PT1204679E

PT1204679E - Peptidos contendo d-aminoácidos substituidos em n para prevenir a associação de cadeia beta.

Info

Publication number: PT1204679E
Application number: PT00949729T
Authority: PT
Inventors: Kelvin Stott
Original assignee: Senexis Ltd
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2007-05-31
Also published as: DE60033668T2; GB9917725D0; EP1204679A1; DK1204679T3; EP1204679B1; NZ516442A; DE60033668D1; ATE355302T1; AU767396B2; ES2282125T3; JP2003505470A; CA2379241A1; WO2001007474A1; US7060671B1; AU6300400A

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS CONTENDO D-AMINOÁCIDOS SUBSTITUÍDOS EM N PARA PREVENIR A ASSOCIÇÃO DE CADEIA BETA" A presente invenção relaciona-se com uma classe de compostos à base de péptidos que se ligam especificamente a cadeias β alvo e assim inibem a sua associação em folhas β e fibras β insolúveis. Em particular, a invenção relaciona-se com péptidos compostos por D-enantiómeros de aminoácidos pelo menos alguns dos quais são modificados por substituição Na.

Um grande número de doenças neurodegenerativas actualmente incuráveis, terrivelmente angustiantes é causado pela agregação de proteínas ou péptidos em inclusões citotóxicas insolúveis ou placas tipo amilóide no cérebro: a doença de Alzheimer (AD) , que é a forma mais comum de demência senil e a quarta causa mais comum de morte no mundo desenvolvido, é provocada pela agregação de um resíduo 39-43 de péptido Αβ de um fragmento de uma proteína precursora amilóide maior (Forloni, 1996; Forloni et al., 1996; Joachim e Selkoe, 1992; Price et al., 1993; Selkoe, 1994; Verbeek et al., 1997; Wisniewski et al., 1997); a doença de Parkinson (PD) e pelo menos uma forma de demência (Demência com Corpos de Lewy, ou DLB) são causadas pela agregação e incorporação de sinucleína α em inclusões intracitoplásmicas chamadas corpos de Lewy (Arima et al., 1998; Baba et al., 1998; Mezey et al., 1998; Polymeropoulos, 1998; Spillantini et al., 1998; Trojanowski et al., 1998; Trojanowski e Lee, 1998); as encefalopatias relacionadas com prião tais como a encefalopatia 2 espongiforme bovina (BSE, ou "doença das vacas loucas") e as suas formas humanas doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) e kuru são causadas pelo desenrolamento e agregação auto-catalisado de proteínas meta-estáveis conhecidas como priões (Forloni, 1996; Forloni et al., 1996; Horwich e Weissman, 1997; Price et al., 1993; Prusiner e Dearmond, 1995); várias doenças neurodegenerativas dominantemente hereditárias incluindo a doença de Huntington (HD), atrofia muscular bulbo-espinal ligada ao cromossoma X (SBMA), atrofia dentatorubral-pallidoluysian (DRPLA), e pelo menos cinco formas geneticamente distintas de ataxia espinocerebelar (SCA tipos 1, 2, 3, 6 e 7; a SCA3 é melhor conhecida como doença de Machado-Joseph, ou MJD) são causadas pela agregação e incorporação de proteínas ou fragmentos de proteína contendo repetições de glutamina anormalmente expandida nas inclusões intranucleares (Perutz, 1999; Ross, 1997).

Em adição a estas e indubitavelmente muitas outras, como doenças neurodegenerativas ainda não identificadas, várias doenças não neurodegenerativas mas igualmente perigosas são causadas pela agregação de proteínas ou péptidos noutras partes do corpo. Por exemplo: a diabetes mellitus tipo II é causada por agregação do resíduo 37 do polipéptido amilóide celular (IAPP ou amilina) nos ilhéus de Langerhans no pâncreas (Clark et al., 1996; Kahn et al., 1999; Obrien et al., 1993); a polineuropatia amilóide familiar e amiloidose sistémica senil são causadas pela agregação de transtiretina de comprimento total e seus fragmentos (Benson e Uemichi, 1996); e a amiloidose relacionada com diálise é causada pela agregação de β2-microglobulina (Miyata et al., 1998). 3

Em todas estas doenças, que são colectivamente conhecidas como amiloidoses, as proteínas ou péptidos envolvidos agregam-se em fibras β insolúveis pela associação intermolecular de cadeias β em folhas β estendidas; estas fibras β são depositadas em inclusões ou placas tipo amilóide que conduzem à morte celular progressiva por algum mecanismo desconhecido. Para revisões mais gerais sobre as amiloidoses e seus mecanismos, ver as referências (Kakizuka, 1998; Kisilevsky e Fraser, 1997; Serpell et al., 1997; Sunde e Blake, 1998; Wisniewski et al., 1998) .

Embora permaneça por determinar como é que a agregação de péptidos e proteínas em inclusões insolúveis resulta na morte progressiva das células, é claro que o modo geral mais efectivo de tratar as doenças seria prevenir a formação destas inclusões citotóxicas utilizando algum agente que iniba especificamente a agregação de proteínas e péptidos em fibras β insolúveis. Por uma razão ou por outra, no entanto, nenhum dos inibidores de agregação de proteína e péptido existentes são adequados para utilizar como agentes terapêuticos: 1) Os compostos orgânicos simples que actuam como desnaturantes proteicos tais como cloreto de guanidínio, ureia, detergentes, e muitos solventes orgânicos são inibidores muito efectivos da agregação de proteína e péptido. No entanto, tendem a desestabilizar proteínas enroladas correctamente e quebrar interacções proteína-proteína sensíveis no interior da célula a concentrações de trabalho porque são demasiado simples na forma para inibir especificamente a agregação de proteína e péptido. Como uma 4 consequência são tóxicos para as células, e são portanto inadequados para utilizar como agentes terapêuticos. 2) Foi descoberto que um número de compostos orgânicos mais complexos inibe a agregação de proteína e péptido um pouco mais especificamente. Incluem: β-ciclodextrina (Camilleri et al., 1994), vermelho do congo e outros corantes sulfonados (Burgevin et al., 1994; Lorenzo e Yankner, 1994; Pollack et al., 1995), nicotina (Salomon et al., 1996), hemina e porfirinas relacionadas (Howlett et al., 1997), antraciclina 4'-iodo-4'-desoxidoxorubicina (Merlini et al., 1995) , brometo de hexadecil-N-metilpiperidínio (Wood et al., 1996), melatonina (Pappolla et al., 1998), e rifampicina (Tomiyama et al., 1994). Nenhum destes compostos foi considerado ser adequado para utilizar como agentes terapêuticos, no entanto, são assim melhor considerados como referências pertinentes estruturais na procura de compostos mais activos e úteis farmacologicamente. Para uma revisão nestes compostos como inibidores da agregação de péptido Αβ, ver a referência (Bandiera et al., 1997). 3) As proteínas grandes tais como proteínas chaperoninas ou de choque térmico (Kudva et al., 1997), ct2-macroglobulina (Hughes et al., 1998), laminina (Bronfman et al., 1996), e anticorpos monoclonais (Hanan e Solomon, 1996; Solomon et al., 1996) podem ser extremamente efectivas e específicas como inibidores da agregação de proteína e péptido devido ao seu tamanho e complexidade. No entanto, são demasiado grandes para penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral, são susceptíveis de agregação e proteólise, e tendem a ser imunogénicas. 5 4) Os péptidos simples podem também inibir a agregação de proteína e péptido efectivamente e especificamente, e são pelo menos suficientemente pequenos para penetrar nas membranas celulares e na barreira sanguínea cerebral, o que também os torna menos prováveis de serem imunogénicos que as proteínas grandes. No entanto, existe actualmente um conflito entre a solubilidade, hidrofobicidade, e potência destes péptidos, assim como um problema de degradação proteolítica.

Na doença de Alzheimer, por exemplo, o resíduo 39-43 do péptido Αβ agrega-se em fibrilos amilóides pela associação intermolecular de segmentos de péptidos de cinco resíduos compreendendo a sequência KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) (correspondente aos resíduos 16-20 do péptido Αβ) (Tjernberg et ai., 1997; Tjernberg et ai., 1996). Os segmentos de péptido formam cadeias β que se associam para formar uma folha β antiparalela estendida através de interacções hidrofóbicas entre as suas cadeias laterais e ligações de hidrogénio entre os seus grupos amida da estrutura base. Esta associação fibrogénica pode ser inibida por péptidos pequenos que também contêm a sequência KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) ou uma sequência homóloga, tal como Ac-QKLVFF-NH2 (Tjernberg et ai., 1996), GQKLVFFAEDVGG-[NH(CH2)5CO]-K6 (Ghanta et ai., 1996), e KKLVFFA (Tjernberg et ai., 1997). Estes péptidos formam cadeias β que competem para associação com a sequência homóloga no péptido Αβ e assim impedem a sua agregação. O primeiro destes péptidos possui uma solubilidade limitada em soluções aquosas porque também se pode agregar em folhas β estendidas. Os últimos dois péptidos, por outro lado, são mais solúveis em água porque contêm mais grupos polares, mas são consequentemente 6 demasiado hidrofílicos para penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral. Os péptidos podem ser tornados mais solúveis sem comprometer a sua hidrofobicidade através da inclusão de resíduos prolina em vez de resíduos polares. Por exemplo, os péptidos RDLPFFPVPID, LPFFPVD, e LPFFD possuem um grau semelhante de hidrofobicidade ao do péptido Αβ, mas são altamente solúveis em soluções aquosas porque os resíduos prolina previnem-nos estereoquimicamente de formar cadeias β que se agregam em folhas β estendidas (Soto et al., 1996; Soto et al., 1998). No entanto, estes péptidos são inibidores menos potentes da agregação do péptido Αβ porque a conformação de cadeia β é realmente requerida para estabelecer interacções fortes e específicas com as cadeias β formadas pelo péptido Αβ, de modo a inibir a sua agregação. Resumidamente, ninguém descobriu como prevenir os péptidos de se agregarem em tampões aquosos sem comprometer a sua hidrofobicidade, que é requerida para a penetração efectiva de membranas celulares e da barreira sanguínea cerebral, ou a sua potência como inibidores de agregação de proteína e de péptido.

