ES2277341T3 - Anticuerpo bioespecifico para tratar el linfoma de linfocitos b y linea celular. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION DESCRIBE ANTICUERPOS BIESPECIFICOS CON ACTIVIDAD CITOTOXICA SELECTIVA CONTRA CELULAS B MALIGNAS. LOS ANTICUERPOS BIESPECIFICOS SE UNEN A UN ANTIGENO DE UNA CELULA EFECTORA Y A UNA PROTEINA HETERODIMERICA DE 28/32 KDA DE LA SUPERFICIE DE LA CELULA B MALIGNA. LA INVENCION INCLUYE TAMBIEN LOS COMPONENTES MONOESPECIFICOS DE LOS ANTICUERPOS BIESPECIFICOS, LAS VERSIONES HUMANIZADAS DE LOS MISMOS, Y LOS ANTICUERPOS BIESPECIFICOS HUMANIZADOS. LA INVENCION DESCRIBE ADEMAS METODOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO QUE EMPLEAN ESTOS ANTICUERPOS.
Description
Anticuerpo bioespecífico eficaz para tratar el
linfoma de linfocitos B y línea celular.
La administración de anticuerpos monoclonales
(MoAb) se ha mostrado prometedora como una nueva modalidad de
tratamiento para el cáncer humano. Sin embargo, la destrucción de
las células cancerosas por MoAb no siempre se produce, incluso
después de la unión lograda del anticuerpo con las células diana. Un
segundo método de inmunoterapia del cáncer implica la manipulación
del sistema inmunitario celular. Las linfocinas, tales como
IL-2, pueden utilizarse para activar tanto las
células NK como los linfocitos T aislados de la sangre, bazo o de
los propios tumores malignos. Los efectos antitumorales de dichas
células están bien documentados tanto in vitro como in
vivo. La toxicidad de la terapia basada en IL-2
sola puede ser grave y puede limitar mucho la utilidad clínica de
esta terapia.
La inmunoterapia del cáncer que intenta combinar
la especificidad de los anticuerpos con el poder de los linfocitos
activados puede ser más eficaz y menos tóxica. Uno de dichos métodos
consiste en la utilización de anticuerpos biespecíficos para
redirigir la toxicidad de los linfocitos T activados hacia las
células tumorales que expresan el antígeno diana (Ag).
Se han producido varias formas de anticuerpos
biespecíficos. Éstas incluyen BSIgG, que son moléculas de IgG que
comprenden dos cadenas pesadas distintas y dos cadenas ligeras
distintas que son segregadas por los denominados "hibridomas
híbridos", y heteroanticuerpos conjugados producidos por la
conjugación química de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de
diferentes especificidades.
Varios investigadores han evaluado las
estructuras de anticuerpo biespecífico
anti-CD3/antitumor como agentes inmunoterapéuticos.
Segal DM, Urch CE, George, AJT, Jost CR, "Bispecific Antibodies in
cancer treatment" en DeVita VT, Hellman S., Rosenberg SA, (eds)
Biologic Therapy of Cancer Updates (Philadelphia, PA, Lippincott
1992). Dichos estudios han descrito la citolisis in vitro del
carcinoma de las células renales, melanoma, glioma, linfoma,
leucemia y las células que expresan la glucoproteína relacionada con
la resistencia a multifármacos. Los linfocitos periféricos humanos
activados por IL-2 dirigidos por determinados
conjugados de heteroanticuerpos específicos para
anti-CD3/antitumoral se han descrito asimismo para
prevenir el crecimiento de xenotrasplantes de cáncer humano en
ratones lampiños. Los estudios in vitro, e in vivo en
ratones inmunodeficientes que llevan xenotrasplantes humanos han
informado de que determinados anticuerpos biespecíficos son capaces
de bloquear el crecimiento tanto de las células tumorales que
llevan determinados antígenos diana como, en cierta medida, las
células tumorales transeúntes que no son reconocidas por el
anticuerpo terapéutico.
Link y Weiner, 1993 (Blood vol. 81, nº 12, págs.
3343-3349) exponen un anticuerpo biespecífico que
reconoce tanto a CD3 como a un antígeno diana, 1D10 encontrado en
una mayoría de linfocitos B humanos malignos (véase también Link y
Weiner, 1992, Proc. Am. Association for Canc. Res. Annual
Meeting, vol. 33, pág. 345).
La caracterización del antígeno 1D10 de
linfocito B puso de manifiesto que es un polipéptido heterodímero
de las cadenas x y \beta que tienen pesos moleculares de 32 y 28
kD respectivamente. El antígeno fue identificado originalmente
utilizando un anticuerpo (denominado asimismo 1D10) específico para
el antígeno (Gingrich et al., 1990. Blood, vol. 75, nº 12,
págs. 2375-2387).
Kostelny et al., 1992, (J.
Immunology, vol. 148, nº 5, págs. 1547-1553)
exponen un procedimiento para la producción de anticuerpos
biespecíficos. Este procedimiento emplea la utilización de
heterodina que forma péptidos de cremallera con leucina de Fos y
Jun. Los péptidos se vuelven a unir a fracciones de Fab de dos
diferentes anticuerpos monoclonales facilitando de este modo su
asociación dimérica.
Se han expuesto (documento WO 90/07861)
procedimientos para diseñar y generar anticuerpos monoclonales
humanizados que presentan una o más zonas determinantes
complementarias (CDR) procedentes de una inmunoglobulina donante y
una zona marco de una inmunoglobulina humana. Además, el potencial
para utilizar anticuerpos humanizados en terapias mejoradas se ha
considerado asimismo (Joliffe, 1992, Intern. Rev. Immunol.,
vol. 10, 1993, págs. 241-250).
Las membranas celulares de los linfocitos son
únicamente las construidas y determinan dichas características
fenotípicas celulares diversas como la función supresora, inductora
o citolítica de la célula, el estado de activación o la etapa de
diferenciación de la célula, y si la célula pertenece a una
población que es monoclonal o policlonal. La inmensa mayoría de
antígenos de la membrana celular descritos ampliamente de esta
manera en los linfocitos malignos se representan en los linfocitos
no malignos en alguna etapa de diferenciación o activación.
A partir de lo anterior, resulta evidente que
existe necesidad de agentes terapéuticos que se dirijan a un
antígeno encontrado predominante o exclusivamente en las células
malignas, y que sean capaces de inducir actividad citolítica
potente contra dichas células. La presente invención satisface esta
y otras necesidades.
La presente invención está basada en el hecho de
que un anticuerpo monoclonal específico que se une a los linfomas
de linfocitos B malignos y a linfocitos T puede formarse el cual se
une eficazmente solo a los linfocitos B malignos y no se une a los
linfocitos B normales.
Además, la presente invención está basada en el
hecho de que un anticuerpo biespecífico puede formarse a partir de
una línea celular obtenida a partir de linfoma de células largas
periféricamente difuso para producir un anticuerpo monoclonal que
es específico únicamente para los linfocitos B malignos y que este
anticuerpo monoclonal puede modificarse para formar un anticuerpo
biespecífico que se une asimismo a los linfocitos T destructores o
a las células NK.
La presente invención está basada además en el
hecho de que una línea celular formada a partir de una fusión de
líneas celulares que produce un anticuerpo IgG específico contra los
linfocitos T o las células NK y una línea celular que produce el
anticuerpo IgG específico contra los cánceres por linfocitos B
producen a su vez un único anticuerpo biespecífico que se une
eficazmente tanto a los linfocitos B malignos como a los linfocitos
T o a las células NK efectuando de esta manera la lisis o
destrucción de los linfocitos B malignos.
Se ha derivado una línea celular de la fusión de
una línea celular que produce un anticuerpo específico para el
antígeno CD3 de linfocito T en combinación con una línea celular
específica para un heterodímero en la membrana celular de los
linfocitos B malignos como se explica con mayor detalle a
continuación.
En la presente memoria se describe el anticuerpo
1D10, que es específico para la proteína heterodímera de 28/32 kDa
sobre la superficie de linfocitos B malignos.
En un aspecto la invención proporciona una
versión humanizada del anticuerpo 1D10 de ratón, caracterizándose
el anticuerpo de ratón por una zona variable de cadena ligera
mostrada en la Figura 4A; panel inferior y una zona variable de
cadena pesada mostrada en la Figura 4B; panel inferior. En una forma
de realización, la invención proporciona un anticuerpo humanizado
como el descrito anteriormente, comprendiendo el anticuerpo (1) una
cadena ligera humanizada que comprende tres zonas determinantes de
complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos procedentes de las zonas determinantes de
complementariedad correspondientes de la cadena ligera de
inmunoglobulina 1D10, y un marco de la zona variable procedente de
una secuencia marco de zona variable de cadena ligera kappa humana
excepto en por lo menos una posición seleccionada de entre un
primer grupo constituido por L48, L49, L69 y L70 en el que la
posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido
presente en la posición equivalente del marco de la zona variable de
cadena ligera de inmunoglobulina 1D10; y (2) una cadena pesada
humanizada que comprende tres zonas determinantes de
complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos procedentes de las zonas determinantes de
complementariedad correspondientes de la cadena pesada de
inmunoglobulina 1D10, y un marco de la zona variable procedente de
una secuencia marco de zona variable de cadena pesada humana excepto
en por lo menos una posición seleccionada de entre un primer grupo
constituido por H27, H29, H30, H37, H67, H71, H78 y H83, en el que
la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido
presente en la posición equivalente del marco de la zona variable
de cadena pesada de inmunoglobulina 1D10. El anticuerpo humanizado
se une específicamente a la proteína heterodímera de 28/32 kDa
presente en la superficie de los linfocitos B malignos con una
afinidad de unión que presenta un límite inferior de
aproximadamente 10^{7} M^{-1} y un límite superior del quíntuplo
de la afinidad de unión de la inmunoglobulina 1D10.
Preferentemente, el marco de zona variable de la cadena ligera
humanizado procede del anticuerpo R3.5H5G (excepto en por lo menos
una posición seleccionada de entre el primer grupo y excepto en la
posición 43 que está ocupada por el aminoácido presente en la
posición equivalente de una secuencia de consenso del subgrupo I
kappa humano) y la cadena pesada humanizada procede del marco
variable de la zona de la cadena pesada del anticuerpo IC4 (excepto
en por lo menos una posición seleccionada de entre el segundo grupo
y excepto en la posición 73 que está ocupada por el mismo aminoácido
presente en la posición equivalente de una secuencia de consenso
del subgrupo II o IV de inmunoglobulina humana).
En un aspecto adicional, la invención
proporciona anticuerpos humanizados específicos para el antígeno
CD3. Los anticuerpos comprenden cadenas pesada y ligera
humanizadas. La cadena ligera humanizada que comprende tres zonas
determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen
secuencias de aminoácidos procedentes de las zonas determinantes de
complementariedad correspondientes de la cadena ligera de
inmunoglobulina M291, y un marco de la zona variable procedente de
una secuencia marco de zona variable de cadena ligera kappa humana.
La cadena pesada humanizada comprende tres zonas determinantes de
complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos procedentes de las zonas determinantes de
complementariedad correspondientes de la cadena pesada de
inmunoglobulina M291, y un marco de la zona variable procedente de
una secuencia marco de zona variable de cadena pesada humana
excepto en por lo menos una posición seleccionada de entre un
segundo grupo constituido por H30, H67, H68, H70, H72 y H74, en el
que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido
presente en la posición equivalente del marco de la zona variable de
cadena pesada de inmunoglobulina M291. La inmunoglobulina M291 se
caracteriza por una zona variable de cadena ligera como se muestra
en la Figura 5A; panel inferior y una zona variable de cadena pesada
mostrada en la Figura 5B; panel inferior. El anticuerpo humanizado
se une específicamente a un antígeno CD3 sobre la superficie de los
linfocitos T con una afinidad de unión que presenta un límite
inferior a aproximadamente 10^{7}M^{-1} y un límite superior
del quíntuplo de la afinidad de unión de la inmunoglobulina M291.
Preferentemente el marco de la zona variable de cadena ligera
humanizada procede del marco de la zona variable de cadena ligera
del anticuerpo HF2-1/17 en el subgrupo y el marco
de la zona de cadena pesada humanizada procede del marco variable de
la zona de cadena pesada del anticuerpo 21/28, excepto en por lo
menos una posición seleccionada de entre el segundo grupo y excepto
en la posición 44 que está ocupada por el mismo aminoácido presente
en la posición equivalente de la secuencia de consenso del subgrupo
I de inmunoglobulina humana.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona anticuerpos biespecíficos humanizados que comprenden un
primer fragmento de unión que se une específicamente al antígeno CD3
y un segundo fragmento de unión que se une específicamente al
antígeno heterodimérico de 28/32 kDa en la superficie de los
linfocitos B malignos. El primer fragmento de unión comprende una
forma humanizada de la zona variable de cadena pesada del anticuerpo
M291 como se muestra en la Figura 5B; panel inferior y una forma
humanizada de la zona variable de cadena ligera del anticuerpo M291
como se muestra en la Figura 5A, panel inferior. El segundo
fragmento de unión, que está unido al primer fragmento de unión,
comprende una forma humanizada de la zona variable de cadena pesada
del anticuerpo 1D10 como se muestra en la Figura 4B, panel inferior
y una forma humanizada de la zona variable de cadena ligera del
anticuerpo 1D10 como se muestra en la Figura 4A, panel inferior.
Los primer y segundo fragmentos de unión
comprenden cada uno además un segmento de una zona constante
fusionado a las zonas variables de cadena pesada respectivas, y los
fragmentos de unión están unidos por asociación de las zonas
constantes. Por ejemplo, los fragmentos de unión pueden ser Fab o
Fab'. Cuando ambos fragmentos de unión son Fab', es anticuerpo
biespecífico es un F(ab')_{2}. Opcionalmente, los primer y
segundo fragmentos de unión comprenden además las primera y segunda
cremalleras de leucina fusionadas a las zonas constantes
respectivas.
La invención proporciona además la utilización
de un anticuerpo biespecífico de la invención para la preparación
de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece
una de las enfermedades seleccionadas de entre leucemia
linfoblástica aguda, leucemia de linfocitos B, leucemia linfocítica
crónica y mieloma múltiple, incluyendo además opcionalmente dicho
medicamento un agente para activar los linfocitos T en el paciente,
p. ej. IL-2.
La Figura 1 es un gráfico que representa la
lisis de linfocitos B malignos mediante el anticuerpo biespecífico
de la presente invención.
La Figura 2 es un gráfico que representa la
lisis de las células Raji producida por diferentes concentraciones
del anticuerpo de la presente invención; la Figura 3 es un gráfico
que representa la lisis de las células KH durante un periodo de
tiempo por el anticuerpo biespecífico de la presente invención
representando asimismo un estudio comparativo.
