ES2278605T3 - Peptidos y ensayos para el diagnostico de la enfermedad de lyme y composiciones utiles para su prevencion. - Google Patents

Abstract

Un péptido, aislado a partir de material celular con el cual está naturalmente asociado o producido recombinantemente o por la síntesis química, cuyo péptido es tanto: (a) un péptido seleccionado a partir de: (b) un análogo de (a) que tiene sustituciones conservadoras en hasta cuatro aminoácidos; (c) un homólogo de (a) con una identidad de al menos el 90 % de ello; y/o (d) un fragmento de (a), (b) o (c) que comprende al menos 8 aminoácidos en longitud, siendo dicho péptido capaz de unirse a un fluido biológico de un paciente con anticuerpos de la enfermedad de Lyme.

Description

Péptidos y ensayos para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme y composiciones útiles para su prevención.

Esta invención fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud con los Números de Subvención ROAI35027 y RR00164. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de composiciones diagnósticas y métodos útiles en el diagnóstico de la borreliosis de Lyme.

Antecedentes de la invención

La bacteria Borreha burgdorferi (sensu lato) es el agente causante de la borreliosis de Lyme, es decir, la enfermedad de Lyme. Esta enfermedad es transmitida por la picadura de varias especies de la garrapata Ixodes que lleva la espiroqueta. La fuente principal de la infección en los Estados Unidos es el ratón de patas blancas, Peromyscus leticopus, y la infección puede ser transmitida a muchas especies de mamíferos incluyendo perros, gatos, y seres humanos [J. G. Donahue et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 36: 92-96 (1987); R. T. Green et al., J. Clin. Micro., 26: 648-653 (1988)]. A pesar de la presencia de una respuesta inmune activa, la enfermedad persiste durante años en los pacientes. Tal persistencia se postula que es el resultado, al menos en parte, de una variación antigénica en las proteínas bacterianas [J. R. Zhang et al., Cell, 89: 275-285 (1997)].

Un número de proteínas de Bornelia burgdorferi y polipéptidos han sido descritos en la bibliografía. Tales proteínas y polipéptidos incluyen proteínas A y B de superficie (OspA y OspB), flagelina, y otras proteínas denominadas P21, P39, P66, y P83 de acuerdo con sus pesos moleculares estimados [A. G. Barbour et al., Infect. Immun., 45: 94-100 (1984). W. J. Simpson et al., J. Clin. Microbiol., 28: 1329-1337 (1990); K. Hansen et al., Infect. Immun., 56: 2047-2053 (1988); K. Hansen et al., Infect. J. Clin. Microbiol., 26: 338-346 (1988); B. Wilske et al., Zentral. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionshkr. Hvg. Abt. I Orig. Reihe. A., 263: 92-102 (1986); D. W. Dorward et al., J. Clin. Microbiol., 29: 1162-1170 (1991); solicitud de patente de EE.UU. NTIS publicada Nº. 465.204 (US-A-5217872), solicitud de patente europea Nº. 465.204 publicada el 8 de enero de 1992; solicitud de patente internacional Nº. PCT/US91/01500 (WO91/13630), publicada el 19 de septiembre de 1991; solicitud de patente internacional Nº. PCT/EP90/02282, (WO91/09870), publicada el 11 de julio de 1991; solicitud de patente internacional Nº. PCT/DK89/00248, (documento WO90/04411), publicada el 3 de mayo de 1990; solicitud de patente internacional Nº. WO92/00055, publicada el 9 de enero de 1992. El documento WO99/00413, publicado el 7 de enero de 1999 describe un antígeno de B. burgdorferi que tiene una masa molecular relativa de 39,5 kDa.

Sin embargo, el diagnóstico de la enfermedad de Lyme en seres humanos y animales ha estado comprometido por la carencia de ensayos serológicos definitivos que conduzcan a ensayos rápidos y exactos. Los ensayos diagnósticos actuales carecen de una alta sensibilidad y especificidad, como se ilustra en una revisión reciente del funcionamiento de laboratorios diagnósticos publicada por el laboratorio "Wisconsin State Laboratory of Hygiene" [L. Bakken et al., J. Clin. Microbiol., 35: 537 (1997)].

Hay así una necesidad en la técnica de una composición diagnóstica simple, sensible y específica y un método para una rápida detección de la enfermedad de Lyme.

Sumario de la invención

La presente invención satisface la necesidad en la técnica proporcionando métodos y composiciones que permiten la rápida y exacta detección de la enfermedad de Lyme. Los métodos y las composiciones de la invención evitan ventajosamente la reactividad no específica serológica con otras condiciones, incluyendo la sífilis, la artritis crónica, y la esclerosis múltiple, con las cuales se requiere un diagnóstico diferencial usando los métodos de la técnica anterior.

Conforme a la presente invención, se proporciona un péptido, aislado a partir del material celular con el cual está asociado naturalmente o producido recombinantemente o por síntesis química, cuyo péptido es tanto:

(a)

el péptido seleccionado a partir de:

\hskip0.7cm

1

(b)

un análogo de (a) que tiene sustituciones conservadoras en hasta cuatro aminoácidos;

(c)

un homólogo de (a) con una identidad de al menos el 90% de ello; o

(d)

un fragmento de (a), (b) o (c) que comprende al menos 8 aminoácidos de longitud,

siendo dicho péptido capaz de unirse en un fluido biológico de un paciente a anticuerpos de la enfermedad de Lyme.

En un aspecto, la invención proporciona un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos MKKDDQIAAAMV
LRGMAKDGQFALKD [SEQ ID NO. 1], llamado en este documento IR_{6}, que es una región invariable que es inmunodominante en pacientes mamíferos de la enfermedad de Lyme.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína artificial que contiene la secuencia de aminoácidos de IR_{6} o un análogo, homólogo o su fragmento. En una realización, esta proteína puede ser una proteína de fusión que contiene IR_{6} o su fragmento y una pareja de fusión. En una realización particularmente deseable, la proteína de fusión contiene un fragmento de IR_{6} correspondiente a un epítopo de células T, en el que el epítopo de células T esta fusionado a una de las otras cinco regiones invariables identificadas en este documento (IR_{1}-IR_{5}).

En otra realización deseable, la proteína artificial contiene la secuencia de aminoácidos de IR_{6} con un aminoácido del extremo N-terminal adecuado para la biotinilación.

En otro aspecto más, la invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido IR_{6} o una proteína de la invención. En otro aspecto más, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en el control de secuencias reguladoras adecuadas. En un aspecto más, la invención proporciona una célula huésped transformada con el vector de la invención.

En todavía un aspecto más, la presente invención proporciona un reactivo diagnóstico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la invención y un marcador detectable que está asociado con dicha secuencia.

En aún un aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo aislado que es específico para el péptido IR_{6} de la invención o su fragmento. En todavía un aspecto más, la invención proporciona un reactivo diagnóstico que comprende el anticuerpo de la invención.

En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo anti-idiotipo específico para el anticuerpo anti-IR_{6} de la invención y un reactivo diagnóstico que contiene el anticuerpo anti-idiotipo con un marcador detectable unido a ello.

En aún un aspecto más, la invención proporciona un método para diagnosticar la enfermedad de Lyme en un mamífero. Este método incluye las etapas de incubar un antígeno o anticuerpo de esta invención, preferiblemente marcado de manera convencional para la detección, con una muestra de fluidos biológicos de un ser humano o un animal para ser diagnosticado. En presencia de la infección por B. burgdorferi del paciente humano o veterinario, se forma un complejo antígeno-anticuerpo. Posteriormente la mezcla de reacción es analizada para determinar la presencia o la ausencia de estos complejos antígeno-anticuerpo. En una realización más, el ensayo diagnóstico emplea secuencias de ADN, preferiblemente secuencias antisentido, del antígeno o sus fragmentos, y diagnostica la infección por la presencia de secuencias en un fluido biológico del paciente que se hibrida a ello. Otros formatos de ensayo convencionales pueden ser empleados usando reactivos identificados por esta invención.

En otro aspecto la invención proporciona un kit para diagnosticar la infección con B. burgdorferi en una muestra de paciente humano o veterinario que contiene al menos un anticuerpo capaz de unirse al menos a un antígeno de esta invención de su(s) fragmento(s) antigénico(s), o una secuencia de ADN que codifica uno o vario(s) antígeno(s) de esta invención o su secuencia antisentido. Opcionalmente se pueden marcar los anticuerpos y las secuencias para la detección, o puede ser incluido en el kit un sistema de detección.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición terapéutica y métodos para tratar a seres humanos y/o animales con la enfermedad de Lyme. La composición terapéutica contiene un anticuerpo, o proteína, o fragmento como se describe anteriormente y un vehículo farmacéutico adecuado.

En un aspecto más, la invención proporciona composiciones de vacuna y métodos para vacunar a un paciente humano o animal contra la enfermedad de Lyme por el uso de estas composiciones anteriormente descritas. La composición de vacuna puede contener la proteína IR_{6}, sus fragmentos, proteínas de fusión o mezclas de proteínas como se describe anteriormente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más preferiblemente, las composiciones de vacuna contienen proteínas de fusión compuestas de IR_{6}, o su fragmento correspondiente a un epítopo de células T, fusionado a una pareja tal como IR_{1}-IR_{5}.

En aún un aspecto más, la invención proporciona composiciones de vacuna y métodos para vacunar a un paciente humano o animal contra la enfermedad de Lyme por el uso de composiciones de ácidos nucleicos, por ejemplo, vacunas de ADN. Las composiciones contienen una cantidad eficaz de una secuencia de ADN que codifica al menos un péptido IR_{1-5} o IR_{6} o proteína de esta invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención son descritos además en la siguiente descripción detallada de sus realizaciones preferidas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra una respuesta de anticuerpo frente a P7-1 en monos. Fueron recogidas en serie muestras de suero de dos macacos rhesus que fueron infectados por espiroquetas de la cepa JD1 de B. burgdorferi (J831 y L131) y dos que fueron infectados con la cepa B31 (L457 y M021). El nivel de anticuerpos (Ab) fue medido por ELISA usando P7-1 como antígeno (Ag). La línea de fondo representa la densidad óptica (OD) del ELISA promedio de muestras de suero recogidas de todos los animales antes de la infección más 3 desviaciones típicas (DT).

La figura 2 proporciona una comparación entre las secuencias de aminoácidos deducidas de P7-1 (SEQ ID NO. 9) y segmentos del casete de VIsE de cepas B31 (SEQ ID NO. 11) y 297 (SEQ ID NO. 10) de B. burgdorferi. El segmento del casete de B31 está limitado entre la secuencia de repetición EGATKG [SEQ ID NO. 2], subrayada de forma sencilla. Las regiones variables (VR_{I-VI}) están doblemente subrayadas y las regiones invariables (IR_{l-6}) están sombreadas. La alineación de la secuencia fue obtenida con el algoritmo pam250 (Compañía Eastman Kodak, New Haven, CT). Los aminoácidos idénticos son indicados con asteriscos y los huecos de la secuencia con rayas; se muestran los restos no idénticos como letras según el código de letras simple.

Las figuras 3A y 3B son los diagramas de barras que ilustran la antigenicidad de IR_{6} en monos (A) y ratones (B). Fueron recogidas muestras de suero de monos o ratones a 0 (pre) y 4-6 semanas después de la infección (PI; post). Los animales fueron infectados con la cepa JD1 de B. burgdorferi (monos J200, J415, J748, J831, K205 y L131), la cepa B31 (monos L457, L549, M021 y M581; ratones 184, 191, 194 y 196), o la cepa Sh-2-82 (ratones 219, 220, 224, 288, 289 y 290). Fueron evaluados los niveles de anticuerpo por el ELISA C_{6}.

Las figuras 4A y 4B son gráficos que ilustran el inmunodominio de IR_{6} en monos y seres humanos. Las muestras de suero fueron obtenidas a partir de monos (A) inoculados 4-6 semanas después de la infección con espiroquetas de la cepa JD1 de B. burgdorferi (J831 y L131) o la cepa B31 (L457 y M021), y de seres humanos (B) con una infección aguda de B. burgdorferi (91-1222 y 91-1348) o una infección crónica (91-0532 y 91-0533). Fueron evaluados los niveles de anticuerpo frente a P7-1 en presencia de concentraciones crecientes del péptido C_{6} según el procedimiento de ELISA competitivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención satisface la necesidad en la técnica proporcionando métodos y composiciones que permiten la detección rápida y exacta de la enfermedad Lyme en seres humanos. Los métodos y las composiciones de la invención evitan ventajosamente la reactividad no específica serológica con otras condiciones, incluyendo la sífilis, la artritis crónica, y la esclerosis múltiple, de las cuales se requiere un diagnóstico diferencial usando los métodos de la técnica anterior. La invención es también útil en la detección de la enfermedad de Lyme en mamíferos no humanos, incluyendo perros, caballos, y vacas, entre otros.

En una realización actualmente preferida, la invención proporciona un ELISA basado en péptido, que en términos de simplicidad, especificidad y sensibilidad, es superior a métodos diagnósticos serológicos actuales para la enfermedad de Lyme. Además, el ELISA de la invención es también útil en las muestras de suero que contienen anticuerpos anti-OspA, permitiendo el diagnóstico de la enfermedad de Lyme en mamíferos que han sido expuestos (naturalmente o por vacunación) a B. burgdorferi, el agente causante de la enfermedad de Lyme.

Los métodos y las composiciones de la invención utilizan un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALKD [SEQ ID NO. 1], que proporciona la especificidad para la enfermedad de Lyme que es una ventaja de la invención. También se proporcionan según la presente invención proteínas que contienen este péptido, así como anticuerpos dirigidos hacia éste y secuencias de ácidos nucleicos que codifican estos péptidos y/o proteínas para uso en composiciones diagnósticas, terapéuticas y profilácticas y métodos para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Lyme. La invención proporciona ventajas sobre el uso de otras proteínas de Borrelia y anticuerpos en composiciones conocidas y métodos para este objetivo.

1. Los péptidos de la región invariable, las proteínas y los ácidos nucleicos de la invención

La presente invención se refiere a seis péptidos antigénicos que corresponden a regiones invariables (IR_{1-6}), encontradas dentro del dominio variable del antígeno superficie de variable de B. burgdorferi (VIsE). Estos IR_{s} son conservados entre cepas y genoespecies del complejo de B. burgdorferi sensu lato. Sorprendentemente, a diferencia de las regiones variables de diversas otras proteínas principales, que no son antigénicas en infecciones naturales, la más conservada de IR_{S}, IR_{6}, es inmunodominante en pacientes con la enfermedad de Lyme y en animales infectados con B. burgdorferi. IR_{6} está expuesto en la superficie de VIsE, como se evalúa por los experimentos de inmunoprecipitación, pero es inaccesible al anticuerpo en la membrana externa de la espiroqueta, como se demuestra por ensayos de inmunofluorescencia y bactericidas in vitro.

Así, la presente invención proporciona seis nuevos péptidos y sus fragmentos que pueden ser usados en una variedad de ensayos diagnósticos y composiciones. De estos péptidos, el péptido IR_{6} y las proteínas que contienen este péptido o sus fragmentos se ajustan particularmente bien para uso en el diagnóstico específico de la enfermedad de Lyme. Los péptidos IR_{1-5} también pueden ser usados para tal objetivo. Los péptidos IR_{1-5} descritos en este documento y las proteínas que contienen uno o varios de estos péptidos o sus fragmentos se ajustan particularmente bien para uso en composiciones terapéuticas y farmacéuticas para el tratamiento de la enfermedad de Lyme. IR_{6} también puede ser usado para tales fines.

A. Secuencias de la proteína y del péptido

Por conveniencia en todas partes de esta memoria descriptiva, se hace referencia a "péptidos IR_{1-5} o IR_{6} y proteínas", pero será entendido que esta expresión abarca los fragmentos, análogos, péptidos modificados y proteínas, proteínas de fusión, y otras construcciones de aminoácidos de la invención, excepto cuando se especifique de otra manera.

En un aspecto, la invención proporciona nuevos péptidos que tienen las secuencias de amino proporcionadas más abajo, utilizando los códigos de aminoácidos de letras simples estándar.

2

Estos antígenos de péptido pueden ser aislados en una forma sustancialmente libre de otros materiales proteicos y no proteicos del microorganismo y el vector de la garrapata. Los antígenos pueden ser aislados de la espiroqueta y pueden ser además purificados usando cualquiera de una variedad de métodos convencionales incluyendo: cromatografía líquida tal como de fase normal o invertida, usando HPLC, FPLC y similares; cromatografía de afinidad (tal como con ligandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales); cromatografía de exclusión por tamaños; cromatografía de quelato metálico inmovilizado; electroforesis de gel; y otros similares. Cualquier experto en la técnica puede seleccionar las técnicas de purificación y aislamiento apropiadas principales y sin separarse del alcance de esta invención.