Em adição a este problema de solubilidade versus hidrofobicidade e potência, todos os péptidos mencionados atrás são extremamente susceptíveis à degradação por enzimas proteolíticas porque consistem inteiramente em resíduos de α-L-aminoácido não substituído em Na, e não são portanto adequados para utilizar como agentes terapêuticos. Este problema particular foi considerado por concepção de péptidos que consistem apenas de resíduos de α-D-aminoácidos, que não são reconhecidos por enzimas proteolíticas (Miller et al., 1995). Por exemplo, todos-D- 7 [RDLPFFPVPID] (Soto et al., 1996) e todos-D-[LFLRR] (Tjernberg et al., 1997) são altamente resistentes à proteólise catalisada por enzimas como esperado, mas estes péptidos ainda enfrentam o problema de conflito entre a solubilidade em tampões aquosos, a capacidade de penetrar nas membranas celulares e na barreira sanguínea cerebral, e a capacidade de inibir a agregação de outras proteínas e péptidos em fibras β insolúveis. A patente mundial WO 96/28471 contém dois compostos que podem modular a agregação de proteínas e péptidos amiloidogénicos por ligação de grupos modulantes à terminações N ou C do péptido amilóide β e/ou anexar grupos modificadores às cadeias laterais dos aminoácidos nos péptidos amilóides β. É conhecido que os péptidos contendo resíduos substituídos em Na ou de a-D aminoácido são muito menos susceptíveis à proteólise catalisada por enzimas que os péptidos que consistem apenas em resíduos de a-L-aminoácidos não substituídos em Na porque nem os resíduos substituídos em Na nem os de a-D-aminoácidos são reconhecidos por enzimas proteolíticas (Miller et al., 1995). Os péptidos contendo resíduos de aminoácidos substituídos em Na são também muito menos prováveis de se agregarem em fibras β insolúveis em soluções aquosas porque os átomos Na destes resíduos não estão disponíveis para ligação de hidrogénio e, além disso, porque os seus substituintes Na não permitem estereoquimicamente a associação de cadeias β. Foi concebido um péptido contendo resíduos de Να-metilaminoácidos que se enrola numa folha β 8 de três cadeias, mas que não se agregam em folhas β estendidas porque os grupos Να-metilo destes resíduos o previnem estereoquimicamente de o fazer (Doig, 1997) . Neste péptido, cada uma das duas cadeias β periféricas contém uma sequência de dois resíduos de Να-metilalanina separados por um resíduo único de alanina não substituído em Na, de modo que todos os quatro grupos Να-metilo fiquem ao longo das extremidades exteriores destas duas cadeias β, enquanto que as extremidades interiores permanecem livres para se associar à cadeia β central, formando assim uma folha de três cadeias β. No entanto, não foi relatado previamente que um tal péptido seja, em isolação, capaz de se associar a cadeias β formadas por outras moléculas de proteína ou péptido e assim inibir a sua agregação em folhas β estendidas e fibras β insolúveis. Além disso, não foi previamente relatado que um péptido compreendendo resíduos de α-D-aminoácidos substituído em Na e não substituído em Na seja capaz de se associar especificamente a cadeias β formadas por outras moléculas de proteína ou péptido e assim inibir a sua agregação em folhas β estendidas e fibras β insolúveis.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é providenciado um composto químico ou composição compreendendo um péptido, em que (a) o referido péptido compreende uma secção do péptido de formação de cadeia β compreendendo uma sequência de pelo menos quatro resíduos de α-D-aminoácidos consecutivos, 9 todos os quais permitem estereoquimicamente a secção de péptido de formação de cadeia β para formar uma cadeia β; (b) cada um dos resíduos de α-D-aminoácidos consecutivos na secção do péptido de formação de cadeia β possui uma cadeia lateral; (c) a referida secção de péptido de formação de cadeia β forma uma cadeia β possuindo uma estrutura de base de péptido que toma a forma de uma tira estendida possuindo duas extremidades, uma primeira extremidade e uma segunda extremidade, tal que os componentes NH e CO dos grupos péptidos da estrutura de base se encontrem ao longo das duas extremidades da tira, e em que a primeira extremidade se associa a uma cadeia β alvo formada por uma molécula contendo péptido separada e as cadeias laterais dos resíduos de α-D-aminoácidos consecutivos são capazes de formar interacções não covalentes favoráveis com cadeias laterais da vizinhança da cadeia β alvo formada pela molécula contendo péptido separada; (d) pelo menos um dos resíduos de a-D-aminoácidos consecutivos da estrutura base de péptido da cadeia β é substituído em Na, tal que o(s) substituinte (s) Na fiquem apenas ao longo da referida segunda extremidade e impeça(m) estereoquimicamente a associação da segunda extremidade com outra cadeia β; e (e) quaisquer dois resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na sucessivos da estrutura base de péptido da cadeia β estão separados por um número ímpar de resíduos de α-D-aminoácidos não substituídos em Να-consecutivos.

Uma cadeia β é uma secção de péptido cuja estrutura de base toma a forma de uma tira estendida; as cadeias 10 laterais dos resíduos consecutivos numa cadeia β projectam-se a partir de lados alternados do plano da tira, enquanto que os componentes NH e CO dos grupos peptídicos da estrutura de base ficam ao longo das duas extremidades da tira. As cadeias β são estruturas regulares que são apenas formadas por secções de péptido que consistem apenas em resíduos de α-L-aminoácido ou apenas em resíduos de a-D-aminoácidos; os ângulos fi e psi de cada resíduo de aminoácido numa cadeia β são próximos de -120° e +120° respectivamente. As cadeias β não são estáveis em isolação, e existem apenas quando duas ou mais estão associadas para formar uma folha β paralela ou anti-paralela. As cadeias β individuais numa folha β são suportadas conjuntamente lado a lado e extremidade a extremidade quer na orientação paralela ou anti-paralela por ligações de hidrogénio entre os componentes NH e CO dos seus grupos peptídicos da estrutura de base, assim como por interacções não covalentes adicionais entre as suas cadeias laterais. A cadeia β possui duas extremidades, cada uma das quais pode suportar a associação de outra cadeia β deste modo. A folha β pode portanto ser estendida indefinidamente pela adição progressiva de mais cadeias β às extremidades livres das suas duas cadeias β periféricas; isto eventualmente resulta na formação de fibras β insolúveis. O mecanismo pelo qual as cadeias β formadas por proteínas e péptidos se agregam em folhas β e assim fibras β insolúveis é ilustrado esquematicamente na Figura 1. Os péptidos de acordo com a invenção inibem a agregação de proteínas e péptidos em fibras β insolúveis por se ligarem 11 especificamente às extremidades livres de cadeias β, impedindo assim estereoquimicamente a sua associação em folhas β estendidas. 0 péptido total poderá estar envolvido na formação de uma cadeia β, ou apenas numa sua secção, como referido atrás. Quando está envolvida apenas uma secção do péptido na formação de cadeia β, poderá ser referida como a "secção de formação de cadeia β".

Uma "secção", como referido aqui, é qualquer parte de uma entidade tal como um péptido. Assim, quando aplicado a péptidos, "secção" refere-se a uma sequência de resíduos de aminoácidos contíguos no interior, ou numa terminação, do péptido. 0 comprimento de uma "secção" de péptido irá depender da aplicação desejada que vai ser dada à secção; por exemplo, uma secção de péptido de formação de cadeia β poderá ter pelo menos quatro aminoácidos de comprimento, preferencialmente mais longa, como estabelecido adiante. Uma secção poderá compreender a totalidade do péptido, ou qualquer sua parte. Por exemplo, poderá compreender 10 %, 25 %, 50 %; 75 %, 90 % ou 100 % do péptido. "Sucessivo", como utilizado aqui, refere-se a quaisquer dois resíduos de aminoácido definidos que se seguem um ao outro numa sequência, quer sejam ou não contíguos na sequência. Assim, os dois resíduos de aminoácido substituídos em Na sucessivos poderão estar separados, se estiverem separados, por um ou mais resíduos de aminoácido não substituídos em Na. "Consecutivo", como utilizado aqui, refere-se a quaisquer dois resíduos de aminoácido definidos que se seguem um ao outro numa sequência contígua. Assim, os dois 12 resíduos de aminoácido substituídos em Na consecutivos estão adjacentes numa sequência de aminoácido.

De acordo com a presente invenção, o composto químico ou composição é separado do alvo. 0 alvo é assim uma molécula discreta, a qual é quer um péptido ou que compreende um péptido. A molécula alvo poderá assim ser um péptido, uma proteína compreendendo um péptido de folha β ou uma secção de péptido, um derivado de uma proteína, ou qualquer outra molécula que seja capaz de formar pelo menos uma cadeia β. A invenção relaciona-se além disso com compostos químicos e composições compreendendo componentes que mimetizam a estrutura e a acção de uma cadeia β e são assim péptidos mímicos. A "péptido mímico" refere-se a um péptido em que um ou mais dos grupos péptidos da estrutura de base ou grupos da cadeia lateral foram substituídos por outro grupo químico de semelhante estequiometria e capacidade de formar interacções não covalentes favoráveis com a cadeia β alvo. Por exemplo, cada grupo do péptido da estrutura de base (CONH) poderá ser substituído por um dos grupos seguintes: CSNH (tioamida); COO (éster); CSO, COS, CSS (tioéster); COCH2 (cetona); CSCH2 (tiocetona); S02NH (sulfonamida); SOCH2 (sulfóxido); S02CH2 (sulfona); S020 (sulfonato). Cada grupo do péptido de estrutura de base substituído em N poderia ser substituído por uma forma substituída em N ou em C de um dos grupos seguintes: CSNH (tioamida); COCH2 (cetona); CSCH2 (tiocetona); S02NH (sulfonamida); SOCH2 (sulfóxido); S02CH2 (sulfona). E cada cadeia lateral poderá ser substituída por outro grupo possuindo uma estequiometria ou configuração de átomos 13 polares e não polares semelhante, desde que quaisquer características particulares que são essenciais para a associação com a cadeia β alvo sejam preservadas. A utilização de α-D-aminoácidos substituídos em Na é altamente vantajosa. Todos os α-D-aminoácidos são resistentes ao ataque de protease, e os a-D-aminoácidos substituídos em Na são também adequados para impedir estereoquimicamente a formação de folha β. A resistência ao ataque de protease é uma propriedade preferida no contexto da presente invenção.

Num segundo aspecto da presente invenção, é providenciado um método para inibir ou reverter a associação de uma cadeia β alvo numa folha β ou fibra β, compreendendo expor a cadeia β alvo a um composto químico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção e permitir ou induzir o composto químico ou composição a se associar à cadeia β alvo.

Opcionalmente, no método de acordo com o aspecto precedente da invenção, poderão ser utilizados outros agentes capazes de desestabilizar a formação de folha β juntamente com os péptidos da invenção. Por exemplo, a utilização in vítro de um péptido de acordo com a invenção e um caotrópico, tal como cloridrato de Guanidínio, é efectiva na prevenção da agregação de cadeias β para formar folhas β em solução.

Num terceiro aspecto, é providenciado um método para inibir ou reverter a agregação de proteínas ou péptidos, 14 compreendendo o contacto das proteínas ou péptidos com um composto químico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

Num quarto aspecto, a invenção providencia um método para assistir no re-enrolamento de proteínas ou péptidos desnaturados ou agregados, compreendendo o contacto das proteínas ou péptidos agregados com um composto químico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

Num quinto aspecto, é providenciado um composto químico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção para utilizar em medicina.

Num sexto aspecto, é providenciada a utilização de um composto químico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção para a preparação de uma composição para o diagnóstico, estudo, ou tratamento de uma doença causada pela agregação de proteínas ou péptidos em fibras β insolúveis.

Num sétimo aspecto, a invenção providencia um método para inibir a oligomerização ou associação de sub-unidades proteicas, compreendendo a exposição das sub-unidades proteicas a um composto químico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção. 0 método do sétimo aspecto poderá ser aplicado, por exemplo, à inibição de uma enzima cuja actividade catalítica dependa da sua oligomerização pela associação de cadeias β, quer in vitro ou in vivo. 15

Num oitavo aspecto, é providenciado um método para indicar a presença ou localização de cadeias β, folhas β, ou fibras β, compreendendo expor uma amostra teste a um composto quimico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção que compreenda uma unidade detectável, remover qualquer composto quimico ou composição não ligado, e avaliar a amostra teste para a presença da unidade detectável.

Uma amostra teste poderá ser uma amostra histológica e o composto quimico ou composição poderá ser utilizado como a corante ou indicador histoquimico.

Num nono aspecto, a invenção relaciona-se com um método para cromatografia por afinidade ou renaturação proteica, compreendendo os passos de ligar covalentemente um composto quimico ou composição de acordo com o primeiro aspecto da invenção a uma matriz sólida, resina, ou suporte; passando a amostra teste na coluna; e separando o produto tratado desejado da coluna.