Figura 4. Secuencias de aminoácidos de las zonas
variables de la cadena ligera (A) y cadena pesada (B) del
anticuerpo 1D10 humanizado (líneas superiores) y del anticuerpo 1D10
de ratón (líneas inferiores), sin incluir las secuencias señal. Las
tres CDR en cada cadena están subrayadas. Los restos en el marco
humano que han sido sustituidos con aminoácidos de ratón o
aminoácidos humanos de consenso están subrayados dos veces. Las
secuencias de aminoácidos de la cadena compacta completa y la cadena
pesada del 1D10 humanizado se presentan en (C) y (E),
respectivamente. El dominio V_{L} está constituido por los restos
1-107 y la C_{K} 108-214. El
dominio V_{H} está constituido por los restos
1-116, la C_{H}1 117-214, la
articulación 215-229, la C_{H}2
230-339 y el dominio C_{H}3
340-446. La secuencia de aminoácidos del
Fd-Jun y la F(ab' cremallera) humanizada de
1D10 se presenta en (D). El dominio V_{H} está constituido por los
restos 1-116, el dominio C_{H}1
117-224, la articulación 215-234
modificada y la cremallera de leucina Fos
235-273.
Figura 5. Secuencias de aminoácidos de las zonas
variables de la cadena ligera (A) y cadena pesada (B) del
anticuerpo M291 humanizado (líneas superiores) y del anticuerpo M291
de ratón (líneas inferiores), sin incluir las secuencias señal. Las
tres CDR en cada cadena están subrayadas. Los restos en el marco
humano que han sido sustituidos con aminoácidos de ratón o
aminoácidos humanos de consenso están subrayados dos veces. Las
secuencias de aminoácidos de la cadena ligera completa del M291
humanizado se presentan en (C). El dominio V_{L} está constituido
por los restos 1-106 y del dominio C_{K} humano
107-213. La secuencia de aminoácidos del
Fd-Fos y la F(ab' cremallera)_{2} de
M291 se presenta en (D). El dominio V_{H} está constituido por
los restos 1-120, el dominio C_{H}1
121-218, la articulación 219-238
modificada y la cremallera de leucina Fos
239-279.
Figura 6. Construcción del plásmido
pHu1D10.IgG1.rG.dE utilizado para la expresión de la IgG1 de 1D10
humanizada.
Figura 7. (A). Ensayo de desplazamiento para
comparar la afinidad relativa de 1D10 humanizada y 1D10 murina para
el antígeno. Las cantidades de subsaturación de
1D10-IgG2a-FITC murino en las
células Raji se desplazaron aumentando las cantidades de
1D10-IgG2a murina o 1D10-IgG1
humanizada. Las células Raji se volvieron a poner en suspensión en
medio completo a 2,5 \times 10^{6}/ml. Las diluciones del
anticuerpo de ensayo (1D10-IgG1 humanizada) o de
referencia (1D10-IgG2a murino) se añadieron y se
incubaron a 4ºC durante 1 hora. Se añadió una cantidad fija, de
subsaturación de 1D10-IgG2a-FITC
murino, y las células se incubaron a 4ºC durante 1 hora, se lavaron
y se volvieron a poner en suspensión en paraformaldehído al 1%. Las
células se analizaron a continuación utilizando citometría de
flujo. Valores expresados en % de inhibición de intensidad de
fluorescencia comparados con la referencia de anticuerpo
competitivo. (B). Análisis del gráfico de Scatchard de la unión de
1D10-IgG1 humanizada marcada con ^{125}I a las
células Raji. Se realizó el análisis de Scatchard mediante
diluciones de la unión de anticuerpos marcados a 4 \times 10^{5}
células Raji en 0,2 ml durante 90 min. a 0ºC. Se lavaron las
células en tampón de unión (suero de caballo al 2% en PBS que
contiene azida sódica al 0,1%) y se hizo el recuento. Se determinó
la unión no específica inhibiendo la unión específica con un exceso
de 1D10-IgG1 humanizada no marcada. Se calculó la
K_{a} aparente y el número de puntos de unión a partir de la
pendiente y de la intercepción con el eje X, respectivamente, del
gráfico de Scatchard.
Figura 8. (A). Capacidad de citotoxicidad
mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) mediante
varios isótopos de 1D10. Se utilizaron células de linfoma humano
Raji marcadas con ^{51}Cr como dianas para (\ding{115})
1D10-IgG1 murina, (\medbullet)
1D10-IgG2a murina o (\blacksquare)
1D10-IgG1 humanizada y células mononucleares
periféricas humanas como células efectoras. La relación
efector:diana fue 40:1. La liberación espontánea fue inferior al
20% de la liberación total. Las barras representan SEM. (B).
Citotoxicidad mediada por el complemento mediante varios isótopos
de 1D10. Se utilizaron células de linfoma humano Raji marcadas con
^{51}Cr como dianas para (\ding{115}) 1D10-IgG1
murina, (\medbullet) 1D10-IgG2a murina o
(\blacksquare) 1D10-IgG1 humanizada y sueros
humanos de un sujeto normal como complemento. La liberación
espontánea fue inferior al 20% de la liberación total. Las barras
representan SEM.
Figura 9. Diagramas esquemáticos de los
plásmidos pHu1D10-Jun.rG.dE y
pHuM291-Fos.rG.dE para la expresión de
Hu1D10-Jun y HuM291-Fos
F(ab'-cremallera)_{2}. Las
construcciones de estos dos plásmidos fueron similares a las de
pHu1D10.IgG1 en la Figura 6 excepto para la sustitución de los
exones C_{H}2 y C_{H}3 por las secuencias cremallera de leucina
Jun y Fos. La señal de poliadenilación para el transcrito
Fd-cremallera procede de la secuencia no
codificante en 3' del gen IgG2a de ratón (véase Kostelny et al.,
J. Immunol. 148, 1547 (1992)).
Figura 10. (A). La secuencia de la articulación
IgG1 humana modificada se utilizó en la fusión de la
articulación-cremallera. Se insertaron dos restos
Lys-Cys (subrayados) en la articulación modificada.
El primer Cys en esta articulación modificada forma enlace
disulfuro con la cadena ligera, y los tres últimos restos Cys forman
disulfuros entre las cadenas pesadas. Para comparación, se
presentan también las secuencias con articulación de la IgG1 (B)
humana y la IgG2a (C) de ratón. Los tres restos Cys en la
articulación de IgG2a de ratón se utilizan para los disulfuros
entre la cadena pesada. Después de la inserción de
Lys-Cys, la articulación modificada y la
articulación de IgG2a de ratón presentan extensa o homología de la
secuencia cerca del terminal COOH.
Figura 11. (A). Ensayo de desplazamiento para
comparar la afinidad relativa de HuM291-Fos y M291
para su antígeno. Las cantidades de subsaturación de
M291-FITC murino en linfocitos T humanos se
desplazaron aumentando las cantidades de M291 murina o
HuM291-Fos. Los linfocitos T se volvieron a poner en
suspensión en medio completo a 2,5 \times 10^{6}/ml. Las
diluciones del anticuerpo de ensayo (HuM291-Fos) o
de referencia (M291 murino) se añadieron y se incubaron a 4ºC
durante 1 hora. Se añadió una cantidad fija, de subsaturación de
M291-FITC murino, y las células se incubaron a 4ºC
durante 1 hora, se lavaron y se volvieron a poner en suspensión en
paraformaldehído al 1%. Las células se analizaron a continuación
utilizando citometría de flujo. Valores expresados en % de
inhibición de intensidad de fluorescencia comparados con la
referencia de anticuerpo no competitivo. (B). Análisis del gráfico
de Scatchard de la unión de HuM291-Fos marcada con
^{125}I a linfocitos T humanos activados. Se realizó el análisis
de Scatchard mediante diluciones de la unión de anticuerpos marcados
a 4 \times 10^{5} linfocitos T en 0,2 ml durante 90 min. a 0ºC.
Se lavaron las células en tampón de unión (suero de caballo al 2%
en PBS que contiene azida sódica al 0,1%) y se hizo el recuento. Se
determinó la unión no específica inhibiendo la unión específica con
un exceso de HuM291-Fos no marcado. Se calculó la
K_{a} aparente y el número de puntos de unión a partir de la
pendiente y de la intercepción con el eje X, respectivamente, del
gráfico de Scatchard.
Figura 12. Lisis de células positivas a 1D10
mediada por linfocitos T inducidos por anticuerpo biespecífico.
Linfocitos T en PBL humana fueron activados por anticuerpo
anti-CD3 OKT3 y se expandieron cultivándoles en
IL-2. Se marcaron células diana con ^{51}Cr y se
lavaron. Se colocaron en placas linfocitos T y células diana
marcadas a una relación efector:diana de 25:1 en placas de
microvaloración con fondo en V. Se añadieron anticuerpos a la
concentración deseada. Los anticuerpos utilizados fueron
Hu1D10-Jun, HuM291-Fos, el
1DT3-D de IgG biespecífico de ratón y el
F(ab'-cremallera)_{2}
Hu1D10-Jun \times HuM291-Fos
biespecífico humanizado. Se incubaron las placas a 37ºC durante 4
horas, se centrifugaron y la lisis de las células diana se midió
determinando la cantidad de ^{51}Cr liberada. Los porcentajes de
la liberación específica en este ensayo citotóxico como: {recuentos
liberados por anticuerpos menos recuentos liberados sin anticuerpo
añadido}/{recuentos liberados por SDS al 0,1% menos recuentos
liberados sin añadir anticuerpos} \times 100.
La expresión "identidad sustancial" o
"homología sustancial" significa que cuando se alinean de
manera óptima dos secuencias peptídicas, tal como mediante los
programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de huecos por defecto,
comparten por lo menos el 65 por ciento de identidad de secuencia,
preferentemente por lo menos el 80 ó 90 por ciento de identidad de
secuencia, más preferentemente por lo menos el 95 por ciento de
identidad de secuencia o más (p. ej., 99 por ciento de identidad de
secuencia). Preferentemente, las posiciones de residuo que no son
idénticas se diferencian por sustituciones conservadoras de
aminoácidos.
Con objeto de clasificar las sustituciones de
aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos
se agrupan de la forma siguiente: Grupo I (cadenas laterales
hidrófobas): norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas
laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas
laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas):
asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (orientación de la cadena que
influye en los restos): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales
aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras
implican las sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Las
sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un
elemento de una de estas clases por un elemento de otra.
Los aminoácidos de las zonas variables de las
cadenas pesada y ligera maduras de inmunoglobulinas se denominan Hx
y Lx respectivamente, en los que x es un número que designa la
posición de un aminoácido según el esquema de Kabat, Sequences
of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of
Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991). Kabat lista muchas secuencias
de aminoácidos para los anticuerpos para cada subclase, y lista la
mayoría de los aminoácidos que aparecen frecuentemente para cada
posición del resto en esta subclase. Kabat utiliza un procedimiento
para asignar un número de resto a cada aminoácido en una secuencia
listada, y este procedimiento para asignar números de resto se ha
convertido en norma en este ámbito. El esquema de Kabat es
extensible a otros anticuerpos no incluidos en este compendio
alineando el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de
consenso en Kabat. La utilización del sistema de numeración de Kabat
identifica fácilmente los aminoácidos en las posiciones
equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoácido
en la posición L50 de un anticuerpo humano ocupa la posición
equivalente a una posición de aminoácido L50 de un anticuerpo de
ratón.
Desde el terminal N al terminal C, tanto la
cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1,
FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La agitación de los aminoácidos a cada
dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat (1987) y
(1991), supra, o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature
342:878-883 (1989).
La unidad estructural de anticuerpo básica es
conocida porque comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone
de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par
una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una
"pesada" (aproximadamente 50 a 70 kDa). La fracción
amino-terminal de cada cadena incluye una zona
variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, responsable
principalmente del reconocimiento del antígeno. La fracción
carboxi-terminal de cada cadena define una zona
constante responsable principalmente de la función efectora. Las
zonas variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el punto
de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene
dos puntos de unión.
Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o
lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta
o epsilon, y definen, el isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada,
las zonas variable y constante se unen mediante una zona "J" de
aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena
pesada una zona "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más.
Véase generalmente, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2ª
ed., Raven Press, N.Y., 1989), cap. 7 (incorporada como referencia
en su totalidad a todos los efectos).
El término epítopo incluye cualquier
determinante de proteína de unión específica a una inmunoglobulina o
receptor de linfocito T. Los determinantes epitópicos están
normalmente constituidos por grupos con superficie químicamente
activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de
azúcar y presentan normalmente características estructurales
tridimensionales específicas, así como características de carga
específica.
El término paciente incluye sujetos humanos y
veterinarios.
La presente invención proporciona anticuerpos
biespecíficos, que son específicos tanto para células efectoras
(linfocitos T o células destructoras naturales) como para un
antígeno heterodimérico de 28/32 kDa presente en la superficie de
los linfocitos B malignos. También se describen en la presente
memoria los hibridomas y otras líneas celulares que producen los
anticuerpos reivindicados.
El antígeno de 28/32 kDa se encuentra
principalmente en la superficie de los linfocitos B malignos y no se
expresa en los linfocitos restantes o en los linfocitos B y T
activados in vitro por una variedad de estímulos inductores,
véase Gingrich et al., Blood 75, 2375-2387
(1990). El antígeno puede expresarse cuando los linfocitos
experimentan transformación maligna o, en algunos casos, cuando son
perturbados por el virus de Epstein-Barr (EBV). Los
linfocitos restantes y estimulados normales no expresan el antígeno.
El antígeno está asimismo ausente en las células madre
hematopoyéticas. Aunque la base científica para el antígeno de 28/32
kDa que se expresa principal o exclusivamente en los linfocitos B
malignos no es crítica en la puesta en práctica de la invención, se
cree que el antígeno puede representar una variante del tratamiento
aberrante después de la traducción del antígeno
HLA-Dr.
Para producir los anticuerpos específicos contra
los linfocitos B malignos, se cultivó una línea celular de linfoma
procedente de un paciente con linfoma de células grandes difusas
periférico marcadas con HO-85 en el cultivo RPMI
1640 en suspensión con suero de ternero fetal al 10% con un tiempo
doble de aproximadamente 24 horas. La línea celular es CD20, mu,
delta (débilmente), kappa, antígeno positivo a HLA de clase I y II.
No reaccionan con los anticuerpos monoclonales que detectan CALLA,
linfocitos T, antígenos de células mieloides o monocíticas. Las
células reaccionan con los anticuerpos monoclonales SFR7, DR7 y
B7/21 lo que indica que expresan a los antígenos DR7 y DP
respectivamente.
Se administraron a ratones BALB/c hembra, de 6 a
10 semanas, 4 a 6 inoculaciones intraperitoneales a intervalos de
dos semanas con 5 \times 10^{6} células de la línea de linfoma
de células grandes humanas como se describió anteriormente. Se
sacrificaron los animales cinco días después de la última
inoculación y se fusionaron los esplenocitos con la línea celular
N-1 de mieloma murino no secretada. Se seleccionaron
hibridomas en el medio de
hipoxantina-aminopterina-timidina
(HAT) después de colocarlas en bandejas de cultivo celular de 96
pocillos. Después de 10 días, se tomaron alícuotas de 25
microlitros de cada pocillo para la determinación de la actividad
de unión de anticuerpo (anti-HO-85)
de linfocitos B malignos.
Se determinó la actividad de unión del
anticuerpo (anti-HO-85) del
linfocito B maligno mediante un radioinmunoanálisis indirecto de
una célula completa utilizando células HO-85
recientes como dianas. El ensayo idéntico se realizó utilizando
como dianas células RAJI (ATCC CCL86), MOLT-3 (ATCC
CRL1582), HL-60 (ATCC CCL240) y células
mononucleares recientes de la sangre periférica. Los pocillos que
presentaban actividad de unión superior a 5 veces la del medio de
cultivo tisular solo a HO-85 y Raji pero no eran
reactivas con MOLT-3, HL-60 y las
células mononucleares de la sangre periférica se recogieron.