De forma alternativa, pueden ser producidos recombinantemente los péptidos y las proteínas de la invención, descritos más abajo, siguiendo las técnicas de ingeniería genética convencionales [véase, por ejemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York y la descripción detallada para preparar las proteínas de más abajo]. En todavía otra alternativa, los péptidos y las proteínas de la invención pueden ser producidos usando técnicas de síntesis química convencionales, como las descritas en G. Barony y R. B. Merrifield, "The Peptides: Analysis, Synthesis & Biology", Academic Press, págs. 3-285 (1980), entre otros. El término "artificial" se usa en este documento para referirse a la preparación de la construcción (por ejemplo, un péptido, una proteína, un ácido nucleico, o un anticuerpo de la invención) por síntesis química, tecnología recombinante, u otro medio similar.

La presente invención además proporciona análogos, fragmentos, y péptidos del mutante, así como proteínas que contienen uno o varios de IR_{1-6}, o tales análogos, fragmentos o mutantes, como se describe más abajo.

i. Análogos y péptido modificado y antígenos de proteína

Se proporcionan análogos o versiones modificadas de los péptidos IR_{1-6}. Típicamente los análogos se diferencian de las proteínas específicamente identificadas por sólo uno a cuatro cambios de codon. Los ejemplos incluyen polipéptidos con variaciones de aminoácidos menores de la secuencia de aminoácidos parcial ilustrada de, por ejemplo, IR_{2} que tiene sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las sustituciones conservadoras son las que ocurren dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por sus cadenas laterales y propiedades químicas. También se proporcionan los homólogos de las proteínas de la invención que están caracterizados por tener una identidad de al menos el 90%, y una identidad más preferiblemente del 95-99% con las secuencias IR_{1} de las proteínas tipo vls. Basado en la información de la secuencia proporcionada en este documento, cualquier experto en la técnica puede obtener fácilmente homólogos de cadena entera y análogos.

Como se sabe en la técnica, "homología" o "identidad" significa el grado de relación de la secuencia entre dos péptidos o dos secuencias de nucleótidos como se determina por la coincidencia en la identidad entre dos longitudes de tales secuencias. Tanto la identidad como la homología pueden ser calculadas fácilmente por métodos existentes en la técnica anterior [Véase, por ejemplo, COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, (1988); BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTEI, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., ed., Humana Press, Nueva Yersey, (1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, (1987); y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. y Devereux, J., ed., M Stockton Prensa, Nueva York, (1991)]. Aunque existen diversos métodos para medir la identidad y la homología entre dos secuencias de nucleótidos, los términos "identidad", "semejanza" y homología son conocidos por los expertos en la técnica [H. Carillo y D. Lipton, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]. Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o la homología entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados, a los descritos en la Guía "Guide to Huge Computers", Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y H. Carillo y D. Lipton, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Se diseñan los métodos preferidos para determinar la identidad o la homología para proporcionar la coincidencia más grande entre las dos secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad y la semejanza son codificados en programas informáticos. Los métodos informáticos preferidos para determinar la identidad y la homología entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados, al algoritmo BESTFIT del paquete del programa GCG [J. Devereux et al., Nucl. Acids Res., 12 (1): 387 (1984)], el programa asociado a MACVECTOR (Oxford), y los programas FASTA (Pearson), que pueden ser usados con los ajustes por defecto o los ajustes modificados tal como se determina adecuado por cualquier de experto en la técnica.

Un péptido IR_{1-5} o IR_{6} o proteína de la presente invención también pueden ser modificados para aumentar su inmunogenicidad. Por ejemplo, el antígeno puede ser acoplado a un compuesto químico o vehículos inmunogénicos, con tal de que el acoplamiento no interfiera con la actividad biológica deseada del antígeno o del vehículo. Para una revisión de algunas consideraciones generales en estrategias de acoplamiento, véase "Antibodies. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow y D. Lane (1988). Los vehículos inmunogénicos útiles conocidos en la técnica, incluyen, sin restricción, hemocianina de lapa californiana (KLH); albúmina de suero bovino (BSA), albúmina de clara de huevo, PPD (derivado de la proteína purificada de tuberculina); glóbulos rojos; toxoide del tétano; toxoide del cólera; perlas de agarosa; carbono activado; o bentonita. Los compuestos químicos útiles para el acoplamiento incluyen, sin restricción, grupos dinitrofenol y ácido arsanílico.

Los péptidos IR_{1-6} y las proteínas de la invención también pueden ser modificados por otras técnicas, tal como por desnaturación con calor y/o SDS. De forma alternativa, pueden ser modificados los péptidos y las proteínas de la invención para proporcionar una secuencia de aminoácidos del extremo N- o C-terminal adicional adecuada para la biotinilación, por ejemplo, cisteína o lisina.

ii. Fragmentos/mutantes de deleción

Además están abarcados según esta invención fragmentos adicionales de los péptidos IR_{1-5}, el péptido IR_{6} u otras proteínas identificadas en este documento. Tales fragmentos se caracterizan deseablemente por tener una actividad biológica similar a la que se muestra por la proteína completa, incluyendo, por ejemplo, la capacidad de inducir anticuerpos contra el agente causante de la enfermedad de Lyme. Estos fragmentos pueden ser diseñados u obtenidos en cualquier longitud deseada, incluyendo tan pequeños como de aproximadamente 5 a 8 aminoácidos de longitud. Tal fragmento puede representar un epítopo de la proteína.

Por ejemplo, un fragmento particularmente deseable de la invención es un epítopo de células T localizado dentro de un péptido de la invención, por ejemplo, IR_{6}. Tal epítopo de células T puede ser identificado fácilmente usando los programas disponibles de modelado por ordenador.

Opcionalmente, los péptidos de la invención pueden ser modificados para crear mutantes de deleción, por ejemplo, por truncamiento en los extremos amino o carboxi, o por la eliminación de uno o varios aminoácidos. Otros fragmentos más modificados de IR_{1-5} o IR_{6} (pueden prepararse por cualquier número de técnicas convencionales actuales para mejorar su producción, para realzar la estabilidad de la proteína u otras características, por ejemplo la actividad de unión o biodisponibilidad, o para conferir alguna otra propiedad deseada sobre la proteína. Otros fragmentos útiles de estos polipéptidos pueden prepararse fácilmente por cualquier experto en la técnica usando técnicas conocidas, tales como mutagénesis de deleción y expresión.

iii. Fusión o proteínas multiméricas y composiciones

También pueden ser construidos los péptidos IR_{1-5} o IR_{6} de la presente invención, o sus fragmentos, usando técnicas de ingeniería genética convencionales como parte de una proteína mayor y/o multimérica o composiciones de proteínas. En una realización actualmente preferida, una proteína de fusión está compuesta de un fragmento de IR_{6} correspondiente a un epítopo de células T, que está fusionado a un péptido seleccionado entre los péptidos de IR_{1-5} de la invención.

Los péptidos IR_{1-5} y IR_{6} y proteínas de esta invención pueden usarse en combinación con proteínas de la superficie externa de B. burgdorferi, tales como OspA y OspB, o varios fragmentos de estos pueden ser usados en combinación con otro. En tal combinación, el antígeno puede estar en forma de una proteína de fusión. Así, un antígeno de la invención (por ejemplo, IR_{6} o su fragmento) puede estar opcionalmente fusionado a un polipéptido seleccionado o proteína, por ejemplo antígenos de Borrelia OspA y OspB, otros antígenos de Borrelia, y/o proteínas o polipéptidos derivados a partir de otros microorganismos. Por ejemplo, un péptido o polipéptido de esta invención puede estar fusionado en sus extremos N-terminal o C-terminal al polipéptido OspA, o polipéptido OspB o a un polipéptido no OspA o no OspB o sus combinaciones. Los polipéptidos OspA y OspB que pueden ser útiles para este fin incluyen polipéptidos identificados por la técnica anterior [véase, por ejemplo, el documento PCT/US91/04056 (documento WO 92/00035)] y sus variantes. Los polipéptidos no OspA y no OspB que pueden ser útiles para este fin incluyen los polipéptidos de la invención y los identificados por la técnica anterior, incluyendo, , proteína asociada a flagelos de B. burgdorferi y sus fragmentos, otras proteínas de B. burgdorferi y sus fragmentos, y proteínas no de B. burgdorferi y sus fragmentos.

Estas proteínas de fusión están construidas para uso en los métodos y las composiciones de esta invención. Estas proteínas de fusión o proteínas multiméricas pueden ser producidas recombinantemente, o pueden ser sintetizadas químicamente. También pueden incluir los péptidos y las proteínas de esta invención fusionados o acoplados a otros restos distintos a aminoácidos, incluyendo lípidos y carbohidratos. Además, los antígenos de esta invención pueden ser empleados en combinación con otros agentes de la vacuna de Borrelia descritos por la técnica anterior, así como con otras especies de agentes de vacuna derivados de otros virus. Tales proteínas son eficaces en la prevención, el tratamiento y el diagnóstico de la enfermedad de Lyme cuando está causado por un amplio espectro de aislados de B. burgdorferi.

Una composición proteínica que puede ser una alternativa preferida a las proteínas de fusión descritas anteriormente es un cóctel (es decir, una mezcla simple) que contiene un péptido IR_{6} o proteína, o diferentes mezclas de los péptidos IR_{1-5} e IR_{6} y proteínas de esta invención.

En otro aspecto más, pueden ser proporcionados el péptido y las proteínas de la invención con un marcador detectable, tal como se describe detalladamente más abajo.

iv. Sales

Un antígeno o peptídico proteínico de la presente invención también puede ser usado en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los polipéptidos de la presente invención son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen ácidos inorgánicos y orgánicos y bases.

B. Secuencias de ácidos nucleicos

La presente invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos de mamíferos que codifican los péptidos IR_{1-5} y IR_{6} y las proteínas de la invención, como se define anteriormente. También se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos complementarias a la cadena codificante, por ejemplo, la cadena antisentido y secuencias de ARN correspondientes.

Las variantes alélicas de estas secuencias dentro de una especie (es decir, secuencias que contienen algunas diferencias de nucleótidos individuales de una secuencia que ocurre más comúnmente dentro de una especie, pero que sin embargo codifican la misma proteína o una proteína con la misma función) también pueden ser obtenidas fácilmente dado el conocimiento de la secuencia de ácidos nucleicos proporcionada según esta invención (véase la Figura 2).

La presente invención además comprende secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse en condiciones rigurosas [véase, J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] a las secuencias de la invención, sus cadenas antisentido, o sus fragmentos biológicamente activos. Un ejemplo de una condición de hibridación altamente rigurosa es la hibridación en 2XSSC a 65ºC, seguido de un lavado a 0,1XSSC a 65ºC durante una hora. De forma alternativa, una condición de hibridación altamente rigurosa ejemplar es en formamida del 50%, 4XSSC a 42ºC. Condiciones de rigurosidad moderadamente altas también pueden mostrarse útiles, por ejemplo, hibridación en 4XSSC a 55ºC, seguido por lavado en 0,1XSSC a 37ºC durante una hora. Una alternativa ejemplar de condiciones de hibridación de severidad moderadamente altas es en formamida del 50%, 4XSSC a 30ºC.

De acuerdo con la invención, las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser modificadas. Utilizando los datos de la secuencia proporcionados en este documento, está dentro de la pericia del experto de la técnica obtener o preparar sintéticamente o recombinantemente otras secuencias de polinucleótidos, o secuencias de polinucleótidos modificadas, que codifican las proteínas de cadena entera o los fragmentos útiles de la invención. Tales modificaciones a nivel del ácido nucleico incluyen, por ejemplo, modificaciones en las secuencias de nucleótidos que son silentes o que cambian los aminoácidos, por ejemplo, para mejorar la expresión o la secreción. También se incluyen las variaciones alélicas, causadas por la degeneración natural del código genético.

También están comprendidos según la presente invención mutantes de los péptidos IR_{1-5} e IR_{6} y proteínas proporcionados en este documento. Tales mutantes incluyen deleciones del extremo amino-terminal, extremo carboxi-terminal o internas, que sustancialmente conservan la antigenicidad de IR_{1-5} de cadena entera e IR_{6} u otras proteínas o fragmentos. Tal mutante truncado, o de deleción, puede ser expresado con el fin de afectar la actividad del gen de cadena entera o tipo silvestre o fragmentos génicos.

Así, la invención proporciona fragmentos que codifican un fragmento deseable de IR_{1-5} o IR_{6}, por ejemplo, un epítopo de células T. Generalmente, estos fragmentos de oligonucleotidos tienen al menos 15 nucleótidos de longitud. Sin embargo, fragmentos de oligonucleotidos de varios tamaños pueden ser seleccionados como se desee. Tales fragmentos pueden ser usados para fines tales como realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, en una muestra de tejido de biopsia.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden ser obtenidas, en todo o en parte, a partir de fuentes naturales y ser aisladas a partir de materiales celulares con los cuales están naturalmente asociados. Por ejemplo, las secuencias que codifican a IR_{1-5} y IR_{6} fueron aisladas inicialmente a partir de un fragmento, denominado 7-1, de la cepa de IP90 Borrelia garinii, fue insertado en el plásmido pBluescript II, fue transformado en E. coli y depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia ("ATCC") el 27 de junio de 1997 con el Nº. entrada 98478.EI7-1 se describe detalladamente en la publicación de patente internacional Nº W099/00413, publicada el 7 de enero de 1999. Sin embargo, las secuencias de la invención pueden ser aisladas a partir de otras fuentes adecuadas por usos convencionales de la reacción en cadena de la polimerasa o técnicas de clonación tales como las descritas en textos convencionales tales como el Sambrook et al., citado anteriormente.

Más deseablemente, estas secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden ser construidas recombinantemente usando técnicas de ingeniería genética convencionales o síntesis químicas o PCR, y similares utilizando la información proporcionada en este documento. Estas secuencias de ácidos nucleicos son útiles para una variedad de usos diagnósticos, profilácticos y terapéuticos. Ventajosamente, las secuencias de ácidos nucleicos son útiles en el desarrollo de sondas diagnósticas y sondas antisentido para uso en la detección y el diagnóstico de la enfermedad de Lyme utilizando una variedad de ensayos de ácidos nucleicos conocidos, por ejemplo, Northern blot y Southern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y otras técnicas de ensayo conocidas para cualquier experto en la técnica. Cuando se usa en aplicaciones diagnósticas, las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden estar asociadas opcionalmente a un marcador detectable, como son los descritos detalladamente más abajo. Las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención son también útiles en la producción de los péptidos y las proteínas de la invención

II. Métodos para preparar antígenos y secuencias de ácidos nucleicos de la invención A. Síntesis química

Los péptidos, proteínas y secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de manera convencional por el recurso de técnicas de síntesis química conocidas, por ejemplo, síntesis química en fase sólida, tal como se describe en Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963), y J. Stuart y Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Compañía Pierce Chemical, Rockford, IL (1984), o se detalla en los ejemplos de más abajo. Se conocen una variedad de métodos para producir las modificaciones identificadas anteriormente de péptidos o secuencias de ácidos nucleicos y pueden ser seleccionados por cualquier experto en la técnica.

B. Expresión in vitro

Para producir los péptidos IR_{1-5} e IR_{6} recombinantes y las proteínas de la invención, las secuencias de ADN de la invención son insertadas en un sistema de expresión adecuado. Deseablemente, son construidos una molécula recombinante o vector en el cual la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína seleccionada, por ejemplo, un péptido IR_{6} o una proteína, es operativamente unida a una secuencia control de expresión heteróloga que permite la expresión de la proteína. Se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados en la técnica para la expresión de proteínas, por técnicas de biología molecular estándar. Tales vectores son seleccionados entre vectores tipos convencionales incluyendo insectos, por ejemplo, expresión en baculovirus, o sistemas de expresión micóticos de levadura, bacterianos o virales. Otros vectores de expresión apropiados, de los cuales se conocen numerosos tipos en la técnica, también pueden ser usados para este fin. Los métodos para obtener tales vectores de expresión son conocidos. Véase, Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986) y las referencias citadas allí.

Las células huésped adecuadas o líneas celulares para la transfección por este método incluyen las células bacterianas. Por ejemplo, varias cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC 1061, y cepas usadas en los ejemplos siguientes) son conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, y otros bacilos y similares también se emplean en este método.

Se usan células de mamíferos, tales como las células 293 humanas, células de ovario de hámster chino (CHO), la línea celular COS-1 de mono o células 3T3 murinas derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH. Otra línea celular de mamífero adecuada es la línea celular CV-1. De todos modos se conocen otras células huésped de mamífero adecuadas, así como métodos para la transfección, el cultivo, la amplificación, el rastreo, la producción, y la purificación en la técnica. [Véase, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981), o de forma alternativa, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) o Howley et al., patente de EE.UU. Nº. 4.419.446].

