ES2275338T3

ES2275338T3 - Nuevos substratos cromogenos para la deteccion de hidrolasas bacterianas.

Info

Publication number: ES2275338T3
Application number: ES99911874T
Authority: ES
Inventors: Lyle Armstrong; Arthur James; Daniel Monget; Sylvain Orenga
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2019-04-02
Also published as: US6340573B1; JP2002510503A; CA2325626A1; EP1066405A1; FR2777018B1; PL343524A1; DE69933759T2; AU3040699A; DE69943326D1; CA2325626C; EP1754792B1; ATE503842T1; FR2777018A1; ATE343640T1; ES2361038T3; EP1066405B1; EP1754792A1; JP4382985B2; DE69933759D1; BR9909356A

Abstract

Composición que comporta dos substratos que permiten detectar la presencia de la actividad enzimática de por lo menos dos enzimas, caracterizada por el hecho de que ésta se encuentra constituida por lo menos por dos moléculas, una primera molécula constituida por una parte marcador no cromógena, asociada a por lo menos una parte específica diana de la primera enzima, y una segunda molécula constituida por otra parte marcador no cromógena, asociada a una parte específica diana de la segunda enzima, y por el hecho de que las partes marcador no cromógenas, una vez liberadas, reaccionan para formar una molécula cromógena, encontrándose constituida, la parte marcador no cromógena de la primera molécula, por aminobenceno o uno de sus derivados, (Ver fórmula) encontrándose constituida, la parte marcador no cromógena de la segunda molécula, por alfa-naftol o uno de sus derivados: (Ver fórmula) y encontrándose constituida, la molécula cromógena obtenida, por: (Ver fórmula) fórmulas éstas en las cuales: el radial R1, se encuentra constituido por -OH -SH ó -NXZ, el radical R10, se elige entre H, -Br, -Cl, -I, ó los grupos de átomos retirados durante el acoplamiento oxidante, cada radical R2 a R9, R11 ó R12, se elige entre -H, -OH, -Br, -Cl, -I, -CH3, -CH2CH3, -OCH3, -OCH2CH3, -COOH, y X, y/ó Z, se encuentra constituido por -H, -CH3, -CH2CH3.

Description

Nuevos substratos cromógenos para la detección de hidrolasas bacterianas.

La presente invención, se refiere a la evidenciación de enzimas del tipo hidrolasas, de una forma particular, de peptidasas, para la utilización de substratos cromógenos eficaces. La presente invención, se refiere igualmente a un procedimiento y a un dispositivo de identificación de micro-organismos que son, a la vez, simples y fiables.

Desde hace muchos años, se utilizan substratos particulares para permitir la determinación de la presencia o de la ausencia de actividades enzimáticas características de las bacterias. Para la elección de los substratos, según haya reacción o no, es posible el caracterizar la naturaleza de una clase de bacterias o de diferenciarla de las especies de una clase bacteriana dada.

Los substratos sintéticos de enzimas, se encuentran constituidos por dos partes, una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar, y una segunda parte que hace la función de marcador, a la cual se la denominará, en la parte que sigue de este documento, como parte marcadora.

Estos substratos particulares, pueden ser substratos fluorescentes o cromógenos. De hecho, es la segunda parte o parte marcadora que es fluorescente o cromógena, cuando ésta no se encuentra asociada a la primera parte.

Los substratos fluorescentes, pueden ser de diferentes composiciones.

En primer lugar, los substratos a base de umbeliferona o de aminocumarina y sus derivados sustituidos en la posición 2, los cuales permiten la liberación de un compuesto fluorescente de color variante, del azul al verde, bajo lámpara a ultravioletas (UV)(\lambda_{ex} = 365 nm).

A continuación, los substratos a base resorufina (y derivados), en donde existe liberación de un compuesto fluorescente rosa, bajo luz natural (\lambda_{ex} = 530 nm).

Finalmente, los substratos a base de fluoresceína (y derivados), la cual, después de degradación, libera un compuesto fluorescente amarillo9, bajo la luz natural)(\lambda_{ex} = 485 nm).

Estos substratos, están poco adaptados a una utilización en medios gelosados (gelificados), y son más útiles en medio líquido.

Los substratos cromógenos, pueden igualmente ser de diferentes naturalezas.

En primer lugar, existen los substratos a base de indoxil y sus derivados, los cuales, en presencia de oxígeno, producen un precipitado variante del azul al rosa.

Sus aplicaciones, se encuentran esencialmente limitadas a las osidasas, esterasas, y no conciernen a la detección de una actividad peptidasa. Bien adaptadas a una utilización sobre soporte sólido (filtro, gelosa, gel de electroforesis,...), estos se encuentran, en cambio, menos bien adaptados a una utilización en medio acuoso líquido (formación de un precipitado).

En segundo lugar, existen substratos a base de hidroxiquinolina o de esculetina y sus derivados, los cuales, en presencia de sales de hierro, producen un precipitado marrón.