Las células que reúnen los criterios anteriores
se observó que producen un anticuerpo denominado 1D10 y se clonaron
posteriormente por dilución limitativa. El hibridoma se desarrolla
bien in vitro y en ascitis de ratones BALB/c cebados con
pristina.
La fracción de los linfocitos B malignos a los
que se une 1D10 es un polipéptido heterodimérico que contiene dos
proteínas con un peso molecular de las cadenas alfa y beta de 32 kDa
y 28 kDa respectivamente. Las proteínas pueden obtenerse
solubilizando los linfocitos B malignos tales como las células Raji
con detergente. La determinación del peso molecular se realiza
utilizando células yodadas y análisis SDS-PAGE de
una dimensión del precipitado MoAb6-antígeno. La
formación del anticuerpo 1D10 es expuesta por Gingrich et al.,
Blood 75, 2375-2387 (1990). Otros anticuerpos
que presentan la misma o similar especificidad de unión a 1D10 se
cribaron por enlace competitivo con 1D10 para el antígeno
heterodimérico de 28/32 kDa. Se conocen numerosos tipos de ensayos
de fijación competitiva, por ejemplo: radioinmunoanálisis (RIA)
directo o indirecto en fase sólida, inmunoanálisis enzimático (EIA)
directo o indirecto en fase sólida, análisis competitivo en sándwich
(véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9,
242-253 (1983)); EIA de
biotina-avidina directo en fase sólida (véase
Kirkland et al., J. Immunol. 137, 3614-3619
(1986)), análisis marcado directo en fase sólida, análisis en
sándwich marcado directo en fase sólida (véase Harlow y Lane,
"Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press
(1988)); RIA marcado directo en fase sólida utilizando el marcador
I-125 (véase Morei et al., Molec. Immunol.
25, 7-15 (1988)); EIA con
biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et
al., Virology 176, 546-552 (1990)); y RIA
marcado directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32,
77-82 (1990)). Típicamente, dicho análisis implica
la utilización de células que llevan el antígeno de 28/32 kDa, una
inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de
referencia marcada (1D10). La inhibición competitiva se mide
determinando la cantidad de marcador unido a las células en
presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente la
inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Los anticuerpos
identificados mediante análisis competitivo (anticuerpos
competitivos) incluyen los anticuerpos que se unen al mismo epítopo
como el anticuerpo de referencia y los anticuerpos que se unen a un
epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido por el
anticuerpo de referencia para que tenga lugar el impedimento
estérico.
El segundo componente para los anticuerpos
biespecíficos de la invención es un anticuerpo que tiene
especificidad para un antígeno en la superficie de los linfocitos T
o de las células NK. Los antígenos de los linfocitos T humanos que
probablemente son adecuados incluyen CD3, CD2, CD28, CD44, CD69, A13
y G1. Los antígenos adecuados en las células destructoras naturales
incluyen los receptores de FC Gamma (3G8, B73.1, LEUL1, VEP13 y
AT10). Los antígenos de linfocitos T humanos que probablemente son
inadecuados incluyen MHC de clase 1, CD4, CD8, CD18 y CD71.
Las líneas celulares que producen IgG específico
para los antígenos de las células efectoras descritos anteriormente
están disponibles comercialmente o pueden producirse de novo
(véase el Ejemplo 3). La célula OKT3 (ATCC CRL 8001) es una fuente
adecuada de anticuerpos para el antígeno CD3. Otros anticuerpos
contra el antígeno CD3 incluyen WT31, WT32,
anti-leu-4, UCHT-1,
SPV-3TA y SPV-T3B. Se prefiere el
punto de CD3 debido a su presencia en todos los linfocitos T.
Los anticuerpos pueden ser producidos por una
línea celular formada mediante la fusión de una línea celular del
primer componente que produce anticuerpos específicos para el
antígeno heterodimérico de 28/32 kDa con una segunda línea celular
que produce un anticuerpo específico para los linfocitos T o las
células de estructuras naturales. Por ejemplo, el hibridoma que
produce 1D10 se fusionó con OKT3 de la manera siguiente.
Se seleccionó la línea celular de hibridoma OKT3
cultivando células OKT3 sucesivamente en un medio que contiene
8-azaguanina 0,13 mM, a continuación ouabaína 1,0
mM. Se produjeron hibridomas híbridos por fusión (utilizando
polietilenglicol a 38%) de 10^{6} hibridomas que segregan 1D10,
sensibles a ouabaína, resistentes a HAT, con 10^{6} hibridomas
que segregan OKT3 resistentes a ouabaína, sensibles a HAT.
Las células fusionadas se colocaron en placas en
medio de HAT-ouabaína para seleccionar los
hibridomas híbridos. El HAT en este medio impidió el crecimiento de
las células OKT3 no fusionadas y la ouabaína impidió el crecimiento
de las células 1D10 no fusionadas. Por lo tanto, únicamente los
hibridomas híbridos que contienen material genético de ambos
hibridomas paternos sobrevivieron. Se aislaron doce hibridomas
híbridos utilizando esta técnica.
Líneas celulares que segregan anticuerpos
biespecíficos pueden identificarse por un procedimiento de
identificación en tres etapas. Por ejemplo, en el análisis de los
hibridomas formados en la fusión de 1D10 y OKT3, se realizó una
identificación inicial en la que el sobrenadante de hibridoma
híbrido se añadió a placas ELISA recubiertas con anticuerpo IgG1
antirratón de cabra. Tras el lavado, se añadió IgG2a antirratón de
cabra marcado con fosfatasa alcalina. La reactividad indicó que el
sobrenadante de hibridoma híbrido contenía moléculas de anticuerpo
aisladas tanto con cadenas pesadas de IgG1 como de IgG2a.
Se utilizó un análisis inmunofluorescente
indirecto como segunda identificación para todas las muestras que
eran positivas a ELISA. En esta segunda identificación, se añadió
sobrenadante de hibridoma híbrido por separado a
HO-85 (reactivas a 1D10) y células Jurkat (reactivas
a OKT3). Se añadió IgG-FITC antirratón de cabra
después del lavado para detectar la presencia de anticuerpo unido.
Los doce hibridomas híbridos segregaron anticuerpo que era capaz de
unirse tanto a las células HO-85 como a las de
Jurkat. Se seleccionó uno de estos hibridomas híbridos para un
estudio adicional. Se subclonó limitando la dilución \times2 y se
denominaron 1DT3-D. Esta línea celular se depositó
el 24 de marzo de 1992 bajo el Tratado de Budapest en la American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852
y se les asignó el número ATCC HB 10993.
Se cultivó 1DT3-D in
vitro en medio HB 101 enriquecido con 100 \mug/l de glutamina
y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. Estas
células se transfirieron a un aparato biorreactor de fibra hueca
Mini Flo-path. El anticuerpo obtenido del medio
agotado se fraccionó por intercambio catiónico en HPLC utilizando un
gradiente de NaCl de 0,18 a 0,5 M. Se aisló el pico que contenía
reactividad biespecífica, demostrada por los análisis anteriores, se
dializó contra la solución salina tamponada con fosfato, se
concentró y se utilizó en estudios posteriores.
El anticuerpo biespecífico formado por fusión de
1D10 y OKT3 es un monoclonal procedente de ratón. Las versiones
humanizadas de este anticuerpo y de otros anticuerpos biespecíficos
de la invención pueden asimismo emplearse como se expone con mayor
detalle a continuación.
La invención proporciona inmunoglobulinas (o
anticuerpos) humanizados como se describió anteriormente y en las
reivindicaciones. Algunos anticuerpos humanizados son específicos
para el antígeno CD3 de linfocitos T. Otros anticuerpos humanizados
son específicos para el heterodímero de 28/32 kDa en linfocitos B
malignos. Estos anticuerpos humanizados son útiles como reactivos
terapéuticos y de diagnóstico en derecho propio o pueden combinarse
para formar un anticuerpo biespecífico humanizado que posee ambas
especificidades de unión de sus componentes. Las formas humanizadas
de inmunoglobulinas tienen la zona (5) de marco variable
sustancialmente de una inmunoglobulina humana (denominada
inmunoglobulina receptora) y las zonas determinantes de
complementariedad sustancialmente de una inmunoglobulina de ratón
(denominada inmunoglobulina donante). La(s) zona(s)
constante(s), si está(n) presente(s), son
sustancialmente también de una inmunoglobulina humana. Los
anticuerpos humanizados presentan una afinidad de unión específica
para sus antígenos respectivos de por lo menos 10^{7}, 10^{8},
10^{9} ó 10^{10} M^{-1}. Con frecuencia los límites superior e
inferior de la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados
están comprendidos dentro de un factor de tres o cinco o diez del
anticuerpo de ratón del que proceden.
El material de partida para la producción del
anticuerpo humanizado específico para el heterodímero de 28/32 kDa
es el anticuerpo 1D10 de ratón. El material de partida para la
producción del anticuerpo humanizado específico para CD3 es el
anticuerpo M291 cuyo aislamiento se describe en el Ejemplo 3.
La sustitución de las CDR de ratón en un marco
con dominio variable humano es lo más probable que resulte en la
retención de su orientación espacial correcta si el marco con
dominio variable humano adopta la misma o similar conformación a la
del marco variable de ratón a partir del cual se originan las CDR.
Esto se consigue obteniendo los dominios variables humanos de
anticuerpos humanos cuyas secuencias de marco presentan el alto
grado de identidad de secuencia con los dominios de marco variable
murino del cual proceden las CDR. Las zonas con marco variable de
cadena pesada y ligera pueden proceder de la misma o diferente
secuencia de anticuerpo humano. Las secuencias de anticuerpo humano
pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos naturales o pueden
ser secuencias de consenso de varios anticuerpos humanos.
Las secuencias de anticuerpos humanos adecuadas
se identifican mediante comparaciones por ordenador de las
secuencias de aminoácidos de las zonas variables de ratón con las
secuencias de anticuerpos humanos conocidos. La comparación se
realiza por separado para las cadenas pesada y ligera pero los
principios son similares para cada una.
La yuxtaposición no natural de las zonas CDR
murinas con la zona de marco variable humana puede producir
limitaciones de configuración no naturales, que, si no se corrige
por sustitución de determinados restos de aminoácidos, conducen a
la pérdida de afinidad de unión. La selección de los restos de
aminoácidos para la sustitución se determina, en parte, por
modelado informático. El equipo y los programas informáticos para
producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulinas
están disponibles en gran medida. En general, se producen modelos
moleculares partiendo de estructuras resueltas para las cadenas de
inmunoglobulina o los dominios de las mismas. En las cadenas que
deben modelarse se compara la similitud de secuencia de aminoácidos
con las cadenas o dominios de las estructuras tridimensionales
resueltas, y las cadenas o dominios que presentan la mayor
similitud de secuencia se selecciona(n) como puntos de
partida para la construcción del modelo molecular. Las estructuras
de partida resueltas se modifican para permitir diferencias entre
los aminoácidos existentes en las cadenas o dominios de
inmunoglobulina que se están modelando y las de la estructura de
partida. Las estructuras modificadas se reúnen a continuación en
una inmunoglobulina compuesta. Por último, se afina el modelo por
minimización energética y verificando que todos los átomos estén a
distancias apropiadas entre sí y que las longitudes y ángulos de
enlace estén dentro de límites químicamente aceptables.
Como se observa anteriormente, los anticuerpos
humanizados de la invención comprenden zona(s) de marco
variable sustancialmente de una inmunoglobulina humana y zonas
determinantes de complementariedad sustancialmente de una
inmunoglobulina de ratón (p. ej., 1D10 o M291). Una vez
identificadas las zonas determinantes de complementariedad de
anticuerpos de ratón e inmunoglobulinas receptoras humanas
apropiadas, la siguiente etapa consiste en determinar qué restos,
si existen, de estos componentes deberían sustituirse para optimizar
las propiedades del anticuerpo humanizado resultante. En general,
la sustitución de restos de aminoácidos humanos por murinos debería
estar minimizada, porque la introducción de restos murinos aumenta
el riesgo de que el anticuerpo provoque una respuesta HAMA en el
hombre. Se seleccionan aminoácidos por sustitución basándose en su
posible influencia sobre la configuración de CDR y/o en la unión al
antígeno. La investigación de dichas posibles influencias es por
modelado, examen de las características de los aminoácidos en
posiciones determinadas o la observación empírica de los efectos de
la sustitución o mutagénesis de determinados aminoácidos.
Cuando un aminoácido se diferencia entre una
zona de marco variable de ratón y una zona de marco variable humana
equivalente, el aminoácido del marco humano debería normalmente
sustituirse por el aminoácido de ratón equivalente si es razonable
esperar que el aminoácido:
- (1)
- contacte no por enlace covalente directamente con el antígeno, o
- (2)
- esté junto a la zona CDR o si no interactúe con una zona CDR (p. ej., esté a aproximadamente 4 a 6 \ring{A} de una zona CDR).
Otros candidatos para la sustitución son los
aminoácidos del marco humano receptores que no son habituales para
una inmunoglobulina humana en esta posición. Estos aminoácidos
pueden sustituirse por los aminoácidos de la posición equivalente
de las inmunoglobulinas humanas más típicas. Alternativamente, los
aminoácidos de las posiciones equivalentes en el anticuerpo de
ratón pueden introducirse en las zonas del marco humano cuando
dichos aminoácidos son típicos de la inmunoglobulina humana en las
posiciones equivalentes.
En general, es deseable la sustitución de todos
o la mayoría de los aminoácidos que cumplen los criterios
anteriores. Ocasionalmente, sin embargo, existe alguna ambigüedad
respecto a si un determinado aminoácido reúne los criterios
anteriores, y se producen las inmunoglobulinas de variante
alternativa, una de las cuales presenta esta particular sustitución
y la otra no.
Los anticuerpos humanizados de la invención que
proceden del anticuerpo 1D10 de ratón contienen normalmente una
sustitución de un resto de marco de la cadena ligera kappa humana
con un resto mu MAb 1D10 correspondiente en por lo menos 1, 2, 3 ó
4 de las posiciones siguientes: L48, L49, L69 y L70. Los anticuerpos
humanizados contienen además normalmente una sustitución de un
resto del marco de cadena pesada humano en por lo menos 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7 u 8 de las posiciones siguientes H27, H29, H30, H37, H67,
H71, H78 y H83. En las formas de realización preferidas, cuando la
inmunoglobulina receptora de cadena ligera humana es R3.5HG, la
cadena ligera contiene asimismo una sustitución en la posición 43.
Esta posición está sustituida con el aminoácido de la posición
equivalente de una inmunoglobulina humana que tiene restos de
aminoácidos más típicos o de una secuencia de consenso de dichas
inmunoglobulinas humanas. Asimismo, cuando la inmunoglobulina
receptora de cadena pesada humana es IC4, la cadena pesada contiene
asimismo una sustitución en la posición 73.
