tiene la forma de una cinta extendida que tiene dos bordes, un primer borde y un segundo borde, de modo que los componentes NH y CO de los grupos peptídicos de la cadena principal quedan a lo largo de los dos bordes de la cinta, y en el que el primer borde se asocia con una cadena \beta diana formada por una molécula que contiene péptido separada y las cadenas laterales de los restos de \alpha-D-aminoácidos consecutivos pueden formar interacciones no covalentes favorables con las cadenas laterales vecinas de la cadena \beta diana formada por la molécula que contiene péptido separada;

(d) al menos uno de los restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos en la cadena principal peptídica de la cadena \beta está sustituido en N\alpha, de modo que el o los sustituyentes en N\alpha quedan sólo a lo largo de dicho segundo borde e impiden estéricamente la asociación del segundo borde con otra cadena \beta; y

(e) cualesquiera dos restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha sucesivos en la cadena principal peptídica de la cadena \beta están separados por un número impar de restos \alpha-D-aminoácidos no sustituidos en N\alpha consecutivos.

Una cadena \beta es una sección de péptido cuya cadena principal toma la forma de una cinta extendida; las cadenas laterales de los restos consecutivos en una cadena \beta sobresalen en lados alternos del plano de la cinta, mientras que los componentes NH y CO de los grupos peptídicos de la cadena principal quedan a lo largo de los bordes de la cinta. Las cadenas \beta son estructuras regulares que sólo se forman en secciones del péptido que consisten solamente en restos \alpha-L-aminoácidos o solamente en restos de \alpha-D-aminoácidos; los ángulos fi y psi de cada resto aminoácido en una cadena \beta son próximos a -120º y +120º respectivamente. Las cadenas \beta no son estables cuando se aislan, y sólo existen cuando dos o más de ellas se asocian para formar una lámina \beta paralela o antiparalela. Las cadenas \beta individuales en una lámina \beta se mantienen juntas una al lado de la otra y borde con borde en orientación paralela o antiparalela mediante enlaces de hidrógeno entre los componentes NH y CO de sus grupos peptídicos de la cadena principal, así como por interacciones adicionales no covalentes entre sus cadenas laterales. Una cadena \beta tiene dos bordes, cada uno de los cuales puede soportar la asociación de otra cadena \beta de esta forma. Por lo tanto una lámina \beta puede extenderse indefinidamente por la adición progresiva de más cadenas \beta a los bordes libres de sus dos cadenas \beta periféricas; dando esto como resultado finalmente la formación de fibras \beta insolubles.

El mecanismo por el cual las cadenas \beta formadas por proteínas y péptidos se agregan en láminas \beta y de esta forma en fibras \beta insolubles se ilustra de forma esquemática en la figura 1. Los péptidos de acuerdo con la invención inhiben la agregación de proteínas y péptidos en fibras \beta insolubles mediante la unión específica a los bordes libres de las cadenas \beta, impidiendo así estéricamente su asociación en láminas \beta extendidas. Puede estar implicado el péptido entero en la formación de una cadena \beta o sólo una sección del mismo, como se describe a continuación. Cuando sólo está implicada una sección del péptido en la formación de la cadena \beta, se puede denominar la "sección que forma cadena \beta".

Una "sección", como se denomina en este documento, es cualquier parte de una entidad tal como un péptido. Así, cuando se aplica a péptidos, "sección" se refiere a una secuencia de restos aminoácidos contiguos dentro de o en un extremo del péptido. La longitud de una "sección" de péptido dependerá de la aplicación deseada en la que se va a poner la sección; por ejemplo, una sección de péptido que forma cadena \beta puede tener al menos cuatro aminoácidos de longitud, preferiblemente más larga, como se expone a continuación. La sección puede abarcar el péptido entero, o cualquier parte del mismo. Por ejemplo, puede abarcar 10%, 25%, 50%, 75%, 90% o 100% del péptido.

"Sucesivo" tal como se usa en este documento, se refiere a cualesquiera dos restos aminoácidos definidos que van seguidos uno de otro en una secuencia, estén o no contiguos en la secuencia. Así, dos restos aminoácidos sustituidos en N\alpha pueden estar separados, si están separados por uno o más restos aminoácidos sustituidos en N\alpha.

"Consecutivo", tal como se usa en este documento, se refiere a cualesquiera dos restos aminoácidos definidos que van seguidos uno de otro en una secuencia contigua. Así, dos restos aminoácidos sustituidos en N\alpha consecutivos son adyacentes en una secuencia de aminoácidos.

De acuerdo con la presente invención, el compuesto o composición química está separado de la diana. Por lo tanto la diana es una molécula discreta, la cual es un péptido o comprende un péptido. La molécula diana puede ser, por lo tanto, un péptido, una proteína que comprende un péptido en lámina \beta o una sección del péptido, un derivado de una proteína o cualquier otra molécula que pueda formar al menos una cadena \beta.

La invención se refiere además a compuestos y composiciones químicas que comprenden componentes que mimetizan la estructura y acción de una cadena \beta y por lo tanto son miméticos de péptidos. Un "mimético de péptido" se refiere a un péptido en el que uno o más grupos peptídicos de la cadena principal o grupos de las cadenas laterales se han sustituido por otro grupo químico de similar estereoquímica y capacidad para formar interacciones no covalentes favorables con la cadena \beta diana. Por ejemplo, cada grupo peptídico de la cadena principal (CONH) se podría sustituir por uno de los siguientes grupos: CSNH (tioamida); COO (éster); CSO, COS, CSS (tioéster); COCH_{2} (cetona); CSCH_{2} (tiocetona); SO_{2}NH (sulfonamida); SOCH_{2} (sulfóxido); SO_{2}CH_{2} (sulfona); SO_{2}O (sulfonato). Cada grupo peptídico de la cadena principal sustituido en el N se podría sustituir por una forma sustituida en el N o en el C de los siguientes grupos: CSNH (tioamida); COCH_{2} (cetona); CSCH_{2} (tiocetona); SO_{2}NH (sulfonamida); SOCH_{2} (sulfóxido); SO_{2}CH_{2} (sulfona). Y cada cadena lateral se podría sustituir por otro grupo que tenga una estereoquímica o disposición de átomos polares y no polares similar, siempre que se conserven cualesquiera características particulares que sean esenciales para la asociación con la cadena \beta diana.

El uso de \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha es muy ventajoso. Todos los \alpha-D-aminoácidos son resistentes al ataque de proteasas y los \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha también son adecuados para impedir estéricamente la formación de láminas \beta. La resistencia al ataque de proteasas es una propiedad preferida en el contexto de la presente invención.

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para inhibir o invertir la asociación de una cadena \beta diana en una lámina \beta o fibra \beta, que comprende exponer la cadena \beta diana a un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención y permitir o inducir que el compuesto o composición química se asocie con la cadena \beta diana.

Opcionalmente, en el procedimiento de acuerdo con el aspecto precedente de la invención, se pueden usar otros agentes capaces de desestabilizar la formación de lámina \beta junto con los péptidos de la invención. Por ejemplo, el uso in vitro de un péptido de acuerdo con la invención y un agente caotrópico, tal como clorhidrato de guanidinio, es eficaz para prevenir la agregación de cadenas \beta para formar láminas \beta en solución.

En un tercer aspecto, se proporciona un procedimiento para inhibir o invertir la agregación de proteínas o péptidos, que comprende poner en contacto las proteínas o péptidos con un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para ayudar al replegado de proteínas o péptidos desnaturalizados o agregados, que comprende poner en contacto las proteínas o péptidos agregados con un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, se proporciona un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención para usar en medicina.

En un sexto aspecto, se proporciona el uso de un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención para preparar una composición para el diagnóstico, estudio o tratamiento de una enfermedad producida por la agregación de proteínas o péptidos en fibras \beta insolubles.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para inhibir la oligomerización o asociación de subunidades de proteínas, que comprende exponer las subunidades de proteínas a un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

El procedimiento del séptimo aspecto se puede aplicar, por ejemplo, para inhibir una enzima cuya actividad catalítica depende de su oligomerización por asociación de cadenas \beta, sea in vitro o in vivo.

En un octavo aspecto, se proporciona un procedimiento para indicar la presencia o localización de cadenas \beta, láminas \beta o fibras \beta, que comprende exponer una muestra de ensayo a un compuesto o composición química, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, que comprende un resto detectable, separar cualquier compuesto o composición química no unido, y evaluar en la muestra de ensayo la presencia del resto detectable.

La muestra de ensayo puede ser una muestra histológica y el compuesto o composición química se puede usar como un tinte o indicador histoquímico.

En un noveno aspecto, la invención se refiere a un procedimiento por cromatografía de afinidad o renaturalización de proteínas, que comprende las etapas de unir de forma covalente un compuesto o composición química de acuerdo con el primer aspecto de la invención a una matriz, resina o soporte sólido; pasar una muestra de ensayo por la columna; y separar el producto tratado deseado de la columna.

En un décimo aspecto, la invención proporciona una biblioteca combinatoria que comprende compuestos o composiciones químicas de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra de manera esquemática como se asocian las cadenas \beta en láminas \beta extendidas y de ese modo en fibras \beta. En esta figura las cadenas \beta se representan por piezas de puzzle blancas que tienen tanto un una lengüeta circular como un agujero circular del mismo tamaño en cada uno de los dos lados largos, que representan los componentes CO y NH de los grupos amida de la cadena principal a lo largo de los bordes de las cadenas \beta. Las cadenas \beta se pueden asociar con orientación paralela o antiparalela en láminas \beta extendidas y fibras \beta insolubles, mediante la formación de enlaces de hidrógeno entre estos componentes CO y NH; en la figura 1 esta interacción se representa mediante la inserción mutua de las lengüetas circulares en los agujeros circulares de las piezas de puzzle asociadas, lo cual puede conducir a la producción de cadenas extendidas de piezas de puzzle que representan las láminas \beta extendidas y fibras \beta insolubles.