También, otra vez, sus aplicaciones, se encuentran limitadas a las osidasas y esterasas. Éstos se encuentran adaptados a una utilización sobre soporte sólido, y poco adaptadas a una utilización en medio acuoso líquido.

En tercer lugar, existen substratos a base de nitrofenol y nitroanilina y derivados, en donde se obtienen la formación de un compuesto amarillo.

Éstos permiten detectar las actividades osidasas y esterasas en el caso de substratos a base de nitrofenol, y actividades peptidasas, en el caso de substratos a base de nitroanilina. Mientras tanto, en el caso de la detección de actividades peptidasas, la nitroanilina liberada, es tóxica para las bacterias que se desea identificar o caracterizar, lo cual puede ser perjudicial para los análisis en curso o ulteriores. Por otra parte, éstos están poco adaptados a una utilización sobre soporte sólido y, mejor adaptados a una utilización en medio líquido. Además, éstos son poco cromógenos, debido al coeficiente de extinción relativamente débil del color (amarillo), en donde, el contraste, es poco pronunciado en los medios biológicos.

En cuarto lugar, existen substratos a base de naftol y naftilamina y sus derivados. En este caso, la reacción, se efectúa en dos tiempos, el naftol o naftilamina liberada mediante la actividad enzimática, sigue un efecto "azo-coupling" (azo-acoplamiento), en presencia de una sal de diazonio que se ajusta en el momento de la revelación, conduciendo a la formación de un compuesto insoluble coloreado.

Éstos permiten detectar las actividades osidasas y esterasas mediante la intermediación del naftol, y las actividades peptidasas mediante la intermediación de la naftilamina. La reacción "azo-coupling", se efectúa en un medio que es a menudo químicamente agresivo, tóxico para las bacterias y que convierte a la muestra en inutilizable para otros análisis y, además, las naftilaminas, son cancerígenas.

Para revelar la naftilamina y, por lo tanto, una actividad peptidasa, es también posible el añadir, al final de la reacción enzimática, p-dimetilaminocinamaldehído en medio ácido, en lugar de una sal de diazonio, siempre con los inconvenientes de toxicidad con respecto a la muestra analizada.

La solicitud de patente francesa FR - A - 2 708 286, propone utilizar una mezcla de substratos cromógenos, proporcionando, cada cromógeno, una coloración particular para una enzima específica, que es diferente de la coloración y de la enzima asociada al otro cromógeno. Cuando las dos coloraciones y, por lo tanto, las dos enzimas, se encuentran presentes, existe formación de una "tercio-coloración".

Esta técnica, no es de todos modos satisfactoria, debido al hecho de que, en función de la reducida concentración de una de las dos enzimas, no es posible detectar esta actividad enzimática la cual se encuentra entonces enmascarada mediante la coloración asociada a la enzima, cuya concentración es preponderante.

Finalmente, las solicitudes de patentes estadounidenses US - A - 4.681.841 y US - A - 4.588.836, describen un procedimiento indirecto de detección de una sola actividad enzimática, que utiliza un acoplamiento entre un aminobenceno y un derivado aromático hidroxilado (por ejemplo, el alfa-naftol), acoplamiento éste, el cual engendra la formación de un indicador cromógeno, en presencia de oxidasa. Uno de los dos compuestos (el aminobenceno), entra en la composición del substrato de partida: si la actividad enzimática investigada se encuentra presente, este compuesto, se liberará y podrá reaccionar con el otro compuesto.

No obstante, estos documentos, no permiten deducir que sea posible el detectar por lo menos dos actividades enzimáticas mediante la intermediación de por lo menos dos moléculas no cromógenas. Sólo la presencia de estas por lo menos dos actividades, genera, de esta forma, una molécula cromógena. El interés de una técnica de este tipo, es pertinente, cuando la bacteria a identificar, comporta por lo menos una actividad enzimática en común con otras bacterias y por lo menos una actividad enzimática diferente para estas mismas otras bacterias. Además, el interés de esta técnica, es particularmente pertinente, cuando la bacteria a identificar, comporta por lo menos una actividad enzimática en común con otras bacterias y por lo menos una actividad enzimática diferente para también otras bacterias, siendo, la bacteria a identificar, la única que tiene estas por lo menos dos actividades enzimáticas.

Es por lo tanto fácil de comprender, el hecho de que no existe hoy en día, un substrato no cromógeno, que permita revelar por lo menos dos actividades enzimáticas que sean particularmente eficaces e interesantes.

En cuanto a lo concerniente al procedimiento y el dispositivo de identificación, el estado actual de la técnica, se encuentra constituido por un procedimiento de identificación que permite una manipulación en tres etapas:

-: extracción de la colonia a identificar

-: realización de un test de ensayo de orientación, y

-: investigación de colonias parecidas a las observadas y realización de un inóculo.

El test de ensayo de orientación, debe practicarse antes de la utilización de un sistema de identificación. Éste es particularmente el caso, para la coloración Gram que necesita una observación microscópica.