Num décimo aspecto, a invenção providencia uma biblioteca combinatorial compreendendo compostos ou composições químicos de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 ilustra esquematicamente como as cadeias β se associam em folhas β estendidas e assim em fibras insolúveis β Nesta figura, as cadeias β estão representadas por peças recortadas brancas que possuem ambos uma saliência circular e um orifício circular do 16 mesmo tamanho em cada uma das suas duas extremidades mais longas, representando os componentes CO e NH dos grupos amida da estrutura de base ao longo das duas extremidades das cadeias β. As cadeias β poderão associar-se quer na orientação paralela ou anti-paralela em folhas β estendidas e fibras β insolúveis pela formação de ligações de hidrogénio entre estes componentes CO e NH; na Figura 1 esta interacção é representada pela inserção mútua de saliências circulares nos orifícios circulares de peças recortadas associadas, que poderão conduzir à produção de cadeias de peças recortadas estendidas representando as folhas β estendidas e as fibras β insolúveis. A Figura 2 ilustra esquematicamente como as cadeias β formadas pelas secções de péptido de formação de cadeia β nos péptidos da invenção são capazes de inibir a agregação de cadeias β alvo formadas por outras moléculas de proteínas e péptido em cadeias β estendidas e fibras β insolúveis. Nesta figura, as cadeias β alvo são representadas por peças recortadas brancas que possuem ambos uma saliência circular e um orifício circular do mesmo tamanho em cada uma das suas duas extremidades mais longas, tal como estão na Fig. 1, enquanto que as cadeias β formadas pelas secções de péptido de formação de cadeia β são representadas por peças recortadas sombreadas. Uma extremidade destas peças recortadas sombreadas possui ambos uma saliência circular e um orifício circular, representando os componentes CO e NH dos grupos amida da estrutura base que ficam ao longo da extremidade livre da cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β. Esta extremidade das peças recortadas sombreadas 17 é idêntica a ambas as extremidades das peças recortadas brancas, e pode portanto ser ligada às peças recortadas brancas quer na orientação paralela ou anti-paralela tal como as peças recortadas brancas são capazes de serem ligadas uma à outra. A outra extremidade das peças recortadas sombreadas, no entanto, possui duas saliências circulares mas nenhum orifício circular, representando o facto que um, alguns, ou todos os grupos NH da estrutura de base ao longo de uma extremidade da cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β são bloqueados estereoquimicamente pelos substituintes Na que estão ao longo dela. Esta extremidade das peças recortadas sombreadas é consequentemente incapaz de ser ligada a qualquer outra peça recortada, quer seja branca ou sombreada. Portanto, quando a extremidade de saliência única de uma peça recortada sombreada é ligada quer na orientação paralela ou anti-paralela de qualquer uma das extremidades de saliência única de uma peça recortada branca, que poderá ou não formar parte de uma cadeia maior de tais peças, nenhuma outra peça recortada poderá subsequentemente ser ligada a essa extremidade da peça recortada branca, e a elongação de uma cadeia nessa direcção é assim bloqueada como mostrado, a menos que a peça recortada sombreada terminal seja primeiro removida. Exactamente do mesmo modo, as cadeias β formadas pela secção de péptido de formação de cadeia β ligam-se às cadeias β alvo formadas por outras moléculas de proteína e péptido e inibem assim a sua agregação em cadeias β estendidas e fibras β insolúveis. 0 modelo composto por peças recortadas ilustra assim claramente o conceito fundamental da presente invenção. 18

As Figuras 3 e 4 mostram como o Péptido X (SEQ. ID. NO 2) forma uma cadeia β (X) e se associa como tal a uma extremidade de uma cadeia β alvo (Y) formada por um segmento do péptido Αβ ou de alguma outra molécula baseada em péptido em qualquer das orientações para formar um complexo de folha β de duas cadeias, paralelo (Fig. 3) ou anti-paralelo (Fig. 4), impedindo assim estereoquimicamente a associação de outras cadeias β com essa extremidade da cadeia β alvo. Em cada uma destas duas figuras: a cadeia β alvo compreende uma sequência de resíduos de oito a-L- aminoácidos consecutivos, cujos átomos Ca não foram marcados; os átomos Ca dos resíduos de seis a-D- aminoácidos do Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) são numerados a partir da terminação N, enquanto que o átomo Ca do seu grupo acetilo terminal N é indicado por uma letra A; apenas os átomos da estrutura de base diferentes de hidrogénio destas duas cadeias β incluindo os átomos de carbono Na-metilo dos dois resíduos de Na-metilo-a-D-aminoácidos (resíduos 2 e 4) do Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) - são mostrados, e são representados por símbolos definidos pela chave dos átomo abaixo das figuras; as ligações de hidrogénio entre os grupos amida da estrutura de base das duas cadeias β são indicadas por linhas tracejadas. A Figura 5 é um gráfico ilustrando a prevenção de agregação do péptido Αβ de Alzheimer em estruturas de folha β após a administração de Péptido X (SEQ. ID. NO. 2). A redução de 50 % na agregação de péptido Αβ de Alzheimer é observada a uma concentração de Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) de 100 mM. 19 A Figura 6 é um micrográfico electrónico ilustrando péptidos Αβ de Alzheimer agregados. 0 péptido Αβ de Alzheimer foi incubado a uma concentração de 500 mM e o agregado examinado por microscopia electrónica. A Figura 7 é um micrográfico electrónico ilustrando péptidos Αβ de Alzheimer incubados a uma concentração de 500 mM na presença de Péptido X (SEQ. ID. NO. 2); a examinação no microscópio electrónico mostra uma eliminação substancial da agregação.

Descrição Detalhada da Invenção

Os péptidos de acordo com a invenção inibem a agregação de proteínas e péptidos em fibras β insolúveis por ligação especificamente às extremidades livres das cadeias β, impedindo assim estereoquimicamente a sua associação em folhas β estendidas. Fazem isto substancialmente como se segue: O péptido de acordo a presente invenção compreende uma secção que é capaz de formar uma cadeia β, porque consiste apenas em resíduos de α-D-aminoácidos que lhe permitem estereoquimicamente fazer isso. No topo disto, as restrições estéricas impostas pelo(s) resíduo(s) de a-D-aminoacidos substituídos em Na e por quaisquer resíduo(s) ramificado(s) em β de α-D-aminoácidos na secção de formação de cadeia β de péptido poderá(ão) servir para encorajar a formação de cadeia β. Quando a secção de péptido de formação de cadeia β forma uma cadeia β, os substituintes em Na dos seus resíduos de α-D-aminoácidos substituídos em Na são posicionados, por concepção, de modo a ficarem 20 apenas ao longo de uma das suas duas extremidades. Os resíduos substituídos em Na são espaçados de modo a que estejam separados por números ímpares de resíduos, uma vez que a unidade de repetição de uma cadeia β é dois resíduos. Por exemplo, entre quaisquer dois resíduos substituídos em Na sucessivos poderão estar 1 ou 3 resíduos não substituídos em Na. A extremidade substituída em Na da cadeia β é incapaz de se associar a outras cadeias β formadas pela secção de péptido de formação de cadeia β porque os substituintes em Na que se encontram ao longo dela previnem-na estereoquimicamente de fazer isso. A outra, extremidade livre desta cadeia β é capaz de o fazer, e poderá associar-se quer na orientação paralela ou na anti-paralela a uma extremidade livre de uma cadeia β alvo formada por outra molécula de proteína ou péptido através de ligações de hidrogénio entre os grupos peptidicos da sua estrutura de base e interacções não covalentes adicionais entre as suas cadeias laterais. Esta cadeia β alvo será mais provavelmente uma das duas cadeias β periféricas de uma folha β existente, mas poderia também ser uma cadeia β única, isolada que se forma apenas à medida que se associa à cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β. De qualquer modo, o resultado desta associação é a formação de um complexo de folha β em que a cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β bloqueia estereoquimicamente a associação de outras cadeias β à extremidade agora associada da cadeia β alvo, prevenindo assim a formação de uma folha β estendida e a 21 deposição de fibras β insolúveis. Por exemplo, se a cadeia β alvo é uma das duas cadeias β periféricas de uma folha β existente, então a associação da cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β à extremidade livre dessa cadeia β alvo bloqueia estereoquimicamente a associação de outras cadeias β com essa extremidade da cadeia β alvo, prevenindo assim a extensão da folha β nessa direcção. A extensão da folha β na outra direcção poderá ser prevenida da mesma maneira por associação da cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β à extremidade livre das outras cadeias β periféricas da folha β. As cadeias β alvo isoladas poderão ser prevenidas de se associarem umas às outras por associação simultânea de ambas as extremidades às duas cadeias β formadas pela secção de péptido de formação de cadeia β. Neste caso, as folhas β resultantes de três cadeias não podem ser estendidas em qualquer uma das direcções devido ao impedimento estereoquimico pelos substituintes em Na que estão ao longo das extremidades exteriores de ambas as cadeias β periféricas.

Como utilizado aqui, um "péptido" é um polimero no qual os monómeros são aminoácidos e estão ligados conjuntamente por ligações peptidicas. 0 comprimento de uma secção de péptido de formação de cadeia β de acordo com a invenção será determinado empiricamente, como descrito em detalhe adiante; no entanto, a secção de péptido de formação de cadeia β tem pelo menos 4 resíduos de aminoácidos em comprimento, e preferencialmente entre cerca de 4 e cerca de 50 aminoácidos em comprimento; 22 vantajosamente entre cerca de 4 e cerca de 16 aminoácidos em comprimento, e mais preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 10 aminoácidos. Preferencialmente, a secção de péptido de formação de cadeia β não é maior que a cadeia β alvo, e pelo menos tão grande quanto a secção causadora de agregação da cadeia β alvo.

Os monómeros aminoácidos de que o péptido é construído are α-D-aminoácidos, significando que são a forma D-enantiomérica como oposto à forma L- enantiomérica. Os L-aminoácidos, que ocorrem comummente na natureza, are susceptíveis a digestão por enzimas proteases se desprotegidos. Os α-D-aminoácidos substituídos em Na são α-D-aminoácidos que possuem um substituinte, que não é hidrogénio, no átomo α-N, enquanto que os a-D-aminoácidos não substituídos em Na não possuem substituinte nesta posição. Os substituintes preferidos úteis para praticar a presente invenção são estabelecidos adiante. Em geral, no entanto, os substituintes têm que ser suficientemente grandes para impedir estereoquimicamente a associação de cadeias β, e preferencialmente grandes o suficiente para impedir ou prevenir a degradação proteolítica do péptido mas não devem impedir estereoquimicamente a secção de péptido de formação de cadeia β de formar uma cadeia β.

Como utilizado aqui, "destabilizar", quando aplicado a folhas β e formação de folha β, refere-se à inibição de agregação de cadeia β em estruturas de folha β e preferencialmente à prevenção de agregação de cadeia β. Vantajosamente, refere-se à reversão da agregação de cadeia β e quebra real de estruturas de folha β. A reversão poderá 23 ser completa ou parcial; em geral, reversão indica que essas estruturas de folha β revertem para cadeias β não associadas, ou que são separadas em folhas β menores. "Impedir", "inibir" e "prevenir", como utilizado atrás, refere-se a uma redução na agregação de cadeia β variando desde parcial até substancialmente completa. Por exemplo, a agregação de cadeia β poderá ser reduzida em 20 %, 30 %, 50 %, 75 % ou mais, preferencialmente cerca de 90 % ou 100 %.

As cadeias laterais usadas em secções de péptido de formação de cadeia β de acordo com a invenção permitem ou favorecem além disso a formação de cadeias β. "Permite", como utilizado aqui, significa que a formação de cadeias β não é impedida. "Favorece" significa que tal formação é facilitada com respeito a qualquer aminoácido seleccionado que meramente permita a formação de cadeia β. O conceito de favorecer ou permitir a formação de cadeia β poderá ser expresso em termos de valores de propensidade de folha β para resíduos de aminoácidos . A propensidade de folha β é uma medida da incidência de aminoácidos particulares nas folhas β formadas por proteínas naturais; foi descoberto que o valor de propensidade se correlaciona muito bem com as considerações termodinâmicas que governam a formação de folha β por resíduos de aminoácidos. Ver, por exemplo, Williams et al., (1987); Wilmot e Tornton, (1988); Kim e Berg, (1993); Smit et al., (1994); Minor e Kim, (1994a); Regan, (1994); e Bai e Englander, (1994) . Vantajosamente, os resíduos incorporados na secção de péptido de formação de cadeia β possuem uma propensidade de folha β de pelo menos cerca de 1,00. 24

Concepção de Péptidos de Acordo com a Invenção

De modo a que a secção de péptido de formação de -cadeia β seja capaz de formar uma cadeia β, deve consistir apenas em resíduos de α-D-aminoácidos que permitam estereoquimicamente que a secção de péptido de formação de cadeia β forme uma cadeia β. A prolina, por exemplo, não pode ser incluida na secção de péptido de formação de cadeia β excepto muito próximo do seu final porque a sua cadeia lateral está ligada novamente a um átomo de azoto da sua estrutura de base, e portanto é incapaz de adoptar o ângulo fi requerido para formar uma cadeia β.

De modo a que a cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β se associe com a força suficiente à cadeia β alvo para inibir a sua agregação em fibras β insolúveis, deve ter pelo menos quatro resíduos de aminoácidos no comprimento. Uma cadeia β consistindo em três ou menos resíduos de aminoácidos não iria interactuar com uma cadeia β alvo fortemente o suficiente para impedir a associação de outras cadeias β àquela cadeia β alvo. Em geral, a secção de péptido de formação de cadeia β poderá ser de qualquer comprimento superior a três resíduos (i.e. quatro ou mais), mas na prática não deverá ser maior que a cadeia β alvo, e deverá preferencialmente ser pelo menos tão longa como o segmento daquela cadeia β alvo que é directamente responsável pela sua agregação.