La figura 2 ilustra de manera esquemática como las cadenas \beta formadas por las secciones de péptido que forman cadena \beta en los péptidos de la invención, pueden inhibir la agregación de las cadenas \beta diana formadas por otras proteínas y moléculas peptídicas, en cadenas \beta extendidas y fibras \beta insolubles. En esta figura, las cadenas \beta diana se representan por piezas de puzzle blancas que tienen tanto una lengüeta circular como un agujero circular del mismo tamaño en cada uno de los dos lados largos, igual que en la figura 1, mientras que las cadenas \beta formadas por secciones de péptido que forman cadena \beta se representan por piezas de puzzle sombreadas. Un lado de estas piezas de puzzle sombreadas tiene tanto una lengüeta circular como un agujero circular, que representan los componentes CO y NH de los grupos amida de la cadena principal que quedan a lo largo del borde libre de la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta. Este lado de las piezas de puzzle sombreadas es idéntico a los dos lados de las piezas de puzzle blancas y por lo tanto se pueden juntar con las piezas de puzzle blancas con orientación paralela o antiparalela al igual que las piezas de puzzle blancas se pueden unir entre sí. Sin embargo, el otro lado de las piezas de puzzle sombreadas tiene dos lengüetas circulares pero no tienen agujero circular, lo cual representa primero el hecho de que algunos o todos los grupos NH de la cadena principal a lo largo de un borde de la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta, están estéricamente bloqueados por los sustituyente en N\alpha que quedan a lo largo de esta. Por consiguiente, este lado de las piezas de puzzle sombreadas no se puede unir a ninguna otra pieza de puzzle, sea blanca o sombreada. Por lo tanto, cuando el lado con una sola lengüeta de una pieza de puzzle sombreada se une con orientación paralela o antiparalela a un lado con una sola lengüeta de una pieza de puzzle blanca, que puede formar parte o no de una cadena más larga de dichas piezas, posteriormente no se puede unir ninguna otra pieza de puzzle a este lado de la pieza de puzzle blanca, y por lo tanto se bloquea como se muestra el alargamiento de una cadena en esa dirección, salvo que se quite primero la pieza de puzzle sombreada terminal. De la misma forma, las cadenas \beta formadas por la sección de péptido que forma cadena \beta se unen a las cadenas \beta diana formadas por otras proteínas o moléculas peptídicas y así inhiben su agregación en láminas \beta extendidas y fibras \beta insolubles. Así, este modelo de puzzle ilustra claramente el concepto fundamental de la presente invención.

Las figuras 3 y 4 muestran como un péptido X (ID SEC Nº 2) forma una cadena \beta (X) y así se asocia con un borde de una cadena \beta diana (Y) formada por un segmento del péptido A\beta o alguna otra molécula basada en péptido en cualquiera de las dos orientaciones para formar un complejo de lámina \beta de dos cadenas paralelas (Fig. 3) o antiparalelas (Fig. 4), impidiendo así estéricamente la asociación de otras cadenas \beta con ese borde de la cadena \beta diana. En cada una de estas dos figuras: la cadena \beta diana comprende una secuencia de ocho restos \alpha-L-aminoácidos consecutivos, cuyos átomos C\alpha no se han marcado; los átomos C\alpha de los seis restos \alpha-D-aminoácidos del péptido X (ID SEC Nº 2) están numerados desde el extremo N, mientras que el átomo C\alpha de su grupo acetilo N-terminal está indicado con una letra A; solo se muestran los átomos de la cadena principal que no son hidrógeno de estas dos cadenas \beta, incluidos los átomos de carbono N\alpha-metilo de los dos restos N\alpha-metil-\alpha-D-aminoácido (restos 2 y 4) del péptido X (ID SEC Nº 2), y se representan mediante símbolos definidos por las claves de átomos debajo de las figuras; los enlaces de hidrógeno entre los grupos amida de la cadena principal de las

\hbox{dos cadenas  \beta  se indican
por líneas de trazos.}

La figura 5 es una gráfica que muestra que se previene la agregación del péptido A\beta de Alzheimer en estructuras de lámina \beta después de la administración del péptido X (ID SEC Nº 2). Se observa una reducción de 50% de la agregación del péptido A\beta de Alzheimer con una concentración de péptido X (ID SEC Nº 2) 100 mM.

La figura 6 es una micrografía electrónica que muestra los péptidos A\beta de Alzheimer agregados. El péptido A\beta de Alzheimer se incubó con una concentración 500 mM y el agregado se examinó por microscopía electrónica.

La figura 7 es una micrografía electrónica que muestra los péptidos A\beta de Alzheimer con una concentración 500 mM en presencia del péptido X (ID SEC Nº 2); el examen por microscopio electrónico muestra una eliminación sustancial de la agregación.

Descripción detallada de la invención

Los péptidos de acuerdo con la invención inhiben la agregación de proteínas y péptidos en fibras \beta insolubles, mediante la unión específica a los bordes libres de las cadenas \beta, impidiendo así estéricamente su asociación en láminas \beta extendidas. Lo hacen sustancialmente como sigue.

El péptido de acuerdo con la presente invención comprende una sección que puede formar una cadena \beta, porque consiste solamente en restos \alpha-D-aminoácidos que lo permiten estéricamente. Además de esto, las restricciones estéricas impuestas por el resto o restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y cualquier resto \alpha-D-aminoácidos ramificado en \beta en la sección de péptido que forma cadena \beta, puede servir para fomentar la formación de cadena \beta. Cuando la sección de péptido que forma cadena \beta forma una cadena \beta, los sustituyentes de N\alpha de sus restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha se colocan, por diseño, de modo que queden a lo largo de sólo uno de sus dos bordes. Los restos sustituidos en N\alpha están espaciados de modo que están separados por números impares de restos, puesto que la unidad que se repite de una cadena \beta son dos restos. Por ejemplo, entre cualesquiera dos restos sustituidos en N\alpha sucesivos puede haber 1 ó 3 restos no sustituidos en N\alpha.

El borde sustituido en N\alpha de la cadena \beta no puede asociarse con otras cadenas \beta formadas por la sección de péptido que forma cadena \beta porque los sustituyentes en N\alpha que quedan a lo largo de la misma impiden estéricamente que lo hagan. El otro borde libre de esta cadena \beta si puede hacerlo, y puede asociarse con orientación paralela o antiparalela con un borde libre de una cadena \beta diana formada por otra proteína o molécula peptídica mediante enlaces de hidrógeno entre sus grupos peptídicos de la cadena principal e interacciones no covalentes adicionales entre sus cadenas laterales. Esta cadena \beta diana lo más probable es que sea una de las dos cadenas \beta periféricas de una lámina \beta existente, pero también puede ser una cadena \beta sola aislada que se forma solo cuando se asocia con la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta. De cualquier forma, el resultado de esta asociación es la formación de un complejo de lámina \beta en el que la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta bloquea estéricamente la asociación de otras cadenas \beta con el borde ahora asociado de la cadena \beta diana, previniendo así la formación de una lámina \beta extendida y la deposición de fibras \beta insolubles. Por ejemplo, si la cadena \beta diana es una de las dos cadenas \beta periféricas de una lámina \beta existente, entonces la asociación de la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta con el borde libre de esta cadena \beta diana bloquea estéricamente la asociación de otras cadenas \beta con este borde de la cadena \beta diana, impidiendo de esta forma la extensión de la lámina \beta en esa dirección. La extensión de la lámina \beta en la otra dirección se puede prevenir de la misma forma por asociación de la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta con el borde libre de la otra cadena \beta periférica de la lámina \beta. Se puede prevenir que las cadenas \beta diana aisladas se asocien entre sí mediante la asociación simultánea de ambos bordes con dos cadenas \beta formadas por la sección de péptido que forma cadena \beta. En este caso, las láminas \beta de tres cadenas resultantes no pueden extenderse en ninguna dirección debido al impedimento estérico de los sustituyentes en N\alpha que quedan a lo largo de los bordes exteriores de ambas cadenas \beta periféricas.

Tal como se usa en este documento, un "péptido" es un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y están unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. La longitud de una sección de péptido que forma cadena \beta de acuerdo con la invención se determinará empíricamente, como se describe a continuación con más detalle; sin embargo, la sección de péptido que forma cadena \beta tiene al menos 4 restos aminoácidos de longitud, y preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 50 aminoácidos de longitud; ventajosamente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 16 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 aminoácidos. Preferiblemente, la sección de péptido que forma cadena \beta no es más larga que la cadena \beta diana, y al menos es tan larga como la sección de la cadena \beta diana que produce agregación.

Los monómeros aminoácidos con los cuales se construye el péptido son \alpha-D-aminoácidos, que significa que son de la forma enantiómera D en vez de la forma enantiómera L. Los aminoácidos L, que se encuentran normalmente en la naturaleza, son susceptibles de digestión por enzimas proteasas si no están protegidos. Los \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha son \alpha-D-aminoácidos que llevan un sustituyente, que no es hidrógeno, en el átomo \alpha-N, mientras que los \alpha-D-aminoácidos no sustituidos en N\alpha no tienen un sustituyente en esta posición. A continuación se exponen los sustituyentes preferidos útiles para practicar la presente invención. Sin embargo, en general, los sustituyentes deben ser suficientemente grandes para impedir estéricamente la asociación de cadenas \beta, y preferiblemente suficientemente grandes para impedir o prevenir la degradación proteolítica del péptido, pero no deben impedir estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta.

Tal como se usa en este documento, "que desestabiliza" cuando se aplica a láminas \beta y a la formación de láminas \beta, se refiere a la inhibición de la agregación de cadenas \beta en estructuras de lámina \beta y preferiblemente y a prevenir la agregación de láminas \beta. Ventajosamente, se refiere a la inversión de la agregación de cadenas \beta y a la propia alteración de las estructuras de láminas \beta. La inversión puede ser completa o parcial; en general, la inversión indica que las estructuras de lámina \beta revierten a cadenas \beta no asociadas, o se dividen en láminas \beta más pequeñas. "Impedir", "inhibir" y "prevenir", como se han usado antes'', se refiere a la reducción de la agregación de las cadenas \beta que va de parcial a sustancialmente completa. Por ejemplo, la agregación de cadenas \beta se puede reducir en 20%, 30%, 50%, 75% o más, preferiblemente aproximadamente 90% o 100%.