Mientras tanto, esta coloración, no siempre es fácil de realizar y, sobre todo, de interpretar. Por otra parte, el coste que acarrea este test de ensayo queda lejos de no tenerse en consideración.

Uno de los objetivos de la presente invención, es por lo tanto el crear el lazo de unión entre un medio de cultivo y los sistemas de identificación y de antibiograma, ofreciendo, a los biólogos, la posibilidad de efectuar un test de ensayo simple en una etapa, permitiendo, a la vez, la confirmación del resultado de la coloración de Gram y la preparación del inóculo. Así, de este modo, se fiabiliza la elección de los tests de ensayo de identificación y de antibiograma.

La solicitud de patente europea EP - A - 0 122 028, propone un procedimiento de colorimetría que permite detectar la presencia de por lo menos una enzima sospechosa de encontrarse presente en una muestra biológica. Ésta preconiza el preparar un material absorbente montado sobre un soporte rígido, tal como un escobillón, absorbiendo, en este material, por lo menos un substrato específico de la enzima que se desea detectar. Previamente a su utilización, el material absorbente que contiene el substrato o los substratos, se seca.

La invención, permite evidenciar, de una forma calorimétrica, las actividades enzimáticas del tipo hidrolasas (osidasas, esterasas, fosfatasas, peptidasas), con la ayuda de substratos sintéticos a base de dos componentes, así como un nuevo procedimiento, que puede aplicarse a medios reactivos, tanto líquidos como sólidos.

Ésta propone, igualmente, un procedimiento y un dispositivo de identificación de microorganismos, que orientan la identificación, y que permiten la recuperación de los citados microorganismos para permitir efectuar un inóculo. Este inóculo, permite utilizar los mismos micro-organismos para una o varias otras etapas, tales como una identificación, un antibiograma.

Después de la hidrólisis de los substratos, la detección de las actividades enzimáticas, se basa en la formación de un complejo coloreado, a partir de un acoplamiento oxidante de los dos compuestos precedentemente citados. El acoplamiento oxidante, puede facilitarse mediante un oxidante añadido al medio reactivo o producto, en el momento de un procedimiento metabólico, en el seno de este medio, o de una forma más simple, mediante la presencia de oxígeno endógeno en este mismo medio.

Según una primera interpretación, la invención, se refiere a una asociación de dos entidades distintas, correspondiendo, cada una de ellas, a un substrato diferente, y permitiendo detectar la presencia de la actividad enzimática de por lo menos dos enzimas. Cada substrato, se caracteriza por el hecho de que éste se encuentra constituido por una parte específica de la enzima investigada, y por una molécula no cromógena, que constituye la parte marcador del substrato y que, las dos moléculas no cromógenas, corresponden a substratos que reaccionan conjuntamente, cuando éstas son en forma libre, y pueden generar una molécula cromógena.

Según una segunda interpretación que se utilizará de una forma más particular en la parte que sigue, para llegar a este resultado, es necesario utilizar una nueva forma de substratos. Así, de este modo, el substrato según la invención, comporta dos moléculas diferentes. Una de las moléculas, se encuentra constituida por una parte específica, de una actividad enzimática, y de una parte marcador, distinta de una molécula cromógena. La otra molécula, comporta siempre la parte marcador, distinta de una molécula cromógena, la cual se encuentra asociada con por lo menos una parte específica, de una actividad enzimática. El objeto de la invención es, por lo tanto, si las actividades se encuentran presentes, el revelar la formación de una molécula cromógena que sea eficaz únicamente cuando las dos partes marcador, una vez liberadas, se han asociado.

La presente invención, se refiere a una composición que comporta dos substratos que permiten detectar la presencia de la actividad enzimática de por lo menos dos enzimas, caracterizada por el hecho de que ésta se encuentra constituida por lo menos por dos moléculas, una primera molécula constituida por una parte marcador - no cromógena, asociada a por lo menos una parte específica diana de la primera enzima, y una segunda molécula constituida por otra parte marcador no cromógena, asociada a una parte específica diana de la segunda enzima, y que las partes marcador no cromógenas, una vez liberadas, reaccionan para formar una molécula cromógena.

Sea cual fuere la forma de realización de los substratos, la parte marcador no cromógena de la primera molécula, se encuentra constituida por aminobenceno o uno de sus derivados:

1

la parte marcador no cromógena de la segunda molécula, se encuentra constituida por \alpha-naftol o uno de sus derivados:

2

\newpage

y la molécula cromógena obtenida, se encuentra constituida por:

3

En este caso, el radial R_{1}, se encuentra constituido por -OH ó -SH ó 100, el radical R_{10}, se encuentra constituido por -H ó por un átomo, tal como -Br, -Cl, -I, ó un grupo de átomos, tal como SH, el cual puede retirarse durante el acoplamiento oxidante, y cada radical R_{2} a R_{9}, R_{11} ó R_{12}, se encuentra constituido por -H, -OH, -Br, -Cl, -I, u otros sustituyentes más complejos, tales como -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3}, -COOH.