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica están también disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Otras células micóticas también pueden ser empleadas como sistemas de expresión. De forma alternativa, pueden ser usadas células de insecto tales como células de Spodoptera frugipedera (Sf9).

Así, la presente invención proporciona un método para producir un péptido IR_{1-5} o IR_{6} recombinante o proteína, que implica transfectar, por ejemplo, por un medio convencional tal como la electroporación, una célula huésped con al menos un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la invención en el control de una secuencia reguladora transcripcional. La célula huésped transfectada o transformada es entonces cultivada en condiciones que permitan la expresión de la proteína. La proteína expresada es recuperada, aislada, y opcionalmente purificada de la célula (o del medio de cultivo, de ser expresada extracelularmente) por medios apropiados conocido para cualquier experto en la técnica.

Por ejemplo, las proteínas se aíslan en forma soluble después de la lisis de las células, o se extraen usando técnicas conocidas, por ejemplo, en cloruro de guanidina. De ser deseado, las proteínas o los fragmentos de la invención son producidos como una proteína de fusión. Tales proteínas de fusión son las descritas anteriormente. De forma alternativa, por ejemplo, puede ser deseable producir proteínas de fusión para realzar la expresión de la proteína en una célula huésped seleccionada, para mejorar la purificación, o para uso en el control de la presencia del péptido deseado o la proteína, por ejemplo, IR_{6}, en tejidos, células o extractos de células. Las parejas de fusión adecuadas para los péptidos y las proteínas de la invención son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, entre otros, b-galactosidasa, glutationa-S-transferasa, y poli-histidina.

C. Expresión in vivo

De forma alternativa, cuando se desee que el péptido IR_{1-5} o IR_{6} o la proteína de la invención se exprese in vivo, por ejemplo, para inducir anticuerpos, o como una vacuna de ADN, un vector apropiado para la administración es seleccionado fácilmente por cualquier experto en la técnica. Vectores ejemplares para la administración génica in vivo están fácilmente disponibles a partir de una variedad de fuentes académicas y comerciales, e incluyen, por ejemplo, el virus adeno-asociado [véase, por ejemplo, las solicitudes de patente internacional N^{os}. W091/18088 y W095/34670], vectores de adenovirus [M. Kay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2353 (1994); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 92: 883 (1993)], u otros vectores virales, por ejemplo, varios poxviruses, vacunas, etc. Métodos para la inserción de una secuencia de codificación deseada, por ejemplo, la secuencia que codifica el péptido IR_{6}, y obtener la expresión in vivo de la proteína codificada, son conocidos por los expertos en la técnica.

III. Anticuerpos de la invención

La presente invención también proporciona anticuerpos capaces de reconocer y unirse a los péptidos IR_{1-5} y IR_{6} de esta invención, incluyendo anticuerpos derivados a partir de las mezclas de tales antígenos o sus fragmentos. Estos anticuerpos son útiles en el diagnóstico de la enfermedad de Lyme y en composiciones terapéuticas para tratar a seres humanos y/o animales que dan positivo por, o, antes de las ensayos, exhibir los síntomas de la enfermedad de Lyme. Los anticuerpos son útiles en el diagnóstico solo (por ejemplo, los anticuerpos producidos usando los péptidos IR_{6} y las proteínas) o en combinación con anticuerpos frente a otros antígenos de esta invención así como anticuerpos frente a otros antígenos de B. burgdorferi conocidos. Estos anticuerpos, particularmente los generados utilizando IR_{1-5}, son también útiles en composiciones de vacunas pasivas.

Los anticuerpos de esta invención son generados por medios convencionales utilizando los antígenos aislados, recombinantes o modificados de esta invención, o mezclas de tales antígenos o fragmentos de antígenos. Por ejemplo, son generados anticuerpos policlonales de manera convencional estimulando el sistema inmunológico de un animal seleccionado o humano con el antígeno aislado o la mezcla de proteínas antigénicas o péptidos de esta invención, permitiendo al sistema inmunológico producir anticuerpos naturales a éstos, y recogiendo estos anticuerpos a partir de la sangre del animal o del humano u otro fluido biológico.

Pueden ser generados también anticuerpos monoclonales (MABs) dirigidos contra un péptido IR_{1-5} o IR_{6} o proteína de la invención. Las líneas celulares de hibridoma que expresan los anticuerpos monoclonales deseables son generadas por técnicas convencionales conocidas, por ejemplo Kohler y Milstein y sus muchas modificaciones conocidas. Anticuerpos con altos títulos deseables son generados de modo similar aplicando técnicas recombinantes conocidas a los anticuerpos monoclonales o policlonales desarrollados frente a estos antígenos [véase, por ejemplo, la solicitud de patente PCT Nº. PCT/GB85/00392 (documento WO 86/01533); publicación de solicitud de patente británica Nº. GB2188638A; Amit et al., Science, 233: 747-753 (1986); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); solicitud de patente PCT Nº. PCT/WO9007861; y Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1988)].

Considerando la descripción contenida en este documento, cualquier experto en la técnica puede generar anticuerpos quiméricos, humanizados o totalmente humanos dirigidos contra un péptido IR_{1-5} o IR_{6} o la proteína de la invención por el recurso a las técnicas conocidas manipulando las regiones determinantes de complementariedad de anticuerpos animales o humanos frente al antígeno de esta invención. Véase, por ejemplo, E. Mark y Padlin, "Humanization of Monoclonal Antibodies", Capítulo 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 113, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", Springer-Verlag (junio de 1994).

De forma alternativa, los antígenos pueden ser ensamblados como complejos multiantigénicos [véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea 0339695, publicada el 2 de noviembre de 1989] o como mezclas simples de proteínas/péptidos antigenicos y ser empleados para obtener anticuerpos de altos títulos capaces de unirse al(a los) antíge-
no(s) seleccionado(s) como aparece(n) en los fluidos biológicos de un animal infectado o ser humano.

Además se proporcionan según la presente invención anticuerpos anti-idiotipo (Ab2) y anticuerpos anti-anti-idiotipo (Ab3). Los Ab2 son específicos para el objetivo al cual los anticuerpos anti-IR_{1-5} o anti-IR (Ab1) de la invención se unen y Ab3 es similar a Ab1 en sus especificidades de unión y actividades biológicas [véase, por ejemplo, M. Wettendorff et al., "Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies". En Idiotypic Network and Diseases, ed. J. Cerny y J. Hiernaux, J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC: págs. 203-229, (1990)]. Estos anticuerpos anti-idiotipo y anti-anti-idiotipo son producidos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Tales anticuerpos anti-idiotipo (Ab2) pueden llevar la imagen interna de los antígenos, y son así útiles para los mismos objetivos que los péptidos IR_{1-5} y IR_{6} y las proteínas de la invención.

En general, los anticuerpos monoclonales de antisuero policlonal y otros anticuerpos que se unen al antígeno seleccionado (Ab1) son útiles para identificar los epítopos de IR_{1-5} y IR_{6} y separar estos péptidos y proteínas de contaminantes en el tejido (por ejemplo, en columnas cromatográficas y similares), y en general como herramientas de investigación y como materiales de partida esenciales para el desarrollo de otros tipos de anticuerpos descritos anteriormente. Los anticuerpos anti-idiotipo (Ab2) son útiles para unirse al mismo objetivo y así pueden ser usados en lugar del antígeno original.

Para el uso en ensayos diagnósticos, los anticuerpos se asocian a marcadores convencionales que son capaces, solos o comúnmente con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. Cuando se emplea más de un anticuerpo en un método diagnóstico, los marcadores son deseablemente interactivos para producir una señal detectable. Más deseablemente, el marcador es detectable visualmente, por ejemplo, colorimétricamente. Se han descrito una variedad de sistemas enzimáticos en la técnica que funcionarán para revelar una señal colorimétrica en un ensayo. Como un ejemplo, la glucosa oxidasa (que usa la glucosa como sustrato) libera como producto al peróxido. La peroxidasa, que reacciona con el peróxido y un donador de hidrógeno tal como la tetrametilbencidina (TMB), produce una TMB oxidada que es vista como un color azul. Otros ejemplos incluyen la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP), y la hexoquinasa en conjunción con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa que reacciona con ATP, glucosa, y NAD^{+} para proporcionar, entre otros productos, NADH que es detectado como un aumento en la absorbancia a 340 nm de longitud de onda. Otros sistemas marcadores que pueden ser utilizados en los métodos de esta invención son detectables por otros medios, por ejemplo, micropartículas de látex coloreadas [Laboratorios Bangs, Indiana] en el cual puede ser usado un tinte embebido en lugar de enzimas para formar conjugados con los anticuerpos y proporcionar una señal visual indicativa de la presencia del complejo resultante en ensayos aplicables. Otros marcadores más incluyen compuestos fluorescentes, compuestos radiactivos o elementos. Marcadores detectables para unirse a los anticuerpos útiles en ensayos diagnósticos de esta invención pueden ser seleccionados fácilmente entre numerosas composiciones conocidas y están fácilmente disponibles para cualquier experto en la técnica de ensayos diagnósticos. Los métodos y los anticuerpos de esta invención no están limitados por ningún marcador detectable particular o sistema marcador empleado. Adecuadamente, estos sistemas detectables también pueden ser utilizados en conexión con reactivos diagnósticos compuestos de los péptidos, las proteínas, y secuencias de ácidos nucleicos de la invención.

IV. Métodos diagnósticos y ensayos

La presente invención proporciona métodos fiables y exactos para diagnosticar la enfermedad de Lyme en mamíferos. Aunque sea particularmente deseable para uso en seres humanos y perros, pueden ser diagnosticados otros animales mamíferos usando los métodos descritos en este documento. Estos métodos diagnósticos son útiles para diagnosticar a seres humanos u otros mamíferos que exhiban los síntomas clínicos de, o se sospeche que tengan, la enfermedad de Lyme. Los péptidos IR_{6}, las proteínas y los ácidos nucleicos de la invención se ajustan particularmente bien para uso en los métodos diagnósticos y las composiciones de la invención. Por conveniencia, se hará referencia a IR_{6} en todas partes de esta sección y en la sección siguiente. Sin embargo, será entendido que los péptidos de IR_{1-5}, las proteínas y los ácidos nucleicos pueden ser útiles en estos métodos.

En una realización, este método diagnóstico implica detectar la presencia de anticuerpos de B. burgdorferi que ocurren naturalmente que son producidos por el sistema inmunológico del paciente infectado humano o veterinario en sus fluidos biológicos, y que son capaces de unirse a los antígenos de esta invención o sus combinaciones. Este método comprende las etapas de incubar el péptido de IR_{6} o la proteína de esta invención con una muestra de fluidos biológicos del paciente. Tal muestra puede ser de sangre, un producto sanguíneo (por ejemplo, plasma o suero), u otro fluido, por ejemplo, lágrimas u orina. Una muestra adecuada puede ser seleccionada fácilmente basado en el formato de ensayo deseado. Los anticuerpos presentes en los fluidos, como consecuencia de la infección por B. burgdorferi, formarán un complejo antígeno-anticuerpo con el antígeno. Posteriormente la mezcla de reacción se analiza para determinar la presencia o la ausencia de estos complejos antígeno-anticuerpo. La etapa de analizar la mezcla de reacción comprende poner en contacto la mezcla de reacción con una pareja de unión marcada específicamente para el anticuerpo.

En una realización del método, el péptido IR_{6} o la proteína, o una mezcla de péptidos y proteínas de la invención son electro-transferidos o corridos en papel de nitrocelulosa. Posteriormente, el fluido biológico (por ejemplo el suero o el plasma) es incubado con el antígeno transferido, y se permite al anticuerpo en el fluido biológico unirse al(a los) antígeno(s). El anticuerpo unido entonces es detectado por métodos inmunoenzimáticos estándar.

En otra realización del método, perlas de látex son conjugadas al(a los) antígeno(s) de esta invención. Posteriormente, el fluido biológico es incubado con el conjugado de perla/proteína, formándose así una mezcla de reacción. La mezcla de reacción entonces se analiza para determinar la presencia de los anticuerpos.

En otra realización, el método diagnóstico de la invención implica detectar la presencia del(de los) antígeno(s) de IR_{6} naturales en su asociación con el patógeno B. burgdorferi en los fluidos biológicos de un animal o humano infectado por el patógeno. Este método incluye las etapas de incubar un anticuerpo de esta invención (por ejemplo, producido administrando a un ser humano adecuado y/o animal un antígeno de esta invención), preferiblemente marcado de manera convencional para la detección, con una muestra de fluidos biológicos de un ser humano o un animal que se diagnostica. En presencia de la infección por B. burgdorferi del paciente humano o animal, se forma un complejo antígeno-anticuerpo (ocurre la unión específica). Posteriormente, el exceso de anticuerpo marcado se elimina opcionalmente, y la mezcla de reacción se analiza para determinar la presencia o la ausencia del complejo antígeno-anticuerpo y la cantidad de marcador asociada con esto.

Los ensayos que emplean un antígeno proteico de la invención pueden ser heterogéneos (es decir, que requieran una etapa de separación) u homogéneos. Si el ensayo es heterogéneo, pueden ser empleados una variedad de medios de separación, incluyendo centrifugación, filtración, cromatografía o magnetismo.

Un ensayo preferido para el rastreo de una muestra de un paciente es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, es decir, un ELISA. Para uso en un ELISA, la muestra es preferiblemente plasma o suero, aunque puede ser usado otro fluido biológico. Típicamente en un ELISA, el(los) antígeno(s) aislado(s) de la invención está(n) adsorbido(s) a la superficie de un pocillo de microtítulo directamente o por una matriz de captura (es decir, el anticuerpo). Los sitios de unión de la proteína residuales en la superficie entonces se bloquean con un agente apropiado, tal como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal inactivado con calor (NGS), o BLOTTO (una solución tamponada de leche en polvo sin grasa que también contiene un conservante, sales, y un agente antiespumante). El pocillo entonces es incubado con una muestra biológica que se sospecha que contiene el anticuerpo específico anti-B. burgdorferi. La muestra puede ser aplicada neta, o más a menudo, puede estar diluida, por lo general en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (en peso del 0,1-5,0%) de proteína, tal como BSA, NGS o BLOTTO. Después de la incubación durante un tiempo suficiente para permitir que ocurra la unión específica, el pocillo es lavado para eliminar la proteína desunida y luego se incuba con inmunoglobulina anti-humana marcada (\alpha Hulg) o con anticuerpos marcados de otra especie, por ejemplo, perros. El marcador puede ser escogido a partir de una variedad de enzimas, incluyendo peroxidasa de rábano picante (HRP), \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, y glucosa oxidasa, como se describe anteriormente. Se proporciona el tiempo suficiente para que la unión específica ocurra de nuevo, entonces el pocillo se lava de nuevo para eliminar el conjugado desunido, y se añade el sustrato para la enzima. Se permite que el color se desarrolle y la densidad óptica del contenido del pocillo se determina visualmente o instru-
mentalmente.

En una realización actualmente preferida, la invención proporciona un nuevo ELISA basada en el péptido para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme que es un ensayo simple, sensible, y exacto que puede ser realizado en sujetos vacunados con OspA. Los primeros datos mostraron que este ensayo tenía una sensibilidad total del 90%, con una especificidad de aproximadamente el 99%, un valor predictivo positivo de aproximadamente el 99% y un valor predictivo negativo de aproximadamente el 89%. Así, el ELISA de la invención es realizado en una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente revestida de estreptavidina o un compuesto que se une a biotina equivalente a una concentración óptima en un tampón de revestimiento alcalino y que se incuba a 4ºC de la noche a la mañana. Después de dos lavados de 3 minutos con tampones de lavado estándar tales como fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM y Tween-20 del 0,1%, pH 7,4 (PBST), una concentración óptima de una forma biotinilada de una composición/antígeno de esta invención disuelta en tampón de bloqueo convencional tal como PBST suplementado con leche en polvo no grasa del 5%, es aplicada a cada pocillo. En una realización preferida, el ELISA utiliza el péptido IR_{6} de la invención o un compuesto que contiene este péptido, por ejemplo, el péptido C_{6}. Después de 2 horas de incubación con agitación y tres lavados como antes, una muestra de fluidos biológicos en la dilución apropiada, obtenida a partir de un ser humano o un animal que se diagnostica, se añade a cada pocillo. La placa se incuba con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) y luego se lava como antes. Cada pocillo entonces recibe una concentración óptima de un anticuerpo anti-inmunoglobulina apropiado que está conjugado a una enzima u otro marcador según procedimientos estándar y se disuelve en tampón de bloqueo. Después de una hora adicional de incubación seguido de cuatro lavados con PBST durante 3, 4, 5 y 6 minutos, respectivamente, una solución compuesta de un cromógeno apropiado o indicador es añadida y se permite que el color se desarrolle durante 10 minutos. La reacción enzimática se para de manera apropiada y la densidad óptica se mide a la longitud de onda apropiada. El valor de OD de recorte puede ser definido como el promedio de OD + 3 desviaciones típicas (DT) de al menos 50 muestras de suero recogidas de individuos de una zona donde la enfermedad de Lyme no es endémica, o por otras tales definiciones convencionales. Los detalles adicionales del ELISA son proporcionados en los ejemplos más abajo. Véase, particularmente, el Ejemplo 1G.