Las cadenas laterales usadas en las secciones de péptido que forman cadena \beta de acuerdo con la invención además permiten o favorecen la formación de cadenas \beta. "Permite" tal como se usa en este documento, significa que la formación de cadenas \beta no está impedida. "Favorece" significa que se facilita dicha formación con respecto a cualquier aminoácido seleccionados que simplemente permita la formación de cadena \beta.

El concepto de favorecer o permitir la formación de cadena \beta se puede expresar en términos de valores de propensión a lámina \beta de los restos aminoácidos. La propensión a lámina \beta es una medida de la frecuencia de aminoácidos particulares en láminas \beta formadas por proteínas naturales; se ha encontrado que el valor de propensión se correlaciona muy bien con las consideraciones termodinámicas que gobiernan la formación de láminas \beta por los restos aminoácidos. Véase, por ejemplo, Williams y col., (1987); Wilmot y Thornton, (1988); Kim y Berg, (1993); Smith y col., (1994); Minor y Kim, (1994a); Regan, (1994); y Bai and Englander, (1994). Ventajosamente, los restos incorporados en la sección de péptido que forma cadena \beta tienen una propensión a lámina \beta de al menos aproximadamente 1,00.

Diseño de péptidos de acuerdo con la invención

Con el fin de que la sección de péptido que forma cadena \beta pueda formar una cadena \beta, debe consistir solamente en restos \alpha-D-aminoácidos que permitan estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta. Por ejemplo, no se puede incluir prolina en la sección de péptido que forma cadena \beta excepto en los extremos, porque su cadena lateral está unida al átomo de nitrógeno de la cadena principal, y por lo tanto no puede adoptar el ángulo fi necesario para formar una cadena \beta.

Con el fin de que la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta se asocie con suficiente fuerza con una cadena \beta diana para inhibir su agregación en fibras \beta insolubles, debe tener al menos cuatro restos aminoácidos de longitud. Una cadena \beta que consistiera en tres o menos restos aminoácidos no interaccionaría con una cadena \beta diana con suficiente fuerza para impedir la asociación de otras cadenas \beta con esta cadena \beta diana. En general, la sección de péptido que forma cadena \beta puede ser de cualquier longitud mayor que tres restos (es decir, cuatro o más), pero en la práctica no debería ser mayor que la cadena \beta diana, y preferiblemente debe ser tan larga como el segmento de la cadena \beta diana que es directamente responsable de su agregación.

Esto se debe a que el segmento que produce la agregación de la cadena \beta diana es probable que comprenda una secuencia de restos que tienen cadenas laterales hidrófobas o que contienen amida, que pueden formar las interacciones más fuertes con las cadenas laterales adyacentes de una cadena \beta asociada en solución acuosa. Es este segmento de la cadena \beta diana que produce la agregación con el que se diseña preferiblemente la sección de péptido que forma cadena \beta para la asociación. Aunque la sección de péptido que forma cadena \beta de acuerdo con la invención puede ser más corta, de la misma longitud o más larga que el segmento de la cadena \beta diana que produce la agregación, no es necesario que la sección de péptido que forma cadena \beta se más larga que la propia cadena \beta diana, porque cualesquiera restos adicionales en la sección de péptido que forma cadena \beta es poco probable que interaccionen fuertemente con restos que flanquean la cadena \beta diana, si dichos restos no están en una estructura de cadena \beta.

La cadena \beta diana, el segmento de la cadena \beta diana que produce la agregación y por lo tanto la longitud óptima de la sección de un péptido que forma cadena \beta de acuerdo con la invención, se pueden determinar empíricamente. Por ejemplo, la cadena \beta diana se puede identificar como una sección de péptido en una proteína o molécula peptídica que forma una cadena \beta y forma agregados o se asocia de forma indeseable así con otras cadenas \beta para formar una lámina \beta o fibra \beta. El segmento que produce agregación de esta cadena \beta diana se puede identificar entonces como una sección de al menos cuatro restos que la mayoría tienen cadenas laterales hidrófobas y/o con grupos amida, o se puede determinar experimentalmente investigando las propiedades de asociación de segmentos cortos de la cadena \beta diana o de mutantes de restos aislados de la cadena \beta diana. Por ejemplo, una sección de péptido A\beta de Alzheimer de 39-43 restos forma una cadena \beta y forma agregados indeseables en forma de fibras \beta insolubles. Por lo tanto, esta cadena \beta se identifica como la cadena \beta diana, y se ha identificado que el segmento que produce la agregación tiene la secuencia KLVFF (ID SEC Nº 1) investigando las propiedades de asociación de segmentos cortos del péptido A\beta y mutantes de un solo resto del mismo: el truncado de este segmento en cualquiera de los dos extremos o la sustitución de cualquiera de sus restos por alanina reduce notablemente la tendencia del péptido A\beta a formar agregados de fibras \beta insolubles (Tjernberg y col., 1997; Tjernberg y col., 1996).

Los expertos en la técnica observarán que se pueden usar procedimientos similares para identificar las cadenas \beta diana en proteínas distintas de A\beta, o para identificar cadenas \beta diana alternativas en A\beta, usando procedimientos similares (u otros), como se conoce en la técnica y/o se describe en este documento. La sección de péptido que forma cadena \beta de acuerdo con la invención preferiblemente se diseña para formar una cadena \beta y que se asocie así en la orientación paralela con este segmento que produce agregación de la cadena \beta diana, para formar un complejo de lámina \beta paralela. Preferiblemente se diseña como sigue.

La sección de péptido que forma cadena \beta preferiblemente contiene el mismo número de restos que el segmento que produce agregación de la cadena \beta diana, y ventajosamente comprende una secuencia de restos N\alpha-metil-\alpha-D-aminoácidos y \alpha-D-aminoácidos no sustituidos en N\alpha. Estas cadenas laterales de los restos en la sección de péptido que forma cadena \beta son complementarios a los del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana en el mismo orden, mediante lo cual se entiende que la cadena lateral del primer resto de la sección de péptido que forma cadena \beta se elige para que forme una interacción no covalente favorable con la cadena lateral del primer resto del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana, etc. Por ejemplo: si el primer resto del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana tiene una cadena lateral que contiene amida, entonces el primer resto de la sección de péptido que forma cadena \beta debe tener también una cadena lateral que contenga amida; si el primer resto del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana tiene una cadena lateral hidrófoba, entonces el primer resto de la sección de péptido que forma cadena \beta debe tener también una cadena lateral hidrófoba; si el primer resto del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana, tiene una cadena lateral que contiene hidroxilo, entonces el primer resto de la sección de péptido que forma cadena \beta también debe tener una cadena lateral que contenga hidroxilo; si el primer resto del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana tiene una cadena lateral básica, entonces el primer resto de la sección de péptido que forma cadena \beta debe tener una cadena lateral ácida; y si el primer resto del segmento que produce agregación de la cadena \beta diana tiene una cadena lateral ácida, entonces el primer resto de la sección de péptido que forma cadena \beta debe tener una cadena lateral básica. Este procedimiento de selección se continua para todas las demás cadenas laterales en la sección de péptido que forma
cadena \beta.

En general, también se puede tomar una secuencia adecuada de cadenas laterales en la sección de péptido que forma cadena \beta de la sección de la cadena \beta que se asocia de forma indeseable con la sección que produce agregación de la cadena \beta diana. Por ejemplo, el péptido A\beta de Alzheimer forma agregados de fibras \beta insolubles mediante la asociación intermolecular de segmentos de péptido que producen agregación KLVFF (ID SEC Nº 1) idénticos, como cadenas \beta en la orientación antiparalela, y en el complejo de lámina \beta antiparalela resultante, las cuatro cadenas laterales hidrófobas de cada cadena \beta forman interacciones hidrófobas con los de la cadena \beta asociada, mientras que la cadena lateral básica de lisina de cada cadena \beta se supone que forma una interacción electrostática con una de las dos cadenas laterales ácidas que siguen a la secuencia KLVFF (ID SEC Nº 1) en la cadena \beta asociada (Tjernberg y col., 1997). Puesto que la sección de péptido que forma cadena \beta se diseña para que se asocia con una cadena \beta con la secuencia KLVFF (ID SEC Nº 1) con la orientación paralela, la secuencia de sus cadenas laterales se diseña preferiblemente para que sea homóloga o idéntica a la secuencia KLVFF (ID SEC Nº 1) en orden inverso, es decir FFVLK (ID SEC Nº 3). Se pueden diseñar otros compuestos o composiciones correspondientes a la presente invención para que se asocien específicamente con otras cadenas \beta diana mediante un procedimiento similar.

En la técnica se ha descrito el diseño nuevo de polipéptidos en lámina \beta. Por ejemplo, se hace referencia a Smith y Regan, (1995); Smith y Regan, (1997); De Alba y col., (1999); y Kortemmey col., (1998). Se pueden usar estos y otros procedimientos para diseñar un polipéptido adecuado. Por ejemplo, una secuencia adecuada de cadenas laterales en la sección de péptido que forma cadena \beta se puede determinar construyendo un modelo molecular de un complejo de lámina \beta paralela o antiparalela en el que la cadena \beta diana está asociada con una segunda cadena \beta, y después adaptando la identidad y conformación de estas cadenas laterales de la segunda cadena \beta para producir interacciones no covalentes favorables con las cadenas laterales de la cadena \beta diana. Esto se puede hacer usando un ordenador y el software adecuado como sigue:

Primero se construye un modelo molecular de la cadena \beta diana. Esto se puede hacer obteniendo las coordenadas de una cadena \beta en una proteína de estructura molecular conocida, y después cambiando la secuencia de sus cadenas laterales a la de la cadena \beta diana. Después, se construye un modelo molecular de una segunda cadena \beta por un procedimiento similar, se transforma en su imagen especular y después se coloca al lado de cualquiera de los dos bordes de la cadena \beta diana en la orientación paralela o antiparalela para formar un complejo de lámina \beta paralela o antiparalela de dos cadenas. Después se consideran las posibles cadenas laterales para cada uno de los restos consecutivos en la segunda cadena \beta, y se exploran sus conformaciones alternativas para determinar si es probable que formen interacciones no covalentes favorables con las cadenas laterales vecinas de la cadena \beta diana asociada en el complejo de lámina \beta. Finalmente, una vez que se ha seleccionado una secuencia adecuada de cadenas laterales, se pueden aplicar programas de minimización de energía y de dinámica molecular para investigar la validez teórica del modelo, antes de sintetizar el péptido candidato y ensayar la actividad experimentalmente.