Los anticuerpos humanizados de la invención que
proceden del anticuerpo M291 de ratón no contienen ninguna
sustitución de un resto de marco de la cadena ligera kappa humana si
el receptor de la cadena ligera es HF2-1/17. Los
anticuerpos humanizados contienen además normalmente una sustitución
de un marco de cadena pesada humano en por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 y
6 de las siguientes posiciones: H30, H67, H68, H70, H72 y H74. En
las formas de realización preferidas, cuando la inmunoglobulina
receptora de cadena pesada humana es 21/28, la cadena ligera
contiene también una sustitución en la posición 44. Esta posición
está sustituida con el aminoácido de la posición equivalente de una
inmunoglobulina humana que presenta restos de aminoácidos más
típicos o de una secuencia de consenso de dicha inmunoglobulina
humana.
Normalmente las zonas CDR en los anticuerpos
humanizados son sustancialmente idénticas, y más habitualmente,
idénticas a las zonas CDR correspondientes en el anticuerpo de ratón
del que proceden. Aunque no sea deseable normalmente, a veces es
posible preparar una o más sustituciones de aminoácidos
conservadoras de los restos de CDR sin afectar apreciablemente la
afinidad de unión de la inmunoglobulina humanizada resultante.
Ocasionalmente, las sustituciones de las zonas CDR pueden aumentar
la afinidad de unión.
Aparte de las sustituciones de aminoácidos
específicas expuestas anteriormente, las zonas marco de
inmunoglobulinas humanizadas normalmente son sustancialmente
idénticas, y con más frecuencia, idénticas a las zonas marco de los
anticuerpos humanos de los que proceden. Desde luego, muchos de los
aminoácidos en la zona marco tienen poca o ninguna contribución
directa a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. De esta
manera, dichas sustituciones conservadoras individuales de restos
de marco pueden tolerarse sin cambio apreciable de la especificidad
o afinidad de la inmunoglobulina humanizada resultante. Sin embargo,
en general, dichas sustituciones son indeseables.
Una vez seleccionados conceptualmente la CDR y
los componentes del marco de inmunoglobulinas humanizadas, una
variedad de procedimientos están disponibles para producir dichas
inmunoglobulinas. Debido a la degeneración del código, una variedad
de secuencias de ácido nucleico codificarán cada secuencia de
aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico
deseadas pueden producirse mediante la síntesis de ADN en fase
sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una variante
preparada inicialmente del polinucleótido deseado. Todos los ácidos
nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en la presente
solicitud pueden utilizarse para producir los anticuerpos de la
invención.
Los segmentos variables de anticuerpos
humanizados producidos como se describió anteriormente están unidos
típicamente por lo menos a una fracción de una zona constante de
inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
Las secuencias de ADN de la zona constante humana pueden aislarse
según procedimientos bien conocidos a partir de una variedad de
células humanas, pero preferentemente linfocitos B inmortalizados
(véase Kabat et al., supra, y el documento WO 87/02671).
Normalmente, el anticuerpo contendrá zonas constantes tanto de
cadena ligera como de cadena pesada. La zona constante de cadena
pesada incluye normalmente las zonas CH1, articulación, CH2, CH3 y
a veces CH4.
Los anticuerpos humanizados incluyen los
anticuerpos que tienen todos los tipos de zonas constantes,
incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y algún isótopo, incluyendo
IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cuando se desea que el anticuerpo
humanizado presente actividad citotóxica, el dominio constante es
normalmente un dominio constante que fija el complemento y la clase
es típicamente IgG_{1}. Cuando dicha actividad citotóxica no sea
deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG_{2}. El
anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una
clase o isotipo.
Los ácidos nucleicos que codifican zonas
variables humanizadas de cadena ligera y pesada, opcionalmente
unidas a zonas constantes, se insertan en vectores de expresión.
Las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en vectores de
expresión iguales o diferentes. Los segmentos de ADN que codifican
cadenas de inmunoglobulina están unidos funcionalmente para
controlar las secuencias en el/los vector(es) de expresión
que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina.
Dichas secuencias de referencia incluyen una secuencia señal, un
activador, un potenciador y una secuencia de terminación de la
transcripción (véase Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86, 10029 (1989); documento WO 90/07861; Co et al., J.
Immunol. 148, 1149 (1992)).
Los anticuerpos humanizados de la invención
incluyen fragmentos así como anticuerpos intactos. Típicamente,
estos fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del cual
proceden para la unión al antígeno. Los fragmentos se unen
típicamente con una afinidad de por lo menos 10^{7} M^{-1}, y
más típicamente de 10^{8} ó 10^{9} M^{-1} (es decir, dentro
de los mismos intervalos que el anticuerpo intacto). Los fragmentos
de anticuerpo humanizado incluyen cadenas pesadas independientes,
cadenas ligeras Fab, Fab' F(ab')_{2} y Fv. Se producen
fragmentos mediante técnicas de ADN recombinante o mediante
separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Los procedimientos expuestos anteriormente para
formar anticuerpos biespecíficos a partir de los anticuerpos
producidos por células de hibridoma pueden aplicarse o adaptarse
también a la producción de anticuerpos biespecíficos procedentes de
anticuerpos expresados de forma recombinante tales como las
versiones humanizadas de 1D10 y M291. Por ejemplo, pueden
producirse anticuerpos biespecíficos por fusión de dos líneas
celulares que expresan respectivamente los anticuerpos componentes.
Alternativamente, los anticuerpos componentes pueden coexpresarse
en la misma línea celular. Los anticuerpos biespecíficos pueden
asimismo formarse mediante reticulación química de los anticuerpos
recombinantes componentes.
Los anticuerpos recombinantes componentes pueden
unirse también genéticamente. En un método, se expresa un
anticuerpo biespecífico como proteína de fusión aislada que
comprende los cuatro dominios variables diferentes de dos
anticuerpos componentes separados por espaciadores. Por ejemplo,
dicha proteína puede comprender desde un terminal al otro, la zona
VL del primer anticuerpo componente, un espaciador, el dominio VH
del primer anticuerpo componente, un segundo espaciador, el dominio
VH del segundo anticuerpo componente, un tercer espaciador y el
dominio VL del segundo anticuerpo componente. Véase, p. ej., Segal
et al., Biologic Therapy of Cancer Updates 2,
1-12 (1992).
En un método adicional, se forman anticuerpos
biespecíficos uniendo los anticuerpos componentes a péptidos
cremallera con leucina. Véase generalmente la solicitud en trámite
11823-003200 (07/801.798, presentada el 29 de
noviembre de 1991; Kostelny et al., J. Immunol. 148,
1547-1553 (1992). Las cremalleras de leucina
presentan la fórmula estructural general
(leucina-X_{1}-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6})_{n},
en la que X puede ser cualquiera de los 20 aminoácidos
convencionales (Proteins, Structures and Molecular
Principles, (1984) Creighton (ed.), W. H. Freeman y Company,
Nueva York), pero son más probablemente los aminoácidos con alto
potencial de formación de la hélice \alpha, por ejemplo, alanina,
valina, ácido aspártico, ácido glutámico y lisina (Richardson y
Richardson, Science 240, 1648 (1988)), y n puede ser 3 o
mayor, aunque típicamente n es 4 ó 5. La cremallera de leucina
tiene lugar en una variedad de proteínas de unión al ADN
eucariótico, tales como GCN4, C/EBP, producto del gen
c-fos (Fos), producto del gen c-jun
(Jun) y producto del gen c-myc. En estas proteínas,
la cremallera de leucina crea una interfase de dimerización en la
que las proteínas que contienen las cremalleras de leucina pueden
formar homodímeros y/o heterodímeros estables.
Para su utilización en la presente invención las
cremalleras de leucina preferentemente tienen afinidad por pares.
La afinidad por pares se define como la capacidad de una especie de
cremallera de leucina, por ejemplo, la cremallera de leucina Fos,
para formar principalmente heterodímeros con otras especies de
cremallera de leucina, por ejemplo, la cremallera de leucina Jun,
de modo que es preferible la formación de heterodímero sobre la
formación de homodímero cuando dos especies de cremallera de leucina
están presentes en concentraciones suficientes. Véase Schuemann
et al., Nucleic Acids Res. 19, 739 (1991). De esta manera, la
formación predominante de heterodímeros conduce a una población de
dímeros que está típicamente comprendida entre 50 y el 75 por
ciento, preferentemente entre el 75 y el 85 por ciento y más
preferentemente más del 85 por ciento de heterodímeros. Cuando los
terminales amino de los péptidos sintéticos incluyen cada uno un
resto de cisteína para permitir el enlace disulfuro intermolecular,
tiene lugar la formación de heterodímero para la exclusión
sustancial de la homodimerización.
En la formación de anticuerpos biespecíficos,
los fragmentos de unión de los anticuerpos componentes se fusionan
en el marco a las primera y segunda cremalleras de leucina. Los
fragmentos de unión adecuados incluyen Fv, Fab, Fab' o la cadena
pesada. Las cremalleras pueden estar unidas a la cadena pesada o
ligera del fragmento que se une al anticuerpo y están normalmente
unidas al extremo terminal C. Si una zona constante o un fragmento
de una zona constante está presente, la cremallera de leucina está
preferentemente unida a la zona constante o un fragmento de la
misma. Por ejemplo, en la fusión de la cremallera
Fab'-leucina, la cremallera está fusionada
normalmente al extremo terminal C en la articulación. La inclusión
de cremalleras de leucina fusionadas a los fragmentos de anticuerpo
del componente respectivo favorece la formación de fragmentos
heterodiméricos por hibridación de las cremalleras. Cuando los
anticuerpos componentes incluyen fracciones de zonas constantes (p.
ej., fragmentos de Fab'), la hibridación de las cremalleras sirve
asimismo para poner las zonas constantes en proximidad,
favoreciendo de este modo el enlace de las zonas constantes (p. ej.,
en un fragmento F(ab')_{2}). Las zonas constantes humanas
típicas se unen mediante la formación de dos enlaces disulfuros
entre las zonas con articulación de las cadenas respectivas. Este
enlace puede reformarse modificando el/los resto(s) de
cisteína adicional(es) en las zonas con articulación
respectivas que permiten la formación de enlaces disulfuro
adicionales.
Las cremalleras de leucina unidas a fragmentos
de unión al anticuerpo pueden producirse de varias maneras. Por
ejemplo, las secuencias polinucleotídicas que codifican una proteína
de fusión que comprende una cremallera de leucina pueden expresarse
mediante un hospedador celular o el sistema de traducción in
vitro. Alternativamente, las cremalleras de leucina y/o los
fragmentos de unión al anticuerpo pueden producirse
independientemente, bien por síntesis de péptidos química, por
expresión de secuencias polinucleotídicas que codifican los
polipéptidos deseados, o por escisión de otras proteínas que
contienen cremalleras de leucina, anticuerpos o especies
macromoleculares, y purificación posterior. Dichos polipéptidos
purificados pueden estar unidos por enlaces peptídicos, con o sin
intervenir secuencias de aminoácido espaciadoras, o mediante enlaces
covalentes no peptídicos, con o sin intervenir moléculas
espaciadoras, siendo las moléculas espaciadoras bien aminoácidos u
otras estructuras químicas distintas a aminoácidos. Con respecto al
procedimiento o tipo de acoplamiento, dicho acoplamiento puede ser
reversible. Por ejemplo, un enlace químicamente lábil, bien
peptidilo o de otro modo, puede escindirse espontáneamente o
durante el tratamiento térmico, radiación electromagnética,
proteasas o agentes químicos. Dos ejemplos de dicho acoplamiento
reversible son: (1) un acoplamiento que comprende un enlace
peptídico Asn-Gly que puede ser escindido por
hidroxilamina, y (2) un acoplamiento de enlace disulfuro que puede
escindirse mediante agentes reductores.
Las proteínas de fusión del componente fragmento
de anticuerpo-cremalleras de leucina pueden
hibridarse expresando conjuntamente ambas proteínas de fusión en la
misma línea celular. Alternativamente, las proteínas de fusión
pueden expresarse en líneas celulares separadas y mezclarse in
vitro. Si los fragmentos de anticuerpo componentes incluyen
partes de una zona constante (p. ej., fragmentos Fab'), las
cremalleras de leucina pueden escindirse una vez haya tenido lugar
la hibridación. Los anticuerpos componentes permanecen unidos en el
anticuerpo biespecífico por las zonas constantes.
\newpage
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
anticuerpos biespecíficos de la presente invención son útiles para
la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea,
intramuscular y especialmente, intravenosa. Las composiciones para
administración parenteral comprenden normalmente una solución del
anticuerpo o una mezcla de los mismos disuelta en un vehículo
aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Puede utilizarse una
variedad de vehículos acuosos, p. ej., agua, agua tamponada,
solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas
soluciones están esterilizadas y generalmente exentas de materia en
partículas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a
las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste de pH y
de tamponación, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por
ejemplo acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro
cálcico y lactato sódico. La concentración de los anticuerpos
biespecíficos en estas formulaciones puede variar ampliamente, es
decir, desde menos de aproximadamente 0,01%, normalmente por lo
menos aproximadamente 0,1% hasta como mucho el 5% en peso y se
seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido y
en las viscosidades según el modo específico de administración
seleccionado.
Puede prepararse una composición típica para
infusión intravenosa que contenga hasta 250 ml de solución Ringer
esterilizada, y 10 mg de anticuerpo biespecífico. Véase
Remington's Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing
Company, Easton, Pensilvania, 1980).
Las composiciones que contienen los presentes
anticuerpos biespecíficos o una mezcla de los mismos pueden
administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En
la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un
paciente afectado ya por linfocitos B malignos (p. ej., leucemia
linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, leucemia linfocítica
crónica y mieloma múltiple) en una cantidad suficiente para curar o
por lo menos interrumpir parcialmente la afección y sus
complicaciones. Una cantidad adecuada que cumpla esto se define
como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces
para esta utilización dependerán de la gravedad de la afección y
del estado general del sistema inmunitario propio del paciente,
pero estarán generalmente comprendidas en el intervalo entre
aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 mg de anticuerpo
específico por dosis, siendo las dosis más frecuentemente utilizadas
las comprendidas entre 01, y 50 mg y 1 a 10 mg por paciente. Las
administraciones individuales o múltiples en un programa diario,
semanal o mensual pueden realizarse siendo seleccionados los niveles
de dosis y el patrón por el médico del tratamiento. En las
aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los
anticuerpos biespecíficos o una mezcla de los mismos se administran
a un paciente que está en situación de riesgo de desarrollar la
enfermedad para aumentar la resistencia del paciente. Dicha cantidad
se define como "dosis profilácticamente eficaz". En esta
utilización, las cantidades exactas dependen de nuevo del estado de
salud del paciente y del nivel general de inmunidad, pero
generalmente oscilan entre 0,1 y 100 mg por dosis, especialmente
entre 1 y 10 mg por paciente.
En algunos procedimientos de tratamiento, los
anticuerpos biespecíficos se administran con un segundo agente (p.
ej., una interleucina) en una cantidad suficiente para activar las
células efectoras aumentando de esta manera su citotoxicidad a los
linfocitos B malignos en comparación con la administración de
anticuerpo biespecífico solo. Es adecuada la
interleucina-2 a una dosis de aproximadamente
500.000 U/kg. La terapia de combinación es particularmente
apropiada cuando el anticuerpo biespecífico que se administra es un
fragmento F(ab')_{2}.