Además, los anticuerpos monoclonales u otros anticuerpos de esta invención que sean capaces de unirse al(a los) antígeno(s) pueden unirse a placas de ELISA. En otro método diagnóstico, el fluido biológico se incuba en la placa unida a anticuerpos y se lava. La detección de cualquier complejo antígeno-anticuerpo, y la medida cualitativa del anticuerpo monoclonal marcado se realiza de manera convencional, como se describe anteriormente.

Otros formatos de ensayo útiles incluyen la copa con filtro y la varilla en aceite. En este antiguo ensayo, un anticuerpo de esta invención es fijado a un filtro de vidrio sinterizado a la abertura de un pequeño tapón. El fluido biológico o la muestra (5 mL) son pasados por el filtro. Si el antígeno está presente (es decir, la infección de B. burgdorferi), éste se unirá al filtro que entonces será visualizado por un segundo anticuerpo/detector. El ensayo de varilla en aceite implica fijar un antígeno o anticuerpo a un filtro, que entonces se baña en el fluido biológico, se seca y se rastrea con una molécula detectora.

Otros ensayos diagnósticos pueden emplear el(los) antígeno(s) o los fragmentos de esta invención como sondas de ácidos nucleicos o como secuencias antisentido, que pueden identificar la presencia de la infección en el fluido biológico por hibridación a secuencias complementarias producidas por el patógeno en los fluidos biológicos. Tales técnicas, como la PCR, hibridaciones Northern o Southern etc. son conocidas en la técnica.

Debe ser entendido por cualquier experto en la técnica que cualquier número de formatos de ensayo proteicos convencionales, particularmente formatos de inmunoensayo, o formatos de ensayo de ácidos nucleicos, pueden ser diseñados para utilizar los antígenos y anticuerpos aislados o sus secuencias de ácidos nucleicos o las secuencias antisentido de esta invención para la detección de la infección por B. burgdorferi en animales y seres humanos. Esta invención, así, no está limitada por la selección del formato de ensayo particular, y según se piensa, comprende formatos de ensayo que se conocen por cualquier experto en la técnica.

V. Kits diagnósticos

Por conveniencia, los reactivos para el ELISA u otros ensayos de acuerdo con esta invención pueden ser proporcionados en forma de kits. Tales kits son útiles para diagnosticar la infección con B. burgdorferi en una muestra de un ser humano o animal. Un tal kit diagnóstico contiene un antígeno de esta invención y/o al menos un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno de esta invención, o las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, o sus secuencias antisentido. De forma alternativa, tales kits pueden contener una mezcla simple de tales antígenos o secuencias, o medios para preparar una mezcla simple.

Estos kits pueden incluir placas de microtítulo a las cuales los péptidos IR_{1-5} o IR_{6}, proteínas, anticuerpos, o las secuencias de ácidos nucleicos de la invención han sido preadsorbidos, varios diluyentes y tampones, conjugados marcados para la detección de antígenos específicamente unidos o anticuerpos, o ácidos nucleicos y otros reactivos que generan la señal, tales como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Otros componentes de estos kits pueden ser determinados fácilmente por cualquier experto en la técnica. Tales componentes pueden incluir anticuerpos de captura policlonales o monoclonales, el antígeno de esta invención, o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, extractos purificados o semipurificados de estos antígenos como estándares, anticuerpos detectores del anticuerpo monoclonal, un anticuerpo anti-ratón o anti-humano con una molécula indicadora conjugada a ello, una placa ELISA preparada para la absorción, prospectos indicadores para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, varillas aplicadoras o recipientes, y una taza preparatoria de la muestra. Tales kits proporcionan una forma conveniente y eficiente para un laboratorio clínico para diagnosticar la infección por B. burgdorferi.

VI. Composiciones terapéuticas

Los antígenos, anticuerpos, secuencias de ácidos nucleicos o secuencias antisentido de la invención, solos o en combinación con otros antígenos, anticuerpos, secuencias de ácidos nucleicos o secuencias antisentido pueden ser usados además en composiciones terapéuticas y en métodos para tratar a seres humanos y/o animales con la enfermedad de Lyme. Por ejemplo, una tal composición terapéutica puede ser formulada para que contenga un vehículo o diluyente y uno o varios de los anticuerpos de la invención. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados facilitan la administración de las proteínas, pero son fisiológicamente inertes y/o no dañosos.

Los vehículos pueden ser seleccionados por cualquier experto en la técnica. Vehículos ejemplares incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo y agua. Además, el vehículo o el diluyente puede incluir un material retardante, tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol solo o con una cera. Además, pueden ser usadas formulaciones poliméricas de liberación lenta.

Opcionalmente, esta composición también puede contener ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes, o estabilizadores químicos. Los ingredientes adecuados que pueden ser usados en una composición terapéutica en conjunción con los anticuerpos incluyen, por ejemplo, casamino ácidos, sacarosa, gelatina, fenol rojo, N-Z-amina, difosfato de monopotasio, lactosa, hidrolizado de lactalbúmina y leche en polvo.

De forma alternativa, o además de los anticuerpos de la invención, otros agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad de Lyme, por ejemplo, antibióticos o agentes inmunoestimuladores y elementos reguladores de citoquina, se espera que sean útiles en reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. Los agentes que pueden ser usados para suprimir o neutralizar los inmunesupresores liberados por el vector de la garrapata o la espiroqueta deben actuar para ayudar a la inmunidad natural del ser humano infectado o animal. Así, tales agentes pueden funcionar comúnmente con las composiciones terapéuticas de esta invención. El desarrollo de composiciones terapéuticas que contienen a estos agentes está dentro del conocimiento de cualquier experto en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención.

De acuerdo con el método de la invención, un ser humano o un animal puede ser tratado para la Enfermedad Lyme administrando una cantidad eficaz de una tal composición terapéutica. Una "cantidad eficaz" puede estar entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 1000 \mug/mL de un anticuerpo de la invención. Una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1,0 mL de una tal cantidad eficaz. Tal composición puede ser administrada 1-3 veces por día a lo largo de un 1 día en un período de 12 semanas. Sin embargo, pueden hacerse ajustes de la dosificación adecuados por el médico que atienda o el veterinario dependiendo de la edad, sexo, peso y la salud general del paciente humano o animal. Preferiblemente, tal composición es administrada parenteralmente, preferiblemente intramuscularmente o subcutáneamente. Sin embargo, también puede ser formulada para que sea administrada por cualquier otra ruta adecuada, incluyendo oralmente o tópicamente.

VII. Composiciones de vacuna

La presente invención proporciona una composición de vacuna que contiene una proteína IR_{1-5} o IR_{6} o un péptido de la invención o sus mezclas y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. En otra realización, la invención proporciona una composición de vacuna que contiene una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, o sus mezclas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente. Las combinaciones de este(os) antígeno(s) de esta invención con otros antígenos de B. burgdorferi, tales como las proteínas OspA y OspB, proteínas BmpA, B, C o D, o sus fragmentos también están comprendidos en esta invención.

Vehículos ejemplares son como los que se describen anteriormente para composiciones terapéuticas. Opcionalmente, la composición de vacuna además puede contener adyuvantes, conservantes, estabilizadores químicos, u otras proteínas antigénicas. Típicamente los estabilizadores, adyuvantes, y conservantes son optimizados para determinar la mejor formulación en eficacia en el objetivo humano o animal. Conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, propil-galato, paraBens, etil-vanilina, glicerina, fenol, y paraclorofenol.

Uno o varios de los componentes de vacuna anteriormente descritos pueden ser mezclados o adsorbidos con un adyuvante convencional. El adyuvante es usado para atraer a los leucocitos o realzar una respuesta inmune. Tales adyuvantes incluyen, entre otros, Ribi, aceite mineral y agua, hidróxido de aluminio, Amphigen, Avridina, L121/squalen, D-lactida-polilactida/glucósido, polioles plurónicos, dipéptido de muramilo, Bordetella inactivada, y saponinas, tales como Quil A. Además, una composición de vacuna de la invención puede comprender también otros antígenos no de B. burgdorferi, incluyendo, Bordetella bronchiseptica, parvovirus canino, moquillo canino, rabia, Leptosporidia, coronavirus canino, y adenovirus canino. Otros antígenos de vacuna que provengan de otras especies también pueden ser incluidos en estas composiciones, por ejemplo, coronavirus felino, etc.

La invención por lo tanto también abarca un método profiláctico que implica administrar a un animal o ser humano una cantidad eficaz de tal composición. Las composiciones de vacuna de la invención son administradas en una "cantidad eficaz", es decir, una cantidad de antígeno que es eficaz en una ruta de administración para proporcionar una ventaja de vacuna, es decir, inmunidad protectora. Las cantidades adecuadas del antígeno pueden ser determinadas por cualquier experto en la técnica basado en el nivel de respuesta inmune deseado. En general, sin embargo, una composición de vacuna a base de proteína contiene entre 1 ng y 1000 mg de antígeno, y más preferiblemente, de 0,05 \mug a 1 mg por mL de antígeno. Generalmente, una vacuna a base de ADN contiene un antígeno de péptido o proteína de la invención opcionalmente bajo el control de las secuencias reguladoras. Cuando el ADN que codifica el antígeno es llevado a un vector, por ejemplo, un vector viral, una dosis puede estar en el intervalo de 1 x 10^{-3} pfu a 1 x 10^{12} pfu.

Otras dosis adecuadas de la composición de vacuna de la invención pueden ser determinadas fácilmente por cualquier experto en la técnica. Generalmente, una dosis adecuada está entre 0,1 y 5 mL de la composición de vacuna. En general, la vacuna será administrada una vez en una base estacional. Cada estación de la garrapata, por lo general, en primavera, debería ser administrado un refuerzo. La vacuna puede ser administrada por cualquier ruta adecuada. Sin embargo, la administración parenteral, particularmente intramuscular, y subcutánea, es la ruta preferida. También es preferida la vía de administración oral. Las rutas de administración pueden ser combinadas, de ser deseado, o ajustadas. Además, dependiendo del paciente humano o especie animal que se trate, es decir, su peso, edad, y salud general, la dosificación también puede ser determinada fácilmente por cualquier experto en la técnica.

VIII. Rastreo del fármaco y desarrollo

Las proteínas, los anticuerpos y las secuencias de polinucleótidos de la presente invención también pueden ser usados en el rastreo y el desarrollo de compuestos químicos o proteínas que tienen utilidad como fármacos terapéuticos o vacunas para el tratamiento o el diagnóstico o la prevención de la enfermedad de Lyme. Como un ejemplo, un compuesto capaz de unirse a IR_{1-5} o IR_{6} y prevenir su actividad biológica puede ser un componente farmacéutico útil para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Lyme. Los métodos descritos en este documento también pueden ser aplicados a los fragmentos de IR_{1-5} o IR_{6}, y, particularmente, a epítopos dentro de estos fragmentos.

Pueden ser determinados fácilmente métodos de ensayo adecuados por cualquier experto en la técnica. Cuando se desee, y dependiendo del ensayo seleccionado, el(los) antígeno(s) seleccionado(s), por ejemplo, IR_{6}, puede(n) ser inmovilizado(s) directamente o indirectamente (por ejemplo, vía un anticuerpo anti- IR_{6}) en una superficie adecuada, por ejemplo, en un formato ELISA. Tales superficies de inmovilización son conocidas. Por ejemplo, puede ser usada una perla inerte humedecible. De forma alternativa, el antígeno seleccionado, por ejemplo, IR_{6}, puede ser usado en ensayos de rastreo que no requieran la inmovilización, por ejemplo, en el rastreo de genotecas combinatorias. Los ensayos y las técnicas existen para el rastreo y el desarrollo de fármacos capaces de unirse a un antígeno de esta invención, por ejemplo, IR_{6}. Estos incluyen el uso de un sistema de exposición de bacteriófago para expresar la(s) proteína(s) antigénica(s), y usar un cultivo de E. coli transfectado u otro microorganismo para producir las proteínas para los estudios de unión de compuestos de unión potenciales. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en G. Cesarini, FEBS Letters, 307 (1): 66-70 (julio de 1992); H. Gram et al., J. Immunol. Meth., 161: 169-176 (1993); C. Summer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3756-3760 (mayo de 1992).

Otras técnicas de rastreo de fármacos convencionales pueden ser empleadas usando las secuencias de proteínas, anticuerpos o polinucleótidos de esta invención. Como un ejemplo, un método para identificar los compuestos que se unen específicamente a una proteína de esta invención, por ejemplo, IR_{6}, puede incluir simplemente las etapas de poner en contacto una proteína IR_{6} seleccionada con un compuesto de ensayo para permitir la unión del compuesto de ensayo a IR_{6}; y determinar de la cantidad del compuesto de ensayo, si hay alguno, que está unido a la proteína IR_{6}. Tal método puede implicar la incubación del compuesto de ensayo y la proteína IR_{6} inmovilizada sobre un soporte sólido. Métodos similares pueden ser empleados para una o varias de las proteínas de cadena de casete.

Típicamente se permite a la superficie que contiene el ligando inmovilizado entrar en contacto con una solución que contiene la proteína y la unión es medida usando un sistema de detección apropiado. Los sistemas de detección adecuados incluyen el conjugado de peroxidasa de rábano picante de estreptavidina, conjugación directa por un marcador, por ejemplo, la fluoresceina. Otros sistemas son conocidos por cualquier experto en la técnica. Esta invención no está limitada por el sistema de detección usado.

Otro método para identificar los compuestos que se unen específicamente a IR_{6} u otro péptido o proteína de esta invención puede incluir las etapas de poner en contacto el péptido o la proteína, por ejemplo, IR_{6}, inmovilizado en un soporte sólido tanto con un compuesto de ensayo como con la secuencia de la proteína que es un receptor para IR_{6} para permitir la unión del receptor al péptido IR_{6} o la proteína; y determinar la cantidad del receptor que está unido al péptido IR_{6}. La inhibición de la unión de la proteína normal por el compuesto de ensayo indica así la unión del compuesto de ensayo al péptido IR_{6}. Métodos similares pueden ser empleados para una o varias de las proteínas de cadena de casete.

Así, por el uso de tales métodos, la presente invención, se anticipa a proporcionar compuestos capaces de interaccionar con IR_{6} o sus partes, y/o los péptidos de IR_{1-5} o las proteínas y realzar o disminuir la actividad biológica de la proteína, como se desee. Tales compuestos, según se piensa, están comprendidos por esta invención.

Los ejemplos siguientes ilustran los métodos preferidos para obtener los antígenos protéicos de la invención y preparar los ensayos y las composiciones de la invención. Significativamente, estos ejemplos indican que los péptidos IR_{1-5} y IR_{6} y las proteínas de esta invención son útiles para el diagnóstico y la profilaxis contra la enfermedad de Lyme y pueden mejorar los ensayos serológicos de Lyme. Estos ejemplos son ilustrativos sólo y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos para la identificación de los péptidos IR_{1-5} y IR_{6} A. Animales, infecciones en animal y cepas de espiroqueta

Fueron infectados monos rhesus (de 2 a 4 años, Macaca mulatta) por la picadura ninfal de la garrapata Ixodes scapularis que estaba infectada con las cepas JDI o B31 de B. burgdorferi sensu stricto. Fueron infectados ratones (de 6 a 8 semanas C3H/HeN, Laboratorios Jackson, Bar Harbor, ME) por la cepa Sh-2-82 de B. burgdorferi sensu stricto (paso bajo, con la gentileza de Denee Thomas, Universidad de Texas Health Science Center, San Antonio, TX) por la inoculación inyectada subcutánea de 1 x 10^{8} espiroquetas administradas en 1 ml de medio BSK-H (Compañía Química Sigma, San Louis, MO), o por la picadura de la garrapata ninfal Ixodes scapularis infectada con B31. La cepa IP90 de B. garinii (paso bajo) fue obtenida de "Centers for Disease Control and Prevention" (CDC, Fort Colins, CO). Cuando se requería, las espiroquetas fueron cultivados en medio BSK-H como se describe antes [Philipp, Infect. Immun., 61: 3047-3059 (1993)].