Se puede encontrar otra guía relacionada con el diseño de péptidos que forman cadenas \beta en el material anterior relacionado con la propensión de los aminoácidos a láminas \beta, así como en las siguientes fuentes: Nelsoney y Kelly, (1996); Hutchinson y col., (1998); Pham y col., (1998); Minor y Kim, (1996); Koepf y col., (1999); y Minor y Kim, (1994b).

Selección y localización de sustituyentes de N\alpha

Con el fin de que los sustituyentes de N\alpha de los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta queden a lo largo de sólo uno de los bordes de la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta, los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha están separadas con números impares de aminoácidos no sustituidos, salvo que haya solo un resto \alpha-D-aminoácido sustituido en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta, porque la unidad que se repite de una cadena \beta es dos restos: si cualesquiera dos restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta fueran adyacentes o estuvieran separados por un número par de restos no sustituidos, entonces sus sustituyentes en N\alpha quedarían en bordes opuestos de la cadena \beta, y ninguno de los dos bordes de la cadena \beta podría asociarse con una cadena \beta diana y así impedir estéricamente la asociación de otras cadenas \beta con la cadena \beta diana.

Por lo tanto, en teoría, los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta podrían estar separados por un gran número de restos, o podría haber sólo un resto \alpha-D-aminoácido sustituido en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta. Sin embargo, en la práctica, los sucesivos restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta deben estar separados preferiblemente por no más de 3 restos no sustituidos porque las restricciones estéricas impuestas por estos restos realmente sirven para favorecer que la sección de péptido que forma cadena \beta adopte la conformación de cadena \beta (Manavalan y Momany, 1980).

Por lo tanto, en el caso más preferible, los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha sucesivos en la sección de péptido que forma cadena \beta están separados entre sí por un solo restos no sustituido, de modo que la sección de péptido que forma cadena \beta comprende una secuencia alternada de restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y no sustituidos en N\alpha. Esto induce a la sección entera de péptido a adoptar una conformación de cadena \beta activa.

Los sustituyentes de N\alpha pueden ser sustancialmente cualquier átomo o grupo que sea más grande que un átomo de hidrógeno, lo cual significa esencialmente cualquier átomo o grupo distinto de un átomo de hidrógeno. Sin embargo, además no deben evitar estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta, porque la sección de péptido que forma cadena \beta tiene que formar una cadena \beta con el fin de asociarse con una cadena \beta diana.

Por lo tanto, el sustituyente de N\alpha es opcionalmente un átomo de flúor o un grupo hidroxi, u otro grupo que está conectado con el átomo N\alpha mediante un átomo de oxígeno en él, tal como un grupo metoxi u otro grupo alcoxi.

Preferiblemente, el sustituyente de N\alpha es un grupo que está conectado al átomo N\alpha por un grupo metileno (CH_{2}) en él. Dicho grupo se puede incorporar en la sección de péptido que forma cadena \beta mediante procedimientos estándar de síntesis de péptidos en solución o en fase sólida, y el grupo metileno de conexión es estéricamente compatible con la formación de una cadena \beta. Los ejemplos adecuados de este forma preferida de sustituyente de N\alpha incluyen un grupo metilo o etilo, u otro grupo alquilo o alifático que esté conectado al átomo N\alpha por un grupo metileno (CH_{2}) en él, o un grupo bencilo sustituido o no sustituido, tal como un grupo 2-hidroxi-4-metoxibencilo (AcHmb) acetilado o acilado de otra forma, u otro grupo aril-metilo.

Un grupo metilo es la forma más preferida de sustituyente de N\alpha porque es el grupo más sencillo que se puede incorporar en la sección de péptido que forma cadena \beta por procedimientos estándar de síntesis de péptidos en solución o en fase sólida, y los correspondientes aminoácidos y sus derivados Fmoc y Boc están disponibles en el comercio.

El grupo 2-hidroxi-4-metoxibencilo (AcHmb) es otra forma preferida de sustituyente de N\alpha porque los aminoácidos correspondientes y sus derivados Fmoc y Boc también están disponibles en el comercio, pero este grupo es bastante lábil salvo que su grupo 2-hidroxilo esté acetilado o acilado de otra forma (Quibell y col., 1995; Quibell y col., 1995; Quibell y col., 1994).

El grupo 2-hidroxibencilo (AcHb) es todavía otra forma preferida de sustituyente de N\alpha, y a diferencia del grupo 2-hidroxi-4-metoxibencilo, no es necesario que esté acetilado o acilado de otra forma (Johnson y Quibell, 1994).

La propensión a formar cadena \beta de la sección de péptido que forma cadena \beta se puede aumentar más incluyendo restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha o no sustituidos en N\alpha cuyas cadenas laterales favorezcan estéricamente la conformación de cadena \beta. Estos incluyen restos \alpha-D-aminoácidos con cadenas laterales ramificadas en \beta, tales como \alpha-D-treonina, \alpha-D-valina, \alpha-D-isoleucina, \alpha-D-terc-leucina, \alpha-D-\beta-hidroxivalina y sus derivados sustituidos en N\alpha. Otros restos \alpha-D-aminoácidos que favorecen la conformación de cadena \beta, por ejemplo, los de cadenas laterales aromáticas como \alpha-D-tirosina, \alpha-D-fenilalanina y \alpha-D-triptófano, y los que tienen cadenas laterales alifáticas hidrófobas tales como \alpha-D-leucina y \alpha-D-metionina, más \alpha-D-serina y \alpha-D-glutamina, también deben incluirse en la sección de péptido que forma cadena \beta si es adecuado y cuando sea adecuado: deben ser compatibles con la química de la síntesis de péptidos en solución o en fase sólida, no deben impedir estéricamente la asociación del borde libre de la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta con la cadena \beta diana, y preferiblemente deben promover que la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta se asocie fuertemente con la cadena \beta diana.

Como se ha explicado antes, los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y no sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta preferiblemente deben promover que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta; pero también deben promover preferiblemente que esta cadena \beta se asocie tan fuerte como se posible con la cadena \beta diana. Para esto, sus cadenas laterales deben formar interacciones no covalentes fuertes con las cadenas laterales vecinas de la cadena \beta diana cuando las dos cadenas se asocian entre sí en el complejo de lámina \beta paralela o antiparalela. Las interacciones no covalentes más fuertes que pueden existir entre las cadenas laterales vecinas de las cadenas \beta asociadas en soluciones acuosas son interacciones hidrófobas entre cadenas laterales hidrófobas y enlaces de hidrógeno entre cadenas laterales que contienen amida. Es probable que el segmento de la cadena \beta diana más responsable de su agregación sea rico en restos que tienen estas cadenas laterales, y por lo tanto es con este segmento que produce agregación de la cadena \beta diana con el que la sección de péptido que forma cadena \beta puede potencialmente asociarse de forma más fuerte. Por esta razón, la mayoría de los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y no sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta preferiblemente tienen cadenas laterales hidrófobas o que contienen amida. Los restos aminoácidos preferidos con cadenas laterales hidrófobas incluyen \alpha-D-valina, \alpha-D-leucina, \alpha-D-isoleucina, \alpha-D-metionina, \alpha-D-fenilalanina, \alpha-D-tirosina, \alpha-D-triptófano, y sus derivados sustituidos en N\alpha; mientras que los restos aminoácidos preferidos con cadenas laterales que contienen amida incluyen \alpha-D-asparagina, \alpha-D-glutamina y sus derivados sustituidos en N\alpha. La cadena lateral más preferida de cada resto en la sección de péptido que forma cadena \beta depende de la cadena lateral vecina de la cadena \beta asociada en el complejo de lámina \beta, porque sus estereoquímicas deben ser compatibles con la formación de una interacción no covalente favorable entre ellos. Sin embargo, en general, la cadena lateral hidrófoba más preferida es la de la leucina porque es bastante grande pero relativamente flexible, y puede adoptar cualquiera de nueve conformaciones de rotámero diferentes, y puede adaptar fácilmente su estereoquímica para hacer la interacción hidrófoba más favorable con casi cualquier cadena lateral hidrófoba vecina de una cadena \beta diana asociada; la cadena lateral que contiene amida más preferida es la de la glutamina porque también es relativamente flexible, y es más probable que pueda formar un enlace de hidrógeno favorable con una cadena lateral vecina de glutamina o asparagina de una cadena \beta diana asociada. Sin embargo, se podría incluir cualquier cadena lateral hidrófoba o cadena lateral que tenga una parte hidrófoba considerable, en la sección de péptido que forma cadena \beta, así como cualquier cadena lateral que contenga amida, siempre que no impidan estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta, o que se asocie como una cadena \beta diana.

Aunque la mayoría de los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y no sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta deben tener cadenas laterales hidrófobas o que contengan amida, los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y no sustituidos en N\alpha restantes en la sección de péptido que forma cadena \beta pueden tener cadenas laterales que ni sean hidrófobas ni contengan amida, pero que, no obstante, formen interacciones no covalentes favorables con las cadenas laterales vecinas de una cadena \beta asociada. Por ejemplo, las cadenas laterales ácidas del aspartato y glutamato pueden formar puentes salinos con cadenas laterales básicas de histidina, arginina y lisina en una cadena \beta asociada, y a la inversa, las cadenas laterales básicas de histidina, arginina y lisina pueden formar puentes salinos con cadenas laterales ácidas de aspartato y glutamato en una cadena \beta asociada; las cadenas laterales de la serina, trenonina y \beta-hidroxivalina que contienen hidroxilo pueden formar enlaces de hidrógeno con las cadenas laterales vecinas que contienen hidroxilo de una cadena \beta asociada.