En el caso del radical R_{1}, X, y/ó Z, se encuentra constituido por -H, u otros sustituyentes más complejos, tales como -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3,}

4

Según una variante de realización, por lo menos uno de los acoplamientos de los radicales R_{2}/R_{3} y R_{4}/R_{5}, se encuentra constituido por un sistema aromático, alicíclico o heterocíclico.

La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento de detección de por lo menos dos actividades enzimáticas, mediante la intermediación de substratos, tales como los descritos anteriormente, arriba, el cual consiste en:

-: poner los substratos en presencia de por lo menos un tipo de bacterias,

-: esperar que las bacterias hidrolicen los substratos, y

-: detectar las actividades ezimáticas basadas en la formación de un complejo coloreado a partir del acoplamiento oxidante de las dos partes marcador.

Otro objeto de la presente invención, es el de proponer un procedimiento, en el cual, las moléculas, se encuentran presentes en un material absorbente, y se ponen en contacto con la muestra, y, después de la detección, los microorganismos de esta forma extraídos, se vuelven a poner en suspensión, con el fin de permitir análisis ulteriores (identificaciones, antibiogramas, etc.).

Las moléculas y otros compuestos que entran en la composición reactiva contenida en el material absorbente, son:

-: la primera molécula constituida por amino-benceno o uno de sus derivados, y

-: la segunda molécula, constituida por \alpha-naftol ó uno de sus derivados.

La composición reactiva, contiene igualmente un oxidante, tal como el ferricianato de potasio.

Entre los otros compuestos, es posible el tener igualmente un activador da la reacción, tal como una reducida cantidad de la primera molécula y/o de la segunda molécula presente(s) en la muestra a someter a test de ensayo.

Siempre entre los otros compuestos, es posible que la constitución contenga un ligante o cola, tal como la polivinilpirrolidona (PVP).

El procedimiento, puede utilizarse parea identificar el Gram de una especie bacteriana a someter a test de ensayo y, en este caso, la primera molécula se encuentra constituida por AlaDMpPD, y la segunda molécula, se encuentra constituida por \alpha-naftol.

Además, la composición de la mezcla reactiva absorbida por el material absorbente, es la siguiente:

-: \alpha-naftol de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l y, por ejemplo, 0,5 g/l,

-: ferricianato de potasio de 0,01 g a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l y, por ejemplo, 0,5 g/l, y

-: AlaDMpPD de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l, y por ejemplo, 0,35 g/l.

Según una variante, el activador, se encuentra constituido por Ala-DMpPD, a una concentración de 0,01 g a 0,5 g/l, de una forma preferente, de 0,05 a 1 g/l y, por ejemplo, 0,075 g/l.

Según otra variante, la composición, comprende, además, de 1 a 50 g/l de PVP, de una forma preferente, de 10 a 25 g/l de PVP y, por ejemplo, 15 g/l de PVP.

La invención, se refiere también a la utilización de substratos, tales como los que se han descrito anteriormente, arriba, para la detección de una actividad enzimática de tipo pepsidasa.

Finalmente, la presente invención, se refiere a un dispositivo de identificación que permite la puesta en práctica del procedimiento de identificación anteriormente descrito, arriba, y éste se encuentra constituido por un soporte, por ejemplo, de plástico, el cual es inerte con respecto al material absorbente de los substratos, que éste contiene, y/o con respecto a la muestra sometida a test de ensayo, sobre el cual se encuentra montado un cabezal de material absorbente, tal como la viscosa, comportando, el citado dispositivo, la composición de la invención.

I - Nuevos substratos cromógenos y procedimiento de utilización

La invención que se describirá a continuación, se refiere a algunas formas de realización particulares de la invención. Estas formas de realización, no son limitativas del alcance de la presente invención que puede utilizarse para la detección de todo tipo de actividades enzimáticas, del tipo hidrolasa, y para todo género o tipo de micro-organismos.

La composición que comporta dos substratos, que permite detectar la presencia de actividad enzimática de por lo menos dos enzimas, se encuentra constituida por lo menos por dos moléculas, una primera molécula constituida por una parte marcador no cromógena, asociada a por lo menos una parte específica diana de la primera enzima, y una segunda molécula constituida por otra parte marcador no cromógena, asociada a una parte específica diana de la segunda enzima. Las partes marcador no cromógenas, una vez liberadas, reaccionan para formar una molécula cromógena.

Las dos partes marcador, se encuentran respectivamente constituidas por los compuestos I y II que se presentan abajo, a continuación.

5

\bullet R_{1} = -OH ó -SH ó 100, con X y/ó Z = -H, u

otros sustituyentes más complejos, como CH_{3}, -CH_{2}CH_{3},

6

\bullet R_{10} = -H ó un grupo o átomo que puede retirarse durante el acoplamiento oxidante, como -Br, -Cl, -I, -SH, etc.