El anticuerpo 1D10 monoespecífico
(particularmente la forma humanizada) es asimismo adecuado para la
administración terapéutica a pacientes que padecen enfermedades
malignas por linfocitos B o están en situación de riesgo de
padecerlas. Opcionalmente, el anticuerpo está conjugado con un
radiomarcador o toxina. El anticuerpo M291 monoespecífico
(particularmente la forma humanizada) puede utilizarse como
inmunosupresor en el tratamiento de enfermedades y trastornos del
sistema inmunitario tales como enfermedad hospedador contra el
injerto, enfermedad injerto contra el hospedador, enfermedades
autoinmunitarias e inflamación. Véase, p. ej., Cosimi et al., N.
Engl. J. Med. 305, 308 (1981); Russel et al., Annu. Rev.
Med. 35, 63 (1984). Las dosis y excipientes farmacéuticos para
la administración de anticuerpos monoespecíficos son similares a las
de los anticuerpos biespecíficos.
Los anticuerpos M291 y 1D10 (ambas formas de
ratón y humanizadas) son asimismo útiles en los procedimientos de
diagnóstico. El anticuerpo 1D10 (y otros anticuerpos que se unen al
mismo o similar epítopo) es útil para diagnosticar la presencia de
linfocitos B malignos y controlar la eficacia de los tratamientos
para éstos. El anticuerpo es asimismo útil con fines de
investigación para identificar y tipificar las células de
determinados linajes y orígenes de desarrollo. El anticuerpo M291
es útil con fines de diagnóstico en el control inmunológico de
pacientes (véase, p. ej., Cosimi et al., supra) y con fines
de investigación en la clasificación de subtipos de leucocitos, p.
ej., como parte de un panel de anticuerpos. Pueden realizarse
procedimientos de diagnóstico in vitro utilizando una
muestra celular (p. ej., muestra de sangre, biopsia de ganglio
linfático o tejido) de un paciente o puede realizarse por
diagnóstico por imagen in vivo.
Se evaluó la capacidad de 1DT3-D
in vitro para producir la eliminación de linfocitos B
malignos por linfocitos T. El ensayo utilizado fue el ensayo de
citotoxicidad por liberación de ^{51}cromo. Se marcaron linfocitos
B malignos diana (10^{7} células en 1 ml) durante 1 hora de
incubación con 100 \muCi ^{51}Cr. Se incubaron linfocitos T de
donantes normales in vitro con IL-2 o
IL-2 y anticuerpo anti CD3 durante 3 a 7 días antes
de su utilización como células efectoras. Se añadieron linfocitos T
a linfocitos B malignos marcados con ^{51}Cr junto con el
anticuerpo. Esta mezcla se incubó durante 4 horas, y el sobrenadante
exento de células se eliminó y se evaluó la presencia de ^{51}Cr
liberado por recuento gamma. Se determinó la liberación máxima
evaluando el sobrenadante obtenido de los pocillos que se habían
tratado con detergente (NP-40) que produce la lisis
de todas las células. Se determinó la liberación de fondo evaluando
las concentraciones de ^{51}Cr de las muestras que tenían
linfocitos B malignos diana y linfocitos T pero no anticuerpos. La
liberación específica de ^{51}Cr indicó la lisis de las células
diana que contienen ^{51}Cr y se calculó utilizando la fórmula
siguiente.
\frac{\text{Liberación en la
muestra - Liberación de fondo}}{\text{Liberación máxima - Liberación
de fondo}} \times
100
La Fig. 1 presenta 1DT3-D
producido por la lisis de un gran número de linfocitos B malignos
diferentes que incluyen Raji (línea celular creada en un paciente
con linfoma de Burkitt), HO-85 (línea celular de
linfoma de macrocitos), 697 (línea celular de leucemia
linfoblástica aguda pre-B) y KH (linfocitos
recientes obtenidos de un paciente con leucemia linfocítica
crónica). La relación linfocito T a célula diana fue 10:1 y la
concentración de anticuerpo fue de 5 \mug/ml. Esta lisis de la
diana no se observó cuando se utilizaba anticuerpo
monoespecífico.
La Fig. 2 demuestra que 1DT3-D
puede producir lisis significativa de células Raji a bajas
relaciones de linfocito T:célula Raji (inferior a 1:1) y a bajas
concentraciones de anticuerpo (inferior a 0,1 \mug/ml). Similares
resultados se observan con otras líneas celulares diana.
La Fig. 3 demuestra que la lisis mediada por
linfocitos T producida por 1DT3-D de células KH
recientes se observó tras tiempos de incubación prolongados.
El anticuerpo biespecífico de la presente
invención puede producirse asimismo simplemente tomando los
fragmentos Fab o F(ab')_{2} del anticuerpo 1D10 que
fusionan éstos con fracciones del anticuerpo OKT3 para formar un
anticuerpo biespecífico de la presente invención. Alternativamente,
los anticuerpos biespecíficos, que reconocen 1D10 y un antígeno en
las células destructoras naturales o en linfocitos T, puede
producirse, mediante técnicas de ingeniería de síntesis o
genética.
Una ventaja de los anticuerpos biespecíficos
reivindicados es su capacidad para reconocer linfocitos B malignos
y distinguir éstos de linfocitos B no malignos. Por lo tanto, la
terapia que utiliza los anticuerpos biespecíficos de la presente
invención es significativamente menos dañina que la terapia que
utiliza, por ejemplo, un anticuerpo no específico tal como un
anticuerpo B4 anti-CD19.
Además, como se muestra mediante los datos
mostrados en el ejemplo, el anticuerpo de la presente invención
produce lisis significativa de linfocitos B malignos a relaciones de
linfocitos T relativamente bajas. La Fig. 2 demuestra que las
relaciones de células malignas a linfocitos T inferiores a 1:1 con
concentraciones de anticuerpos relativamente bajas inferiores a 0,1
microgramos por ml proporciona extrusión significativa de las
células malignas. Esto es particularmente importante ya que reduce
la dependencia de la concentración de linfocitos T disponibles en
el paciente. Además, reduce también la cantidad de anticuerpo
requerido, limitando de este modo cualquier efecto secundario
potencial.
Este ejemplo describe una prueba in vivo
del anticuerpo 1DT3-D biespecífico. Se activaron
linfocitos de sangre periférica humanos de donante normal in
vitro en presencia de OKT3 (2 \mug/ml) e IL-2
recombinante (300 \mug/ml). Se inyectaron por vía subcutánea a
ratones CB-17 scid/scid (Itoh et al.,
Cancer 72, 2686-2694 (1993)) 5 \times
10^{6} células Raji mezcladas con 5 \times 10^{6} linfocitos
activados. 24 h después, se inyectó a los ratones anticuerpo
biespecífico, un componente del anticuerpo monoespecífico de
anticuerpo biespecífico o sin anticuerpo. Se examinó a los ratones
a diario del desarrollo de tumores de por lo menos 0,5 cm en el
punto de la inyección del tumor. Los ratones que permanecen sin
tumor después de 60 días se puntuaron como negativos y los ratones
que desarrollan tumores en 60 días como positivos. Los ratones de
referencia no tratados siempre desarrollaron tumores en 21 a 28
días.
En un primer experimento, se trataron 5 ratones
con 10 \mug/ratón de anticuerpo biespecífico 24 horas después de
la inoculación con la mezcla de células maligna y linfocitos T
humanos activados. Un grupo de referencia de 5 ratones se inoculó
con vehículo únicamente. La aparición del tumor (es decir, el
desarrollo de un tumor de por lo menos 0,5 cm en por lo menos ocho
semanas) en los grupos tratados y de referencia fue la
siguiente:
| Grupo | Sin tumores | Tumores | Total |
| Tratamiento | 4 | 1 | 5 |
| Referencia | 0 | 5 | 5 |
Utilizando la prueba exacta de una cara de
Fischer, el tratamiento con anticuerpos biespecíficos prolongó la
supervivencia sin enfermedad con un valor p de 0,024.
Se diseñó un segundo experimento para comparar
los efectos antitumorales del anticuerpo biespecífico con
anti-CD3 monoespecífico y 1D10 monoespecífico a una
dosis de 10 \mug/ratón en ratones inoculados con células tumorales
y linfocitos T como se esbozó anteriormente. Los ratones del Grupo
2 recibieron 1D10 monoespecífico y OKT3 monoespecífico, los del
Grupo 3 recibieron anticuerpo biespecífico y el grupo de referencia
recibió vehículo solamente. Los ratones del Grupo 4 recibieron
también anticuerpo biespecífico a una concentración de 10
\mug/ratón, pero estos ratones habían sido inoculados previamente
con linfocitos T inactivados distintos de todos los demás grupos
que recibieron linfocitos T activados.
| Grupo | Sin tumores | Tumores | Total |
| Referencia | 0 | 5 | 5 |
| 2 | 5 | 0 | 5 |
| 3 | 5 | 0 | 5 |
| 4 | 2 | 3 | 5 |
Se utilizó la prueba exacta de Fischer para las
tablas generales de dos vías (Agresti, Categorical Data
Analysis (Wiley, NY, 1990), págs. 64-65) para
probar la hipótesis nula de que las frecuencias de aparición en los
cuatro grupos son iguales. Existe una diferencia muy significativa
entre los grupos (p = 0,001). Se realizaron también las pruebas
exactas a pares que comparan el grupo de referencia con cada uno de
los grupos 2, 3 y 4. Los valores p de una cara correspondientes son
0,004, 0,004 y 0,222. Por lo tanto, los grupos 2 y 3 son ambos
significativamente diferentes del grupo de referencia. Se concluyó
que a una dosis de tratamiento de 10 \mug/ratón con anticuerpo
biespecífico o con una combinación de ambos anticuerpos
monoespecíficos componentes se prolongaba la supervivencia sin
tumor.
En un tercer experimento, se realizó un estudio
de respuesta a la dosis para probar los efectos antitumorales de
dosis variables de anticuerpo biespecífico. Se trataron
respectivamente grupos separados de ratones con dosis de 0,4, 2 ó
10 \mug/ratón de anticuerpo biespecífico o vehículo.
| Grupo | Sin tumores | Tumores | Total |
| Referencia | 0 | 5 | 5 |
| 0,4 | 1 | 4 | 5 |
| 2 | 5 | 0 | 5 |
| 10 | 4 | 1 | 5 |
Se utilizó la prueba de tendencia de
Cochran-Armitage (Agresti, Categorical Data
Analysis (Wiley, NY, 1990), págs. 100-102,
118-119) para demostrar la hipótesis nula de que las
frecuencias de aparición en los cuatro grupos son iguales, frente a
la hipótesis alternativa de una tendencia lineal. Utilizando las
puntuaciones espaciadas igualmente, el valor p es 0,001; utilizando
las puntuaciones 0, 0,4, 2 y 10, el valor p es 0,0164. Ambas series
o puntuaciones indican una tendencia significativa en las
proporciones. Estos resultados demuestran que el anticuerpo
biespecífico es eficaz para prolongar el tiempo de supervivencia y
que los ratones que reciben dosis mayores (10 \mug y 2 \mug)
han mejorado la supervivencia sin tumor.
Se diseñó un cuarto experimento para comparar
OKT3 monoespecífico y 1D10 con el anticuerpo biespecífico a una
dosis de 2 \mug anticuerpo/ratón.
| Grupo | Sin tumores | Tumores | Total |
| Referencia | 0 | 5 | 5 |
| 2 | 0 | 5 | 5 |
| 3 | 1 | 4 | 5 |
| 4 | 4 | 1 | 5 |
La supervivencia sin tumor de los ratones
tratados con OKT3 monoespecífico (Grupo 2) y 1D10 monoespecífico
(Grupo 3) no fue significativamente diferente de la referencia,
mientras que los ratones tratados con anticuerpo biespecífico
(Grupo 4) habían prolongado la supervivencia utilizando la prueba
exacta de Fischer para tablas generales por dos vías.
Estos datos indican que la administración
generalizada de destructores y 1DT3-D y/o impide el
desarrollo de linfocitos B malignos in vivo y que la terapia
con anticuerpo biespecífico a una dosis de 2 \mug/animal es más
eficaz que la terapia con anticuerpo monoespecífico.
El anticuerpo 1DT3-D descrito en
el Ejemplo 1 incorporaba OKT3 como grupo de unión con una afinidad
para las células efectoras. El presente ejemplo describe el
aislamiento de un anticuerpo alternativo, M291, para su utilización
como componente de la unión efector-célula en un
anticuerpo biespecífico.
Se activaron células mononucleares de la sangre
periférica humana (PBMC) con PHA e IL-2 para
expandir los linfocitos T. Se utilizaron linfocitos T activados
como inmunógenos en ratones Balb/C. Se generaron hibridomas en los
bazos de estos ratones por procedimientos normalizados. Estos
hibridomas fueron identificados por anticuerpos que podían
estimular que PBMC proliferase in vitro. Los anticuerpos
anti-CD3 con el Fc apropiado dan lugar a que los
linfocitos T proliferen en PBMC. Uno de estos hibridomas, M291, se
aisló y se observó que segrega un anticuerpo del isótopo
IgG2a/kappa que podría activar los linfocitos T para que proliferen.
El anticuerpo M291 purificado compite con otro anticuerpo CD3
anti-humano, OKT3, (IgG2a/kappa) para unirse a
linfocitos T humanos, demostrando que los epítopos reconocidos por
los anticuerpos respectivos están poco espaciados. M291 es por lo
tanto un anticuerpo con especificidad contra el complejo CD3
humano.
Este ejemplo describe los procedimientos de
humanización independientes para los anticuerpos 1D10 y M291.
Se clonaron los ADNc con dominio V pesado y
ligero para 1D10 y M291 utilizando un procedimiento PCR anclado
(véase Loh et al., Science 243, 217 (1989)). Los ADN se
sintetizaron en primer lugar por transcriptasa inversa después de
sondar los poliA+ ARN de las células de hibridoma con oligo dT. Se
añadió una cola de los dG al terminal 3' del ADNc por
desoxinucleotidil transferasa terminal. Los dominios V se ampliaron
a continuación por PCR con cebadores 3' que se hibridaron a las
zonas C y cebadores 5' que se hidrolizaron en las colas de G.
Varios clones de cadena H y L independientes se secuenciaron para
asegurar que ninguna secuencia errónea era introducida por PCR.
Para 1D10, se expresaron los dominios V como un anticuerpo del
isotipo IgG2a/kappa de ratón transfiriendo los genes en vectores
adecuados en la línea celular SP2/C de mieloma para confirmar que
codifican el punto de unión de 1D10. Los vectores de expresión
utilizados en la transfección son similares a los plásmidos pVk.G y
pVg.D descritos por Co et al. (véase Co et al., J.
Immunol. 148, 1149 (1992)), excepto que los genes para las
zonas constantes procedían de secuencias de ratón. El anticuerpo
aislado de las células transfectadas se obtuvo por citometría de
flujo para unirse a las células Raji en un modelo indistinguible de
este del anticuerpo IgG1/kappa 1D10 del ratón paterno. Los dominios
V de M291 se clonaron asimismo y se expresaron como
F(ab'-cremallera)_{2} de ratón
(véase Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547 (1992)). El
ensayo de citometría de flujo indicó que M291-Fos
F(cremallera ab')_{2} se une a linfocitos T humanos con
similar o idéntica afinidad que el anticuerpo paterno. Esta
observación confirmó que los dominios V correctos de M291 estaban
clonados.