B. Clonación, secuenciación y expresión del segmento de casete 7-1 de IP90

Una genoteca de ADN total repartida al azar de IP90 de B. garinii fue construida en el vector bacteriófago \lambdaZAP II (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo un procedimiento descrito previamente [R. Ramamoorthy et al., Infect. Immun., 64: 1259-1264 (1996)]. La genoteca fue rastreada con una mezcla de plasma recogida de monos rhesus en las 10 primeras semanas después de la inoculación con la garrapata con JD 1 de B. burgdorferi. En las inmunotransferencias de los extractos de célula entera de IP90 de B. garinii esta mezcla de plasma reaccionó fuertemente sólo con tres componentes, a saber, flagelina, una proteína de 60-kDa no identificada, y Ag que era el homólogo de IP90 del VIsE de 34 kDa de B31 [J. R. Zhang et al., Infect. Immun., 66: 3698-3704 (1998)]. Después de varias rondas de rastreo, fueron rescatados once clones en el fagómido pBluescript (Stratagene). Los plásmidos recombinantes fueron purificados y usados para transformar las células de la cepa SURE de E. coli (Stratagene). Varios transformantes fueron seleccionados a partir de cada clon original, y se confirmó la presencia del inserto, y fue cultivado un tal transformante de cada clon, inducido para la expresión, lisado y analizado por análisis de inmunotransferencia con la mezcla de plasma original. Uno de los once fragmentos clonados (denominados 7-1) se hibridaron a todos los otros por la hibridación del ensayo en gota. Este fragmento fue seleccionado para la sobreexpresión y la purificación en base a la fuerte reactividad de la proteína expresada con los anticuerpos de plasma. La secuenciación del inserto 7-1 fue realizada según procedimientos estándar [J. Sambrook et al., "Molecular cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)] después de la generación de deleciones de Bal 31 anidadas y la subclonación de los fragmentos parcialmente deleccionados. El anticuerpo de la mezcla original en plasma que fue purificado por afinidad usando la proteína recombinante (P7-1) expresada por el clon 7-1 como immunoabsorbente reaccionó con el supuesto VIsE IP90 en la inmunotransferencia de lisados de B. garinii. El inserto 7-1 fue subclonado en el sistema de expresión pQE para la sobreexpresión y la purificación del polipéptido (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). La concentración de la proteína fue determinada usando el kit de ensayo de proteínas de Bio-Rad (Laboratorios Bio-Rad, Richmond, CA) con BSA como un estándar.

C. ELISA de P7-1

Este protocolo fue usado inicialmente para controlar las respuestas inmunológicas de mono frente a P7-1. Placas ELISA de noventa y seis pocillos (Corning Inc., Corning, Nueva York) fueron revestidas con 100 \mul por pocillo de una solución de P7-1 en 0,1 \mug/ml en tampón de revestimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,2) a 4ºC de la noche a la mañana. Las placas fueron bloqueadas con 200 \mul por pocillo de 5% de FCS en PBS/T (fosfato de sodio 10 mM, NaCI 150 mM y 0,1% de Tween-20, pH 7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 3 veces con PBS/T, 50 ml por pocillo de muestras de suero de monos infectados con B. burgdorferi diluídos 1/100 en 5% de FCS en PBS/T fueron incubados durante 1 hora a 37ºC. Las placas fueron lavadas e incubadas con 50 \mul de (1) una mezcla de anticuerpos IgG (específico a la \mu-cadena) antihumano de cabra biotinilado e IgM (específico a la m-cadena) a la dilución recomendada por el fabricante (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA) durante 1 hora a 37ºC, (2) el complejo avidin-peroxidasa de rábano picante también en la dilución recomendada por el fabricante (Vector) durante 30 minutos a 37ºC, (3) una solución que contiene 2 g/l de orto-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno del 0,03% (ambos de Sigma) en tampón 0,1 M de fosfato de sodio de citrato, pH 5,0 durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción fue parada con 50 \mul de 4 NH_{2}SO_{4}. Fue determinada la OD a 490 nm. IgG e IgM antihumano de cabra reaccionaron específicamente totalmente con el anticuerpo de mono.

D. Identificación de secuencias conservadas y predicción de antigenicidad de las regiones invariables del dominio variable de VlsE

La secuencia de aminoácidos deducida de P7-1 fue comparada con las secuencias disponibles en la base de datos de la genoteca del GenBank (National Center for Biotechnology Information, Rockville, MD) utilizando el algoritmo BlastP [J. Zhang y T. L. Madden, Genome Res., 6: 649-656 (1997)]. La antigenicidad del polipéptido entero P7-1 fue analizada usando la escala de Hopp-Woods [T. P. Hopp y K. R. Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828 (1981)], y fueron calculadas las identidades de las regiones invariables de P7-1 con segmentos de casete homólogos de las cepas B31 y 297 después de la alineación de los segmentos de casete usando el algoritmo pam250, y el software de MacVector 5.0 (Empresa Eastman Kodak, New Haven, CT).

E. Síntesis de péptidos y conjugación a biotina

Un péptido de 26-mer (C_{6}) que reproducía la secuencia de IR_{6} de VIsE clonada a partir de la cepa IP90 de B. garinii fue preparado usando el protocolo de síntesis de fluorenilmetoxicarbonilo [G. Barony y R. B. Merrifield, "The Peptides: Analysis, Synthesis, & Biology", Academic Press, págs. 3-285 (1980)]. Un resto de cisteína fue incluido en el extremo N-terminal y fue usado como sitio de biotinilación. La biotinilación fue realizada por el método del carboxilato de maleimida de N-succinimidila. El reactivo de maleimida era de Molecular Probes (Eugene, OR) y fue seguido el protocolo sugerido por el fabricante.

F. Muestras de suero humano

Un panel de 41 muestras de suero humano fue proporcionado amablemente por el CDC. Todas las muestras fueron recogidas de pacientes con la enfermedad de Lyme que tenían signos y síntomas que cumplieron la definición de caso clínico del CDC ["Morbidity and Mortality Weekly Report", 39, Nº. RR-13, 19-20 (1990)]. Cuatro muestras de suero de pacientes crónicos con la enfermedad de Lyme fueron obtenidos de los "National Institutes of Health". Noventa y siete muestras de suero obtenidas de pacientes hospitalizados en una zona no endémica para la enfermedad de Lyme fueron usadas como controles negativos.

G. ELISA del péptido C_{6} de la invención

Fueron revestidas placas ELISA de noventa y seis pocillos con 100 \mul por pocillo de 4 \mug/ml de estreptavidina (Empresa Química Pierce, Rockford, IL) en tampón de revestimiento y fueron incubados a 4ºC de la noche a la mañana. Las etapas restantes fueron conducidas en un agitador rotatorio a temperatura ambiente. Después de dos lavados de 3 minutos con 200 \mul por pocillo de PBS/T a 200 revoluciones por minuto, fueron aplicados a cada pocillo 200 \mul de 5 \mug/ml de péptido C_{6} biotinilado disuelto en solución de bloqueo (PBS/T suplementado con leche en polvo sin grasa del 5% [Carnation, Nestle Food Company, Glendale, CA]). La placa fue agitada a 150 revoluciones por minuto durante 2 horas. Después de tres lavados con PBS/T como antes, fueron añadidos a cada pocillo 50 \mul de suero (ratón, mono o humano) diluidos 1:200 con solución de bloqueo. La placa fue incubada a 150 revoluciones por minuto durante 1 hora y luego fue lavada tres veces con PBS/T. Cada pocillo entonces recibió 100 \mul de 0,2 \mug/ml de IgG antimono de cabra (\lambda-cadena específica, [Laboratorios Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD]), 0,5 \mug/ml de IgG anti-ratón (cadena pesada y ligera específica, [Sigma]), o 0,1 \mug/ml de IgG anti-humano (cadena pesada y ligera específica, [Pierce]), cada uno conjugado a peroxidasa de rábano picante y disuelto en solución de bloqueo. La placa fue incubada durante 1 hora agitando. Después de cuatro lavados con PBS/T cada uno durante 3, 4, 5 y 6 minutos, respectivamente, la reacción Ag-Ab fue sondada usando 100 \mul de una solución compuesta del cromógeno 3,3',5,5'-tetrametilbencidina a 0,2 mg/ml y peróxido de hidrógeno del 0,01% en el tampón suministrado por el fabricante ["TMB Microwell Peroxidase Substrate System", Kirkegaard y Perry], y se permitió que el color se desarrolle durante 10 minutos. La reacción enzimática fue parada por la adición de 100 \mul de H_{3}PO_{4} 1 M. La OD fue medida a 450 nm con un espectrofotómetro de placa ELISA modelo SLT Spectra con el Software Soft2000 (Instrumentos de Laboratorio SLT, Alemania).

H. ELISA competitivo

Fueron revestidas placas ELISA de noventa y seis pocillos con 100 \mul por pocillo de 0,3 \mug/ml de P7-1 recombinante purificado disuelto en tampón de revestimiento a 4ºC de la noche a la mañana. Después del bloqueo con la solución de bloqueo, fueron añadidos a cada pocillo 25 \mul de esta solución con 0, 1, 4, 16, 64, 256 o 1024 ng del péptido C_{6}. Un volumen de 25 ml de una dilución 1:100 del suero apropiado en la solución de bloqueo también fue añadido a cada pocillo. Las etapas restantes fueron realizadas como se refiere en el párrafo G anterior que describe el ELISA del péptido C_{6}.

1. Preparación del antisuero del péptido anti-C_{6} de conejo

El péptido C_{6} fue unido covalentemente a la hemocianina de lapa californiana (KLH) por el método del carboxilato de maleimida de N-succinimidilo. El reactivo de maleimida era de Molecular Probes (Eugene) y fue seguido el protocolo sugerido por el fabricante. Se les dieron a conejos Blancos de Nueva Zelanda de seis meses tres inyecciones a intervalos quincenales de 200 \mug de Ag conjugado emulsionado con adyuvante de Freund completo (primera inyección) o incompleto (inyecciones restantes). Diez días después de la última inyección el título del anticuerpo fue determinado por el ELISA del péptido y el análisis de inmunotransferencia usando lisados de células enteras de espiroqueta de IP90 como Ag.

J. Inmunoprecipitación e inmunotransferencia

La inmunoprecipitación fue conducida a 4ºC. Aproximadamente 1,5 x 10^{10} de espiroquetas IP90 cultivadas en la fase de crecimiento estacionaria fueron extraídas en 4,5 ml de tampón de solubilización (Tris-HCI 50 mM, Triton X-100 del 1%, EDTA 1 mM, pH 7,6) durante 30 minutos. La mezcla fue centrifugada a 13.000 x g durante 30 minutos y el sobrenadante fue recogido. Cada 1,5 ml de este sobrenadante fue mezclado con 30 \mul de suero de conejo preinmune o inmune y fue incubado durante 30 minutos. Entonces fueron añadidos cincuenta microlitros de Proteína G Inmovilizada ImmunoPure® agotado (Pierce) preequilibrado en tampón de solubilización y se dejó incubar durante 30 minutos más. Después del lavado del gel dos veces con volúmenes en exceso de este tampón por centrifugación a 3,000 x g durante 20 minutos, fueron añadidos 150 ml de tampón de ensayo de SDS-PAGE no reductor (Tris-HCI 125 mM, 3% de SDS y 20% de glicerol, pH 6,8). La suspensión fue incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego fue centrifugada a 16.000 x g durante 30 minutos. Diez microlitros de sobrenadante fueron cargados en cada uno de diez vías de un minigel de poliacrilamida SDS del 12%. Las proteínas separadas fueron sometidos a electrotransferencia con nitrocelulosa en tampón de transferencia Towbin. Después de la incubación en solución de bloqueo durante 2 horas, la transferencia fue incubada durante 1 hora en suero anti-C_{6} de conejo diluido 1:2.000 con solución de bloqueo. Después de 3 lavados con PBS/T, la transferencia fue incubada en solución de bloqueo con 0,5 \mug/ml de IgG anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pierce) durante 1 hora. La reacción Ag-Ab fue sondada en PBS/T suplementado con 0,05% de 4-cloro-naftol (Sigma), 0,015% de peróxido de hidrógeno y 17% de metanol.

K. Inmunofluorescencia directa

Fue purificada IgG de conejo a partir de suero preinmune o inmune usando la precipitación convencional con sulfato de amonio. La pureza y la concentración de preparaciones de IgG fueron evaluadas usando SDS-PAGE y el kit de ensayo de proteínas de BioRad, respectivamente. La IgG purificada fue conjugada a FITC según las instrucciones del fabricante (Pierce). Para marcar, las espiroquetas fueron no fijadas o fijadas con acetona. Para marcar fluorescente de espiroquetas no fijadas, aproximadamente 10 espiroquetas que fueron cultivadas a partir de 1,0 ml de cultivo de IP90 cultivado en la fase estacionaria por centrifugación a 4.000 x g durante 20 minutos fueron resuspendidas con cuidado en 100 \mul de PBS suplementado con 2 mg de conjugado de IgG-FITC anti-C_{6} de conejo, y fueron incubados durante 1 hora. Después de 2 lavados con volúmenes en exceso de PBS por centrifugación a 16.000 x g durante 5 minutos, las espiroquetas fueron resuspendidos en 100 \mul de PBS, fueron aplicadas a portas de microscopio y fueron contadas tanto bajo microscopios de campo oscuro como fluorescentes. La relación de espiroquetas fluorescentes frente a las totales fue calculada como sigue. El mismo procedimiento fue realizado en espiroquetas fijadas en acetona. Con este objetivo, fueron suspendidos organismos cultivados a partir de 1,0 ml de fluido de cultivo en 1,5 ml de acetona, fueron incubados durante 20 minutos, y luego centrifugados a 16,000 x g durante 5 minutos. Después de un lavado con PBS, las espiroquetas fijadas fueron teñidas con anticuerpo anti-C_{6} fluorescente como se describe para las espiroquetas no fijadas. Fue usado como control positivo conjugado FITC de anticuerpo anti-B. burgdorferi de cabra (Laboratorios Kirkegaard y Perry).

L. Ensayo ADCK

Como una fuente de complemento, fueron recogidas muestras de suero de macacos rhesus normales, fueron reunidas y almacenadas en pequeños alícuotas a -70ºC hasta su uso. El suero escogido para este fin no contenía anticuerpos anti-B. burgdorferi inespecíficos como se determina por el análisis de inmunotransferencia usando los lisados de células enteras de B. burgdorferi como Ag. Para realizar el ensayo ADCK, las espiroquetas fueron cultivadas en medio BSK-H hasta que alcanzaron la fase semi-logarítmica (aproximadamente 2 x 10^{7} células por ml). Un total de aproximadamente 5 x 10^{5} espiroquetas en 25 \mul de medio BSK-H fueron añadidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Corning Inc.). Un volumen de 50 ml de muestra de suero inactivada con calor (56ºC, 30 minutos) diluida de manera apropiada en el mismo medio fue distribuida en cada pocillo. La placa fue incubada a 34ºC durante 30 minutos antes de la adición de 25 ml de preparación de complemento (suero de mono normal). Después de 24 horas de incubación a 34ºC en una atmósfera humedecida del 3% de CO_{2}, 5% O_{2} y equilibrada con N_{2}, fueron retirados 5 \mul de cada muestra, y las espiroquetas muertas (no movibles) y vivas (movibles) fueron contadas en un microscopio de campo oscuro. Fue usado antisuero anti-OspA de mono como control positivo [J.M. Nowling y M.T. Phillip, Infect. Immun., 67:443-445 (1999)].

Ejemplo 2 Las regiones invariables del dominio variable de VlsE son conservadas entre cepas y genoespecies de B. burgdorferi

La respuesta immune frente al polipéptido P7-1 recombinante en los monos que habían sido inoculados con garrapata con espiroquetas B31 o JD 1 de B. burgdorferi fue evaluada y fue notado que la respuesta era detectable en las primeras tres semanas después de la infección (PI), y que persistía al menos hasta la semana 10 PI, el punto de tiempo más largo medido en este experimento inicial (figura 1). Se muestra la secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido recombinante P7-1 de B. garinii en la figura 2. Se representa alineada con secuencias de los segmentos de casete de VIsE de cepas B31 de B. burgdorferi [J. R. Zhang et al., Cell, 89: 275-285 (1997)] y 297 [H. Kawabata et al., Microb. Pathog., 24: 155-166 (1998)]. En B31, el segmento de casete está comprendido entre las repeticiones EGAIKG [SEQ ID NO. 2] (figura 2) [Zhang, citado anteriormente]. Las seis regiones variables del segmento de casete de VIsE B31 [Zhang, citado anteriormente] están doblemente subrayadas. Las regiones invariables IR_{1-6} del dominio variable de VlsE de IP90 (figura 2) están claramente conservadas tanto a través de genoespecies como a través de cepas de B. burgdorferi sensu lato. A excepción de IR_{1}, que es 78% conservado en la cepa B31 y sólo 11% en 297, todas las otras regiones invariables están entre 80 y 90% conservadas en lo que concierne al segmento de casete de VIsE de P7-1 de IP90 (Tabla 1).