\bullet R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{11} y R_{12} = -H, -OH, -Br, -Cl, -I, -CH_{3}, CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3}, -COOH, ó todo otro sustituyente más complejo, R_{2}/R_{3} y R_{4}/R_{5}, pudiendo igualmente hacer parte de un sistema aromático, alicíclico o incluso heterocíclico, como:

7

\newpage

El compuesto III, obtenido mediante la combinación de dos compuestos I y II, es por lo tanto el siguiente:

8

Para comprender la invención, se recuerda que la fórmula de un substrato enzimático hidrolasa, puede esquematizarse bajo la forma:

\bullet A - O - B, si se trata de un substrato de osidasa, de fosfatasa, o de esterasa o de sulfatasa.

La hidrólisis enzimática, puede entonces escribirse:

A - O - B + H_{2}O \longrightarrow A-OH + B-OH,

con, según la invención:

A-OH =: osa, fosfato, sulfato, ácido graso (después del más simple, es decir, el ácido acético), y

B-OH =: compuesto I con R_{1} = -OH ó compuesto II.

\bullet A-CO-NH-B, si se trata de un substrato de peptidasa.

La hidrólisis enzimática, puede entonces escribirse:

A-CO-NH-B + H_{2}O \longrightarrow A-COOH + B-NH_{2},

con, según la invención:

A-COOH =: aminoácido o cadena de aminoácidos terminados o no por un agente bloqueante, y

B-NH_{2} =: compuesto I.

La formación, en el medio reactivo, del complejo coloreado III (derivado del indofenol), a partir del acoplamiento oxidante de I y II, permite decelerar la hidrólisis del substrato y, por lo tanto, la actividad enzimática implicada.

El color del compuesto III, depende de los sustituyentes sobre los compuestos I y II.

Éste es por ejemplo un color púrpura, si R_{1} = -OH, y R_{2} a R_{11} = -H, o azul, en el caso en donde, R_{1} = -OH, R_{2} y
R_{5} = -Cl, y R_{5} a R_{11} = -H.

El procedimiento de esta forma descrito, es en particular extremamente interesante, para decelerar colorimétricamente las actividades del tipo peptidasas. En efecto, según el estado anterior de la técnica, la elección de las reacciones coloreadas, se limitaba a la utilización de los substratos a base de nitroanilina, poco cromógena, y de substratos a base de naftilamina, muy tóxica, que necesitaban la adición de un reactivo, al final de la reacción (sal de diazonio, por ejemplo), para decelerar la amina liberada.

\newpage

La invención, propone un nuevo tipo de substratos de peptidasas, a base de aminobenceno o derivados (compuesto I).

Este último, a medida que se libera en el medio reactivo, en el momento de la hidrólisis enzimática, forma un complejo fuertemente coloreado (rojo a azul, generalmente), mediante acoplamiento oxidante con el \alpha-naftol o un derivado (compuesto II), presente en este medio.

La reacción de acoplamiento, puede igualmente obtenerse al final del test de ensayo, si la adición del compuesto II, interviene al término de la reacción enzimática.

Una ventaja importante de la invención, consiste en asociar dos substratos en el medio reactivo, según el procedimiento, uno a base del compuesto I, y el otro a base del compuesto II.

Se pueden imaginar, de este modo, todos los tipos de combinaciones de detección simultánea de dos actividades enzimáticas (por ejemplo, una peptidasa y una osidasa, una esterasa y una osidasa, dos osidasas, etc.). En este caso, habrá la formación del complejo coloreado III únicamente, si los dos substratos están hidrolizados. Esta combinación, puede ser útil para los tests de ensayo de diagnóstico que requieren una gran especificidad, especialmente, cuando se trata de caracterizar micro-organismos.

Uno de los ejemplos citados, ilustra el interés de esta detección simultánea de dos actividades enzimáticas en el sector de la identificación de las bacterias.

Entre las otras ventajas de la invención, es posible el proporcionar una doble funcionalidad al compuesto. Es en efecto posible el injertar químicamente, sobre el compuesto I, por una parte sobre el grupo -NH_{2}, un aminoácido o una cadena de aminoácidos terminados o no por un agente bloqueante y, por otra parte, sobre R_{1}, si se trata de un grupo hidroxilo (-OH), una osa, un fosfato o un ácido graso. Se obtiene una molécula que puede calificarse de doble substrato, la cual, para generar el compuesto I en el estado libre, en el medio reactivo, debe hidrolizarse mediante dos actividades enzimáticas distintas, por una parte, una peptidasa y, por otra parte, una osidasa, fosfatasa o esterasa, según la naturaleza del producto injertado sobre R_{1}.

Así, de este modo, en presencia del compuesto II, el complejo coloreado II, no puede obtenerse más que si, las dos actividades enzimáticas, se encuentran presentes. El interés de estos substratos de doble funcionalidad, reside en su especificidad muy grande, la cual puede aprovecharse, para caracterizar micro-organismos, por ejemplo.