Prevención del apilamiento de láminas \beta

Con el fin de que las láminas \beta formadas por asociación de cadenas \beta no se agreguen por apilamiento, la sección de péptido que forma cadena \beta también incluye preferiblemente uno o más restos \alpha-D-aminoácidos que tienen una cadena lateral que se extiende más allá de las cadenas laterales vecinas en la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta. Dicha cadena lateral extendida preferiblemente es larga y preferiblemente tiene un extremo polar, de modo que no soporta el apilamiento de láminas \beta. Las cadenas laterales de lisina y arginina son ejemplos adecuados de dichas cadenas laterales extendidas que tienen un extremo polar.

Marcaje de péptidos

Con el fin de que los péptidos de acuerdo con la invención se puedan localizar o detectar, la sección de péptido que forma cadena \beta puede incluir un resto \alpha-D-aminoácido que tenga una cadena lateral que contenga un núcleo radiactivo o magnéticamente activo, tal como un resto \alpha-D-fenilalanina, \alpha-D-tirosina o \alpha-D-treonina con uno o más átomos de yodo u otro halógeno radiactivos o magnéticamente activos sustituidos en el(los) anillo(s) aromático(s); o la sección de péptido que forma cadena \beta puede incluir un resto \alpha-D-aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un grupo fluorescente, coloreado u otro grupo detectable por espectroscopía, incluyendo los marcadores de espín tales como los grupos 2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi (PROXYL) y 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) que contienen electrones desapareados. Un péptido que contiene dicho grupo detectable por espectroscopía o un núcleo radiactivo o magnéticamente activo se puede usar como una sonda localizable que indica la presencia y situación de las cadenas \beta diana o fibras \beta insolubles, in vitro o in vivo.

Penetración de membrana

Con el fin de que el compuesto o composición pueda penetrar más fácilmente las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, la sección de péptido que forma cadena \beta preferiblemente contiene una proporción alta de restos aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas o básicas. Las cadenas laterales hidrófobas interaccionan con las partes hidrófobas de las moléculas de fosfolípidos que constituyen estas barreras, mientras que las cadenas laterales básicas pueden interaccionar con los grupos fosfato de la cabeza de estas moléculas, como se ha propuesto que hacen las cadenas laterales básicas en los segmentos de péptido que penetran la membrana del homeodominio de Drosophila Antennapedia y la proteína Tat del VIH-1 (Derossi y col., 1996; Vives y col., 1997; Vives y col., 1997).

Alternativamente, o además de lo anterior, se puede fomentar que el péptido de la invención penetre las membranas celulares y la barrera hematoencefálica más fácilmente disponiendo la sección de péptido que forma cadena \beta de modo que sea precedida o seguida en la secuencia peptídica, o unido de otra forma, de una sección diferente de péptido que penetra la membrana que consista enteramente o casi enteramente en restos aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas o hidrófobas. Estas secciones de péptido que penetran la membrana pueden llevar péptidos y proteínas pequeñas a las que se unen por membranas celulares y la barrera hematoencefálica, interaccionando con las moléculas de fosfolípidos que constituyen estas barreras biológicas como se ha descrito antes. Otras secciones del péptido que son ricas en restos con cadenas laterales básicas y/o hidrófobas también pueden actuar como vectores para llevar la sección de péptido que forma cadena \beta a través de estas barreras (Derossi y col., 1998). La cadena lateral de cada resto en la sección de péptido que penetra la membrana preferiblemente es un grupo básico o hidrófobo, tales como los de la alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, prolina, histidina, lisina y arginina. La sección de péptido que penetra la membrana también puede incluir restos aminoácidos sustituidos en \alpha-D o N\alpha, para hacerlos más resistentes a la degradación proteolítica catalizada por
enzimas.

La sección de péptido que penetra la membrana se puede unir a la sección de péptido que forma cadena \beta incluyéndolo en la síntesis en fase sólida de la sección de péptido que forma cadena \beta como un péptido continuo, en el que la sección de péptido que penetra la membrana precede o sigue a la sección de péptido que forma cadena \beta. Alternativamente, la sección de péptido que penetra la membrana se puede unir por un enlace amida o disulfuro a una de las cadenas laterales de la sección de péptido que forma cadena \beta.

La sección de péptido que forma cadena \beta puede tener un extremo N libre, acetilado o acilado de otra forma y/o un extremo C libre, amidado o esterificado, o puede formar parte de un péptido más grande que tiene un extremo N libre, acetilado o acilado de otra forma y/o un extremo C libre, amidado o esterificado. Se prefiere la amidación o esterificación del extremo C porque un grupo carboxilo libre reduce la capacidad de un péptido para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, debido a las interacciones electrostáticas desfavorables entre este grupo con carga negativa y los grupos fosfatos con cargas negativas de las cabezas de las moléculas de fosfolípidos que constituyen estas barreras.

La acetilación o acilación del grupo amino N-terminal puede reducir realmente la capacidad del péptido para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica porque un grupo amino N-terminal cargado positivamente formaría interacciones electrostáticas favorables con los grupos fosfato con cargas negativas de las cabezas, y así ayudaría al péptido a cruzar estas barreras.

Sin embargo, un grupo amino N-terminal con carga positiva no formaría un enlace de hidrógeno tan fuerte con el átomo de oxígeno carbonílico de la cadena principal de una cadena \beta diana asociada como lo haría un grupo amino N-terminal acetilado o acilado de otra forma. Por lo tanto, se prefiere un grupo amino N-terminal acetilado o acilado de otra forma si el grupo amino N-terminal forma parte de la sección de péptido que forma cadena \beta: el problema de la menor capacidad del péptido para penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica se puede superar uniendo restos con cadenas laterales básicas o una sección de péptido que penetra la membrana distinto a cualquiera de los dos extremos de la sección de péptido que forma cadena \beta, como se ha descrito antes.

Unión de grupos funcionales

El péptido de acuerdo con la invención se puede unir a un componente funcional. Este componente funcional puede ser una sección de péptido u otra molécula que hace que el compuesto o composición se dirija a órganos, células o moléculas específicos, tales como una hormona, anticuerpo, factor de transcripción u otra molécula de proteína; o puede ser un marcador como se ha descrito antes, tal como un grupo o átomo que contiene un núcleo radiactivo o magnéticamente activo; o podría ser un grupo fluorescente, coloreado u otro grupo detectable por espectroscopia; o podría ser un grupo que contenga un electrón desapareado y que actúe como un marcador de espín, tal como el grupo 2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi (PROXYL) o el grupo 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO); o puede ser una enzima o una molécula citotóxica que mate selectivamente células que contengan o estén asociadas de otra forma con la cadena \beta diana; o puede ser una matriz, resina o soporte sólido.

La sección de péptido que forma cadena \beta se une a cualquiera de estos componentes funcionales o a algún otro componente funcional mediante un enlace amida, enlace éster o cualquier otra unión adecuada entre una cadena lateral, sustituyente en N\alpha o cualquiera de los dos extremos del péptido entero. El componente funcional y esta unión se hacen antes, durante o después de la síntesis del péptido entero por acoplamiento de las moléculas adecuadas. Por ejemplo, la inclusión de un resto de cisteína o lisina en el péptido entero permite que se una a un componente funcional que contenga un grupo electrófilo tal como un grupo bromo o yodo, o un grupo éster o anhídrido, mediante el ataque nucleófilo del átomo de azufre del tiol del resto cisteína o el átomo de nitrógeno del amino del resto lisina a ese grupo electrófilo del componente funcional. Alternativamente, se puede usar un agente de reticulación bifuncional para unir la sección de péptido que forma cadena \beta al componente funcional; o se puede sintetizar el péptido entero usando un derivado de aminoácido especialmente preparado que ya contenga el componente funcional; o se puede usar un agente de acoplamiento estándar tal como diciclohexilcarbodiimida para formar un enlace amida entre una cadena lateral o un grupo carboxilo o amino terminal del péptido y un grupo carboxilo o amino del componente funcional.

Usos de péptidos de acuerdo con la invención

Los compuestos y composiciones químicas descritos en este documento se pueden usar para cualquier aplicación que use su capacidad para asociarse específicamente con cadenas \beta diana, e inhibir así la asociación de otras cadenas \beta con esas cadenas \beta diana. Una aplicación para estos compuestos es el uso para inhibir o invertir la agregación de proteínas o péptidos en fibras \beta insolubles, o más específicamente, para inhibir o invertir la asociación de cadenas \beta en láminas \beta, in vitro o in vivo. In vitro, por ejemplo, se pueden usar combinados con un agente adicional tal como urea, cloruro de guanidinio u otro desnaturalizante para ayudar al replegado de las proteínas o péptidos desnaturalizados, mal plegados o agregados.

De acuerdo con el presente aspecto de la invención, la proteína o péptido desnaturalizado, mal plegado o agregado se dializa de una solución que contiene el péptido de acuerdo con la invención más el agente adicional, por ejemplo, o por cromatografía de renaturalización de proteínas a través de una matriz, resina o soporte sólido al que el péptido se une covalentemente, en presencia del agente adicional.

Los péptidos también son útiles para el diagnóstico in vivo o in vitro, estudio o tratamiento de enfermedades producidas por la agregación de proteínas o péptidos en fibras \beta insolubles, tales como las listadas en la introducción. Para dichas aplicaciones, los compuestos se diseñan de modo que puedan penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, y de modo que sean resistentes a las proteolisis catalizada por enzima; también se puede incorporar un grupo localizable en el compuesto de la invención como se ha descrito, de modo que se pueda usar como una sonda para el diagnóstico de estas enfermedades.