Se seleccionaron las secuencias de los dominios
V humanos más similares a 1D10 y M291 murinas para servir como
marco del anticuerpo humanizado. Para 1D10; la mejor secuencia
V_{k} humana fue R3.5H5G del subgrupo I humano con solo dieciséis
diferencias de 1D10 en zonas marco. Manheimer-Lory
et al., J. Exp. Med. 174, 1639-1652 (1991).
La mejor secuencia V_{H} fue IC_{4} del subgrupo II o del
subgrupo IV de Kabat (véase Kabat et al., Sequences of Proteins
of Immunological Interest 1, 1137 (1991)), con veintiséis
diferencias. Para M291, la mejor secuencia V_{k} humana es
HF2-1/17 del subgrupo I humano con diferencias de
veintiséis aminoácidos de M291 en zonas marco (Athison et al.,
J. Clin. Invest. 75, 1138 (1985); Lampman Blood 74, 262 (1989));
la mejor secuencia V_{H} humana es 21/28 del subgrupo I humano
con veinte diferencias de aminoácidos. Dersimonian et al., J.
Immunol. 139, 2496-2501 (1987). Con ayuda del
modelo tridimensional, se identificaron numerosas posiciones marco
adicionales que se diferencian entre los anticuerpos murinos y las
secuencias humanas seleccionadas. La posición de estos restos de
aminoácido en el espacio tridimensional en comparación con las zonas
hipervariables, o CDR, indicaron que influyen probablemente en la
configuración de CDR, y de este modo en la afinidad de unión. Se
utilizaron secuencias murinas en estas posiciones. Se identificaron
numerosas posiciones en las secuencias humanas que se diferencian
del consenso de sus respectivos subgrupos. Estos aminoácidos se
cambiaron para que correspondan con las secuencias de consenso. Las
comparaciones de las secuencias V_{H} y V_{L} entre 1D10 murino
y humanizado, y entre M291 murino y humanizado, se presentan en la
Figura 4 y Figura 5, respectivamente.
Se construyeron segmentos de ADN que codifican
1D10 humanizado y zonas V con cadena L y H por síntesis génica
total a partir de oligonucleótidos solapantes. Estos miniexones
incluían secuencias señal, segmentos J y secuencias donantes de
corte y empalme y estaban rodeadas por secuencias XbaI. Los
segmentos de ADN se incorporaron en un vector de expresión
utilizando el esquema esbozado en la Figura 6.
Se clonaron dominios V humanizados en las
secuencias XbaI de los correspondientes plásmidos pV_{g}1.D.Tt y
pVk.rG.dE de expresión de la cadena pesada y ligera. Los plásmidos
resultantes se denominan pHu1D10.Vgl.D.Tt y pHu1D10.V_{k}.rG.dE.
El vector de expresión de cadena pesada, pVgl.D.Tt, que contiene el
gen mutante de dihidrofolato reductasa (mdhfr) como marcador
seleccionable (véase Simonsen y Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 80, 2495 (1983)), el activador precoz intermedio principal
de citomegalovirus humano (hCMV) y el potenciador para la
iniciación de la transcripción (véase Boshart et al., Cell
41, 521 (1985)), y las zonas constantes de IgG1 humana se
construyeron a partir de los fragmentos respectivos por
procedimientos normalizados. Se diferencia del vector pV_{g}1.D
descrito por Co et al., J. Immunol., 148, 1149 (1992) por
tener un punto 3' de terminación de la transcripción con el punto
\gamma1 del gen poli(A). El punto (Tt) de terminación de
la transcripción procedía de la secuencia situada corriente abajo
del gen C2 del complemento humano (+37 a +162 bp del punto C2
poli(A)) (véase Ashfield et al., EMBO J. 10, 4197
(1991)) y se sintetizó completamente utilizando oligonucleótidos
solapantes.
Para la expresión de la cadena ligera, se
construyó un vector procedente del activador y potenciador del hCMV,
el gen C_{K} humano que incluye parte del intrón anterior, y el
gen de xantina-guanina fosforribosiltransferasa
(gpt) (véase Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,
2072 (1981)) para selección. El vector, pV_{k}.rG.dE, es similar
al pV_{k} descrito por Co et al. (véase co et al., J.
Immunol. 148, 1149 (1992)) excepto para la orientación del gen
gpt. Además, una de las dos secuencias repetidas en la zona
potenciadora del activador SV40 utilizada para transcribir el gen
gpt fue eliminada por digestión con SphI.
Para la coexpresión de las cadenas pesada y
ligera en un plásmido, un fragmento EcoRI que contiene el activador
hCMV, el exón VH, los exones C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3, la señal
poliA y la señal de terminación de la transcripción se extrajeron
del vector de expresión de cadena pesada y se clonaron en una
secuencia EcoRI única del plásmido correspondiente de expresión con
cadena ligera. Debido a la presencia de la señal de terminación de
la transcripción situada entre ellos, los dos genes son transcritos
independientemente por el activador de hCMV. Después de la
transcripción el exón V_{H} humanizado se corta y empalma al
\gamma1 C_{H}1 humano, a la articulación, a los exones C_{H}2
y C_{H}3 y a continuación se poliadenila. Asimismo el exón
V_{L} se corta y empalma con el exón C_{K} humano. Las
secuencias de aminoácidos previstas de las cadenas ligera y pesada
madura de 1D10 humanizadas se presentan en las Figuras 4C y 4E,
respectivamente.
El plásmido pHu1D10.IgG1.rG.dE, se utilizó para
la transcripción en la línea celular TSO del mieloma de ratón por
electroporación. Las células TSO derivadas de las células NSO del
mieloma de ratón (ECACC 85110503) se seleccionan por su capacidad
para cultivarse en medio exento de suero según el procedimiento de
Sato et al., J. Exp. Med. 165, 1761 (1987). Se seleccionaron
las células de cada transfección para la expresión de gpt.
Debido a que el activador/potenciador SV40 ha sido inhabilitado como
gen gpt, solamente unos pocos transfectantes pueden expresar
a gpt lo bastante como para sobrevivir a la selección (véase
Jasin y Berg, Genes Dev. 2, 1353 (1988)). La eficacia de la
transfección es aproximadamente
0,5-1,0\times10^{-6}; en comparación con la
eficacia de 10-50\times10^{-6} de la
transfección que utiliza el plásmido casi idéntico que contiene el
activador SV40 natural para gpt. Cuando se identificó para la
producción de anticuerpos humanizados por ELISA normalizado, el
promedio de células supervivientes también proporcionó mayores
concentraciones de anticuerpo en comparación con los transfectados
con plásmido que contiene el activador SV40 natural. El mejor
productor de anticuerpo se subclonó a continuación para la
producción del 1D10 humanizado. El anticuerpo, Hu1D10, fue
purificado a partir del medio gastado exento de suero por
cromatografía de afinidad con proteína A.
1D10-IgG2a murino y 1D10
humanizado tenían espectros idénticos de reactividad con las líneas
celulares 1D10 positiva y 1D10 negativa. La afinidad de
1D10-IgGa murino y 1D10 humanizado para las células
que llevan el anticuerpo diana se evaluó utilizando un ensayo de
desplazamiento (véase Woodle et al., J. Immunol. 148 2756
(1992)). En este ensayo, se cuantificó la capacidad de 1D10
humanizada preunida o de 1D10-IgG2a murino para
inhibir la unión de 1D10-IgG2a murino marcado con
FITC por análisis FACS. 1D10 humanizado inhibió competitivamente la
unión de 1D10-IgG2a murino en un grado similar al
observado con el anticuerpo precursor (Figura 7A). Estos datos
indicaban que el anticuerpo humanizado se une con afinidad similar a
la del anticuerpo murino. Se utilizó análisis de Scatchard para
estimar mejor la afinidad aparente de 1D10 humanizado. Se observó
que 1D10-IgG1 humanizado tiene una K_{a} aparente
de 2,3\times10^{8} M^{-1}, y existen aproximadamente 5
\times 10^{5} puntos por célula en la línea celular Raji
(Figura 7B). Además, 1D10 humanizado tiene capacidad para dirigir
ADCC y la lisis mediada por el complemento, dos funciones de efector
que no están presentes en el 1D10 murino original (Figuras 8A y
8B).
Los genes cremallera de leucina, Jun y Fos, se
sintetizaron tal como describe Kostelny et al., J. Immunol.
148, 1547 (1992). Los productos de PCR resultantes fueron los
fragmentos PstI-SalI de 179 bp, que comprenden la
fusión del gen cremallera completo con articulación. La secuencia
PstI es la secuencia de restricción natural localizada al comienzo
del exón con articulación, pero la secuencia SalI se añadió al final
de las secuencias cremallera durante la PCR. Se insertó el exón con
articulación/cremallera con un fragmento SalI-BamHI
de 162 bp que contiene la secuencia no codificadora en 3' del gen
IgG2a de ratón en el vector pVgI.D.Tt de expresión de la cadena
pesada, que sustituye a la articulación, los exones C_{H}2 y
C_{H}3 en el plásmido. La coexpresión del gen (Fd) con cadena
pesada truncada con el gen de cadena ligera en un plásmido es
esencialmente la misma descrita anteriormente para pHu1D10.IgG1.rG
· dE (Figura 6). Los plásmidos de expresión se denominan
pHu1D10-Jun.rG.dE y
pHuM291-Fos.rG.dE (Figura 9). Las diferencias entre
estos plásmidos y los utilizados para expresar el anticuerpo
completo son: (1) el exón \gamma1 C_{H}1 humano se corta y
empalma ahora con el exón de fusión con articulación/cremallera en
lugar de los exones C_{H}2 y C_{H}3 con articulación, y (2) el
transcrito se poliadenila mediante una señal heteróloga. La
cremallera Jun de leucina se utiliza para el Fd de Hu1D10 y Fos para
Fd de HuM291. Cuando se combina con la cadena ligera
correspondiente, la cremallera de Fd formaría el
F(ab'-cremallera)_{2}. Los
fragmentos F(ab'-cremallera)_{2}
humanizados para 1D10 y M291 se denominan Hu1D10-Jun
y HuM291-Fos, respectivamente. Las secuencias de
aminoácido previstas del Fd-cremallera de cadena
pesada en Hu1D10-Jun y HuM291-Fos
se presentan en las Figuras 4D y 5D, respectivamente. En ambos casos
existieron modificaciones de la articulación de 1gG1 humana en la
zona de fusión de articulación/cremallera (Figura 10). Una inserción
de dos restos de aminoácido Lys-Cys procedentes de
la articulación de IgG2a de ratón se introdujo en el exón de
articulación para proporcionar un enlace disulfuro adicional entre
las cadenas pesadas. La inserción de estos dos restos en la
articulación de IgG1 humana hace homólogo a su mitad terminal COOH
con el de la articulación de IgG2a de ratón. La articulación
modificada tendría tres enlaces disulfuros entre las cadenas pesadas
en comparación con dos en la IgG1 humana natural. Además un resto
Ala (primer resto del dominio C_{H}2) y dos restos Gly se
introdujeron en la unión de la fusión para hacer las uniones más
flexibles. Los plásmidos de expresión,
pHu1D10-Jun.rG.dE y
pHuM291-Fos.rG.dE, se transfectaron por separado en
la línea celular TSO de mieloma de ratón por electroporación. Se
identificó la presencia de transfectantes y la cantidad de
fragmentos F(ab'-cremallera)_{2}
segregados por ELISA. Se purificaron los fragmentos
F(ab'-cremallera)_{2} utilizando la
cromatografía de afinidad de la proteína G.
Se evaluó la afinidad relativa de
F(ab'-cremallera)_{2} de M291 murino
y HuM291-Fos para los linfocitos T utilizando el
ensayo de desplazamiento descrito anteriormente.
HuM291-Fos bloquea la unión de IgG2a de M291 murino
marcado con FITC así como la M291 no marcada (Figura 11A). La
afinidad de HuM291 para CD3 se estima que está comprendida entre 2
y 3 veces la de las M291. El análisis de Scatchard indicó que la
afinidad aparente de HuM291-Fos fue K_{a} 1,1
\times 10^{9} M^{-1}, y existen aproximadamente 6,6 \times
10^{4} puntos por célula en los linfocitos T humanos activados
(Figura 11B).
Se mezclaron Hu1D10-Jun y HuM291
en relación molar igual a las concentraciones entre 0,5 y 3,0 mg/ml
y se redujeron con DTT 10 mM en PBS a 37ºC durante 1 hora para
formar Fab'-cremalleras. Se pasaron a través de la
columna Sepharose G-50 en PBS para eliminar el DTT.
Se incubó la proteína desalada a 4ºC durante 48 horas para permitir
la formación de Hu1D10-Jun \times
HuM291-Fos biespecífico heterodimérico. Las
moléculas biespecíficas se continuaron purificando por
cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en una columna Fenil
Sepharose.
Se determinó la capacidad de
Hu1D10-Jun \times BuM291-Fos para
dirigir la lisis mediada por linfocitos T en un ensayo de
liberación de cromo. Los linfocitos T humanos procedentes de PBMC
después del tratamiento con OKT3 e IL-2 se
utilizaron como células efectoras. Dawo, que es una línea celular
desarrollada en un paciente con linfoma de linfocitos B grandes, se
utilizó como células diana. La Figura 12 demuestra que
Hu1D10-Jun \times HuM291-Fos
biespecífico, así como el 1DT3-D de IgG biespecífica
de ratón dirigió los linfocitos T para lisar células diana. Las dos
moléculas biespecíficas parece que tienen actividades similares a
bajas concentraciones de anticuerpo. Los dos anticuerpos
precursores, HuM291-Fos y
Hu1D10-Jun, no fueron eficaces en este ensayo, ni
aisladamente ni en combinación.
A altas concentraciones (10 \mug/ml,
1DT3-D presentó mayor actividad que
Hu1D10-Jun \times HuM291-Fos para
mediar la lisis de las células diana. Esto es debido a los
receptores Fc de baja afinidad en la superficie de las células
diana. A alta concentración de anticuerpo, Fc de las IgG
biespecíficas pudo unirse a estos receptores y dirigir los
linfocitos T para lisar las células diana independientes del
antígeno diana, un mecanismo conocido como lisis inversa (véase
Weiner et al., J. Immunol. 152, 2385 (1994)). Debido a que
Hu1D10-Jun \times HuM291-Fos es
una molécula similar a F(ab')_{2} sin un Fc, no puede
iniciar la lisis al unirse a un receptor Fc. En alguna aplicación
terapéutica, la propiedad del anticuerpo humanizado presenta
ventajas al aumentar la toxicidad selectiva del anticuerpo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Weiner, George
\hskip3.9cmGingrich, Roger
\hskip3.9cmLink, Brian
\hskip3.9cmTso, J. Yun
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpo biespecífico eficaz para tratar el linfoma de linfocitos B y línea celular
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Townsend and Townsend and Crew
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One Market Plaza, Steuart Tower, Suite 2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94105
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/379.411
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-MAR-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/859.583
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-MAR-1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Smith, William M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.223
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 011823-004901
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415-326-2400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415-326-2422
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 214 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 273 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 446 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 106 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 106 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 213 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 279 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
Claims (14)
1. Versión humanizada del anticuerpo 1D10 de
ratón, estando el anticuerpo de ratón caracterizado por una
zona variable de cadena ligera mostrada en la Figura 4A; panel
inferior y una zona variable de cadena pesada mostrada en la Figura
4B; panel inferior.