En el mismo sentido, se puede concebir, según la invención, una mezcla de un substrato de doble funcionalidad, a base del compuesto I, tal como se ha descrito anteriormente, arriba, y un substrato a base del compuesto II, para la investigación o búsqueda de otra osidasa, fosfatasa o esterasa. En este caso, la producción del producto coloreado III, necesita la presencia simultánea de tres actividades enzimáticas, con el fin de liberar los compuestos I y II. Dos actividades enzimáticas, permiten hidrolizar la molécula a base del compuesto I, una actividad enzimática, permite hidrolizar la molécula a base del compuesto II. Se aumenta así todavía la especificidad del test de ensayo.

Según la invención, es también posible el combinar diferentes tipos de substratos en el mismo medio reactivo, en particular, substratos conocidos en el arte anterior de la técnica, y substratos según el procedimiento reivindicado. Esto permite poner en práctica diferentes reacciones coloreadas y, por lo tanto, revelar, al mismo tiempo, varias actividades enzimáticas, en el seno del mismo medio reactivo.

La invención, puede aplicarse a la investigación o búsqueda de actividades enzimáticas en diferentes tipos de muestras, biológicas o no.

Ésta puede igualmente utilizarse para caracterizar micro-organismos, como bacterias o levaduras. Los tests de ensayo enzimáticos, pueden entonces practicarse en medio líquido, en tubos individuales, o en soportes compartimentados, como las placas de microtitrimetría, por ejemplo. Éstos pueden igualmente practicarse en medio gelosado (en placas de Petri, por ejemplo), con coloración de las colonias que producen las actividades enzimáticas investigadas.

La presente invención, se refiere, por lo tanto, a un procedimiento de detección de por lo menos dos actividades enzimáticas, mediante la intermediación de substratos, tal y como se describen anteriormente, arriba, el consiste en:

-: poner los substratos en presencia de por lo menos un tipo de bacterias,

-: esperar que las bacterias hidrolicen los substratos, y

-: detectar las actividades ezimáticas basadas en la formación de un complejo coloreado a partir del acoplamiento oxidante de dos partes marcador.

El acoplamiento oxidante, se facilita mediante bien ya sea:

-: la adición de por lo menos un oxidante en el medio reactivo,

-: la producción, en el momento de un proceso metabólico, en el seno de este medio reactivo, de por lo menos un oxidante,

-: la presencia de oxígeno endógeno en el citado medio reactivo.

Los ejemplos que se facilitan abajo, a continuación, permitirán el comprender mejor la invención. Éstos se refieren únicamente al sector de bacteriología, pero está claro que, el procedimiento, puede aplicarse a todos los otros sectores de la enzimología, que implican la investigación o búsqueda de hidrolasas.

Ejemplo 1 Detección de la \beta-glucosidasa en medio líquido (método 1)

El medio reactivo propuesto en este ejemplo tiene, como formulación:

\bullet	peptona de carne	10 g
\bullet	NaCl	5 g
\bullet	\alpha-naftil-\beta-D-glucopiranósido	0,5 g
\bullet	4-aminofenol	50 mg
\bullet	H_{2}O	1000 mg
\bullet	pH	7,0

Esta medio, se esteriliza mediante filtración, sobre Millipore 0,22 \mu, y se reparte en tubos estériles a razón de 5 ml por tubo.

El test de ensayo de investigación de la \beta-glucosidasa, se practica sobre 4 capas cultivadas, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 35 - 37°C, sobre gelosa Tripticasa-Soja. Estas cepas, pertenecen exclusivamente a las especies:

-: Escherichia coli,

-: Staphilococcus sciuri,

-: Streptococcus pyogenes,

-: Enterococcus faecalis.

A partir de los cultivos anteriores, se realizan suspensiones acuosas ajustadas a 0,5 McFarland.

Se utilizan 100 microlitros de estas suspensiones, para sembrar cuatro tubos de medio reactivo, correspondiendo, cada tubo, a una cepa.

Los tubos tapados, se incuban a una temperatura de 35 - 37°C, durante un transcurso de tiempo de 18 a 24 horas.

Después de la incubación, se observa la aparición de una coloración púrpura, correspondiente a la formación del complejo indofenol, y traduciendo la presencia de una actividad \beta-glucosidasa.

Los resultados obtenidos, son los siguientes:

9

Ejemplo 2 Detección de la \beta-glucosidasa en medio líquido (método 2)

El medio reactivo propuesto en este ejemplo tiene, como formulación:

\bullet	peptona de carne	10 g
\bullet	NaCl	5 g
\bullet	\alpha-naftol	50 mg
\bullet	4-aminofenil-\beta-D-glucopiranósido	0,5 g
\bullet	H_{2}O	1000 mg
\bullet	pH	7,0

La preparación del medio, la elección de las cepas sometidas a test de ensayo, y la práctica del test de ensayo, son idénticas a las del procedimiento descrito en el ejemplo 1.