Isto é porque é provável que o segmento causador da agregação da cadeia β alvo compreenda uma sequência de resíduos possuindo cadeias laterais hidrofóbicas ou contendo amidas, que possam formar as interacções mais 25 fortes com as cadeias laterais adjacentes a uma cadeia β associada em soluções aquosas. É este segmento causador da agregação da cadeia β alvo com o qual a secção de péptido de formação de cadeia β é preferencialmente concebida para se associar. Enquanto que a secção de péptido de formação de cadeia β de acordo com a invenção poderá ser mais curta, ter o mesmo comprimento ou ser maior que o segmento causador da agregação da cadeia β alvo, não existe necessidade de a secção de péptido de formação de cadeia β ser mais comprida que a própria cadeia β alvo, porque quaisquer resíduos adicionais na secção de péptido de formação de cadeia β não são prováveis de interactuar fortemente com os resíduos que flanqueiam a cadeia β alvo, se tais resíduos não estiverem numa estrutura de cadeia β. A cadeia β alvo, o segmento causador da agregação dessa cadeia β alvo e portanto o comprimento óptimo para a secção de um péptido de formação de cadeia β de acordo com a presente invenção, poderá ser determinado empiricamente. Por exemplo, a cadeia β alvo poderá ser identificada como uma secção de péptido numa molécula de proteína ou péptido que forma uma cadeia β e indesejavelmente se agrega ou associa como tal a outras cadeias β para formar uma folha β ou fibra β. 0 segmento causador da agregação desta cadeia β alvo pode então ser identificado como uma secção de pelo menos quatro resíduos possuindo principalmente cadeias laterais hidrofóbicas e/ou contendo amidas, ou pode ser determinado experimentalmente através da investigação das propriedades de associação de segmentos pequenos da cadeia β alvo ou de mutantes de resíduo único da cadeia β alvo. 26

Por exemplo, uma secção do resíduo 39-43 do péptido Αβ de Alzheimer forma uma cadeia β e indesejavelmente agrega-se como tal em fibras β insolúveis. Esta cadeia β é portanto identificada como a cadeia β alvo, e o segmento causador da sua agregação foi identificado como possuindo a sequência KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) por investigação das propriedades de associação de pequenos segmentos do péptido Αβ e seus mutantes de resíduo único: a truncagem deste segmento em qualquer terminação, ou a substituição de qualquer um dos seus resíduos por alanina reduziu dramaticamente a tendência do péptido Αβ para se agregar em fibras β insolúveis (Tjernberg et al., 1997/ Tjernberg et ai., 1996) .

Será entendido por aqueles peritos na técnica que poderão ser utilizados procedimentos semelhantes para identificar as cadeias β alvo em proteínas para além da Αβ, ou para identificar as cadeias β alvo alternativas em Αβ, utilizando procedimentos semelhantes (ou outros), como conhecido na técnica e/ou descrito aqui. A secção de péptido de formação de cadeia β de acordo com a invenção é preferencialmente concebida para formar uma cadeia β e associar-se como tal na orientação paralela a este segmento causador da agregação da cadeia β alvo para formar um complexo de folha β paralela. Preferencialmente, é concebida como se segue. A secção de péptido de formação de cadeia β contém preferencialmente o mesmo número de resíduos que o segmento causador da agregação da cadeia β alvo, e vantajosamente 27 compreende uma sequência alternante de Na-metil-a-D-aminoácidos e resíduos de α-D-aminoácidos não substituídos em Na. As cadeias laterais dos resíduos na secção de péptido de formação de cadeia β são complementares àquelas do segmento causador da agregação da cadeia β alvo na mesma ordem, pela qual é significado que a cadeia lateral do primeiro resíduo da secção de péptido de formação de cadeia β é escolhido para formar uma interacção não covalente favorável com a cadeia lateral do primeiro resíduo do segmento causador da agregação da cadeia β alvo, e assim por diante. Por exemplo: se o primeiro resíduo do segmento causador da agregação da cadeia β alvo possuir uma cadeia lateral contendo amidas, então o primeiro resíduo da secção de péptido de formação de cadeia β deverá também possuir uma cadeia lateral contendo amidas; se o primeiro resíduo do segmento causador da agregação da cadeia β alvo possuir uma cadeia lateral hidrofóbica, então o primeiro resíduo da secção de péptido de formação de cadeia β deverá também possuir uma cadeia lateral hidrofóbica; se o primeiro resíduo do segmento causador da agregação da cadeia β alvo possuir uma cadeia lateral contendo hidroxilo, então o primeiro resíduo da secção de péptido de formação de cadeia β deverá também possuir uma cadeia lateral contendo hidroxilo; se o primeiro resíduo do segmento causador da agregação da cadeia β alvo possuir uma cadeia lateral básica, então o primeiro resíduo da secção de péptido de formação de cadeia β deverá possuir uma cadeia lateral acídica; e se o primeiro resíduo do segmento causador da agregação da cadeia β alvo possuir uma cadeia lateral acídica, então o primeiro resíduo da secção de péptido de formação de cadeia β deverá possuir uma cadeia lateral 28 básica. Este procedimento de selecção é continuado para todas as cadeias laterais restantes na secção de péptido de formação de cadeia β.

Em geral, uma sequência adequada de cadeias laterais na secção de péptido de formação de cadeia β pode também ser tomada directamente a partir da secção da cadeia β que indesejavelmente se associa à secção causadora da agregação da cadeia β alvo. Por exemplo, o péptido Αβ de Alzheimer agrega-se em fibras β insolúveis pela associação intermolecular de segmentos de péptido causador da agregação de KLVFF idênticos (SEQ. ID. NO.45 1) como cadeias β na orientação anti-paralela, e no complexo de folha β anti-paralela resultante, as quatro cadeias laterais hidrofóbicas da cada cadeia β formam interacções hidrofóbicas com aquelas da cadeia β associada, enquanto que a cadeia lateral lisina básica de cada cadeia β presumivelmente forma uma interacção electrostática com uma das duas cadeias laterais acidicas que se seguem à sequência KLVFF (SEQ. ID. N0.1) na cadeia β associada (Tjernberg et al., 1997). Uma vez que a secção de péptido de formação de cadeia β é concebida para se associar como uma cadeia β à sequência KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) na orientação paralela, a sequência das suas cadeias laterais é preferencialmente concebida para ser homóloga ou idêntica à sequência KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) na ordem inversa, i.e. FFVLK (SEQ. ID. NO. 3). Poderão ser concebidos outros compostos ou composições correspondentes à presente invenção para se associarem especificamente a outras cadeias β alvo por um método semelhante. 29 A concepção de novo de polipéptidos de folha β foi descrita na técnica. Por exemplo, é feita referência a Smit e Regan, (1995); Smit e Regan, (1997); De Alba et al., (1999); e Kortemme et al., (1998). Estas e outras abordagens poderão ser empregues na concepção de um polipéptido adequado. Por exemplo, uma sequência adequada de cadeias laterais na secção de péptido de formação de cadeia β poderá ser determinada por construção de um modelo molecular de um complexo de folha β paralela ou anti-paralela no qual a cadeia β alvo está associada à segunda cadeia β, e em seguida adapta a identidade e conformação das cadeias laterais da segunda cadeia β para formar interacções não covalentes favoráveis com as cadeias laterais da cadeia β alvo. Isto poderá ser feito utilizando um computador e suporte lógico adequado como se segue:

Primeiro, é construído um modelo molecular da cadeia β alvo. Isto poderá ser feito por extracção das coordenadas de uma cadeia β numa proteína de estrutura molecular conhecida, e em seguida variar a sequência das suas cadeias laterais para aquela da cadeia β alvo. Em seguida, é construído um modelo molecular da segunda cadeia β por um método semelhante, é transformado na sua imagem no espelho e é em seguida posicionado ao longo de qualquer uma das extremidades da cadeia β alvo na orientação paralela ou anti-paralela para formar um complexo de folha β de duas cadeias paralela ou anti-paralela. São em seguida consideradas cadeias laterais possíveis para cada resíduo consecutivo na segunda cadeia β, e são exploradas as suas conformações alternativas para determinar se são prováveis de formar interacções não covalentes favoráveis com as 30 cadeias laterais da vizinhança da cadeia β alvo associada no complexo de folha β. Finalmente, após ter sido seleccionada uma sequência de cadeias laterais adequadas, poderão ser aplicados programas de minimização de energia e dinâmica molecular para investigar a validade teórica do modelo, antes de sintetizar o péptido candidato e de o testar experimentalmente para actividade.

Outra orientação relativa à concepção de péptidos que formam cadeias β poderá ser encontrada no material que se segue relativo às propensidades de folha β para aminoácidos, assim como as fontes seguintes: Nelsoney e Kelly, (1996); Hutchinson et al., (1998); Fam et al.r (1998); Minor e Kim, (1996); Koepf et al., (1999); e Minor e Kim, (1994b).

Selecção e Localização de Substituintes em Na

Para que os substituintes em Na dos resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na na secção de péptido de formação de cadeia β fiquem ao longo de apenas uma das duas extremidades da cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β, os resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na são intercalados por números impares de aminoácidos não substituídos, a menos que exista apenas um resíduo de α-D-aminoácido substituído em Na na secção de péptido de formação de cadeia β, porque a unidade de repetição de uma cadeia β é dois resíduos: se quaisquer dois resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na na secção de péptido de formação de cadeia β estiverem adjacentes ou separados por um número par de resíduos não substituídos, então os seus 31 substituintes em Να estarão em extremidades opostas da cadeia β, e nenhuma extremidade da cadeia β seria capaz de se associar à cadeia β alvo e assim impedir estereoquimicamente a associação de outras cadeias β com essa cadeia β alvo.

Em teoria, portanto, os resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na na secção de péptido de formação de -cadeia β poderiam ter números de resíduos separados muito grandes, ou poderia existir apenas um resíduo de a-D-aminoácido substituído em Na na secção de péptido de formação de cadeia β. Na prática, no entanto, os resíduos de α-D-aminoácidos substituídos em Na sucessivos na secção de péptido de formação de cadeia β deverão preferencialmente estar separados por não mais que 3 resíduos não substituídos porque as restrições estéricas impostas por estes resíduos servem realmente para encorajar a secção de péptido de formação de cadeia β a adoptar a conformação de cadeia β activa (Manavalan e Momany, 1980).

Portanto no caso mais preferido, os resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na sucessivos na secção de péptido de formação de cadeia β estão separados uns dos outros por um único resíduo não substituído de modo que a secção de péptido de formação de cadeia β compreenda uma sequência alternante de resíduos a-D-aminoácidos substituídos em Na e não substituídos em Na. Isto induz a totalidade da secção de péptido a adoptar uma conformação de cadeia β activa. 32

Os substituintes em Na poderão ser substancialmente qualquer átomo ou grupo que seja maior que um átomo de hidrogénio, que essencialmente significa qualquer átomo ou grupo para além de um átomo de hidrogénio. No entanto, não podem também prevenir estereoquimicamente a secção de péptido de formação de cadeia β de formar uma cadeia β, porque a secção de péptido de formação de cadeia β tem que formar uma cadeia β de modo a se associar à cadeia β alvo. 0 substituinte em Na é assim opcionalmente um átomo de flúor ou um grupo hidroxi, ou outro grupo que esteja conectado ao átomo Na por um átomo de oxigénio dele, tal como um grupo metoxi ou outro grupo alcoxi.

Preferencialmente, o substituinte em Na é um grupo que está ligado ao átomo Na por um grupo metileno (0¾) dele. Um tal grupo pode ser incorporado na secção de péptido de formação de cadeia β por métodos comuns de síntese peptídica em solução ou em fase sólida, e o grupo metileno de ligação é estereoquimicamente compatível com a formação de uma cadeia β. Exemplos adequados desta forma preferida de substituinte em Na incluem um grupo metilo ou etilo, ou outro grupo alquilo ou alifático que esteja ligado ao átomo Na por um grupo metileno (CH2) dele, ou um grupo benzilo substituído ou não substituído, tal como um grupo 2-hidroxi-4-metoxibenzilo acetilado ou de outro modo acilado (AcHmb), ou outro grupo aril-metilo.