Los péptidos de la invención también se podrían usar in vitro o in vivo, para inhibir la oligomerización o asociación de subunidades de proteínas, cuando se produzca por asociación de cadenas \beta. Muchas enzimas y otras proteínas sólo son activas como dímeros u otros oligómeros que se forman a partir de subunidades individuales por la asociación de cadenas \beta, y los compuestos de la invención se podrían usar para inhibir la actividad de estas proteínas mediante la unión a estas cadenas \beta y así el impedimento de su asociación para formar el complejo de proteína completo. Por ejemplo, la actividad catalítica de la proteasa del VIH depende de su dimerización, la cual implica la asociación de cadenas \beta formadas por las secciones N y C-terminales del péptido. Se han usado satisfactoriamente homólogos peptídicos cortos de estas secciones de péptido para inhibir la dimerización y así la actividad catalítica de esta enzima (Babe y col., 1992; Franciskovich y col., 1993; Schramm y col., 1993; Schramm y col., 1996; Schramm y col., 1992; Zutshi y col., 1997). Sin embargo, estos péptidos no son muy solubles en soluciones acuosas y son susceptibles de degradación por encimas proteolíticas porque consisten solamente en restos \alpha-L-aminoácidos no sustituidos en N\alpha, y por lo tanto no son adecuados para usar como agentes terapéuticos. Los compuestos descritos en este documento son más solubles en soluciones acuosas y son resistentes a la degradación por enzimas proteolíticas, por lo que son más adecuados para usar como agentes terapéuticos. Para una revisión sobre el uso de péptidos de "interfase" para inhibir la oligomerización o asociación de subunidades de proteínas en complejos activos, véase la referencia (Zutshi y col., 1998).

Por lo tanto, la capacidad de los péptidos de la invención para inhibir la asociación de cadenas \beta se puede usar para cualquier aplicación sea in vitro o in vivo. Además, la capacidad de estos compuestos para asociarse simplemente de forma específica con cadenas \beta diana también se puede usar así para cualquier aplicación in vitro o in vivo. Por ejemplo, los compuestos se podrían usar como una sonda localizable, en especial como un tinte o indicador histoquímico, para indicar la presencia o localización de cadenas \beta, láminas \beta o fibras \beta in vitro o in vivo. En dichas aplicaciones, el compuesto contiene o está unido a un átomo o grupo que contiene un núcleo radiactivo o magnéticamente activo, o un grupo fluorescente, coloreado o detectable por otra espectroscopía, tal como un grupo que contiene un electrón desapareado y actúa así como un marcador de espín. Dicho compuesto se puede usar específicamente como un tinte o indicador histoquímico para hacer un seguimiento de la producción de fibras \beta insolubles en pacientes con la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas producidas por la agregación de proteínas o péptidos en fibras \beta insolubles en el cerebro.

Los péptidos de acuerdo con la invención se pueden unir a una matriz, resina o soporte sólido, y así usar para la cromatografía de renaturalización de proteínas como se ha descrito antes; también se podrían usar en esta forma para la cromatografía de afinidad en la que la sección de péptido que forma cadena \beta actúa como un cebo para capturar las proteínas o péptidos que forman la cadena \beta diana. Por ejemplo, una sección de péptido que forma cadena \beta diseñada para formar una cadena \beta y que así se asocia específicamente con una cadena \beta diana formada por una proteína particular de interés bioquímico, se podría unir a una matriz, resina o soporte sólido para permitir la purificación de esa proteína particular por cromatografía de afinidad: la proteína que contiene la cadena \beta diana se unirá a la cadena \beta formada por la sección de péptido que forma cadena \beta unida al soporte sólido, y de esta forma se pude separar de otras proteínas que no serán reconocidas por la sección de péptido que forma cadena \beta; la proteína purificada después se puede liberar del soporte añadiendo una forma libre de la sección de péptido que forma cadena \beta, o algún otro agente que altere la interacción entre las dos cadenas \beta, tal como urea o algún otro agente desnaturalizante.

Finalmente, los compuestos descritos en este documento se pueden incluir en una biblioteca combinatoria de dichos compuestos para seleccionar un compuesto particular que se va a usar para cualquiera de las aplicaciones anteriores. Esta biblioteca combinatoria se podría preparar por cualquier procedimiento estándar adecuado de preparación de bibliotecas de péptidos sintéticos (Lebl y Krchnak, 1997), en los que se incluyen restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en los péptidos en las posiciones adecuadas de acuerdo con la presente invención. Después en la biblioteca resultante se seleccionan los péptidos que se unen a una cadena \beta diana con suficiente fuerza, o que inhiben suficientemente la actividad de una proteína oligómera bloqueando su oligomerización, o que rescatan células que de otra forma morirían por la agregación de proteínas o péptidos en fibras \beta insolubles. Los compuestos seleccionados se pueden usar directamente para cualquiera de las aplicaciones anteriores, o se pueden usar para diseñar bibliotecas combinatorias de compuestos que son incluso más activos, o que son más adecuados para usar como agentes terapéuticos.

Para usar como agentes terapéuticos, los péptidos de acuerdo con la invención se pueden formular de acuerdo con las prácticas establecidas. El péptido de acuerdo con la invención se puede administrar de una forma conveniente tal como por vía oral, intravenosa (cuando sea soluble en agua), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o por supositorio, o por implante (p. ej., usando moléculas de liberación lenta).

Dependiendo de la vía de administración, puede ser necesario recubrir el péptido con un material para protegerlo de la acción de las encimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivarlo.

Con el fin de administrar el péptido por otra vía distinta de la administración parenteral, se puede recubrir, o se puede administrar con un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el péptido se puede administrar en un adyuvante, coadministrar con inhibidores de enzimas o en liposomas. El adyuvante se usa en su sentido más amplio e incluye cualquier compuesto estimulador del sistema inmunitario tal como interferón. Los adyuvantes contemplados en este documento incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen-oleil-éter y n-hexadecil-polietilen-éter. Los inhibidores de enzimas incluyen los de la tripsina pancreática y otras proteasas digestivas.

Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales.

El compuesto activo también se puede administrar por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que se pueda administrar con jeringuilla fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos se puede hacer mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede hacer mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria del disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados antes, según sean necesarios, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados antes. En el caso de polvos estériles para preparar soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado a vacío y la técnica de liofilización que dan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de su solución previamente esterilizada por filtración.

Cuando el péptido está adecuadamente protegido como se ha descrito antes, se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible digestible, o se puede encerrar en cápsulas de gelatina dura o blanda, o se puede comprimir en comprimidos, o se puede incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares, para ingerir. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtenga una dosificación adecuada.

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante tal como goma de tragacanto, goma arábiga o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato magnésico; y se puede añadir un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente de sabor tal como menta, aceite de gaulteria, o sabor de cereza. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido.

Puede haber otros materiales diferentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas se pueden recubrir con laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como un agente edulcorante, metil y propilparabén como conservantes, un colorante y un agente de sabor tal como sabor de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier unidad de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades usadas. Además, el compuesto activo se puede incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Tal como se usa en este documento "vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar principios activos complementarios en las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación por la facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación tal como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar; y cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de unidad de dosificación nuevas de la invención viene dada por y depende directamente de (a) las características particulares del material activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) de las limitaciones inherentes en la técnica de la producción de composiciones tal como el material activo, para el tratamiento de enfermedades en sujetos vivos que tienen una afección patológica en la que la salud corporal está
deteriorada.

Los principios activos principales se combinan para una administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la forma de unidad de dosificación. En el caso de composiciones que contienen principios activos complementarios, las dosificaciones se determinan por referencia a la dosis habitual y la forma de administración de dichos principios.

La presente invención proporciona el uso de un péptido de acuerdo con la invención para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la estructura aberrante de proteínas/polipéptidos. La naturaleza aberrante de la proteína/polipéptido puede deberse a un mal plegamiento o al no plegamiento, que a su vez puede deberse a una secuencia de aminoácidos anómala, por ejemplo, mutada. La proteína/polipéptido se puede desestabilizar o depositar en forma de placas, p. ej., como en la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad puede ser causada por un prion. Un medicamento basado en polipéptido de la invención actuaría para renaturalizar o resolubilizar o inhibir la acumulación de proteínas aberrantes, defectuosas o depositadas.

La invención se describe con más detalle, sólo con el propósito de ilustrar, en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

La agregación del péptido A\beta de Alzheimer en fibras amiloides es producida por la asociación intermolecular de segmentos peptídicos de cinco restos KLVFF (ID SEC Nº 1) que comprenden los restos 16-20 del péptido A\beta (Tjernberg y col., 1997). Por lo tanto se construyó un péptido, denominado a continuación péptido X (ID SEC Nº 2), para que se asociara fuertemente con el motivo KLVFF (ID SEC Nº 1), con el fin de inhibir la agregación del péptido A\beta.

La secuencia de cadenas laterales en el péptido X es LLLLRR (ID SEC Nº 2), que es muy homóloga con la secuencia inversa FFVLK (ID SEC Nº 3), excepto que se ha añadido un resto adicional que tiene una cadena lateral de arginina en el extremo C.

Se seleccionaron cadenas laterales de leucina para sustituir a las cuatro cadenas laterales hidrófobas en la secuencia FFVLK (ID SEC Nº 3) porque son relativamente flexibles y pueden adaptar su conformación para hacer interacciones hidrófobas fuertes con las cadenas laterales hidrófobas vecinas de una cadena \beta asociada, mientras que se eligió una cadena lateral de arginina para sustituir la cadena lateral de lisina en la secuencia FFVLK (ID SEC Nº 3) porque puede formar una interacción electrostática más fuerte con una de las dos cadenas laterales ácidas que siguen al segmento que produce agregación KLVFF (ID SEC Nº 1) de la cadena \beta diana.

Los restos adicionales que tienen una cadena lateral de arginina en el extremo C del péptido X (ID SEC Nº 2) pueden formar otra interacción electrostática fuerte con la segunda de estas dos cadenas laterales ácidas, y debería ayudar más al péptido X (ID SEC Nº 2) a penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica.

Finalmente, el grupo amino N-terminal del péptido X (ID SEC Nº 2) se acetiló para maximizar su asociación con el segmento que produce agregación KLVFF (ID SEC Nº 1) de la cadena \beta diana, y su otro grupo carboxilo C-terminal cargado negativamente se amidó para mejorar más la capacidad del péptido X (ID SEC Nº 2) de penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica. El péptido X (ID SEC Nº 2) se ha diseñado para que se asocie específicamente como una cadena \beta con el segmento que produce agregación FFVLK (ID SEC Nº 1) de la cadena \beta diana formada por el péptido A\beta de Alzheimer, para formar un complejo de lámina \beta paralela, impidiendo así estéricamente la agregación del péptido A\beta en fibras \beta insolubles.