La aparición de una coloración púrpura, debida a la formación del complejo indofenol, indica la presencia de una actividad \beta-glucosidasa.

Los resultados obtenidos, son los siguientes:

10

Estos resultados, muestran el hecho de que es posible el detectar una actividad del tipo osidasa, procediendo a utilizar, según la invención, de la misma forma, tanto un substrato a base del compuesto I, como un substrato a base del compuesto II. Sería lo mismo, para investigar las actividades de los tipos esterasas o fosfatasas.

Ejemplo 3 Detección de la piroglutamil-aminopeptidasa en medio líquido

El medio reactivo propuesto en este ejemplo tiene, como formulación:

\bullet	peptona de carne	10 g
\bullet	NaCl	5 g
\bullet	\alpha-naftol	50 mg
\bullet	L-piroglutamil-4-amino-2,6-diclorofenol	0,5 g
\bullet	H_{2}O	1000 mg
\bullet	pH	7,0

La aparición de una coloración azul, debida a la formación del complejo indofenol, evidencia una actividad piroglutamil-aminopeptidasa. Debe tomarse debida nota del hecho de que, la tonalidad azul, resulta de la presencia de los grupos cloros, en posición 2 y 6, sobre el 4-aminofenol.

\newpage

Los resultados obtenidos, son los siguientes:

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Ejemplo 4 Investigación combinada de dos actividades enzimáticas según el procedimiento de la invención. Aplicación a la detección simultánea de la \beta-glucosidasa y la piroglutamil-aminopeptidasa

El medio reactivo propuesto en este ejemplo tiene, como formulación:

\bullet	peptona de carne	10 g
\bullet	NaCl	5 g
\bullet	L-piroglutamil-4-amino-2,6-diclorofenol	0,5 g
\bullet	H_{2}O	1000 mg
\bullet	pH	7,0

La aparición de una coloración azul, debida a la formación del complejo indofenol, no es posible, más que, si los dos substratos, se encuentran hidrolizados. Ésta traduce por lo tanto una combinación de las actividades \beta-glucosidasa y piroglutamil-aminopeptidasa, en el mismo medio reactivo. La ausencia de una de las actividades, impide la formación del complejo coloreado.

Los resultados obtenidos, son los siguientes:

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Este ejemplo, ilustra claramente una de las ventajas de la invención, permitiendo una mayor selectividad en la caracterización de los microorganismos (E. faecalis, en esta aplicación).

Ejemplo 5 Caracterización de las bacterias en medio gelosado, mediante la investigación simultánea de las actividades \beta-galactosidasa (\betaGAL) y L-alanina-aminopeptidasa (Ala)

A un medio tripticasa gelosado, se le añaden \alpha-naftil-\beta-D-galactopiranósido y L-alanil-N,N'-dimetil-p-fenilen-diamina-naftaleno-sulfonilhidrazina. Este substrato, de deriva del compuesto I según la invención.

El medio, se reparte y se siembra de la siguiente forma:

\bullet seis placas con cultivos puros:

-: Escherichia coli [\betaGAL (+), Ala(+)]

-: Klebsiella pneumoniae [\betaGAL (+), Ala(+)]

-: Salmonella typhimurium [\betaGAL (-), Ala(+)]

-: Pseudomonas aeruginosa [\betaGAL (-), Ala(+)]

-: Staphylococcus xilosus [\betaGAL (+), Ala(-)]

-: Candida albicans [\betaGAL (-), Ala(-)]

\bullet dos placas, con las mezclas de las cepas E. coli/S. xylosus y S. typhimurium/C. albicans.

Los medios, se incuban a una temperatura de 35 - 37°C. Después de un transcurso de tiempo de 18 - 24 horas de incubación, solamente las placas que contienen las cepas de E. coli y K. pneumoniae [\betaGAL (+), Ala(+)], presentan colonias coloreadas en azul.

Con la mezcla E. coli/S. xylosus, solamente las colonias de E. coli son azules, permaneciendo incoloras las de S. xilosus.

De la misma forma que en el ejemplo 4, la producción del complejo coloreado III, a base de indofenol, tiene por lo tanto la necesidad de la presencia conjunta de dos actividades enzimáticas, aquí, la \beta-galactosidasa y la L-alanina-aminopeptidasa.

Por el contrario, la presencia de solamente una o de ninguna de estas dos actividades, no conlleva la formación del complejo coloreado.

Tal y como es el caso en el ejemplo 5, la elección de un derivado apropiado de la fenilen-diamina, permite obtener una coloración que permanece en las proximidades inmediatas de las colonias, y así, de este modo, el distinguir dos poblaciones diferentes en la mezcla.

Este ejemplo, muestra que es posible, según la invención, el colorear específicamente las colonias, en la superficie de un medio gelosado, y así, por lo tanto, el caracterizarlas. En el presenta caso, podría aplicarse a la detección de las bacterias coliformes, las cuales son bacillos de Gram negativo, que poseen las dos actividades \beta-galactosidasa y L-alanina-aminopeptidasa.