TABLA 1

3

La antigenicidad de las regiones invariables de P7-1 fue evaluada con el algoritmo de hidrofilia de Hopp-Woods [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828 (1981)]. Según se dice, este método ha estado más acertado que otros similares para identificar los determinantes antigénicos proteicos [T. P. Hopp, Pept. Res., 6: 183-190 (1993)]. En general, las regiones invariables del dominio variable de IP90 mostraron valores de hidrofilia negativos, posiblemente indicativos de su carencia de exposición en la superficie de la proteína. Las secuencias con valores positivos estaban compuestas de menos de 6 aminoácidos y por eso no configuraban probablemente sitios antigénicos. Al contrario, IR_{6} contenía seis o más aminoácidos contiguos con relativamente altos valores de hidrofilia positivos (1,7). IR_{6} también era ligeramente más conservado que otras regiones invariables, con una identidad mediana del 87% usando la secuencia de IP90 como cepa de referencia (Tabla 1).

Ejemplo 3 Evaluación experimental de la antigenicidad de IR_{6}

Para evaluar experimentalmente la antigenicidad de IR_{6}, el péptido C_{6}, cuya estructura primaria abarcó la de IR_{6} con un resto de cisteína añadido al extremo N-terminal para la biotinilación, fue sintetizado como se describe en el Ejemplo 1. El péptido C_{6} resultante tiene la secuencia de aminoácidos: CMKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK [SEQ ID NO. 8].

Las muestras de suero de las sangrias obtenidas de 10 macacos rhesus que fueron infectados con espiroquetas JDI (6 animales) o B31 fueron usadas para examinar la antigenicidad de IR_{6} en monos. Los niveles de anticuerpo de ELISA anti-C_{6} mostrados en la figura 3A estaban presentes en las muestras de suero a las 4-6 semanas PI y permanecieron tan altos o más altos hasta tres años PI (datos no mostrados).

Los ratones también respondieron fuertemente a esta región. Las muestras de suero recogidas 4-6 semanas PI de 10 ratones infectados con la cepa Sh-2-82 (6 animales) o B31 de B. burgdorferi mostraron altos niveles de anticuerpos anti-C_{6} (figura 3B). Este resultado además confirmó la antigenicidad de IR_{6} y reafirmó la conservación antigénica de esta región.

En seres humanos, la antigenicidad de IR_{6} fue examinada con la ayuda del panel CDC de 41 muestras de suero. El anticuerpo dirigido contra C_{6} fue encontrado en 36 de las 41 muestras (Tabla 2). N: resultado negativo; P: resultado positivo.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

4

\newpage

El resultado de este experimento también subraya tanto la antigenicidad como la conservación antigénica de IR_{6}, cuando el panel de suero de CDC estaba compuesto de muestras recogidas de varias zonas endémicas de la enfermedad de Lyme en los Estados Unidos y por lo tanto debe abarcar anticuerpos contra múltiples cepas de B. burgdorferi.

Ejemplo 4 IR_{6} es la única región invariable inmunodominante en ambos monos y seres humanos

Además de IR_{6}, el dominio variable de VIsE contiene otras cinco regiones invariables (figura 2). Para determinar si alguna de estas regiones es antigénicas, fue realizado un ELISA competitivo, usando P7-1 como Ag unido a una placa de ELISA, en presencia de concentraciones crecientes del péptido C_{6}. P7-1 incluye las regiones invariables IR_{1-6} (figura 2). Fueron analizadas diez muestras de suero de monos infectados, 4 muestras de suero humanas seleccionadas al azar del panel CDC, y 4 muestras de suero adicionales de pacientes crónicos con enfermedad de Lyme proporcionadas por los "National Institutes of Health". Los resultados representativos para 4 muestras de suero humano y 4 de mono son representados en la figura 4. La adición de C_{6} inhibió casi completamente la reacción con anticuerpos de suero de mono y humano reactivos con P7-1. Así, IR_{6} parece ser la única región invariable inmunodominante dentro del dominio de variable de VIsE en ambos monos y seres humanos. Cuando el ELISA competitivo fue usado para analizar suero de ratón infectado, la inhibición máxima resultado de la adición de C_{6}, no fue más grande que el 40%, indicando que otras regiones invariables pueden ser antigénicas en ratones (datos no mostrados).

Ejemplo 5 Exposición de IR_{6} en la superficie de VlsE

La exposición de IR_{6} en la superficie de la proteína de VIsE fue examinada por inmunoprecipitación con el antisuero anti-C_{6} de conejo. El VIsE de espiroquetas de la cepa IP90 de B. garinii fue extraído en tampón de solubilización y se inmunoprecipitó con proteína-G-agarosa en presencia de antisuero anti-C_{6} de conejo o suero obtenido del mismo conejo antes de la inmunización. La presencia de VlsE en los inmunoprecipitados entonces fue evaluada en inmunotransferencias reaccionadas con el antisuero anti-C_{6}. El VIsE de IP90 fue inmunoprecipitable con el antisuero anti-C_{6}, pero no con el suero normal. Este resultado indica que IR_{6} está expuesto en la superficie de VIsE.

Ejemplo 6 IR_{6} no está accesible al anticuerpo en la membrana externa de la espiroqueta

La exposición de IR_{6} en la superficie de espiroqueta fue evaluada por inmunofluorescencia. Aunque el anticuerpo anti-C_{6} de conejo FITC-conjugado marcó extensivamente todas las espiroquetas de IP90 fijadas en acetona, éste marcó algunas (menos del 5%) de las espiroquetas no fijadas. Las espiroquetas no fijadas que fueron marcadas exhibieron un modelo fluorescente discontinuo, mientras que las espiroquetas fijadas mostraron una fluorescencia uniforme. El conjugado anticuerpo-FITC anti-B. burgdorferi control marcó tanto a las espiroquetas fijadas como a las no fijadas. Estos resultados indican que IR_{6} está unido a partir de la superficie de la espiroqueta aunque el VIsE esté expuesto a la superficie [Zhang, Cell, 89: 275-285 (1997)]. Esto es compatible con la observación hecha en el ensayo de ADCK, en el cual el antisuero anti-C_{6} no tenía ninguna actividad de inactivación significativa comparado con el suero preinmune aunque el antisuero anti-OspA de mono inactivó a todos las espiroquetas en el mismo experimento (datos no mostrados).

Ejemplo 7 IR_{1-5} y IR_{6}

Esta invención demuestra que las secuencias de aminoácidos de las seis regiones invariables descritas antes en los segmentos de casete de VIsE [Zhang, citado anteriormente] son conservadas, al menos en dos genoespecies de Borrelia, B. garinii y B. burgdorferi sensu stricto. Además, se ha ilustrado con datos de la bibliografía que tal conservación también es conservada entre las cepas de las últimas genoespecies. Esto es evidente a partir del alto nivel de identidad entre la secuencia de aminoácidos deducida de las regiones invariables dentro del dominio variable de IP90 (B. garinii), que fue clonado, secuenciado e identificado, y aquellos de los segmentos de casete B31 y 297 (figura 2, Tabla 1).

La conservación de secuencia de las seis regiones invariables a través de la cepa y barreras de genoespecies indica que estas regiones son importantes en el papel que juega VIsE en la fisiología de B. burgdorferi. Se esperaría, por lo tanto, que tales secuencias no fueran antigénicas en huéspedes con una infección de B. burgdorferi crónica o que fueran de otra manera inaccesibles al anticuerpo, porque están conformacionalmente enterradas dentro de la molécula de VIsE o no están disponibles en la superficie de la espiroqueta. El algoritmo de Hopp-Woods indicó que, a excepción de IR_{6}, todas las otras regiones invariables no eran antigénicas o tenían una antigenicidad muy baja.

La antigenicidad predicha de IR_{6} fue confirmada en seres humanos, monos y ratones (figura 3, Tabla 2). Sueros de todos estos huéspedes reaccionaron inicialmente con el péptido C_{6} y continuamente en el curso de la infección, indicando así que IR_{6} contiene uno o varios epítopos que pueden ser ampliamente antigénicos, independientemente de la especie del huésped. La antigenicidad de C_{6} no sólo era manifesta independientemente de la especie de huésped, sino que también independientemente de si los animales habían sido infectados por las cepas JD1, B31 o Sh-2-82 de B. burgdorferi sensu stricto. Además, 36 de 41 muestras de suero humano recogidas en el Noreste y Medio-Oeste de EE.UU. de pacientes con enfermedad aguda o crónica de Lyme también reaccionaron con este péptido. Las 5 muestras de suero que no tenían ningún anticuerpo detectable anti-C_{6} fueron obtenidas de los pacientes que estaban en las etapas incipientes de la infección. A partir de esto, los resultados negativos pueden reflejar la presencia de títulos de suero de anticuerpo muy bajos más bien que ausencia de reactividad no específica. El péptido C_{6} puede servir así como una sonda diagnóstica global.

La ausencia de antigenicidad, o relativamente baja, de IR_{1-5} fue subrayada por los resultados de los experimentos competitivos (figura 4). El hecho de que la unión de la mayor parte de los anticuerpos humanos y de mono que reaccionaron con P7-1 pudieran ser inhibidos simplemente añadiendo un exceso del péptido C_{6} indica que en estos IR_{6} huéspedes está posiblemente la única región invariable inmunodominante dentro del dominio variable de VIsE. En ratones los resultados fueron diferentes, como un exceso añadido del péptido C_{6} era incapaz de inhibir totalmente la reactividad de P7-1 de anticuerpos anti-Sh-2-82 o anti-B31 de ratón. Este resultado implica que algunas otras regiones invariables pueden ser antigénicas en ratones. El inmunodominio de IR_{6} además fue subrayado por la persistencia a largo plazo de anticuerpos anti-C_{6} en monos infectados y en pacientes con la enfermedad de Lyme crónica (datos no mostrados).

El algoritmo de Hopp-Woods también predijo, como se esperaba, que algunas regiones variables del segmento de casete eran fuertemente antigénicas (datos no mostrados). Así, al menos teóricamente, las regiones variables de VIsE podrían satisfacer el paradigma de variación antigénica de que los dominios variables son inmunodominantes. En el caso de VIsE, sin embargo, el inmunodominio de la región variable de moléculas de VIsE individuales puede ser difícil de alcanzar, para el procedimiento de recombinación que es la base del mecanismo de variación de VIsE ocurre muy rápidamente [J. R. Zhang et al., Infect. Immun., 66: 3869-3697)]. A pesar de la fuerte antigenicidad, ninguna región variable en ningún momento pudo ser representada en un número de células bacterianas suficientemente grande, o de otra manera, ser expresado lo suficientemente, para hacerse inmunodominantes. De hecho, en los 4 primeros días PI, no menos de 11 cambios de aminoácidos predichos por variante de VIsE pueden ocurrir durante una infección de B31 de B. burgdorferi en ratones C3H/HeN [Zhang, citado anteriormente], y a diferencia de T. brucei, N. gonorrhoeae y B. hermsii, los serotipos de VlsE de B. burgdorferi nunca han sido encontrados.

El hecho de que IR_{6} esté expuesto en la superficie de VIsE, pero no en la superficie de las espiroquetas está de acuerdo con la antigenicidad y el inmunodominio de esta región. Las propiedades características de los dominios de las proteínas tales como la accesibilidad superficial, la hidrofilia, la flexibilidad y la proximidad a un sitio reconocido por las células T son todas importantes en la determinación positiva de la antigenicidad del dominio [J. A. Berzofsky y I. J. Berkower, Immunogenicity and antigen structure, en "Fundamental Immunology", William E. Paul, ed., Raven Press, Ltd., Nueva York, 235-282 (1993)]. Aunque es posible que la solubilización con Triton X-100 pueda haber desnaturalizado parcialmente el VIsE y así haber expuesto artificialmente IR_{6}, el resultado del experimento de la precipitación inmune indica que IR_{6}, está accesible en la superficie de VIsE natal. Es también hidrófilo, como se evalúa por el algoritmo de Hopps-Woods. La exposición superficial molecular de IR_{6} también fue indicada por el hecho de que una pequeña proporción de espiroquetas no fijadas emitía fluorescencia cuando se incubaba con el anticuerpo anti-C_{6} FITC-marcado.

La mayor parte de las espiroquetas no fijadas fallaron al marcarse con el anticuerpo anti-C_{6} FITC-conjugado. Esto indica que IR_{6} no está expuesto en la superficie de las espiroquetas. La pequeña proporción de espiroquetas no fijadas que se unieron al anticuerpo anti-C_{6} probablemente tenía algún grado de daño de membrana. Aunque el procedimiento de los inventores para marcar espiroquetas no fijadas implicara manipulaciones muy suaves, es posible que partes de la molécula de VlsE no normalmente expuestas en la superficie de las espiroquetas, sin embargo, estuvieran expuestas en una fracción de las espiroquetas. La fragilidad de la membrana externa de B. burgdorferi ha sido señalada por otros investigadores [D. L. Cox et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7973-7978 (1996)]. La pérdida del plásmido Ip28-1, que codifica VIsE, durante el cultivo in vitro [Zhang, Cell, 89: 275-285 (1997)], también podría explicar un resultado de marcaje negativo. Sin embargo, el hecho de que se marcaron casi el 100% de espiroquetas fijadas de acetona a partir del mismo cultivo nos permite excluir esta posibilidad. La fijación de acetona probablemente expuso las regiones de VIsE no accesibles al anticuerpo en las espiroquetas intactas.

El resultado del experimento de ADCK fue completamente compatible con las observaciones inmunofluorescentes, como que la ausencia de inactivación es más probable debido al fracaso del anticuerpo anti-CG de unirse a la superficie de las espiroquetas. La inactivación dependiente del complemento de B. burgdorferi está facilitada por la unión del anticuerpo antisuperficial y no depende de las propiedades C-activantes del anticuerpo. Las espiroquetas de B. burgdorferi son capaces de activar el complemento a través de un mecanismo independiente del anticuerpo [S. M. Kochi et al., Infect. Immun., 61:2532-2536 (1993)]. Tomados juntos, los resultados de la inmunofluorescencia y ADCK indican que IR_{6} se secreta en la superficie de las espiroquetas.

Aunque las regiones variables de antígenos tales como VSG, Vmp o pilin son extremadamente antigénicas, no se ha publicado ninguna antigenicidad fuerte de las regiones invariables de estas moléculas o sus dominios invariables más largos [D. M. Reinitz et al., Mol. Biochem. Parasitol., 51: 119-132 (1992); K. T. Forest et al., Infect. Immun., 64: 644-652 (1996)]. El papel principal atribuido tanto a las regiones invariables como a los dominios ha sido la conservación de conformaciones moleculares funcionales [Reinitz, citado anteriormente; Forest, citado anteriormente]. Se ha especulado que la exposición de huésped crónica a antígenos inmunodominantes o epítopos desvía al sistema inmunológico de responder a antígenos menos antigénicos pero funcionalmente importantes o epítopos, sirviendo así como una estrategia protectora para patógenos persistentes [P. Marrack y J. Kappler, Cell, 76:323-332 (1994)]. Recientemente, fue demostrado que cuando el epítopo del bucle V3 inmunodominante de la glicoproteína 120 (gp120) del virus de la inmunodeficiencia humana 1 está enmascarado por mutagénesis dirigida de glicosilación N-unida, la respuesta del anticuerpo neutralizante dominante, tipo-específica es cambiada lejos de V3 a epítopos en el primer dominio variable (V1) de gp120 [R. R. Garrity et al., J. Immunol., 159: 279-289 (1997)]. Las respuestas inmunes a los dominios conservados de gp120 también fueron observadas [Garrity et al., citado anterior-
mente].

El papel de la antigenicidad y el inmunodominio de IR_{6} debe actuar como un epítopo de señuelo y contribuir a destruir la respuesta del anticuerpo frente a B. burgdorferi. Las regiones variables de VlsE no se vuelven, o no se hacen siempre, inmunodominantes. La variación antigénica de VIsE puede servir para inhibir la formación de anticuerpos de alta avidez frente a las regiones de VIsE variables, pero no desviar la respuesta de las regiones de VIsE invariables y dominios invariables u otros anticuerpos de B. burgdorferi menos antigénicos pero funcionalmente neutralizantes. Sólo aproximadamente la mitad de la longitud de la proteína de VIsE madura es variable, comparado con más de dos terceras partes de proteínas tales como VSG, pilin o VMP. Además, más de la mitad del dominio variable de VlsE está abarcada por regiones invariables incluyendo la IR_{6} altamente inmunodominante. Las regiones conservadas de VlsE distintas a IR_{6} pueden ser expuestas así, por la fuerza, en la superficie de la espiroqueta. IR_{6} sirve como el epítopo de señuelo para tales dominios, suprimiendo las respuestas inmune-protectoras por mecanismos tales como la restricción clonal y/o la desregulación idiotípica, como se ha descrito para sV3 del VIH-1 [H. Kohler et al., J. Acquired Immune Defic. Syndr., 5: 1158-1168 (1993: R. Metals y V. Veljkovic, Vaccine, 13: 355-359
(1995)].