Um grupo metilo é a forma mais preferida de substituinte em Na porque é o grupo mais simples que pode ser incorporado na secção de péptido de formação de cadeia 33 β por métodos comuns de síntese peptídica em solução ou em fase sólida, e os aminoácidos correspondentes e os seus derivados Fmoc e Boc estão disponíveis comercialmente. 0 grupo 2-hidroxi-4-metoxibenzilo (AcHmb) é uma forma preferida adicional de substituinte em Na porque os aminoácidos correspondentes e os seus derivados Fmoc e Boc estão também disponíveis comercialmente, mas este grupo é muito mais lábil a menos que o seu grupo 2-hidroxilo seja acetilado ou de outro modo acilado (Quibell et al., 1995; Quibell et al., 1995; Quibell et al., 1994). 0 grupo 2-hidroxibenzilo (AcHb) é ainda outra forma preferida de substituinte em Na, e contrariamente ao grupo 2- hidroxi-4-metoxibenzilo, não necessita de ser acetilado ou de outro modo acilado (Johnson e Quibell, 1994). A propensidade de formação de cadeia β da secção de péptido de formação de cadeia β poderá ser aumentada adicionalmente através da inclusão de resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na ou não substituídos em Na cujas cadeias laterais favorecem estereoquimicamente a conformação de cadeia β. Estes incluem resíduos de a-D-aminoácidos com cadeias laterais ramificadas em β, tais como a-D-treonina, α-D-valina, a-D-isoleucina, α-D-tert-leucina, α-Ο-β-hidroxivalina, e seus derivados substituídos em Na. Outros resíduos de a-D-aminoácidos que favorecem a conformação de cadeia β, por exemplo aqueles com cadeias laterais aromáticas tais como α-D-tirosina, a-D-fenilalanina e α-D-triptofano, e aqueles com cadeias laterais hidrofóbicas alifáticas tais como α-D-leucina e 34 α-D-metionina, mais α-D-serina e α-D-glutamina, deverão também ser incluídos na secção de péptido de formação de -cadeia β se e quando adequado: têm que ser compatíveis com a química de síntese peptídica em solução ou em fase sólida, não podem impedir estereoquimicamente a associação da extremidade livre da cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β com a cadeia β alvo, deverão preferencialmente promover que a cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β se associe fortemente à cadeia β alvo.

Como explicado atrás, os resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na ou não substituídos em Na na secção de péptido de formação de cadeia β deverão preferencialmente promover que a secção de péptido de formação de cadeia β forme uma cadeia β; mas deverão também preferencialmente promover que esta cadeia β se associe tão fortemente quanto possível à cadeia β alvo. Para isto, as suas cadeias laterais deverão formar interacções não covalentes fortes com as cadeias laterais da vizinhança da cadeia β alvo quando as duas cadeias estão associadas uma à outra no complexo de folha β paralela ou anti-paralela. As interacções não covalentes mais fortes que podem existir entre as cadeias laterais da vizinhança de cadeias β associadas em soluções aquosas são interacções hidrofóbicas entre cadeias laterais hidrofóbicas e ligações de hidrogénio entre cadeias laterais contendo amidas. 0 segmento da cadeia β alvo principalmente responsável pela sua agregação é provavelmente rico em resíduos que possuem estas cadeias laterais, e portanto é a este segmento 35 causador da agregação da cadeia β alvo que a secção de péptido de formação de cadeia β se pode potencialmente associar mais fortemente. Por esta razão, a maioria dos residuos de α-D-aminoácidos substituídos em Na e não substituídos em Na na secção de péptido de formação de cadeia β possui preferencialmente cadeias laterais hidrofóbicas ou contendo amidas. Os resíduos de aminoácidos preferidos com cadeias laterais hidrofóbicas incluem a-D-valina, α-D-leucina, a-D-isoleucina, α-D-metionina, a-D-fenilalanina, a-D-tirosina, α-D-triptofano, e seus derivados substituídos em Na; enquanto que os resíduos de aminoácidos com cadeias laterais contendo amidas preferidos incluem a-D-asparagina, α-D-glutamina, e seus derivados substituídos em Να. A cadeia lateral mais preferida de cada resíduo na secção de péptido de formação de cadeia β depende da cadeia lateral vizinha da cadeia β alvo associada no complexo de folha β, porque as suas estereoquímicas têm que ser compatíveis com a formação de uma interacçâo não covalente favorável entre elas. Em geral, no entanto, a cadeia lateral hidrofóbica mais preferida é aquela de leucina porque é muito maior mas relativamente flexível, sendo capaz de adoptar qualquer uma das nove conformações rotaméricas diferentes, e pode facilmente adaptar a sua estereoquímica para estabelecer a interacçâo hidrofóbica mais favorável com quase todas as cadeias laterais hidrofóbicas vizinhas de uma cadeia β alvo associada; a cadeia lateral contendo amida mais preferida é aquela de glutamina porque é também relativamente flexível, e é mais provavelmente capaz de fazer uma ligação de hidrogénio favorável com uma cadeia lateral vizinha de glutamina ou asparagina de uma cadeia β alvo associada. No 36 entanto, qualquer cadeia lateral hidrofóbica, ou cadeia lateral que possua uma porção hidrofóbica considerável, poderá ser incluída na secção de péptido de formação de -cadeia β, como poderia qualquer cadeia lateral contendo amidas, desde que não impeçam estereoquimicamente a secção de péptido de formação de cadeia β de formar uma cadeia β, ou de se associar como tal à cadeia β alvo.

Embora a maioria dos resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na e não substituídos em Na na secção de péptido de formação de cadeia β devam possuir cadeias laterais hidrofóbicas ou contendo amidas, os restantes resíduos de α-D-aminoácidos substituídos em Na e não substituídos em Na na secção de péptido de formação de cadeia β poderão possuir cadeias laterais que não são nem hidrofóbicas nem contendo amidas, mas que podem apesar disso formar interacções não covalentes favoráveis com as cadeias laterais vizinhas de uma cadeia β associada. Por exemplo: as cadeias laterais acídicas do aspartato e do glutamato poderão formar pontes salinas com as cadeias laterais básicas da histidina, arginina, e lisina numa cadeia β associada, e inversamente, as cadeias laterais básicas da histidina, arginina, e lisina poderão formar pontes salinas com as cadeias laterais acídicas do aspartato e do glutamato numa cadeia β associada; as cadeias laterais contendo hidroxilo de serina, treonina, e α-hidroxivalina poderão formar ligações de hidrogénio com as cadeias laterais contendo hidroxilo vizinhas de uma cadeia β associada.

Prevenção de empilhagem de folha β 37

De modo a que as folhas β formadas por associação das cadeias β não se agreguem por empilhagem, a secção de péptido de formação de cadeia β também inclui preferencialmente um ou mais resíduos de a-D-aminoácidos possuindo uma cadeia lateral que se estende para além das cadeias laterais vizinhas na cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β. Uma tal cadeia lateral estendida é preferencialmente longa e preferencialmente possui uma terminação polar, de modo que não suporta a empilhagem das folhas β. As cadeias laterais de lisina e arginina são exemplos adequados de tais cadeias laterais estendidas possuindo uma terminação polar.

Marcação de péptidos

De modo a que os péptidos de acordo com a invenção possam ser rastreados ou detectados, a secção de péptido de formação de cadeia β poderá incluir um resíduo de a-D-aminácido possuindo uma cadeia lateral que contém um núcleo radioactivo ou magneticamente activo, tal como um resíduo de a-D-fenilalanina, α-D-tirosina, ou α-D-tironina com um ou mais iodos radioactivos ou magneticamente activos ou outros átomos de halogéneo substituídos nos anel (is) aromático(s); ou a secção de péptido de formação de cadeia β poderá incluir um resíduo de α-D-aminoácido possuindo uma cadeia lateral que contém um grupo fluorescente, corado, ou outro detectável espectroscopicamente, incluindo marcadores de rotação tais como os grupos 2,2,5,5-tetrametil-l-pirrolidiniloxi (PROXYL) e 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxi (TEMPO) que contêm electrões desemparelhados. Um péptido contendo um tal grupo espectroscopicamente detectável ou um núcleo radioactivo ou 38 magneticamente activo poderá ser utilizado como uma sonda rastreável para indicar a presença e a localização de cadeias β alvo ou fibras β insolúveis, quer in vitro ou in vi vo.

Penetração de Membrana

De modo a que o composto ou composição possa penetrar mais facilmente nas membranas celulares e na barreira sanguínea cerebral, a secção de péptido de formação de -cadeia β contém preferencialmente uma elevada proporção de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais hidrofóbicas ou básicas. As cadeias laterais hidrofóbicas interactuam com as porções hidrofóbicas das moléculas de fosfolípido que constituem estas barreiras, enquanto que as cadeias laterais básicas poderão interactuar com os grupos fosfato da extremidade destas moléculas, tal como as cadeias laterais básicas nos segmentos peptídicos penetrantes da membrana do homeodomínio Drosofila Antennapedia e a proteína HIV-1 Tat foram propostos fazer (Derossi et al., 1996; Vives et al., 1997; Vives et al., 1997).

Alternativamente, ou em adição ao precedente, o péptido da invenção poderá ser encorajado a penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral mais facilmente por arranjo da secção de péptido de formação de cadeia β tal que seja precedida ou seguida na sequência peptídica por, ou de outro modo ligada a, uma secção de péptido penetrante na membrana distinta que consiste inteiramente ou quase inteiramente de resíduos de aminoácido possuindo cadeias laterais básicas ou hidrofóbicas. Estas secções de péptido penetrantes de 39 membrana são capazes de transportar péptidos e pequenas proteínas que estejam a ele ligados através das membranas celulares e da barreira sanguínea cerebral por interacção com as moléculas de fosfolípido que constitui estas barreiras biológicas, como descrito atrás. Outras secções de péptido que são ricas em resíduos com cadeias laterais básicas e/ou hidrofóbicas poderão também ser capazes de actuar como vectores para transportar a secção de péptido de formação de cadeia β através destas barreiras (Derossi et al., 1998). A cadeia lateral de cada resíduo na secção de péptido penetrante de membrana é preferencialmente um grupo básico ou hidrofóbico, tal como aquelas de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, histidina, lisina, e arginina. A secção de péptido penetrante de membrana poderá também incluir resíduos de aminoácidos substituídos em a-D- ou Na para a tornar mais resistente à degradação proteolítica catalisada por enzimas. A secção de péptido penetrante de membrana poderá estar ligada à secção de péptido de formação de cadeia β através da sua inclusão na síntese de fase sólida da secção de péptido de formação de cadeia β como um péptido contínuo, em que a secção de péptido penetrante de membrana ou precede ou está a seguir à secção de péptido de formação de cadeia β. Alternativamente, secção de péptido penetrante de membrana poderá estar ligada através de uma ligação amida ou dissulfureto a uma das cadeias laterais da secção de péptido de formação de cadeia β. A secção de péptido de formação de cadeia β poderá possuir uma terminação N livre, acetilada, ou de outro modo 40 acilada e/ou uma terminação C livre, amidada, ou esterificada, ou poderá formar parte de um péptido maior que possui uma terminação N livre, acetilada, ou de outro modo acilada e/ou uma terminação C livre, amidada, ou esterificada. A amidação ou esterificação da terminação C é preferível porque um grupo carboxilo livre reduz a capacidade de um péptido penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral, devido a interacções electrostáticas desfavoráveis entre este grupo carregado negativamente e os grupos fosfato das extremidade negativamente carregados das moléculas de fosfolípidos que constituem estas barreiras. A acetilação ou a acilação do grupo amino terminal N poderá realmente reduzir a capacidade do péptido penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral porque um grupo amino terminal N carregado positivamente livre iria formar interacções electrostáticas favoráveis com os grupos fosfato das extremidades carregados negativamente das moléculas de fosfolípido, e assim ajudar o péptido a atravessar estas barreiras.

No entanto, um grupo amino terminal N carregado positivamente livre não iria formar tão forte como uma ligação de hidrogénio com o átomo de oxigénio carbonilo da estrutura de base de uma cadeia β alvo associada como o iria um grupo amino terminal N acetilado ou de outro modo acilado. Portanto, é preferido um grupo amino terminal N acetilado ou de outro modo acilado se o grupo amino terminal N formar parte da secção de péptido de formação de cadeia β: o problema da capacidade reduzida do péptido para penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral pode ser ultrapassado pela ligação dos resíduos às 41 cadeias laterais básicas ou a uma secção de péptido penetrante de membrana distinta a qualquer terminação da secção de péptido de formação de cadeia β, como descrito atrás.