2. Anticuerpo humanizado según la reivindicación
1, comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada humanizada y una
cadena ligera humanizada:
- (1)
- comprendiendo la cadena ligera humanizada tres zonas determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena ligera de inmunoglobulina 1D10, y un marco de la zona variable de una secuencia marco de zona variable de cadena ligera kappa humana excepto en por lo menos una posición seleccionada de entre un primer grupo constituido por L48, L49, L69 y L70 en el que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la zona variable de cadena ligera de inmunoglobulina 1D10; y
- (2)
- comprendiendo la cadena pesada humanizada tres zonas determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena pesada de inmunoglobulina 1D10, y un marco de la zona variable de una secuencia marco de zona variable de cadena pesada humana excepto en por lo menos una posición seleccionada de entre un primer grupo constituido por H27, H29, H30, H37, H67, H71, H78 y H83, en el que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la zona variable de cadena pesada de inmunoglobulina 1D10 de ratón,
en el que anticuerpo 1D10 se caracteriza
por una zona variable de cadena ligera mostrada en la Figura 4A;
panel inferior y una zona variable de cadena pesada mostrada en la
Figura 4B; panel inferior; y
en el que el anticuerpo humanizado se une
específicamente a una proteína heterodimérica de 28/32 kDa en la
superficie de linfocitos B malignos con una afinidad de unión que
presenta un límite inferior de aproximadamente 10^{7} M^{-1} y
un límite superior del quíntuplo de la afinidad de unión de la
inmunoglobulina 1D10.
3. Anticuerpo humanizado según la reivindicación
2, en el que el marco de zona variable de la cadena ligera
humanizada procede del marco de la zona variable de cadena ligera
del anticuerpo R3.5H5G, excepto en por lo menos una posición
seleccionada de entre el primer grupo y excepto en la posición L43,
que está ocupada por el aminoácido presente en la posición
equivalente de una secuencia de consenso del subgrupo I kappa
humano;
la cadena pesada humanizada procede del marco
variable de la zona de la cadena pesada del anticuerpo IC4, excepto
en por lo menos una posición seleccionada de entre el segundo grupo,
y excepto en la posición H73, en el que la posición del aminoácido
está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición
equivalente de una secuencia de consenso del subgrupo II o IV de
inmunoglobulina humana.
4. Anticuerpo humanizado según la reivindicación
3, en el que la cadena ligera humanizada comprende la secuencia de
aminoácidos de la Figura 4A; panel inferior y
la cadena pesada humanizada comprende la
secuencia de aminoácidos de la Figura 4B; panel superior;
opcionalmente en el que la cadena ligera
humanizada comprende además una zona constante kappa humana, la
cadena pesada humanizada comprende además una zona constante
\gamma1 humana, y el anticuerpo humanizado efectúa ADCC y la lisis
mediada por el complemento de linfocitos B malignos cuando se une a
una proteína heterodimérica de 28/32 kDa en la superficie de las
células.
5. Anticuerpo humanizado, comprendiendo el
anticuerpo una cadena pesada humanizada y una cadena ligera
humanizada:
- (1)
- comprendiendo la cadena ligera humanizada tres zonas determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena ligera de inmunoglobulina M291 de ratón, y un marco de la zona variable de una secuencia marco de zona variable de cadena ligera kappa humana, y
- (2)
- comprendiendo la cadena pesada humanizada tres zonas determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena pesada de inmunoglobulina M291 de ratón, y un marco de la zona variable de una secuencia marco de zona variable de cadena pesada humana excepto en por lo menos una posición seleccionada de entre un segundo grupo constituido por H30, H67, H68, H70, H72 y H74, en el que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la zona variable de cadena pesada de inmunoglobulina M291 de ratón;
en el que la inmunoglobulina M291 está
caracterizada por una zona variable de cadena ligera mostrada
en la Figura 5A; panel inferior y una zona variable de cadena pesada
mostrada en la Figura 5B; panel inferior; y
en el que el anticuerpo humanizado se une
específicamente al antígeno CD3 en la superficie de linfocitos T con
una afinidad de unión que presenta un límite inferior de
aproximadamente 10^{7} M^{-1} y un límite superior del quíntuplo
de la afinidad de unión de la inmunoglobulina M291.
6. Anticuerpo humanizado según la reivindicación
5, en el que el marco de la zona variable de cadena ligera
humanizada procede del marco de la zona variable de cadena ligera
del anticuerpo HF2-1/17 en el subgrupo I;
el marco de la zona de cadena pesada humanizada
procede del marco variable de la zona de cadena pesada del
anticuerpo 21/28, excepto en por lo menos una posición seleccionada
de entre el segundo grupo, y excepto en la posición 44, en el que la
posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido
presente en la posición equivalente de una secuencia de consenso del
subgrupo I de inmunoglobulina humana.
7. Anticuerpo humanizado según la reivindicación
6, en el que la cadena ligera humanizada comprende la secuencia de
aminoácidos de la Figura 5A; panel superior y la cadena pesada
humanizada comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 5B;
panel inferior.
8. Anticuerpo biespecífico que comprende:
un primer fragmento de unión que comprende:
- una forma humanizada de la zona variable de cadena pesada del anticuerpo M291 como se muestra en la Figura 5B; panel inferior;
- una forma humanizada de la zona variable de cadena ligera del anticuerpo M291 como se muestra en la Figura 5A, panel inferior; y
un segundo fragmento de unión, que está unido al
primer fragmento de unión, que comprende:
- una forma humanizada de la zona variable de cadena pesada del anticuerpo 1D10 como se muestra en la Figura 4B, panel inferior;
- una forma humanizada de la zona variable de cadena ligera del anticuerpo 1D10 como se muestra en la Figura 4A, panel inferior;
en el que el primer fragmento de unión se une
específicamente al antígeno CD3 y el segundo fragmento de unión se
une específicamente al antígeno heterodimérico de 28/32 kDa en la
superficie de los linfocitos B malignos.
9. Anticuerpo biespecífico según la
reivindicación 8, en el que:
la forma humanizada de la zona variable de
cadena pesada del anticuerpo M291 comprende tres zonas determinantes
de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad
correspondientes de la cadena pesada de inmunoglobulina M291, y un
marco de la zona variable procedente de una secuencia marco de zona
variable de cadena pesada humana excepto en por lo menos una
posición seleccionada de entre un grupo constituido por H30, H67,
H68, H70, H72 y H74, en el que la posición del aminoácido está
ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente
del marco de la zona variable de cadena pesada de inmunoglobulina
M291 de ratón;
la forma humanizada de la zona variable de
cadena ligera del anticuerpo M291 comprende tres zonas determinantes
de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos procedentes de las zonas determinantes de
complementariedad correspondientes de la cadena ligera de
inmunoglobulina M291, y un marco de la zona variable de una
secuencia marco de zona variable de cadena ligera kappa humana;
la forma humanizada de la zona variable de
cadena pesada del anticuerpo 1D10 comprende tres zonas determinantes
de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad
correspondientes de la cadena pesada de inmunoglobulina 1D10, y un
marco de la zona variable de una secuencia marco de zona variable de
cadena pesada humana excepto en por lo menos una posición
seleccionada de entre un grupo constituido por H27, H29, H30, H37,
H67, H71, H78 y H83, en el que la posición del aminoácido está
ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente
del marco de la zona variable de cadena pesada de inmunoglobulina
1D10 de ratón; y
la forma humanizada de la zona variable de
cadena ligera del anticuerpo 1D10 comprende tres zonas determinantes
de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de
aminoácidos de las zonas determinantes de complementariedad
correspondientes de la cadena ligera de inmunoglobulina 1D10, y un
marco de la zona variable de una secuencia marco de zona variable de
cadena ligera kappa humana excepto en por lo menos una posición
seleccionada de entre un primer grupo constituido por L48, L49, L69
y L70 en el que la posición del aminoácido está ocupada, por el
mismo aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la
zona variable de cadena ligera de inmunoglobulina 1D10.
10. Anticuerpo biespecífico según la
reivindicación 9, en el que el primer fragmento de unión comprende
la zona variable de cadena pesada mostrada en la Figura 5B; panel
superior y la zona variable de cadena ligera mostrada en la Figura
5A; panel superior; y el segundo fragmento de unión comprende la
zona variable de cadena pesada mostrada en la Figura 4B; panel
superior y la zona variable de cadena ligera mostrada en la Figura
4A; panel superior;
opcionalmente en el que los primer y segundo
fragmentos de unión comprenden cada uno además un segmento de una
zona constante fusionado a las zonas variables de cadena pesada
respectivas, y los fragmentos de unión están unidos por asociación
de las zonas constantes.
11. Anticuerpo biespecífico según la
reivindicación 10, en el que los fragmentos de unión son Fab o Fab',
preferentemente en el que los primer y segundo fragmentos de unión
son los Pab y el anticuerpo específico es un
F(ab')_{2}.
F(ab')_{2}.
12. Anticuerpo específico según cualquiera de
las reivindicaciones 10 u 11, en el que los primer y segundo
fragmentos de unión comprenden además las primera y segunda
cremalleras de leucina fusionadas a las zonas constantes
respectivas.
13. Anticuerpo específico según la
reivindicación 12, en el que el primer fragmento de unión comprende
una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en
la Figura 5D y el segundo fragmento de unión comprende una cadena
pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura
4D.
14. Utilización de un anticuerpo biespecífico
según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 13, en la preparación
de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece
una de las enfermedades seleccionadas de entre leucemia
linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, leucemia linfocítica
crónica y mieloma múltiple;
incluyendo además dicho medicamento
opcionalmente un agente para activar los linfocitos T en el
paciente, p. ej. IL-2.
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Families Citing this family (141)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7381803B1 (en) * | 1992-03-27 | 2008-06-03 | Pdl Biopharma, Inc. | Humanized antibodies against CD3 |
| US6129914A (en) * | 1992-03-27 | 2000-10-10 | Protein Design Labs, Inc. | Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line |
| US5834597A (en) * | 1996-05-20 | 1998-11-10 | Protein Design Labs, Inc. | Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same |
| DE19634159C1 (de) * | 1996-08-23 | 1997-09-25 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Induktion einer Tumorimmunität durch Injektion von Hybridzellen |
| AU737106B2 (en) * | 1997-04-18 | 2001-08-09 | Biogen, Inc. | Type II TGF-beta receptor/immunoglobulin constant region fusion proteins |
| WO1999027964A1 (en) * | 1997-12-01 | 1999-06-10 | Cfy Biomedicals, Inc. | Multivalent recombinant antibodies for treating hrv infections |
| US20030035798A1 (en) * | 2000-08-16 | 2003-02-20 | Fang Fang | Humanized antibodies |
| WO2000034459A1 (en) | 1998-12-09 | 2000-06-15 | Protein Design Labs, Inc. | Animal model for psoriasis for the prevention and treatment of psoriasis in humans |
| US6723338B1 (en) * | 1999-04-01 | 2004-04-20 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Compositions and methods for treating lymphoma |
| US6376654B1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-04-23 | Molecular Discoveries, Llc | Myeloma cell and ovarian cancer cell surface glycoproteins, antibodies thereto, and uses thereof |
| US6929910B2 (en) | 2000-04-19 | 2005-08-16 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic and therapeutic methods using the H37 tumor suppressor gene |
| US7226750B1 (en) | 2000-08-08 | 2007-06-05 | Molecular Discoveries, Inc. | Ovarian cancer cell and myeloma cell surface glycoproteins, antibodies thereto, and uses thereof |
| US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US6916611B2 (en) * | 2001-02-26 | 2005-07-12 | The Regents Of The University Of California | Expression vector system and a method for optimization and confirmation of DNA delivery and quantification of targeting frequency |
| US6955717B2 (en) * | 2001-05-01 | 2005-10-18 | Medimmune Inc. | Crystals and structure of Synagis Fab |
| AU2002365196C1 (en) | 2001-07-19 | 2009-08-13 | Perlan Therapeutics, Inc. | Multimeric proteins and methods of making and using same |
| US6833441B2 (en) | 2001-08-01 | 2004-12-21 | Abmaxis, Inc. | Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers |
| EP1434871B1 (en) * | 2001-09-20 | 2017-01-18 | Immunex Corporation | Selection of cells expressing heteromeric polypeptides |
| US20030082188A1 (en) * | 2001-10-11 | 2003-05-01 | Tso J. Yun | Treatment of prostate cancer by inhibitors of NCAM2 |
| US7175983B2 (en) * | 2001-11-02 | 2007-02-13 | Abmaxis, Inc. | Adapter-directed display systems |
| DE60328870D1 (de) | 2002-03-15 | 2009-10-01 | Schering Corp | Verfahren zur modulierung von cd200-rezeptoren |
| US6841565B1 (en) * | 2002-03-29 | 2005-01-11 | The Ohio State University | Treatment of patients with chronic lymphocytic leukemia |
| US7332585B2 (en) | 2002-04-05 | 2008-02-19 | The Regents Of The California University | Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof |
| US7332580B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-02-19 | The Regents Of The University Of California | Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof |
| CA2506672C (en) | 2002-12-23 | 2012-04-17 | Schering Corporation | Il-23 for treating cutaneous wounds |
| EP1596813A4 (en) * | 2003-01-31 | 2008-02-20 | Five Prime Therapeutics Inc | POLYPEPTIDES EXPRESSED BY LUNGS |
| JP4685764B2 (ja) * | 2003-04-10 | 2011-05-18 | アボット バイオセラピューティクス コーポレイション | 変異誘発による抗体のＦｃＲｎ結合親和力又は血清半減期の改変 |
| WO2005011580A2 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for herpes simplex prophylaxis and treatment |
| GB2406094B (en) * | 2003-09-17 | 2007-06-06 | Antisoma Plc | Modified antibody comprising an amino acid substitution mutation which confers increased stability |
| AU2003271174A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
| EP2311945A1 (en) | 2003-10-14 | 2011-04-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibodies substituting for functional proteins |
| EP1673395A1 (en) | 2003-10-15 | 2006-06-28 | PDL BioPharma, Inc. | Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig |
| SI1716178T1 (sl) * | 2004-02-16 | 2010-11-30 | Micromet Ag | Manj imunogene vezne molekule |
| US7794713B2 (en) | 2004-04-07 | 2010-09-14 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases |
| US20060193849A1 (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Antisoma Plc | Biological materials and uses thereof |
| DK3050963T3 (da) | 2005-03-31 | 2019-12-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement |
| EP2586798A3 (en) | 2005-07-25 | 2013-08-07 | Emergent Product Development Seattle, LLC | B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules |
| WO2007062466A1 (en) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | The University Of Sydney | Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents |
| AU2007232873B2 (en) | 2006-03-31 | 2014-02-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
| CN105177091A (zh) | 2006-03-31 | 2015-12-23 | 中外制药株式会社 | 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法 |