Ejemplo 8 Un ELISA basado en IR_{6} para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme

La especificidad diagnóstica y la sensibilidad del ELISA del péptido C_{6} descrito en el Ejemplo 1G fueron examinadas, como se describe en este ejemplo. Estos datos demuestran que el ELISA es un ensayo simple, sensible, específico y exacto que reduce algunos de los problemas restantes en la serodiagnosis de la enfermedad de Lyme. Su péptido sintético lo hace barato de fabricar y lo hace útil para el diagnóstico hasta en sujetos vacunados con
OspA.

Como se usa en este documento, la Sensibilidad es definida como positivos verdaderos/positivos verdaderos + negativos falsos, la Especificidad como negativos verdaderos/negativos verdaderos + positivos falsos, la precisión como la frecuencia para obtener el mismo resultado en dos análisis por duplicado como un grupo de muestras positivas y negativas. La enfermedad de Lyme tardía precozmente localizaday precozmente diseminada se definen en A. Steene, N. Engl. J. Med., 321: 586-596 (1989). Valor predictivo positivo como positivos verdaderos/positivos verdaderos + positivos falsos y valor predictivo negativo como negativos verdaderos/negativos verdaderos + negativos
falsos.

A. Fuentes de suero y ELISA de péptido 1. Muestras de suero de mono

Fueron infectados monos rhesus (de 2 a 4 años, Macaca mulatta) por la picadura ninfal de la garrapata Ixodes scapularis (9 animales), o por inoculación inyectada (1 animal) como se ha descrito antes [Philipp et al., Infect. Immun., 61: 3047-3059 (1993)]. Las garrapatas alimentadas a los animales estaban infectadas por las espiroquetas de cualquiera de las cepas JDI (Philipp et al., 1993, citado anteriormente) o B31 [Philipp et al., Vaccine, 15: 1872-1887 (1997)] de B. burgdorferi sensu stricto. El animal inoculado por inyección recibió las espiroquetas JD1. Las muestras de sangre fueron recogidas cada una o dos semanas después de la inoculación y las muestras de suero fueron almacenadas a -20ºC hasta que fue llevado a cabo el ELISA de péptido. Para evaluar la reactividad no específica del péptido C_{6} con anticuerpos anti-OspA, fueron utilizadas muestras de suero de animales a los que se les había sido administrados una vacuna OspA [Philipp et al., citado anteriormente, (1997)]. La formulación de vacuna y el protocolo de administración, que también había sido usado en ensayos humanos [C. Van Hoecke et al., Vaccine, 14: 1620-1626 (1996)] han sido descritos previamente [Philipp et al., citado anteriormente, (1997)].

2. Muestras de suero humanas

Muestras de suero humanas fueron obtenidas a partir de una variedad de fuentes. Para evaluar la sensibilidad diagnóstica, fueron usados tres paneles de suero de pacientes con la enfermedad de Lyme. Una era de los "Centers for Disease Control and Prevention", amablemente proporcionado por el Doctor Martin Schriefer; un segundo panel era de pacientes del "Tufts-New England Medical Center"; un tercer panel era de los "National Institutes of Health". El panel de suero CDC estaba compuesto de 40 muestras de pacientes que estaban en la fase convaleciente de la enfermedad de Lyme. Veintisiete de estas muestras fueron también confirmadas por cultivo. Todos las muestras de suero en este panel eran de pacientes cuyo caso satisfizo la definición de caso de la enfermedad de Lyme de los CDC ["Centers for Disease Control and Prevention", Morb. Mort. Wkly Rep., 46: 20-21 (1997)]. Además, todas las muestras habían sido analizadas en los CDC con los kits disponibles comercialmente: el ELISA fue realizado con Lyme Screen II (bioMerieux, San Loius, MO) e IgG e IgM con Marblot (MarDx, Carlsbad, CA). El panel del "Tufts-New England Medical Center" estaba compuesto de 157 muestras, de las que 39 eran de pacientes en la fase aguda de la enfermedad de Lyme. Estos pacientes estaban en la fase precoz (localizada o diseminada) de la enfermedad de Lyme. También en este panel había 39 muestras de individuos en fase convaleciente, 20 de los pacientes que habían presentado signos y/o síntomas de fase precoz diseminada que habían presentado signos y/o síntomas de neuroborreliosis precoz, y 59 de los pacientes con enfermedad de Lyme tardía (49 con artritis de Lyme, y 10 con neuroborreliosis tardía). Todos los pacientes en el panel de Tufts cumplieron los criterios clínicos para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme, como se describe antes [F. Dresser et al., J. Infect. Dis., 167: 392-400 (1993)]. El panel del NIH estaba compuesto de 13 muestras obtenidas de pacientes con la enfermedad de Lyme después del tratamiento, definido como síntomas persistentes o intermitentes durante al menos 6 meses después de la terapia con antibióticos apropiada para la enfermedad de Lyme. Síntomas habituales incluyen dolor extendido musculoesquelético y fatiga; daños de la memoria y/o concentración, dolor radicular, parestesia o distesia. El inicio de los síntomas coincide con, u ocurre 6 meses antes de, la infección inicial de B. burgdorferi. Los síntomas son bastante significativos para interferir con actividades de la vida diaria, y se han excluido otras causas. Todas estas muestras cumplieron los criterios CDC para la seropositividad [US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, Morb. Mortal. Wkly Rep., 44: 590-591 (1995)].

Para examinar la especificidad diagnóstica del ELISA del péptido, un panel de 56 muestras de suero fue obtenido a partir de pacientes con enfermedades autoinmunes o neurológicas, enfermedades de espiroqueta distintas a la Borreliosis de Lyme, u otras infecciones crónicas fueron obtenidos del NIH. Los sueros eran de pacientes con esclerosis múltiple (n=10), anticuerpos anticardiolipin positivos (n=10), factor reumatoide positivo (n=10), reagina en plasma rápido positivo (n=10), anticuerpo antinuclear positivo (n=10), síndrome de Guillain-Barre (n=1) o infección micobacteriana (n=5). Un segundo panel, obtenido del CDC estaba compuesto de 9 muestras de suero de pacientes con fiebre recurrente. Un tercer panel de 12 muestras de suero con sífilis adicional, (9 de pacientes con enfermedad precoz latente y 3 con tardía latente) fue obtenido del banco de suero de sífilis mantenido en la Universidad de California en Los Angeles (UCLA); cada muestra de suero fue positiva por el ensayo de inmovilización del treponema pálido. Finalmente, un panel de 99 muestras fue obtenido a ciegas de pacientes de un hospital en Luisiana, donde no se conoce que la enfermedad de Lyme sea endémica.

3. ELISA de péptido

El péptido C_{6} fue sintetizado como se describe en el Ejemplo 1 anterior. El ELISA de péptido fue realizado como se describe en el Ejemplo 1 anterior. El valor de OD (0,500) de recorte fue definido como el promedio de OD + 3 desviaciones típicas a partir de 97 muestras de suero recogidas de los pacientes de un hospital de Luisiana (donde la enfermedad de Lyme no es endémica).

B. Respuesta de IgG precoz y persistente frente a C_{6} en monos rhesus infectados

Muestras de suero recogidas en serie de diez monos que habían sido inoculados con cepasB31 o JD 1 de B. burgdorferi fueron analizadas por ELISA por sus respuestas inmune frente a C_{6}. El anticuerpo frente a IgG fue detectable en 7 animales tan pronto como 3 semanas después de la inoculación. En la semana 5 después de la inoculación 9 animales habían respondido, y todos en la semana 6. El anticuerpo frente a C_{6} permaneció con altos niveles en todos los animales durante el período de estudio entero, que fue entre 25 y 160 semanas. Sólo se muestran las muestras de suero de monos infectados con JD1. Las respuestas inmunes anti-C_{6} de IgM fueron detectables sólo en algunos de los animales y no aparecieron antes que las respuestas de IgG correspondientes.

C. Sensibilidad del ELISA de C_{0}

Cuarenta muestras de suero obtenidas por los CDC de pacientes en la fase convaleciente de borreliosis de Lyme fueron evaluadas con el ELISA de C_{6}.

TABLA 3

5

Treinta y cuatro fueron positivos (Tabla 3), proporcionando así una sensibilidad de detección del 85%. Una evaluación de las mismas muestras realizadas en los CDC proporcionó una sensibilidad del 80% (32/40) con un ELISA convencional y 75% (30/40) con la combinación tanto de inmunotransferencias de IgG como de IgM.

Ciento cincuenta y nueve muestras de suero adicionales recogidas de pacientes con fases diferentes de la enfermedad de Lyme en el "Tufts-New England Medical Center" también fueron evaluadas con el ELISA de C_{6}. La sensibilidad fue del 74% (29/39) para pacientes en la fase de la enfermedad aguda, 90% (35/39) para pacientes en fase convaleciente, 95% (19/20) para pacientes con la enfermedad de Lyme precoz diseminada (neuroborreliosis), y 100% (59/59) para tardía, respectivamente (Tabla 3). De estos, 49 tenían artritis de Lyme tardía y 10 tenían neuroborreliosis tardía (Tabla 3). Todos los pacientes "agudos" en este panel tenían signos de infección localizada (eritema migratoria) y algunos tenían, además, signos o síntomas de infección diseminada. Un análisis de la fracción anti-C_{6}-anticuerpo-positivo de muestras de suero tomadas en las semanas consecutivas después del inicio de signos/síntomas mostró que el 80-90% de las muestras tomadas en 3 semanas o más tarde después del inicio de la enfermedad eran positivas. Un ensayo adicional de 13 muestras de suero recogidas de pacientes con enfermedad de Lyme crónica proporcionó una sensibilidad del 62% (8/13) (Tabla 3).

Fueron empleados muestras de suero en fase aguda y convaleciente del Panel 2 para examinar la respuesta inmune del IgM frente a C_{6}. De las 39 muestras en cada categoría, ninguna era sólo positiva del anticuerpo de IgM, 16 muestras "agudas" y 10 "convalecientes" eran tanto positivas del anticuerpo de IgG como del IgM, y 13 y 25 fueron sólo positivas frente al anticuerpo de IgG en las categorías agudas y convalecientes, respectivamente.

La sensibilidad del ELISA de C_{6} estaba en el intervalo de 62% a 100% dependiendo de cuando fueron recogidas en el curso de la infección las muestras de suero, y de la definición clínica de los signos y síntomas de los pacientes (Tabla 3). Basado en los resultados de los análisis longitudinal de los inventores de la respuesta del anticuerpo anti-C_{6} en monos rhesus infectados, es improbable que tal respuesta pueda ser detectable con una buena sensibilidad antes de una a dos semanas después de la infección. Sin embargo, antes de la semana 5 después de la infección, el 90% de los animales había respondido. Este resultado es compatible con lo obtenido con el panel de suero "agudo" (Panel 2, Tufts), que mostraba que un 80% o más de los pacientes cuyo suero había sido recogido 3 o más semanas después del inicio de la enfermedad eran positivos con el ELISA de C_{6}. Con el panel de suero de CDS de 40 muestras de pacientes convalecientes, la sensibilidad del ELISA de C_{6} (85%) era ligeramente más alta que la del ELISA convencional (80%) y más alta que la combinación de la inmunotransferencia de IgG y IgM (75%). Una sensibilidad inferior fue obtenida con muestras de suero recogidas durante la fase aguda de la enfermedad de Lyme (74%), con las 30 muestras de "Tufts-New England Medical Center". Sin embargo, sólo 3 de estos pacientes permanecieron negativos en la fase convaleciente. La cuarta muestra negativa entre las muestras de fase convaleciente había sido positiva cuando se obtuvo durante la fase aguda. La posibilidad de hacer un diagnóstico precoz analizando la respuesta de IgM frente a C_{6} tanto en monos como en seres humanos fue explorada. En tal caso, no fue observada ninguna respuesta inmune frente a IgM en ausencia de una respuesta de IgG, no importa cuanto antes después de la infección o al inicio de la enfermedad las muestras de suero habían sido recogidas.

En general, y como se espera a partir de los resultados obtenidos con monos rhesus en el progresos de la infección en estos animales, la sensibilidad de la detección del anticuerpo anti-C_{6} era más alta en seres humanos con las formas tardías de la enfermedad de Lyme. Para pacientes en la fase diseminada precoz (neuroborreliosis), la sensibilidad era del 95%, y del 100% para pacientes con enfermedad de Lyme tardía (Tabla 3). La excepción fue para las muestras de pacientes con síndrome de la enfermedad de Lyme después del tratamiento, que fueron sólo 62% positivas (Tabla 3). Los pacientes en este grupo tenían una historia de la enfermedad de Lyme y a pesar de haber recibido terapia con antibióticos, tenían síntomas de la enfermedad de Lyme persistentes. La etiología de estos síntomas está actualmente en investigación en el NIH.

C. Especificidad de ELISA de C_{6}

El ELISA de C_{6} proporcionó una especificidad del 100% cuando las muestras de suero de pacientes con otras infecciones crónicas o enfermedades autoinmunes fueron analizadas (Tabla 4). Este panel incluyó 9 muestras de pacientes con fiebre recurrente (CDC), 22 muestras de paciente con sífilis (10 del NIH y 12 de la UCLA), y 46 muestras de pacientes con esclerosis múltiple, anticuerpos anticardiolipin positivos, factor reumatoide positivo, reagina en plasma rápido positivo, anticuerpo antinuclear positivo, síndrome de Guillain-Barré o con infección micobacteriana (NIH). Sólo dos resultados potenciales positivos falsos fueron obtenidos cuando un grupo de 99 muestras de suero humanas recogidas al azar en un hospital local en Luisiana, EE.UU., fueron analizadas (Tabla 4). La enfermedad de Lyme no es endémica en Luisiana, pero la identidad de los pacientes y su historia clínica es desconocida.

En la tabla siguiente, se usan las abreviaturas: MS, esclerosis múltiple; ACA, anticuerpo anticardiolipin positivo; RF, factor reumatoide positivo, RFR, reagina en plasma rápido positivo, ANA, anticuerpo antinuclear positivo; GBS, síndrome de Guillan Barre; Myco, infección micobacteriana.

TABLA 4

6

Estos datos demuestran que el ELISA de C_{6} es notablemente específico (Tabla 4). Éste podía discriminar entre la borreliosis de Lyme e infecciones con espiroquetas de especies diferentes, pero del mismo género (B. hermsii) o familia (T. pallidum). Además, ninguna de las muestras de pacientes con enfermedades autoinmunes o enfermedades que a menudo necesitan ser diagnosticadas diferencialmente respecto a la enfermedad de Lyme, tal como la esclerosis múltiple o el síndrome de Guillain-Barre fueron positivas con el ensayo de C_{6}. Sólo 2 de 99 muestras de sueros de un hospital local en Luisiana, donde la enfermedad de Lyme no es endémica, proporcionaron un resultado de ELISA de C_{6} positivo. Considerando que las muestras fueron recogidas al azar a partir de pacientes desconocidos, es imposible evaluar si estos dos pacientes podían haber estado expuestos a B. burgdorferi. Los resultados de especificidad obtenidos son apoyados por el hallazgo de los inventores de que, excepto para el casete de Vls de espiroquetas de Lyme, ninguna otra secuencia homóloga a C_{6} pudo ser identificada (utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST) en la base de datos de secuencias de proteínas del "National Center for Biotechnology". La alta especificidad diagnóstica es extremadamente crítica para mejorar el valor positivo predictivo de un ensayo, especialmente cuando la incidencia de una enfermedad es muy baja. El predominio de la enfermedad de Lyme en la mayor parte de las zonas endémicas es de menos del 0,01%; la tasa de incidencia más alta en EE.UU, es del 0,09% en Connecticut [Lightfoot et al., Ana Intern Med., 119: 503-509 (1993); Tugwell et al., Ana Intern Med., 127: 1109-1123 (1997)]. La especificidad total del ELISA de C_{6} fue del 99% y los valores positivos y negativos predictivos fueron del 99% y del 89%, respectivamente.

La parte de casete del VIsE contiene 6 regiones invariables (IR) esparcidas por un número igual de regiones variables [Zhang et al., Cell, 89: 275285 (1997)]. La última, por su misma naturaleza, no tiene ningún valor diagnóstico. Las 5 IR_{s} adicionales no están tan conservadas como IR_{6}. Sin embargo, los inventores evaluaron si las IR_{s} (IR_{1-5}) restantes podían contribuir a mejorar el funcionamiento diagnóstico de C_{6}, cuya secuencia está basada en la de IR_{6}. Ninguna respuesta del anticuerpo frente a los péptidos que reproducen las secuencias de IR_{1-5} fueron detectadas en seres humanos o monos infectados por B. burgdorferi (datos no mostrados). En base a esto los inventores concluyeron que ninguna mejora sería mayor al incorporar cualquiera de estos péptidos en el ensayo.