Ligação de grupos funcionais 0 péptido de acordo com a invenção poderá estar ligado um componente funcional. Este componente funcional poderá ser uma secção de péptido ou outra molécula que cause que o composto ou composição atinja órgãos, células, ou moléculas específicos, tais como uma hormona, anticorpo, factor de transcrição, ou outra molécula proteica; ou poderá ser um marcador como descrito atrás, tal como um átomo ou grupo que contenha um núcleo radioactivo ou magneticamente activo; ou poderia ser um grupo fluorescente, corado, ou outro detectável espectroscopicamente; ou poderia ser um grupo que contivesse um electrão desemparelhado e assim actuaria como um marcador de rotação, tal como o grupo 2,2,5,5-tetrametil-l-pirrolidiniloxi (PROXYL) ou o grupo 2,2,6, 6-tetrametil-l-piperidiniloxi (TEMPO); ou poderá ser uma enzima, ou uma molécula citotóxica que mate selectivamente as células contendo ou de outro modo associada à cadeia β alvo; ou poderá ser uma matriz sólida, resina, ou suporte. A secção de péptido de formação de cadeia β está ligada a qualquer um destes componentes funcionais ou a algum outro componente funcional por meio de uma ligação amida, ligação éster, ou qualquer outra ligação adequada entre a cadeia lateral, substituinte N, ou qualquer terminação do péptido completo. 0 componente funcional, e esta ligação é feita antes, durante, ou após a síntese do 42 péptido completo por acoplamento das moléculas adequadas. Por exemplo, a inclusão de um resíduo de cisteína ou lisina no péptido completo permite-lhe que seja ligado a um componente funcional que contém um grupo electrofílico tal como um grupo bromo ou iodo, ou um grupo éster ou anidrido, através do ataque nucleofílico do átomo de enxofre tiol do resíduo de cisteína ou do átomo de azoto amino do resíduo de lisina nesse grupo electrofílico do componente funcional. Alternativamente, poderá ser utilizado um agente bifuncional de reticulação para se ligar a secção de péptido de formação de cadeia β ao componente funcional; ou o péptido completo poderá ser sintetizado utilizando um derivado de aminoácido preparado especialmente que já contenha o componente funcional; ou poderá ser utilizado um agente de acoplamento comum tal como a diciclohexilcarbodiimida para formar uma ligação amida entre a cadeia lateral ou grupo carboxilo ou amino terminal do péptido e um grupo amino ou carboxilo do componente funcional.

Utilizações de Péptidos de acordo com a Invenção

Os compostos e composições químicos descritos aqui podem ser utilizados para qualquer aplicação que empregue a sua capacidade de se associar especificamente a cadeias β alvo e assim inibir a associação de outras cadeias β com aquelas cadeias β alvo. Uma aplicação destes compostos é a sua utilização para inibir ou reverter a agregação de proteínas ou péptidos em fibras β insolúveis, ou mais especificamente, inibir ou reverter a associação de cadeias β em folhas β, in vitro ou in vivo. In vitro, por exemplo, podem ser utilizados em combinação com um agente adicional tal como urea, cloreto de guanidínio, ou outro desnaturante 43 para assistir no re-enrolamento de proteínas ou péptidos desnaturados, desenrolados, ou agregados.

De acordo com o presente aspecto da invenção, a proteína ou o péptido desnaturado, desenrolado, ou agregado é sujeito a diálise a partir de uma solução contendo o péptido de acordo com a invenção mais o agente adicional, por exemplo, ou por cromatografia de renaturação proteica através de uma matriz sólida, resina, ou suporte ao qual o péptido está covalentemente ligado, na presença do agente adicional.

Os péptidos são também úteis in vivo ou in vitro para o diagnóstico, estudo, ou tratamento de doenças causadas pela agregação de proteínas ou péptidos em fibras β insolúveis, tais como aquelas listadas na introdução. Para tais aplicações, os compostos são concebidos de modo a que possam penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral, e de modo que sejam resistentes à proteólise catalisada por enzimas; poderá também ser incorporado um grupo rastreável no composto inventado como descrito de modo que possa ser utilizado como uma sonda para o diagnóstico destas doenças.

Os péptidos da invenção poderiam também ser utilizados quer in vitro ou in vivo para inibir a oligomerisação ou associação de sub-unidades proteicas quando isto ocorresse pela associação de cadeias β. Muitas enzimas e outras proteínas são activas apenas como dímeros ou outros oligómeros que são formados a partir de sub-unidades individuais pela associação de cadeias β, e os compostos inventados poderiam ser utilizados para inibir a actividade 44 destas proteínas através da ligação destas cadeias β e impedir assim a sua associação para formar o complexo proteico completo. Por exemplo, a actividade catalítica da HIV protease depende da sua dimerização, que envolve a associação de cadeias β formadas pelas suas secções terminais N e C do péptido. Péptidos pequenos homólogos a estas secções de péptido foram utilizados com sucesso para inibir a dimerisação e portanto a actividade catalítica desta enzima (Babe et al., 1992; Franciskovich et al., 1993; Schramm et al., 1993; Schramm et al., 1996; Schramm et al., 1992; Zutshi et al., 1997). Estes péptidos não são, no entanto, muito solúveis em soluções aquosas e são susceptíveis à degradação por enzimas proteolíticas porque consistem apenas em resíduos dea-L-aminoácidos não substituídos em Na, portanto não são adequados para utilizar como agentes terapêuticos. Os compostos descritos aqui são mais solúveis em soluções aquosas e são resistentes à degradação por enzimas proteolíticas, de modo que são mais adequados para utilizar como agentes terapêuticos. Para uma revisão na utilização de péptidos de 'interface' para inibir a oligomerisação ou associação de sub-unidades proteicas em complexos activos, ver a referência (Zutshi et al., 1998).

Assim a capacidade dos péptidos da invenção inibirem a associação de cadeias β poderá ser utilizada para qualquer aplicação quer in vitro e in vivo. Em adição, a capacidade destes compostos para simplesmente se associarem especificamente a cadeias β alvo poderá também ser utilizada com tal para qualquer aplicação in vitro ou in vivo. Por exemplo, os compostos poderiam ser utilizados como uma sonda rastreável, especialmente como um corante ou 45 indicador histoquímico, para indicar a presença ou a localização de cadeias β, folhas β, ou fibras β in vitro ou in vivo. Em tais aplicações, o composto contém ou está ligado a um átomo ou grupo que contém um núcleo radioactivo ou magneticamente activo, ou um grupo fluorescente, corado, ou outro detectável espectroscopicamente tal como um grupo que contém um electrão desemparelhado e assim actua como um marcador de rotação. Especificamente, um tal composto poderá ser utilizado como um corante ou indicador histoquimico para monitorizar a produção de fibras β insolúveis em pacientes da Doença de Alzheimer e de outras doenças neurodegenerativas causadas pela agregação de proteínas ou péptidos em fibras β insolúveis no cérebro.

Os péptidos de acordo com a invenção poderão estar ligados a uma matriz sólida, resina, ou suporte e utilizados como tal para cromatografia de renaturação proteica como descrito atrás; poderiam também ser utilizados nesta forma para cromatografia de afinidade em que a secção de péptido de formação de cadeia β actua como um isco para capturar as proteínas ou os péptidos que formam a cadeia β alvo. Por exemplo, a secção de péptido de formação de cadeia β concebida para formar uma cadeia β e se associar especificamente como tal à cadeia β alvo formada por uma proteína particular de interesse bioquímico poderia estar ligada a uma matriz sólida, resina, ou suporte para permitir a purificação dessa proteína particular por cromatografia de afinidade: a proteína que contém a cadeia β alvo irá ligar-se à cadeia β formada pela secção de péptido de formação de cadeia β ligada ao suporte sólido, e poderá assim ser separada de outras proteínas que não irão ser reconhecidas pela secção de péptido de 46 formação de cadeia β; a proteína purificada poderá então ser libertada do suporte por adição de uma forma livre da secção de péptido de formação de cadeia β ou alguns outros agentes que quebrem a interacção entre as duas cadeias β, tais como ureia ou alguns outros desnaturantes.

Finalmente, os compostos descritos aqui poderão ser incluídos numa biblioteca combinatorial de tais compostos para classificar um composto particular que seja para ser utilizado para qualquer das aplicações atrás. Esta biblioteca combinatorial poderia ser preparada por qualquer método comum adequado de preparar bibliotecas de péptidos sintéticos (Lebl e Krchnak, 1997), em que os resíduos de α-D-aminoácidos substituídos em Na estão incluídos nos péptidos em posições adequadas de acordo com a presente invenção. A biblioteca resultante é em seguida classificada para péptidos que se ligam a uma cadeia β alvo suficientemente fortemente, ou que inibem suficientemente a actividade de uma proteína oligomérica através do bloqueamento da sua oligomerisação, ou que salva células que de outro modo seriam mortas pela agregação de proteínas ou péptidos em fibras β insolúveis. Os compostos seleccionados poderão ser utilizados directamente em qualquer das aplicações atrás, ou utilizados para conceber bibliotecas combinatoriais de compostos que são ainda mais activos, ou que são mais adequados para utilizar como agentes terapêuticos.

Para utilizar como agentes terapêuticos, os péptidos de acordo com a invenção poderão ser formulados de acordo com práticas estabelecidas. 0 péptido de acordo com te invenção poderá ser administrado de um modo conveniente tal 47 como pelas vias oral, intravenosa (quando solúveis em água), intramuscular, subcutânea, intranasal, intradérmica ou de supositório ou implantando (e.g. utilizando moléculas de libertação retardada).

Dependendo da via de administração, o péptido poderá ser requerido para ser revestido com um material para o proteger da acção de enzimas, ácidos e outras condições naturais que o poderão inactivar.

Para administrar o péptido por outro modo diferente da administração parentérica, poderá ser revestido por, ou administrado com, um material para prevenir a sua inactivação. Por exemplo, o péptido poderá ser administrado num adjuvante, co-administrado com enzimas inibidores ou em liposomas. 0 adjuvante é utilizado no seu senso mais lato e inclui qualquer composto imune estimulante tal como interferon. Os adjuvantes contemplados aqui incluem resorcinois, surfactantes não iónicos tais como éter oleilpolioxietileno e éter n-hexadecilpolietileno. Os inibidores enzimáticos incluem aqueles de tripsina pancreática e outras proteases digestivas.

Os liposomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água assim como liposomas convencionais. 0 composto activo poderá também ser administrado parentericamente ou intraperitonealmente. Podem também ser preparadas dispersões em glicerol, polietiloenoglicóis líquidos, e suas misturas e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenagem e utilização, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos. 48

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a reparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Em todos os casos a forma tem que ser estéril e tem que ser fluida na extensão de que exista capacidade de seringabilidade fácil. Tem que ser estável sob as condições de fabrico e armazenagem e tem que ser preservada da acção contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), suas misturas adequadas, e óleos vegetais. A fluidicidade adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de superfactantes. A prevenção da acção de microorganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida pela utilização nas composições de agentes de retardação da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções estéreis injectáveis são preparadas por incorporação do composto activo na quantidade requerida no solvente adequado com vários dos outros componentes enumerados atrás, como requerido, seguido por esterilização 49 filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do componente activo esterilizado num veiculo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros componentes requeridos daqueles enumerados atrás. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem sob vácuo e a técnica de liofilização que origina um pó do componente activo mais qualquer componente desejado adicional a partir da sua solução filtrada esterilmente previamente.

Quando o péptido é protegido adequadamente como descrito atrás, poderá ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veiculo edível assimilável, ou poderá estar contido em cápsulas de gelatina de parede dura ou mole, ou poderá estar comprimido em comprimidos, ou poderá ser incorporado directamente com os alimentos da dieta. Para administração terapêutica oral, o composto activo poderá ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos ingeriveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e semelhantes. A quantidade de composto activo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que seja obtida uma a dosagem adequada.

Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e semelhantes poderão também conter o seguinte: um aglutinante tal como goma tragacanta, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato de dicálcio; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e poderá ser adicionado um agente adoçante tal como sacarose, lactose ou 50 sacarina ou um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, óleo gaultéria, ou aromatizante de cereja. Quando a forma unitária de dosagem para uma cápsula, poderá conter, em adição aos materiais do tipo atrás, um veiculo liquido.

Poderão estar presentes vários outros materiais como revestimentos ou para modificar de outro modo a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos, as pílulas, ou as cápsulas poderão ser revestidas com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir poderá conter o composto activo, sacarose como um agente adoçante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e um aromatizante tal como aroma de cereja ou laranja. È claro que, qualquer material utilizado na preparação de qualquer forma de unidade de dosagem deverá ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades empregues. Em adição, o composto activo poderá ser incorporado em preparações e formulações de libertação controlada.