El péptido X (ID SEC Nº 2) es un péptido sustituido, de acuerdo con la presente invención. La secuencia, incluyendo los sustituyentes, es N\alpha-acetil-(D-leucina)-(N\alpha-metil-D-leucina)-(D-leucina)-(N\alpha-metil-D-leucina)-(D-arginina)-(D-arginina)-NH_{2}, o todo-D-[Ac-Leu-meLeu-Leu-meLeu-Arg-Arg-NH2.

El péptido X (ID SEC Nº 2) se sintetizó mediante síntesis de péptidos en fase sólida basada en el 9-fluorenilmetoxi-
carbonilo- (Fmoc-) (Fields y Noble, 1990) usando el agente de acoplamiento 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), que es capaz de acoplar aminoácidos con impedimento estérico (Angell y col., 1994; Carpino y col., 1994).

Se encontró que el péptido X (ID SEC Nº 2) era completamente soluble en soluciones acuosas en un amplio intervalo de valores de pH, incluso con una concentración 10 mM (aproximadamente 10 mg/ml); además, excepto por sus dos cadenas laterales de arginina con carga positiva, es extremadamente hidrófobo y por lo tanto puede penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica, en especial puesto que sólo tiene seis aminoácidos de longitud. Las dos cadenas laterales de arginina con carga positiva ayudan al péptido a penetrar las membranas celulares y la barrera hematoencefálica produciendo interacciones electrostáticas con los grupos fosfato con cargas negativas de las cabezas de las moléculas de fosfolípidos constituyentes, dando como resultado la formación de micelas invertidas que llevan las moléculas de péptido a través de estas membranas.

La capacidad del péptido X (ID SEC Nº 2) para inhibir la agregación de un fragmento de péptido sintético correspondiente a los restos 11 a 25 del péptido A\beta de Alzheimer en fibras amiloides se determinó cuantitativamente usando un ensayo estándar basado en la fluorescencia de la tioflavina T a 482 nm dependiente de amiloide (Levine, 1993).

El péptido X (ID SEC Nº 2) se disolvió en agua a una concentración 10 mM (aproximadamente 10 mg/ml). El fragmento de péptido A\beta de Alzheimer, con una concentración 50 \muM (aproximadamente 0,1 mg/ml) en tampón de acetato sódico 50 mM (pH 5,0) se incubó a 25ºC en ausencia o presencia de péptido X (ID SEC Nº 2) con concentraciones en el intervalo de 100 \muM a 1 mM; la agregación del fragmento de péptido A\beta en fibras \beta insolubles en las soluciones se determinó cuantitativamente después de 20 minutos midiendo la fluorescencia de tioflavina T 1 \muM añadida a 482 nm, usando una longitud de onda de excitación de 440 nm. Después se analizaron partes alícuotas de 5 ml por microscopía electrónica para confirmar que el péptido X (ID SEC Nº 2) había inhibido y/o invertido la agregación del fragmento de péptido A\beta de Alzheimer en fibras \beta insolubles.

De acuerdo con este ensayo, la agregación del fragmento de péptido A\beta en fibras amiloides era inhibida en más de 60% en presencia del péptido X 200 \muM (ID SEC Nº 2) (véase la figura 5). Se obtuvieron resultados similares cuando se añadió el péptido X (ID SEC Nº 2) al fragmento de péptido A\beta después de incubación, mostrando que el péptido X (ID SEC Nº 2) es capaz de disgregar fibrillas amiloides previamente formadas. El análisis del fragmento de péptido A\beta incubado con y sin péptido X 500 mM (ID SEC Nº 2) por microscopía electrónica confirmó que el péptido X (ID SEC Nº 2) había inhibido casi completamente la agregación del fragmento de péptido A\beta en fibrillas amiloides (véanse las figuras 6 y 7).

Las figuras 3 y 4 muestran como el péptido X (ID SEC Nº 2) forma una cadena \beta (X) y se asocia así con un borde de una cadena \beta diana (Y) formada por un segmento de péptido A\beta o alguna otra molécula basada en péptidos en cualquiera de las dos orientaciones para formar un complejo de lámina \beta de dos cadenas paralela (figura 3) o antiparalela (figura 4), impidiendo estéricamente de esta forma la asociación de otras cadenas \beta con ese borde de la cadena \beta diana.

La longitud entera del péptido X (ID SEC Nº 2) puede formar una cadena \beta porque consiste solamente en restos \alpha-D-aminoácidos que estéricamente le permiten hacerlo: todos pueden adoptar los ángulos fi y psi respectivos necesarios para formar una cadena \beta. Además, las restricciones estéricas impuestas por los grupos N\alpha-metilo de los dos restos N\alpha-metil-a-D-aminoácido (restos 2 y 4) sirven para fomentar que el péptido X (ID SEC Nº 2) forme una cadena \beta. Cuando el péptido X (ID SEC Nº 2) forma una cadena \beta, estos dos grupos N\alpha-metilo quedan a lo largo del mismo borde de la cadena \beta como se muestran en la figura 3 o figura 4, porque están separados entre sí por un número par de restos (en este caso dos restos) y la unidad que se repite de una cadena \beta es dos restos. Este borde de la cadena \beta formado por el péptido X (ID SEC Nº 2) está estéricamente impedido por estos dos grupos N\alpha-metilo para asociarse con otra cadena \beta. Sin embargo, el otro borde de la cadena \beta formada por el péptido X (ID SEC Nº 2) sigue estando libre para hacerlo, y se puede asociar en la orientación paralela o en la antiparalela con un borde libre de una cadena \beta diana formada por un segmento del péptido A\beta o alguna otra molécula de proteína o péptido para formar un complejo de lámina \beta de dos cadenas paralela (figura 3) o antiparalela (figura 4), impidiendo así estéricamente la asociación de otras cadenas \beta con este borde de la cadena \beta diana, y previniendo así la formación de láminas \beta extendidas y la deposición de fibras \beta insolubles patógenas. Esta asociación de la cadena \beta formada por el péptido X (ID SEC Nº 2) con la cadena \beta diana se hace por enlaces de hidrógeno entre sus grupos peptídicos de la cadena principal e interacciones no covalentes adicionales entre sus cadenas laterales.

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<110> STOTT, KELVIN

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<120> PÉPTIDOS

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<130> 42197PCT

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<140>

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<141>

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<150> GB 9917725.5

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<151> 1999-07-28

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 5

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<212>PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: RESTOS 16 A 20 DEL PÉPTIDO A-BETA HUMANO

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<400> 1

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\sa{Lys Leu Val Phe Phe}

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<210> 2

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<211> 5

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<212>PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO ARTIFICIAL QUE SE ASOCIA FUERTEMENTE CON LA SECUENCIA DE ID SEC Nº 1

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<400> 2

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\sa{Leu Leu Leu Arg Arg}

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<210> 3

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: INVERSIÓN DE LA SECUENCIA DE PÉPTIDOS DE ID SEC Nº 1

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<400> 3

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\sa{Phe Phe Val Leu Lys}

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> STOTT, KELVIN

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<120> PÉPTIDOS

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<130> 42197PCT

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<140>

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<141>

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<150> GB 9917725.5

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<151> 1999-07-28

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: RESTOS 16 A 20 DEL PÉPTIDO A-BETA HUMANO

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<400> 1

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\sa{Lys Leu Val Phe Phe}

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<210> 2

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: PÉPTIDO ARTIFICIAL QUE SE ASOCIA FUERTEMENTE CON LA SECUENCIA ID SEC Nº 1

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> 2

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<223> METILACIÓN

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> 4

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<223> METILACIÓN

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<223> todos los restos aminoácidos son el enantiómero D

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<400> 2

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\sa{Leu Leu Leu Arg Arg}

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<210> 35

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: INVERSO DE LA SECUENCIA PEPTÍDIA DE ID SEC Nº 1

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<400> 3

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\sa{Phe Phe Val Leu Lys}

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Claims (36)

1. Un compuesto o composición química que comprende un péptido, en el que

(a) dicho péptido comprende una sección de péptido que forma cadena \beta que comprende una secuencia de al menos cuatro restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos, todos los cuales permiten estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta;

(b) cada uno de los restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos en la sección de péptido que forma cadena \beta tiene una cadena lateral;

(c) dicha sección que forma cadena \beta del péptido forma una cadena \beta que tiene una cadena principal peptídica que toma la forma de una cinta extendida que tiene dos bordes, un primer borde y un segundo borde, de modo que los componentes NH y CO de los grupos peptídicos de la cadena principal quedan a lo largo de los dos bordes de la cinta, y en el que el primer borde se asocia con una cadena \beta diana formada por una molécula que contiene péptido separada y las cadenas laterales de los restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos pueden formar interacciones no covalentes favorables con las cadenas laterales vecinas de la cadena \beta diana formada por la molécula que contiene péptido
separada;

(d) al menos uno de los restos \alpha-D-aminoácidos consecutivos en la cadena principal peptídica de la cadena \beta está sustituido en N\alpha, de modo que el o los sustituyentes de N\alpha quedan sólo a lo largo de dicho segundo borde e impiden estéricamente la asociación del segundo borde con otra cadena \beta; y

(e) cualesquiera dos restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha sucesivos en la cadena principal peptídica de la cadena \beta están separados por un número impar de restos de \alpha-D-aminoácidos no sustituidos en N\alpha.

2. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dos restos aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta no están separados por más de 3 restos aminoácidos no sustituidos en N\alpha.

3. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta están separados entre sí por un solo resto \alpha-D-aminoácido no sustituido en N\alpha, de forma que la sección de péptido que forma cadena \beta comprende una secuencia alternada de restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha y no sustituidos en N\alpha.

4. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el sustituyente de N\alpha de cada uno de los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta permite o promueve estéricamente que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta, e impide estéricamente la asociación de dicho segundo borde de la cadena \beta con otra cadena \beta.

5. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el sustituyente de N\alpha de cada uno de los restos \alpha-D-aminoácidos sustituidos en N\alpha en la sección de péptido que forma cadena \beta se selecciona del grupo constituido por:

un átomo de flúor o un grupo OH;

un grupo que está conectado al átomo N\alpha por un átomo de oxígeno en él;

un grupo que está conectado al átomo N\alpha por un subgrupo CH2 en él;

un grupo metilo o etilo, o algún otro grupo alquilo o alifático;

un grupo bencilo sustituido o no sustituido, o algún otro grupo arilmetilo;

un grupo 2-hidroxi-4-metoxi-bencilo acetilado o acilado (AcHmb); y

un grupo 2-hidroxibencilo acilado o no acilado (AcH/Hb).

6. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicha cadena lateral de cada resto \alpha-D-aminoácido en la sección de péptido que forma cadena \beta permite o promueve que la sección de péptido que forma cadena \beta forme una cadena \beta.

7. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena lateral de uno o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta es la de un resto aminoácido que tiene una propensión a lámina \beta mayor que 1,00.

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8. Un compuesto o composición química de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la cadena lateral de uno cualquiera o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, se seleccionan del grupo constituido por:

un átomo o grupo que permite o promueve que la sección de péptido que forma cadena \beta se asocie como una cadena \beta con la cadena \beta diana y así forme un complejo de lámina \beta estable; y

un átomo o grupo que forma una interacción hidrófoba o electrostática, enlace de hidrógeno u otra interacción no covalente favorable con la cadena lateral vecina de la cadena \beta diana en un complejo de lámina \beta que comprende la cadena \beta diana y la sección de péptido que forma cadena \beta.

9. Un compuesto o composición química de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la cadena lateral de uno cualquiera o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, se seleccionan del grupo constituido por:

un grupo hidrófobo, o un grupo que tiene una parte hidrófoba considerable;

un grupo alquilo o alifático ramificado o lineal;

un grupo que está ramificado en su átomo de carbono \beta de conexión;

un grupo aromático;

un grupo ácido o básico; y

un grupo que contiene amida o hidroxilo.

10. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena lateral de uno o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, impide el apilamiento de láminas \beta.

11. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena lateral de uno o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, se extiende más allá de las cadenas laterales vecinas en la cadena \beta.

12. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena lateral de uno o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, permite que el compuesto o composición sea localizado o detectado.

13. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena lateral de uno cualquiera o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, se selecciona del grupo constituido por:

un átomo o grupo que contiene un núcleo radiactivo o magnéticamente activo;

la de la fenilalanina o tirosina con uno o más átomos de yodo u otro halógeno radiactivos o magnéticamente activos sustituidos en el anillo aromático;

un grupo fluorescente, coloreado u otro grupo detectable por espectroscopía,

un grupo que contiene un electrón desapareado y por lo tanto actúa como un marcador de espín;

un grupo que contiene el grupo 2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi (PROXYL); y

un grupo que contiene el grupo 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO).

14. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena lateral de uno o más restos \alpha-D-aminoácidos en la sección de péptido que forma cadena \beta, se seleccionan del grupo constituido por la cadena lateral de:

cualquier \alpha-L-aminoácido natural o derivado sintético del mismo; glicina; alanina; serina; cisteína; treonina; valina; leucina; isoleucina; metionina; fenilalanina; tirosina; triptófano; glutamina; asparagina; glutamato; aspartato; histidina; lisina; arginina; y terc-leucina o \beta-hidroxivalina.

15. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la cadena \beta está formada por el péptido A\beta de Alzheimer, y la sección de péptido que forma cadena \beta se une específicamente como una cadena \beta a parte o toda la secuencie KLVFFAE en la cadena \beta diana en orientación paralela, formando así un complejo de lámina \beta paralela en el que los restos consecutivos de la sección de péptido que forma cadena \beta quedan diagonalmente en frente de los restos consecutivos de la secuencia KLVFFAE en el mismo
orden.

16. Un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la cadena \beta está formada por el péptido A\beta de Alzheimer, y la sección de péptido que forma cadena \beta se une específicamente como una cadena \beta a parte o toda la secuencie KLVFFAE en la cadena \beta diana en orientación antiparalela, formando así un complejo de lámina \beta antiparalela en el que los restos consecutivos de la sección de péptido que forma cadena \beta quedan diagonalmente en frente de los restos consecutivos de la secuencia KLVFFAE en orden inverso.

17. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la sección de péptido que forma cadena \beta está precedida, seguida, o unida de otra forma, a una sección diferente de péptido que penetra la membrana que permite que la sección de péptido que forma cadena \beta cruce barreras biológicas, tales como membranas celulares y la barrera hematoencefálica.

18. Un compuesto o composición química de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la cadena lateral de cada resto en la sección de péptido que penetra la membrana se selecciona del grupo constituido por:

un grupo básico o hidrófobo; una cadena lateral de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptófano, prolina, histidina, lisina o arginina.

19. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la sección de péptido que forma cadena \beta tiene un extremo N libre o acilado y un extremo C libre, amidado o esterificado, o forma parte de un péptido más grande que tiene un extremo N libre o acilado y un extremo C libre, amidado o esterificado.

20. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la sección de péptido que forma cadena \beta está unido a otro componente funcional.

21. Un compuesto o composición química de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el componente funcional se selecciona del grupo constituido por:

un componente que refuerza la unión de la sección de péptido que forma cadena \beta a la cadena \beta diana;

un componente que potencia la especificidad de la asociación de la sección de péptido que forma cadena \beta con la cadena \beta diana;

un componente que posibilita que la sección de péptido que forma cadena \beta cruce barreras biológicas tales como membranas celulares y la barrera hematoencefálica;

un componente que hace que el compuesto/composición se dirija a órganos, células o moléculas específicos;

un componente que permite que el compuesto/composición sea localizado o detectado;

un átomo o grupo que contiene un núcleo radiactivo o magnéticamente activo;

un grupo fluorescente, coloreado u otro grupo detectable por espectroscopía;

un grupo que contiene un electrón desapareado y por lo tanto actúa como un marcador de espín;

un grupo que contiene el grupo 2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi (PROXYL) o el grupo 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO);

una matriz, resina o soporte sólido;

una enzima, hormona, anticuerpo, factor de transcripción u otra molécula de proteína;

un grupo que se une específicamente a una proteína particular, y

una molécula citotóxica.

22. Un compuesto o composición química de acuerdo con la reivindicación 20 o reivindicación 21, en el que la unión de la sección de péptido que forma cadena \beta al componente funcional es mediante un enlace amida o éster formado con el grupo carboxilo C-terminal o el grupo amino N-terminal del péptido entero, o con un grupo carboxilo, amino o hidroxilo de una cadena lateral en el péptido entero, o por un puente disulfuro formado con un grupo tiol de una cadena lateral en el péptido entero.

23. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la sección de péptido que forma cadena \beta comprende entre 5 y 10 restos aminoácidos y/o incluye una secuencia de cadenas laterales que es homóloga o idéntica a la secuencia de aminoácidos FFVLK (ID SEC Nº 3).

24. Un compuesto o composición química de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la sección de péptido que forma cadena \beta se asocia con una cadena \beta diana que comprende la secuencia de aminoácidos KLVFF (ID SEC Nº 1).

25. Un compuesto o composición química de acuerdo con la reivindicación precedente, en el que uno o más grupos peptídicos (CONH) de la cadena principal de la sección de péptido que forma cadena \beta se sustituyen por uno de los siguientes grupos: CSNH (tioamida); COO (éster); CSO, COS, CSS (tioéster); COCH_{2} (cetona); CSCH_{2} (tiocetona); SO_{2}NH (sulfonamida); SOCH_{2} (sulfóxido); SO_{2}CH_{2} (sulfona); SO_{2}O (sulfonato); y/o en el que uno o más grupos peptídicos de la cadena principal sustituidos en el N de la sección de péptido que forma cadena \beta, se sustituyen por una forma sustituida en el N o C de uno de los siguientes grupos: CS-NH (tioamida); COCH_{2} (cetona); CSCH_{2} (tiocetona); SO_{2}NH (sulfonamida); SOCH_{2} (sulfóxido); SO_{2}CH_{2} (sulfona).

26. El uso de un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la fabricación de un medicamento para inhibir o invertir la asociación de una cadena \beta diana en una lámina \beta o fibra \beta.

27. El uso de un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la fabricación de un medicamento para inhibir o invertir la agregación de proteínas o péptidos.

28. El uso de un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la fabricación de un medicamento para ayudar al replegado de proteínas o péptidos desnaturalizados o agregados.

29. El uso de un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la preparación de una composición para el diagnóstico, estudio o tratamiento de una enfermedad producida por la agregación de proteínas o péptidos.

30. El uso de un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la fabricación de un medicamento para inhibir la oligomerización o asociación de subunidades de proteínas.

31. Un procedimiento para indicar la presencia o situación de cadenas \beta, láminas \beta o fibras \beta, que comprende exponer una muestra de ensayo a un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende un resto detectable.

32. El uso de un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende un resto detectable, en la fabricación de un agente para indicar la presencia o situación de cadenas \beta, láminas \beta o fibras \beta.

33. Un procedimiento por cromatografía de afinidad o de renaturalización de proteínas, que comprende las etapas de unir covalentemente un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 a una matriz, resina o soporte sólido; pasar una muestra de ensayo por la columna; y separar el producto tratado deseado de la columna.

34. Una biblioteca combinatoria que comprende compuestos o composiciones químicas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

35. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto o composición química de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

36. El uso de la reivindicación 29, en el que la enfermedad se selecciona de las siguientes: enfermedad de Alzheimer (EA); enfermedad de Parkinson (EP); demencia, demencia con cuerpos de Lewy (DCL); encefalopatías relacionadas con priones; encefalopatía espongiforme bovina (EEB); enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ); kuru; enfermedades neurodegenerativas predominantemente heredadas; enfermedad de Huntington(EH), atrofia muscular bulboespinal (SBMA) ligada al cromosoma X, atrofia dentatorubral-palidoluisiana (DRPLA), ataxia espinocerebelar; diabetes mellitus de tipo II; polineuropatía amiloide familiar; amiloidosis sistémica senil; y amiloidosis relacionada con diálisis.