Como se espera, las muestras de suero de mono que contenían anticuerpo anti-OspA con altos títulos no reaccionaron con C_{6}. Este ELISA, por lo tanto, es adecuado en sueros de OspA-vacuna. Además, debido a su simplicidad y a la alta especificidad y sensibilidad, el ELISA de la presente invención alivia los problemas hasta ahora insuperables de la serodiagnosis de la enfermedad de Lyme.

Ejemplo 9 Diagnóstico de la enfermedad de Lyme usando el ELISA de la invención independientemente de la infección de genoespecies de Borrelia

La serodiagnosis de la enfermedad de Lyme está en parte obstaculizada por el polimorfismo de las proteínas antigénicas de B. burgdorferi. En Europa este problema es más serio ya que todas las tres genoespecies patógenas son frecuentes. Los estudios proporcionados en esta sección de ejemplos demuestran que el IR_{6} inmunodominante de VIsE está antigénicamente conservado entre las tres genoespecies de B. burgdorferi y puede servir como una sonda universal para la serodiagnosis de la enfermedad de Lyme. En este ejemplo fueron investigadas cepas europeas.

A. Fuentes de suero humanas

Dos fuentes de suero humano fueron utilizadas en este estudio, una de Austria y otra de Italia. Cada fuente proporcionó dos paneles, una de pacientes con enfermedad de Lyme precoz y la otra de pacientes con manifestaciones tardías de la enfermedad. El panel de suero inicial de Austria estaba compuesto de 29 muestras recogidas en serie de 11 pacientes con eritema migratorio (EM). Un kit ELISA comercial fue usado según las instrucciones del fabricante (DAKOPATTS A/S, Copenhague, Dinamarca) para analizar las muestras de suero de pacientes austriacos con enfermedad de Lyme precoz. El antígeno era proteína flagelar nativa purificada a partir de la cepa DK-1 de B. afzelii cultivada. Un kit de ensayo de inmunotransferencia comercial (MRL Diagnostics, Cypress, CA) fue empleado para analizar el panel de suero austriaco obtenido de pacientes con enfermedad de Lyme precoz, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El antígeno consistía en sonicados de células enteras de la cepa 20047 de B. garinii cultivada. Un ensayo fue considerado positivo cuando al menos una de las bandas de IgM de 23- o 39-kDa o cuatro de las bandas de IgG de 21-, 23-, 37-, 39-, 41-, 45-, o 93-kDa eran visibles en las inmunotransferencias. Pacientes austriacos con enfermedad de Lyme precoz cuyas biopsias de la piel fueron cultivadas (todos excepto uno), eran cultivos positivos. El panel de suero tardío de esta fuente consistió en 21 muestras de 21 pacientes IgG seropositivos con acrodermatitis crónica atrófica (ACA) clínicamente e histológicamente diagnosticada.

El panel italiano de muestras de suero precoces consistía en 20 muestras recogidas en serie de 13 pacientes EM con cultivo confirmado de la infección por B. burgdorferi. Para analizar las muestras de suero de pacientes italianos con la enfermedad de Lyme precoz con mayor sensibilidad, tres cepas locales de BITS de B. garinii, BL3 de B. afzelii y Alcaide de B. burgdorferi sensu stricto fueron utilizadas individualmente como una fuente de antígenos de la inmunotransferencia. Los anticuerpos anti-B. burgdorferi fueron sondados con anticuerpos de IgG o IgM antihumano de cabra como anticuerpos secundarios. Un diagnóstico fue hecho basado en los criterios descritos antes [U. Hauser et al., J. Clin. Microbiol., 35: 1433-1444 (1997); M. Cinco et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 12: 217-222 (1995)]. Las muestras de suero crónicas de Italia eran de 20 pacientes con signos clínicamente diagnosticados y síntomas que eran compatibles con neuroborreliosis tardía, artritis o ACA. Fueron recogidas muestras precoces en serie comenzando en el inicio de la enfermedad y siguiendo a partir de ahí durante 3 meses, durante y después del tratamiento con antibióticos.

B. ELISA basado en péptido

C_{6} (CMKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK, SEQ IDNO: 8), fue sintetizado y conjugado con biotina como se describe en el Ejemplo 1E anterior. El ELISA fue realizado como se describe en Ejemplo 1G, usando las muestras de suero humanas del Ejemplo 9A. La reacción antígeno-anticuerpo fue sondada usando un sistema de sustrato de peroxidasa y la densidad óptica (OD) fue medida a 450 nm.

C. Sensibilidad del ELISA de C_{6} en pacientes con enfermedad precoz de Lyme

Veinte de 23 pacientes con EM confirmada por cultivo (87%) tenían una respuesta inmune detectable frente a anti- IR_{6}. Un paciente (A3) con EM positiva fue negativo con el ELISA de C_{6}. Ningún cultivo fue realizado con este paciente. Los resultados obtenidos con el ELISA estándar y las inmunotransferencias indican que el ELISA de C_{6} es más sensible que cualquiera de estos análisis, usados solos o combinados, para detectar una infección precoz (panel austriaco). El ELISA C_{6} también funcionó, en términos de sensibilidad diagnóstica, mejor que cualquiera de las tres preparaciones del antígeno que fueron usadas para diagnosticar el panel de suero italiano. El aislamiento bacteriano y la clasificación revelaron que los pacientes fueron infectados con cepasde B. garinii o B. afzelii. Este resultado proporcionó una prueba adicional de que IR_{6} está antigénicamente conservado a través de las barreras de genoespecies del complejo de B. burgdorferi sensu lato.

D. Sensibilidad del ELISA de C_{6}, para la serodiagnosis de la enfermedad de Lyme tardía

Veinte de 21 pacientes (95%) con ACA histológicamente confirmada y los ensayos serológicos de IgG estándar positivos mostraron una fuerte respuesta inmune frente a IR_{6}. Una sensibilidad del 70% (14/20) fue obtenida cuando fue analizado un panel de sueros de pacientes con signos y/o síntomas compatibles con la enfermedad de Lyme tardía. Estos 14 resultados positivos incluyeron a 3 pacientes (3/4) con artritis tardía, 8 (8/12) con manifestaciones neurológicas tardías, y 3 (3/4) con ACA, indicando que el ELISA de C_{6} era capaz de detectar las diferentes manifestaciones que podrían estar causadas por varias cepas de B. burgdorferi. Sin embargo, debe ser advertido que el diagnóstico clínico de la enfermedad de Lyme tardía puede ser difícil debido a la ausencia de criterios bien definidos.

E. Discusión

Las infecciones experimentales de monos y ratones con las cepas B31, JD1, NT 1 o Sh-2-82 de B. burgdorferi sensu stricto han sido encontradas que producen una respuesta inmune precoz, fuerte y persistente frente a IR_{6}. Todas estas cepas habían sido aisladas en los Estados Unidos. En otro experimento, los ratones respondieron fuertemente a IR_{6}, independientemente de si fueron infectados por las cepas de B. garinii o B. afzelii por garrapata o inoculación inyectadas. En el estudio descrito en este Ejemplo, fueron obtenidas sensibilidades del 83% (20/24) y 95% (20/21) para pacientes europeos con la enfermedad de Lyme clínicamente bien definida precoz (EM, confirmada por cultivo) y tardía (histológicamente confirmada) (ACA), respectivamente.

Varios grupos independientes han notado que los pacientes europeos muestran respuestas inmunes restringidas frente a antígenos de B. burgdorferi, lo que contribuye en parte a la relativamente inferior sensibilidad en la serodiagnosis europea. Esta diferencia no fue evidente cuando fue usado el ELISA C_{6}, ya que fueron obtenidas sensibilidades diagnósticas similares con muestras de suero norteamericanas [véanse los ejemplos iniciales] y europeas. La excepción fue el panel de muestras de suero recogidas de los pacientes italianos con síntomas crónicos, con los cuales el ELISA de C_{6} proporcionó una sensibilidad de sólo el 70%. El diagnóstico clínico de la enfermedad de Lyme tardía está compuesto por la ausencia de signos patognomónicos y la imposibilidad virtual de confirmar el diagnóstico por cultivo.

La serodiagnosis de la enfermedad de Lyme además está obstaculizada por la baja especificidad de los ensayos existentes. Esto puede estar causado por antígenos no específicos compartidos entre B. burgdorferi y otras bacterias patógenas o no patógenas. Entre estos antígenos son homólogos de las omnipresentes proteínas de choque de calor bacterianas, la flagelina, que está compartida con otras espiroquetas tales como Borrelia hermsii y Treponema pallium, y un antígeno de 60-kDa que es expresado por un amplio rango de bacterias. Otras infecciones bacterianas pueden así producir los anticuerpos que reaccionan con los antígenos de B. burgdorferi, causando falsos resultados positivos. En contraste con las técnicas diagnósticas convencionales, el ELISA de C_{6} es altamente específico. Ninguna de las setenta y siete muestras de suero de pacientes infectados por B. hermsii, la espiroqueta que causa fiebre recurrente, o T. pallidum, el agente de la sífilis, o que padecen de otras infecciones crónicas o enfermedades tales como la tuberculosis y la esclerosis múltiple, contenían el anticuerpo detectable frente a C_{6}. Además, excepto el VlsE de B. burgdorferi, ningún otro homólogo de las secuencias de proteína frente a IR_{6} pudo ser identificado por las búsquedas del BLAST en el "National Center for Biotechnology Information".

Recientemente, la iniciación de la inmunoprofilaxis de la enfermedad de Lyme en seres humanos por el uso de la vacuna de OspA (proteína superficial externa A) ha hecho anticuado a los ensayos diagnósticos basados en antígenos de células enteras, ya que estas preparaciones incluyen OspA. De hecho, el ELISA de C_{6} no detecta a los anticuerpos anti-OspA. Por ello, la aprobación y el uso de la vacuna OspA en Europa no afectará al funcionamiento del ELISA descrito en este documento. Además, el ELISA de la invención será adaptado fácilmente para proporcionar una lectura estrictamente cuantitativa, o un tipo más rápido con una lectura semicuantitativa.

Ejemplo 10 ELISA basado en el péptido para diagnóstico de la enfermedad de Lyme canina

Borreha burgdorferi, el agente etiológico de la enfermedad de Lyme, es capaz de infectar una variedad de especies mamíferas, incluyendo perros. De los animales domésticos, los perros tienen el mayor riesgo de verse infectados por B. burgdorferi y se han recomendado como animales de laboratorio para la enfermedad de Lyme humana. Debido a la carencia de signos diferenciales tales como el eritema migratorio en perros infectados, los métodos de laboratorio son muy importantes para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme canina. En este estudio, fueron analizados sueros recogidos de perros experimentalmente infectados por B. burgdorferi por la inoculación con garrapata respecto a su respuesta inmune en las seis regiones invariables (IR_{s}) de VlsE, el antígeno superficial variable de B. burgdorferi, por ensayos inmunoabsorbentes ligado a enzimas a base de péptido (ELISA). Dos IR_{s}, IR_{2} e IR_{6}, fueron encontrados que eran inmunodominantes. Estudios de respuesta inmune en serie revelaron que la respuesta del anticuerpo frente a IR_{6} aparecía más rápidamente y era más fuerte que la respuesta frente a IR_{2} lo que sugiere que IR_{6} solo era suficiente para la serodiagnosis. El ELISA basado en el péptido de IR_{6} (C_{6}), cuando solo fue usado C_{6} como antígeno, mostró una respuesta inmune significativa en el 35% (7/20) de perros tan pronto como 3 semanas después de la infección. Todos los perros (n=33) se volvieron fuertemente positivos una semana más tarde, y esta respuesta persistió para el estudio entero, que duró 18 meses. Cuando fueron usados tanto C_{2} como C_{6} combinados como antígenos de ELISA la sensibilidad para detectar el anticuerpo específico en perros experimentalmente infectados y/o en clínicamente positivos no pudo ser mejorada más. Estos resultados excluyeron la necesidad de incluir C_{2} como antígeno diagnóstico. Además, C_{6} solo dio una sensibilidad similar como diagnóstico de inmunotransferencia convencional o ELISA cuando fueron analizadas muestras clínicas. Además, el ELISA de C_{6} causó una especificidad del 100% con muestras de sangre recogidas de 70 perros sanos de una zona donde la enfermedad de Lyme no era endémica, 13 perros con otras infecciones, y 10 animales vacunados con vacunas de espiroqueta entera o OspA. Por lo tanto, esta sonda sola puede ser sensible y específica para la serodiagnosis de la enfermedad de Lyme canina.

<110> Los Administradores del "Tulane Educational Fund"

\hskip1cm

Philipp, Mario T.

\hskip1cm

Liang, Fang Ting

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Péptidos y ensayos para el diagnóstico de la enfermedad de lyme y composiciones útiles para su prevención

\vskip0.400000\baselineskip

<130>TUL3APCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/300.971

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-04-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: proteína IR_{6}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala Ala Met Val Leu Arg Gly Met}

\sac{Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Ala Ile Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: proteína IR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: proteína IR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile Lys Gly Ile Val Asp Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: proteína IR3

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Lys Leu Phe Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: proteína IR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Gly Lys Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Val Ser Gly Glu Gln}

\sac{Ile Leu Lys Ala Ile Val His Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: proteína IR5

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido C6

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala Ala Met Val Leu Arg Gly}

\sac{Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Listado de secuencias

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Los Administradores del "Tulane Educational Fund"

\hskip1cm

Philipp, Mario T.

\hskip1cm

Liang, Fang Ting

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Péptidos y ensayos para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme y composiciones útiles para su prevención

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> TUL3APCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/USOO/11085

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-04-25

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/300.971

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-04-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína IR6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala Ala Met Val Leu Arg Gly Met}

\sac{Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Ala Ile Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína IR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína IR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile Lys Gly Ile Val Asp Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína IR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Lys Leu Phe Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína IR4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Gly Lys Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Val Ser Gly Glu Gln}

\sac{Ile Leu Lys Ala Ile Val His Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212>PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína IR5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido C6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala Ala Met Val Leu Arg Gly}

\sac{Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia garinii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asn Asn Asp His Asp Asn His Lys Gly Thr Val Lys Asn Ala Val}

\sac{Asp Met Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>10

9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Borrelia burgdorferi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

Claims (16)

1. Un péptido, aislado a partir de material celular con el cual está naturalmente asociado o producido recombinantemente o por la síntesis química, cuyo péptido es tanto:

(a)

un péptido seleccionado a partir de:

\hskip0.7cm

14

(b)

un análogo de (a) que tiene sustituciones conservadoras en hasta cuatro aminoácidos;

(c)

un homólogo de (a) con una identidad de al menos el 90 % de ello; y/o

(d)

un fragmento de (a), (b) o (c) que comprende al menos 8 aminoácidos en longitud,

siendo dicho péptido capaz de unirse a un fluido biológico de un paciente con anticuerpos de la enfermedad de Lyme.

2. Un péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido es:

\hskip0.2cm

15

3. Un péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido se selecciona a partir de:

\hskip0.2cm

16

4. Un péptido de la reivindicación 1 acoplado a un vehículo inmunogénico.

5. Una proteína de fusión que comprende un péptido de parte (a) o parte (b) de la reivindicación 1 fusionada a una pareja de fusión, seleccionada a partir de IR_{1}

\hskip0.2cm

17

6. Un péptido de la reivindicación 4 o la reivindicación 5 que tiene un marcador detectable.

7. Una composición que comprende un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 fusionado en su extremo N-terminal o C-terminal a un péptido seleccionado a partir de OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC y BmpDde Borreha burgdorferi.

8. Un reactivo diagnóstico que comprende un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un marcador detectable o un vehículo inmunogénico al cual el péptido está acoplado.

9. Un reactivo diagnóstico que comprende un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 adsorbido a una placa de microtítulo.

10. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

11. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, operativamente unido a una secuencia control de expresión heteróloga que permite la expresión de dicho péptido.

12. Una célula huésped que contiene un vector de la reivindicación 11.

13. Un anticuerpo aislado, sintético, monoclonal, o recombinante que se une específicamente a un péptido de las reivindicaciones 1 a 3.

14. El uso de un péptido de la reivindicación 1 a 3 en la preparación de una composición para la detección de la enfermedad de Lyme en un mamífero.

15. El uso de una secuencia de ácidos nucleicos aislada de la reivindicación 10 o un vector de la reivindicación 11 en la preparación de una composición para la detección de la enfermedad de Lyme en un mamífero.

16. El uso de un anticuerpo de la reivindicación 13 en la preparación de una composición para la detección de la enfermedad de Lyme en un mamífero.