| US7862812B2 (en) | 2006-05-31 | 2011-01-04 | Lpath, Inc. | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
| MX2008015524A (es) | 2006-06-12 | 2009-01-13 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| CN101679506B (zh) * | 2006-10-27 | 2015-02-25 | 勒帕斯公司 | 用于结合鞘氨醇-1-磷酸的组合物和方法 |
| AU2007313822A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-08 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for treating ocular diseases and conditions |
| AU2007353412A1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-11-20 | Fox Chase Cancer Center | Anti-EGFR family antibodies, bispecific anti-EGFR family antibodies and methods of use thereof |
| US9163091B2 (en) * | 2007-05-30 | 2015-10-20 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid |
| EP2164992B1 (en) * | 2007-05-30 | 2016-05-04 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid |
| US8604172B2 (en) * | 2009-04-17 | 2013-12-10 | Lpath, Inc. | Humanized antibody compositions and methods for binding lysophosphatidic acid |
| EP4368721A2 (en) | 2007-09-26 | 2024-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr |
| KR101680906B1 (ko) | 2007-09-26 | 2016-11-30 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항체 정상영역 개변체 |
| US8361465B2 (en) * | 2007-10-26 | 2013-01-29 | Lpath, Inc. | Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents |
| CN102099377A (zh) | 2008-04-11 | 2011-06-15 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合 |
| US8871202B2 (en) | 2008-10-24 | 2014-10-28 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate |
| WO2010065921A2 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Lpath, Inc. | Antibody design using anti-lipid antibody crystal structures |
| US8401799B2 (en) * | 2008-12-05 | 2013-03-19 | Lpath, Inc. | Antibody design using anti-lipid antibody crystal structures |
| US20160095939A1 (en) | 2014-10-07 | 2016-04-07 | Immunomedics, Inc. | Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates |
| DK3912643T3 (da) | 2009-02-13 | 2022-10-17 | Immunomedics Inc | Immunokonjugater med en intracellulært-spaltelig binding |
| WO2010098863A1 (en) * | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Lpath, Inc. | Humanized platelet activating factor antibody design using anti-lipid antibody templates |
| US8877199B2 (en) | 2009-05-15 | 2014-11-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | B cell surface reactive antibodies |
| CA2769473A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | N.V. Organon | Fully human antibodies to btla |
| EP2478110B1 (en) | 2009-09-16 | 2016-01-06 | Immunomedics, Inc. | Class i anti-cea antibodies and uses thereof |
| EP2496707B1 (en) | 2009-11-04 | 2020-02-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Engineered anti-tslp antibody |
| WO2011068845A1 (en) | 2009-12-02 | 2011-06-09 | Immunomedics, Inc. | Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy |
| EP3778917A3 (en) | 2009-12-04 | 2021-06-09 | F. Hoffmann-La Roche AG | Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods |
| US20110212088A1 (en) * | 2010-02-26 | 2011-09-01 | Sabbadini Roger A | Anti-paf antibodies |
| RU2624027C2 (ru) * | 2010-04-23 | 2017-06-30 | Дженентек, Инк. | Получение гетеромультимерных белков |
| MA34291B1 (fr) | 2010-05-03 | 2013-06-01 | Genentech Inc | Compositions et méthodes de diagnostic et de traitement d'une tumeur |
| MY166429A (en) | 2010-11-17 | 2018-06-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
| TWI736437B (zh) | 2010-11-30 | 2021-08-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 細胞傷害誘導治療劑 |
| JP2014518615A (ja) * | 2011-04-22 | 2014-08-07 | エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー | 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法 |
| CN103501825B (zh) | 2011-05-02 | 2017-03-15 | 免疫医疗公司 | 用于小体积施用的同种异型选择的抗体的超滤浓缩 |
| SG10201703425RA (en) * | 2011-05-21 | 2017-05-30 | Macrogenics Inc | Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3 |
| EP3279315A3 (en) * | 2012-05-25 | 2018-02-28 | Cellectis | Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells |
| WO2014012085A2 (en) * | 2012-07-13 | 2014-01-16 | Zymeworks Inc. | Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-cd3 constructs |
| AU2013302696B9 (en) | 2012-08-14 | 2018-08-09 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease |
| RU2655964C2 (ru) | 2012-11-20 | 2018-05-30 | Спектрум Фармасьютикалз, Инк. | Улучшенный способ получения инкапсулированного в липосомы винкристина для терапевтического применения |
| CN118001422A (zh) | 2012-12-13 | 2024-05-10 | 免疫医疗公司 | 功效改进且毒性降低的抗体与sn-38的免疫缀合物的剂量 |
| WO2017004144A1 (en) | 2015-07-01 | 2017-01-05 | Immunomedics, Inc. | Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker |
| EP3050896B1 (en) | 2013-09-27 | 2021-07-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
| WO2015077891A1 (en) | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Zymeworks Inc. | Bispecific antigen-binding constructs targeting her2 |
| CN106132436B (zh) | 2014-02-21 | 2021-06-15 | Ibc药品公司 | 通过诱导对trop-2表达细胞的免疫应答的疾病疗法 |
| EP3110445A4 (en) | 2014-02-25 | 2017-09-27 | Immunomedics, Inc. | Humanized rfb4 anti-cd22 antibody |
| GB201409558D0 (en) | 2014-05-29 | 2014-07-16 | Ucb Biopharma Sprl | Method |
| CA2953567C (en) | 2014-06-24 | 2023-09-05 | Immunomedics, Inc. | Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis |
| CA2895659A1 (en) | 2014-07-01 | 2016-01-01 | Pfizer Inc. | Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof |
| GB201412659D0 (en) | 2014-07-16 | 2014-08-27 | Ucb Biopharma Sprl | Molecules |
| GB201412658D0 (en) | 2014-07-16 | 2014-08-27 | Ucb Biopharma Sprl | Molecules |
| JO3663B1 (ar) | 2014-08-19 | 2020-08-27 | Merck Sharp & Dohme | الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين |
| CR20170060A (es) | 2014-08-19 | 2017-04-18 | Merck Sharp & Dohme | Anticuerpos anti tigit |
| TWI701435B (zh) | 2014-09-26 | 2020-08-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 測定ｆｖｉｉｉ的反應性之方法 |
| MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
| TWI700300B (zh) | 2014-09-26 | 2020-08-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體 |
| CN110658340B (zh) * | 2015-01-08 | 2023-10-31 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物 |
| JP7082484B2 (ja) | 2015-04-01 | 2022-06-08 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
| AU2016252771B2 (en) | 2015-04-22 | 2021-12-16 | Immunomedics, Inc. | Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating Trop-2-positive cancer cells |
| ES2953441T3 (es) | 2015-06-25 | 2023-11-13 | Immunomedics Inc | Combinación de anticuerpos anti-hla-dr o anti-Trop-2 con inhibidores de microtúbulos, inhibidores de parp, inhibidores de la cinasa de bruton o inhibidores de la fosfoinositida 3-cinasa mejora significativamente el resultado terapéutico en el cáncer |
| US11147886B2 (en) | 2015-07-15 | 2021-10-19 | Zymeworks Inc. | Drug-conjugated bi-specific antigen-binding constructs |
| GB201601077D0 (en) | 2016-01-20 | 2016-03-02 | Ucb Biopharma Sprl | Antibody molecule |
| GB201601073D0 (en) | 2016-01-20 | 2016-03-02 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
| GB201601075D0 (en) | 2016-01-20 | 2016-03-02 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies molecules |
| TWI678213B (zh) | 2015-07-22 | 2019-12-01 | 美商史倍壯製藥公司 | 用於長春新鹼硫酸鹽脂質體注射之即可使用的調配物 |
| EA201890613A1 (ru) | 2015-09-21 | 2018-10-31 | Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс | Полипептиды, связывающие cd3 |
| JO3555B1 (ar) | 2015-10-29 | 2020-07-05 | Merck Sharp & Dohme | جسم مضاد يبطل فعالية فيروس الالتهاب الرئوي البشري |
| GB201521393D0 (en) | 2015-12-03 | 2016-01-20 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
| GB201521382D0 (en) | 2015-12-03 | 2016-01-20 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
| GB201521391D0 (en) | 2015-12-03 | 2016-01-20 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
| GB201521383D0 (en) | 2015-12-03 | 2016-01-20 | Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech | Method |
| GB201521389D0 (en) | 2015-12-03 | 2016-01-20 | Ucb Biopharma Sprl | Method |
| MX2018007406A (es) | 2015-12-16 | 2018-08-15 | Merck Sharp & Dohme | Anticuerpos anti-lag3 y fragmentos de enlace al antigeno. |
| EP3398965A4 (en) | 2015-12-28 | 2019-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION |
| CA3019588A1 (en) | 2016-04-20 | 2017-10-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cmv neutralizing antigen binding proteins |
| NL2017267B1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Aduro Biotech Holdings Europe B V | Anti-pd-1 antibodies |
| NL2017270B1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-09 | Aduro Biotech Holdings Europe B V | New anti-hCTLA-4 antibodies |
| CN109661241A (zh) | 2016-09-06 | 2019-04-19 | 中外制药株式会社 | 使用识别凝血因子ix和/或活化凝血因子ix以及凝血因子x和/或活化凝血因子x的双特异性抗体的方法 |
| JOP20190055A1 (ar) | 2016-09-26 | 2019-03-24 | Merck Sharp & Dohme | أجسام مضادة ضد cd27 |
| ES2908239T3 (es) | 2016-10-28 | 2022-04-28 | Astute Medical Inc | Uso de anticuerpos contra timp-2 para la mejora de la función renal |
| EP3579848A4 (en) | 2017-02-08 | 2021-03-03 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR ACTIVATING NATURAL KILLER CELLS AND THEIR THERAPEUTIC USES FOR TREATING CANCER |
| WO2018152496A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of zika virus infection |
| CA3054079A1 (en) | 2017-02-20 | 2018-08-23 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Proteins binding her2, nkg2d and cd16 |
| AU2018252546A1 (en) | 2017-04-13 | 2019-10-10 | Sairopa B.V. | Anti-SIRPα antibodies |
| EP4230649A3 (en) | 2017-04-25 | 2023-10-25 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antibodies and methods for the diagnosis and treatment of epstein barr virus infection |
| EP3655430A1 (en) | 2017-07-19 | 2020-05-27 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Antibodies and methods for the diagnosis and treatment of hepatitis b virus infection |
| WO2019025299A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | METHOD OF HUMANIZATION BASED ON THREE DIMENSIONAL STRUCTURE |
| AR113142A1 (es) | 2017-09-29 | 2020-01-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Moléculas de unión al antígeno multiespecíficas que tienen actividad de sustitución de la función de cofactor del factor viii de coagulación de sangre (fviii), y formulaciones farmacéuticas que contienen dicha molécula como ingrediente activo |
| WO2019148412A1 (en) | 2018-02-01 | 2019-08-08 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies |
| CA3090244A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor |
| CN112334485A (zh) | 2018-04-06 | 2021-02-05 | 百进生物科技公司 | 抗-四次穿膜蛋白33药剂及其组合物以及制备和使用方法 |
| WO2019213416A1 (en) | 2018-05-02 | 2019-11-07 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Antibodies and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of epstein barr virus infection |
| CN113365697A (zh) | 2018-09-25 | 2021-09-07 | 百进生物科技公司 | 抗tlr9药剂和组合物及其制备方法和使用方法 |
| CA3123024A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing body weight and lean muscle mass using antagonists against leptin receptor, gdf8 and activin a |
| EA202192528A1 (ru) | 2019-05-13 | 2022-01-27 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Комбинация ингибиторов pd-1 и ингибиторов lag-3 для повышения эффективности при лечении рака |
| BR112021023335A2 (pt) | 2019-06-11 | 2022-01-04 | Regeneron Pharma | Anticorpos recombinante isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno e monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, composição farmacêutica, molécula polinucleotídica isolada, vetor, célula, método de diminuição do risco de adquirir infecção por p. aeruginosa, e, métodos de diminuição da carga bacteriana em um sujeito com uma infecção por p. aeruginosa, de aumento da sobrevida ou da probabilidade de sobrevida de um sujeito que sofre de infecção por p. aeruginosa ou de um sujeito que corre risco de infecção por p. aeruginosa, para melhorar ou reduzir a gravidade, a duração ou a frequência de ocorrência de pelo menos um sintoma de uma infecção por p. aeruginosa, para aumentar a sobrevida ou a probabilidade de sobrevida de um sujeito que sofre de fibrose cística |
| EP4090681A1 (en) | 2020-01-17 | 2022-11-23 | Biolegend, Inc. | Anti-tlr7 agents and compositions and methods for making and using the same |
| EP4143227A2 (en) | 2020-04-30 | 2023-03-08 | Sairopa B.V. | Anti-cd103 antibodies |
| WO2021237516A1 (zh) * | 2020-05-27 | 2021-12-02 | 上海济煜医药科技有限公司 | Sars-cov-2抗体及其应用 |
| WO2022093640A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-05 | BioLegend, Inc. | Anti-nkg2c agents and compositions and methods for making and using the same |
| WO2022093641A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-05 | BioLegend, Inc. | Anti-nkg2a agents and compositions and methods for making and using the same |
| EP4342497A1 (en) | 2021-05-10 | 2024-03-27 | Kawasaki Institute of Industrial Promotion | Antibody having reduced binding affinity for antigen |
| CN115677856B (zh) * | 2021-07-29 | 2023-11-28 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 抗人IgM抗体及其应用 |
| WO2024020051A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-01-25 | BioLegend, Inc. | Anti-cd157 antibodies, antigen-binding fragments thereof and compositions and methods for making and using the same |
| WO2024040114A2 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | BioLegend, Inc. | Anti-axl antibodies, antigen-binding fragments thereof and methods for making and using the same |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4658019A (en) * | 1979-04-26 | 1987-04-14 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells |
| US4714681A (en) * | 1981-07-01 | 1987-12-22 | The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center | Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same |
| US4661586A (en) * | 1981-11-17 | 1987-04-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Monoclonal anti-idiotype antibodies |
| US4444878A (en) * | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
| US4724213A (en) * | 1985-05-24 | 1988-02-09 | Northwestern University | Murine hybridoma Lym-1 and diagnostic antibody produced thereby |
| US4676980A (en) * | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
| DE3689123T2 (de) | 1985-11-01 | 1994-03-03 | Xoma Corp | Modulare einheit von antikörpergenen, daraus hergestellte antikörper und verwendung. |
| US4831117A (en) * | 1986-01-03 | 1989-05-16 | Uckun Fatih M | Monoclonal antibody specific for human B-cells |
| US4861589A (en) * | 1987-03-23 | 1989-08-29 | Trustees Of Boston University | Method for therapeutically treating abnormal cells expressing a major histocompatibility complex class II antigen using cytolytic inducer T4 cells |
| US4892824A (en) * | 1988-03-15 | 1990-01-09 | Synbiotics Corporation | Fast track method for producing monoclonal bi-specific immunoglobulins |
| IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| US5582996A (en) * | 1990-12-04 | 1996-12-10 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Bifunctional antibodies and method of preparing same |
| US5932448A (en) | 1991-11-29 | 1999-08-03 | Protein Design Labs., Inc. | Bispecific antibody heterodimers |
| US6129914A (en) * | 1992-03-27 | 2000-10-10 | Protein Design Labs, Inc. | Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line |
-
1995
- 1995-03-01 US US08/397,411 patent/US6129914A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-29 WO PCT/US1996/002754 patent/WO1996026964A1/en active IP Right Grant
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-
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| Publication number | Publication date |
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| DE69636748D1 (de) | 2007-01-18 |
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| JPH11506310A (ja) | 1999-06-08 |
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| AU5090496A (en) | 1996-09-18 |
| ATE504601T1 (de) | 2011-04-15 |
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| EP0812333B1 (en) | 2006-12-06 |
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