Como utilizado aqui "veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção isotónicos e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas activas é bem conhecida na técnica. Desque que como qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o componente activo, é contemplada a sua utilização nas composições terapêuticas. Suplementarmente os componentes activos podem também ser incorporados nas composições. 51 É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma unitária de dosagem para fácil administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem como utilizada aqui refere-se a unidades fisicamente discretas convenientes como dosagens unitárias para os sujeitos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de material activo calculado para produzir os efeitos terapêuticos desejados em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as novas formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas por e directamente dependentes de (a) as características únicas do material activo e os efeitos terapêuticos particulares a serem conseguidos, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição tais como o material activo para o tratamento de doença em sujeitos vivos possuindo um estado doentio no qual a saúde corporal está

Os principais componentes activos são compostos para administração conveniente e efectiva em quantidades efectivas com um veículo farmaceuticamente aceitável adequado na forma unitária de dosagem. No caso de composições contendo componentes activos suplementares, as dosagens são determinadas por referência aos usuais dose e modo de administração dos referidos componentes. A presente invenção providencia a utilização de um péptido de acordo com a invenção para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doença associada à estrutura aberrante de proteína/polipéptido. A natureza aberrante da proteína/polipéptido poderá ser devida ao desenrolamento ou não enrolamento que por sua vez poderá ser devido a uma sequência de aminoácidos anómala e.g. que 52 sofreu mutação. A proteína/polipéptido poderá ser destabilizada ou depositada como placas e.g. na doença de Alzheimer. A doença poderá ser causada por um prião. Um medicamento baseado no polipéptido da invenção iria actuar para re-naturar ou re-solubilisar ou inibir a acumulação de proteínas aberrantes, defeituosas ou depositadas. A invenção é descrita adicionalmente, apenas com o propósito de ilustração, nos exemplos seguintes.

Exemplo 1 A agregação do péptido Αβ de Alzheimer em fibras amilóides é causada pela associação intermolecular do resíduo cinco KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) segmentos de péptido de compreendendo resíduos 16-20 do péptido Αβ (Tjernberg et al., 1997). Um péptido, referido adiante como Péptido X (SEQ. ID. NO. 2), foi portanto construído para se associar fortemente ao motivo KLVFF (SEQ. ID. NO.l), de modo a inibir a agregação do péptido Αβ. A sequência de cadeias laterais no Péptido X é LLLLRR (SEQ. ID. NO. 2), que é altamente homóloga à sequência reversa FFVLK (SEQ. ID. NO. 3), excepto que foi adicionado à terminação C um resíduo adicional possuindo uma cadeia lateral arginina.

As cadeias laterais leucina foram seleccionadas para ocupar o lugar de todas as quatro cadeias laterais hidrofóbicas na sequência FFVLK (SEQ. ID. NO. 3) porque são relativamente flexíveis e podem adaptar a sua conformação para estabelecer interacções hidrofóbicas fortes com as cadeias laterais hidrofóbicas vizinhas de uma cadeia β 53 associada, enquanto que foi escolhida uma cadeia lateral arginina para tomar o lugar da cadeia lateral lisina na sequência FFVLK (SEQ. ID. NO. 3) porque pode formar uma interacção electrostática mais forte com uma das duas cadeias laterais acidicas que se seguem ao segmento causador da agregação KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) da cadeia β alvo. 0 resíduo adicional possuindo uma cadeia lateral de arginina na terminação C do Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) poderá formar outra interacção electrostática forte com a segunda destas duas cadeias laterais acidicas, e deverá assistir adicionalmente o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) a penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral.

Finalmente, o grupo amino terminal N do Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) foi acetilado para maximizar a sua associação ao segmento causador da agregação KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) da cadeia β alvo, e o seu de outro modo grupo carboxilo terminal C carregado negativamente foi sujeito a amidação para melhorar adicionalmente a capacidade do Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral. Deste modo, o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) foi concebido para se associar especificamente como uma cadeia β ao segmento causador da agregação KLVFF (SEQ. ID. NO. 1) da cadeia β alvo formada pelo péptido Αβ de Alzheimer para formar um complexo de folha β paralela, assim impedir estereoquimicamente a agregação do péptido Αβ em fibras β insolúveis. 54 0 Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) é um péptido substituído, de acordo com a presente invenção. A sequência, incluindo os substituintes, é Να-acetil-(D-leucina)- (Να-metil-D-leucina)-(D-leucina)-(Na-metil-D-leucina)- (D-arginina)-(D-arginina)-NH2, ou todos-D-[AcLeu-meLeu-Leu-meLeu-Arg-Arg-NH2. 0 Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) foi sintetizado por síntese de péptido em fase sólida baseada em 9-fluorenilmetoxicarbonil- (Fmoc-) (Fields e Noble, 1990) utilizando o agente de acoplamento l-hidroxi-7- azabenzotriazole (HOAt), que é capaz de se acoplar a resíduos de aminoácidos impedidos estereoquimicamente (Angell et ai., 1994; Carpino et al., 1994). Foi descoberto que o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) é completamente solúvel em soluções aquosas numa grande gama de valores de pH, mesmo a uma concentração de 10 mM (cerca de 10 mg/ml); ainda, excepto para as duas cadeias laterais da arginina carregadas positivamente, é extremamente hidrofóbico e é portanto capaz de penetrar as membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral, especialmente porque tem apenas seis resíduos de aminoácidos no comprimento. As duas cadeias laterais arginina positivamente carregadas assistem o péptido na penetração das membranas celulares e da barreira sanguínea cerebral através do estabelecimento interacções electrostáticas com os grupos fosfato das extremidades carregados negativamente das suas moléculas de fosfolípidos constituintes, resultando na formação de micelas invertidas que transportam as moléculas de péptido através destas membranas. A capacidade do Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) para inibir a agregação de um fragmento de péptido sintético 55 correspondente aos resíduos 11 a 25 do péptido Αβ de Alzheimer nos fibrilos amilóide foi determinada quantitativamente utilizando um ensaio comum baseado na fluorescência dependente de amilóide da tioflavina T a 482 nm (Levine, 1993). 0 Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) foi dissolvido em água até uma concentração de 10 mM (cerca de 10 mg/ml) . O fragmento do péptido Αβ de Alzheimer, a uma concentração de 50 μΜ (cerca de 0,1 mg/ml) em tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 5,0), foi incubado a 25 °C na ausência ou presença de Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) a concentrações variando desde 100 μΜ até 1 mM; a agregação do fragmento de péptido Αβ em fibras β insolúveis nas soluções foi determinada quantitativamente após 20 minutos por medição da fluorescência de 1 μΜ de tioflavina T adicionada a 482 nm utilizando um comprimento de onda de excitação de 440 nm. Alíquotas de 5 ml destas soluções foram seguidamente analisadas por microscopia electrónica para confirmar que esse Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) tinha inibido e/ou revertido a agregação do fragmento de péptido Αβ de Alzheimer em fibras β insolúveis.

De acordo com este ensaio, a agregação do fragmento de péptido Αβ em fibrilos amilóides foi inibida em mais de 60 % na presença de Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) 200 μΜ (ver Fig. 5). Resultados semelhantes foram obtidos quando o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) foi adicionado ao fragmento de péptido Αβ após incubação, mostrando que o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) é capaz de desagregar fibrilos amilóides pré-formados. A análise do fragmento de péptido Αβ incubado com e sem Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) 500 mM por microscopia 56 electrónica confirmou que o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) inibiu quase completamente a agregação do fragmento de péptido Αβ nos fibrilos amilóides (ver Figs. 6 e 7) .

As figuras 3 e 4 mostram como o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) forma uma cadeia β (X) e se associa como tal a uma extremidade de uma cadeia β alvo (Y) formada por um segmento do péptido Αβ ou algumas outras moléculas baseadas em péptidos em qualquer orientação para formar um complexo de folha β de duas cadeias paralelas (Fig. 3) ou anti-paralelas (Fig. 4), impedindo assim estereoquimicamente a associação de outras cadeias β com essa extremidade da cadeia β alvo. 0 comprimento total do Péptido X (SEQ. ID. NO.2) é capaz de formar uma cadeia β porque consiste apenas de resíduos de α-D-aminoácidos que permitem estereoquimicamente que o faça: são todos capazes de adoptar os ângulos respectivos fi e psi requeridos para formar uma cadeia β. Adicionalmente, as restrições estereoquímicas impostas pelos grupos Να-metilo dos dois resíduos Na-metil-a-D-aminoácido (resíduos 2 e 4) servem para encorajar o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) a formar uma cadeia β. Quando o Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) forma uma cadeia β, estes dois grupos Να-metilo estão ao longo da mesma extremidade da cadeia β, como ilustrado quer na Figura 3 ou na Figura 4, porque são um número par de resíduos (neste caso dois resíduos) separados um do outro e a unidade de repetição de uma cadeia β é dois resíduos. Esta extremidade da cadeia β formada pelo Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) é impedida estereoquimicamente por estes dois 57 grupos Να-metilo de se associar a outra cadeia β. A outra extremidade da cadeia β formada pelo Péptido X (SEQ. ID. NO. 2), no entanto, permanece livre para o fazer, e pode associar-se quer na orientação paralela ou anti-paralela com a extremidade livre de uma cadeia β alvo formada por um segmento do péptido Αβ ou alguma outra molécula de proteína ou péptido para formar um complexo de folha β de duas cadeias paralelas (Fig. 3) ou anti-paralelas (Fig. 4), impedindo assim estereoquimicamente a associação de outras cadeias β com aquela extremidade da cadeia β alvo, e prevenindo assim a formação de folhas β estendidas e a deposição de fibras β insolúveis patogénicas. Esta associação da cadeia β formada pelo Péptido X (SEQ. ID. NO. 2) à cadeia β alvo é feita por ligações de hidrogénio entre os grupos peptídicos das suas estruturas de base e interacções não covalentes adicionais entre as suas cadeias laterais.

REFERÊNCIAS

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LISTAGEM DA SEQUÊNCIA

<110> STOTT, KELVIN

<120> PÉPTIDOS

<130> 42197PCT <140> <141> <150> GB 9917725.5 <151> 1999-07-28 < 16 0 > 3 <170> Patentln Ver. 2.1

< 210 > 1 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: RESÍDUOS 16 A 20 DE PÉPTIDO A-BETA HUMANO <4 0 0> 1

Lys Leu Vai Phe Phe 1 5

< 210 > 2 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223>Descrição da Sequência Artificial: PÉPTIDO ARTIFICIAL ASSOCIADO FORTEMENTE À SEQUÊNCIA DA SEQ ID NO 1 <400> 2

Leu Leu Leu Arg Arg 1 5 <210>3 <211>5

<212>PRT <213>Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: REVERSÃO DA SEQUÊNCIA DO PÉPTIDO DE SEQ ID NO 1 71 <4Q0> 3

Phe Phê Vai Leu Lys 1 5

LISTAGEM DA SEQUENCIA

<110> STOTT, KELVIN <120> PÉPTIDOS <130> 42197PCT <140> 1 <150> GB 9917725.5 <151> 1999-07-28 < 16 0 > 3

<170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: RESÍDUOS 15 A 20 DE PÉPTIDO A-BETA HUMANO <400> 1

Lys Leu Vai Phe Phe 1 5

<210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: PÉPTIDO ARTIFICIAL ASSOCIADO FORTEMENTE À SEQUÊNCIA DA SEQ ID NO 1 <220> <221> MOD_RES <222> 2 <223> METILAÇÃO <220> <221> MOD_RES <222> 4

<223> METILAÇÃO <220> 72 <223> todos os resíduos de aminoácidos são enantiómeros D <400> 2

Leu Leu Leu Leu Arg Arg 1 6

<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: REVERSÃO DA SEQUÊNCIA DO PÉPTIDO DE SEQ ID NO 1 <400> 3

Phe Phe Vai Leu Lys 1 5

Lisboa 27 de Abril de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto químico ou composição compreendendo um péptido, em que (a) o referido péptido compreende uma secção do péptido de formação de cadeia β compreendendo uma sequência de pelo menos quatro resíduos de α-D-aminoácidos consecutivos, todos os quais permitem estereoquimicamente a secção de péptido de formação de cadeia β para formar uma cadeia β; (b) cada um dos resíduos de α-D-aminoácidos consecutivos na secção do péptido de formação de cadeia β possui uma cadeia lateral; (c) a referida secção de péptido de formação de cadeia β forma uma cadeia β possuindo uma estrutura de base de péptido que toma a forma de uma tira estendida possuindo duas extremidades, uma primeira extremidade e uma segunda extremidade, tal que os componentes NH e CO dos grupos péptidos da estrutura de base se encontrem ao longo das duas extremidades da tira, e em que a primeira extremidade se associa a uma cadeia β alvo formada por uma molécula contendo péptido separada e as cadeias laterais dos resíduos de α-D-aminoácidos consecutivos são capazes de formar interacções não covalentes favoráveis com cadeias laterais da vizinhança da cadeia β alvo formada pela molécula contendo péptido separada; (d) pelo menos um dos resíduos de a-D-aminoácidos consecutivos da estrutura base de péptido da cadeia β é substituído em Na, tal que o(s) substituinte (s) Na fiquem apenas ao longo da referida segunda extremidade e impeça(m) 2 estereoquimicamente a associação da segunda extremidade com outra cadeia β; e (e) quaisquer dois resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na sucessivos da estrutura base de péptido da cadeia β estão separados por um número ímpar de resíduos de α-D-aminoácidos não substituídos em Να-consecutivos.

2. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que dois resíduos de aminoácidos substituídos em Na sucessivos na secção de péptido de formação de cadeia β são separados por não mais de 3 resíduos de aminoácidos não substituídos em Na consecutivos.

3. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que resíduos de a-D-aminoácidos substituídos em Na sucessivos Na na secção de péptido de formação de cadeia β estão separados um do outro por resíduos de α-D-aminoácidos não substituídos em Na únicos, tais que uma secção de péptido de formação de -cadeia β compreenda uma sequência alternante de resíduos de α-D-aminoácidos substituídos em Na e não substituídos em Na.

4. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o substituinte em Na de cada resíduo de α-D-aminoácidos substituído em Na na secção de péptido de formação de cadeia β permite ou promove estereoquimicamente que a secção de péptido de formação de cadeia β forme uma cadeia β, e impede 3 estereoquimicamente a associação da referida segunda extremidade dessa cadeia β a outra cadeia β.

5. Um composto quimico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o substituinte em Na de cada residuo de α-D-aminoácidos substituído em Na na secção de péptido de formação de cadeia β é seleccionado do grupo constituído por: um átomo de flúor ou um grupo OH; um grupo que está ligado ao átomo Na por um átomo de oxigénio dele; um grupo que está ligado ao átomo Na por um subgrupo CH2 dele; um grupo metilo ou etilo, ou algum outro grupo alquilo ou alifático; um grupo benzilo substituído ou não substituído, ou algum outro grupo arilmetilo; um grupo acetilado ou 2-hidroxi-4-metoxibenzilo acilado (AcHmb); e um grupo 2-hidroxibenzilo acilado ou não acilado (AcHb/Hb).

6. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a cadeia lateral de cada resíduo de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β permite ou promove que a secção de péptido de formação de cadeia β forme uma cadeia β.

7. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β é esse de um resíduo de 4 aminoácido possuindo uma propensidade de folha β superior a 1,00.

8. Um composto químico ou composição de acordo com a reivindicação 6, em que a cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β é seleccionado a partir do grupo constituído por: um átomo ou grupo que permite ou promove que a secção de péptido de formação de cadeia β se associe como uma cadeia β à cadeia β alvo e forme assim um complexo de folha β estável; e um átomo ou grupo que forma uma interacção hidrofóbica ou electrostática, ligação de hidrogénio, ou outra interacção não covalente favorável com a cadeia lateral vizinha da - cadeia β alvo num complexo de folha β compreendendo a - cadeia β alvo e a secção de péptido de formação de cadeia β·

9. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma da reivindicação 6, em que a cadeia lateral de qualquer um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β é seleccionada a partir do grupo constituído por: um grupo hidrofóbico, ou um grupo que possua uma porção hidrofóbica considerável; um grupo alquilo ou alifático ramificado ou não ramificado; um grupo que é ramificado no seu átomo de carbono β de ligação; um grupo aromático; 5 um grupo acídico ou básico; e um grupo contendo amida ou hidroxilo.

10. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β impede a empilhagem de folhas β.

11. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β se extende para além das cadeias laterais vizinhas na cadeia β.

12. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que te cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β permite que o composto ou composição seja rastreado ou detectado.

13. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β é seleccionada a partir do grupo constituído por: um átomo ou grupo que contenha um núcleo radioactivo ou magneticamente activo; esse de fenilalanina ou tirosina com um ou mais iodos radioactivos ou magneticamente activos ou outros átomos de halogéneo substituídos no anel aromático; 6 um grupo fluorescente, corado, ou outro detectável espectroscopicamente; um grupo que contenha um electrão desemparelhado e portanto actue como um marcador de rotação; e um grupo que contenha o grupo 2,2,5,5-tetrametil-l-pirrolidiniloxi (PROXYL) ou o grupo 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxi (TEMPO).

14. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a cadeia lateral de um ou mais resíduos de α-D-aminoácidos na secção de péptido de formação de cadeia β é seleccionada a partir do grupo consistindo de cadeia lateral de: qualquer α-L-aminoácido ocorrendo naturalmente ou seu derivado sintético; glicina; alanina; serina; cisteína; treonina; valina; leucina; isoleucina; metionina; fenilalanina; tirosina; triptofano; glutamina; asparagina; glutamato; aspartato; histidina; lisina; arginina; e tert-leucina ou β-hidroxivalina.

15. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente em que a cadeia β alvo é formada pelo péptido Αβ de Alzheimer, e a secção de péptido de formação de cadeia β se liga especificamente como uma -cadeia β a parte ou a toda a sequência KLVFFAE da cadeia β alvo na orientação paralela, formando assim um complexo de folha β paralela em que os resíduos consecutivos da secção de péptido de formação de cadeia β ficam diagonalmente opostos aos resíduos consecutivos da sequência KLVFFAE na mesma ordem. 7

16. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 em que a cadeia β alvo é formada pelo péptido Αβ de Alzheimer, e a secção de péptido de formação de cadeia β se liga especificamente como uma cadeia β a parte ou a toda a sequência KLVFFAE da cadeia β alvo na orientação anti-paralela, formando assim um complexo de folha β anti-paralela em que os resíduos consecutivos da secção de péptido de formação de cadeia β ficam diagonalmente opostos aos resíduos consecutivos da sequência KLVFFAE na ordem reversa.

17. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a secção de péptido de formação de cadeia β é precedida por, seguida por, ou de outro modo ligada a uma secção de péptido penetrante de membrana distinta que permite que a secção de péptido de formação de cadeia β atravesse barreiras biológicas tais como membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral.

18. Um composto químico ou composição de acordo com a reivindicação 17 em que a cadeia lateral de cada resíduo na secção de péptido penetrante de membrana é seleccionada a partir do grupo constituído por: um grupo básico ou hidrofóbico; e uma cadeia lateral de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, histidina, lisina, ou arginina.

19. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a secção de 8 péptido de formação de cadeia β possui uma terminação N livre ou acilada e uma terminação C livre, amidada, ou esterificada, ou forma parte de um péptido maior que possua uma terminação N livre ou acilada e uma terminação C livre, amidada, ou esterificada.

20. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a secção de péptido de formação de cadeia β está ligada a outro componente funcional.

21. Um composto químico ou composição de acordo com a reivindicação 20, em que o componente funcional é seleccionado do grupo constituído por: um componente que fortaleça a ligação da secção de péptido de formação de cadeia β com a cadeia β alvo; um componente que fortaleça a especificidade da associação da secção de péptido de formação de cadeia β à cadeia β alvo; um componente que permita que a secção de péptido de formação de cadeia β atravesse barreiras biológicas tais como membranas celulares e a barreira sanguínea cerebral; um componente que cause que o composto/composição atinja órgãos, células, ou moléculas específicos; um componente que permita que o composto/composição seja rastreado ou detectado; um átomo ou grupo que contenha um núcleo radioactivo ou magneticamente activo; um grupo fluorescente, corado, ou outro detectável espectroscopicamente; um grupo que contenha um electrão desemparelhado e portanto actue como um marcador de rotação; 9 um grupo que contenha o grupo 2,2,5,5-tetrametil-l-pirrolidiniloxi (PROXYL) ou o grupo 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxi (TEMPO); uma matriz sólida, resina, ou suporte; uma enzima, hormona, anticorpo, factor de transcrição, ou outra molécula proteica; um grupo que se ligue especificamente a uma proteína particular; e uma molécula citotóxica.

22. A químico composto ou composição de acordo com a reivindicação 20 ou com a reivindicação 21, em que a ligação da secção de péptido de formação de cadeia β ao componente funcional é por meio de uma ligação amida ou éster formada com o grupo carboxilo terminal C ou com o grupo amino terminal N do péptido completo, ou com um grupo carboxilo, amino, ou hidroxilo da cadeia lateral do péptido completo, ou por meio de uma ponte dissulfureto formada com um grupo tiol da cadeia lateral do péptido completo.

23. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a secção de péptido de formação de cadeia β compreende entre 5 e 10 resíduos de aminoácidos e/ou inclui a sequência de cadeias laterais que é homóloga a ou idêntica à sequência de aminoácidos FFVLK (SEQ. ID. NO. 3).

24. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a secção de péptido de formação de cadeia β se associa à cadeia β alvo compreendendo a sequência de aminoácido KLVFF (SEQ. ID. NO. D · 10

25. Um composto químico ou composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que um ou mais grupos do péptido da estrutura de base (CONH) da secção de péptido de formação de cadeia β é/são substituídos por um dos seguintes grupos: CSNH (tioamida); COO (éster); CSO, COS, CSS (tioéster); COCH2 (cetona); CSCH2 (tiocetona); S02NH (sulfonamida); SOCH2 (sulfóxido); S02CH2 (sulfona); S020 (sulfonato) e/ou em que um ou mais grupos do péptido substituído em N de estrutura de base da secção de péptido de formação de cadeia β é/são substituídos em N ou em C por um dos grupos seguintes: CSNH (tioamida); COCH2 (cetona); CSCH2 (tiocetona); S02NH (sulfonamida); SOCH2 (sulfóxido); S02CH2 (sulfona) .

26. A utilização de um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 no fabrico de um medicamento para inibir ou reverter a associação de uma cadeia β alvo numa folha β ou fibra β.

27. A utilização de um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 no fabrico de um medicamento para inibir ou reverter a agregação de proteínas ou péptidos.

28. A utilização de um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 no fabrico de um medicamento para assistir no re-enrolamento de proteínas ou péptidos desnaturados ou agregados.

29. A utilização de um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 na 11 preparação de uma composição para o diagnóstico, estudo, ou tratamento de uma doença causada pela agregação de proteínas ou péptidos.

30. A utilização de um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 no fabrico de um medicamento para inibir a oligomerisaçâo ou associação de sub-unidades proteicas.

31. Um método para indicar a presença ou localização de cadeias β, folhas β, ou fibras β, compreendendo a exposição de uma amostra teste a um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 que compreende uma unidade detectável.

32. A utilização de um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 que compreende uma unidade detectável, no fabrico de um agente para indicar a presença ou localização de cadeias β, folhas β, ou fibras β.

33. Um método para cromatografia por afinidade ou renaturação proteica, compreendendo os passos de ligar covalentemente um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25 a uma matriz sólida, resina, ou suporte; passando a amostra teste na coluna; e separando o produto tratado desejado da coluna.

34. Uma biblioteca combinatorial compreendendo compostos químicos ou composições de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25. 12

35. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto químico ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

36. A utilização da reivindicação 29, em que a doença é seleccionada a partir das seguintes: doença de Alzheimer (AD); doença de Parkinson (PD); demência; Demência com Corpos de Lewy (DLB); encefalopatias relacionadas com prião; encefalopatia espongiforme bovina (BSE); doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD); kuru; doenças neurodegenerativas dominantemente hereditárias; doença de Huntington (HD) , atrofia muscular bulbo-espinal ligada ao cromossoma X (SBMA) , atrofia dentatorubral-pallidoluysian (DRPLA); ataxia espinocerebral; diabetes mellitus tipo II; polineuropatia amilóide familiar; amiloidose sistémica senil; e amiloidose relacionada com diálise. Lisboa, 27 de Abril de 2007