Ejemplo 6 Investigación combinada de tres actividades enzimáticas según el procedimiento de la invención. Aplicación a la detección simultánea de la \beta-glucosidasa (\betaGAL), de la \beta-glucosidasa (\beta-GLU) y de la L-alanina-aminopeptidasa (Ala)

El medio reactivo propuesto en este ejemplo tiene, como formulación:

\bullet	peptona de carne	10 g
\bullet	NaCl	5 g
\bullet	\alpha-nafil-\beta-D-glucopironósido	0,5 g
\bullet	L-piroglutamil-4-amino-2,6-dicloro fenil-\beta-D-galactopiranósido	0,5 g
\bullet	H_{2}O	1000 mg
\bullet	pH	7,0

La preparación del medio, es idéntica a la del procedimiento descrito en el ejemplo 1.

El test de ensayo de investigación, de las 3 actividades enzimáticas, se practica sobre 5 cepas cultivadas, durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 35 - 37°C, sobre gelosa Triticasa-Soja. Estas cepas, pertenecen, respectivamente, a las especies:

-: Eschrichia coli [\betaGAL (+), \betaGLU (-), Ala(+)]

-: Klebsiella pneumoniae [\betaGAL (+), \betaGLU (+), Ala(+)]

-: Salmonella typhimurium [\betaGAL (-), \betaGLU (-), Ala(+)]

-: Stenotrophomonas maltophilia [\betaGAL (-), \betaGLU (+), Ala(+)]

-: Staphylococcus saprophyticus [\betaGAL (+), \betaGLU (-), Ala(-)].

La aparición de una coloración azul, debida a la formación del complejo indofenol, no es posible, más que, si los 3 substratos, se encuentran hidrolizados. Ésta traduce por lo tanto una combinación de las actividades \beta-glucosidasa \beta-glucosidasa y L-alanina-aminopeptidasa, en el mismo medio reactivo, tal y como es el caso para la cepa de K. pneumoniae. La ausencia de una de las actividades, impide la formación del complejo coloreado.

Los resultados obtenidos, son los siguientes:

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Este ejemplo, muestra, otra vez, las potencialidades de la invención, para poner en práctica tests de ensayo altamente selectivos.

Los seis ejemplos citados, describen únicamente tests enzimáticos según la invención.

En el bien entendido, es posible el combinar éstos a otros tests de ensayo conocidos el arte especializado de la técnica anterior, utilizando substratos cromogénicos o fluorogénicos.

II - Procedimiento y dispositivo de identificación

El principio del medio, utilizado con el procedimiento y el dispositivo de identificación, se basa en la utilización de los substratos emparejados, anteriormente descritos, arriba.

Según un ejemplo representativo, el procedimiento de identificación de los GRAM, utiliza un substrato a base de amino-benceno, o uno de sus derivados, tal como la dimetil-parafenilendiamina (DMpPD). En el ejemplo que se presenta a continuación, el substrato, se encuentra constituido por la alanina-dimetil-parafenilen-diamina (AlaDMpPD). La actividad evidenciada, es por lo tanto la alanina-aminopeptidasa, actividad específica de las bacterias a Gram negativo.

Su funcionamiento, es el siguiente. Existe, mediante hidrólisis enzimática, liberación del grupo DMpPD. A continuación, el DMpPD, se une con el \alpha-naftol (o un derivado), mediante acoplamiento oxidante facilitado por un oxidante, el ferricianato de potasio (K_{3}Fe(CN)_{6}). Existe entonces formación de un complejo coloreado gris violeta.

En un primer tiempo, el dispositivo, se define de la forma siguiente:

-: un medio biogelytone, que contiene el substrato AlaDMpPD, y

-: un escobillón impregnado de una mezcla reactiva constituida por \alpha-naftol y ferricianato de potasio.

Se ha definido otro dispositivo, el cual es aún más específico en la identificación del Gram y que es también utilizable con las gelosas con sangre del tipo Columbia. Éste consiste en:

-: un medio constituido por una gelosa con sangre del tipo Columbia (con o sin AlaDMpPD), y

-: una mezcla reactiva que impregna un escobillón y que se encuentra constituida a base de \alpha-naftol, de ferricianato de potasio y de AlaDMpPD y que después se seca.

Esta mezcla reactiva contenida por el escobillón, se mejoró todavía más, mediante la adición de una etapa de secado de los escobillones, lo cual facilita su manipulación ulterior.

La composición exacta, es la siguiente:

\bullet: para la gelosa:

: presencia o no de AlaDMpPD a 0,075 gramos por litro, y

\bullet: para el escobillón:

-: ferricianato de potasio de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l y, por ejemplo, 0,5 g/l, y

-: AlaDMpPD de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l y, por ejemplo, 0,35 g/l.

Los resultados obtenidos, en términos de sensibilidad y especificidad, se obtienen entonces de una forma mejor. En este caso, la detección de la reacción, no es instantánea. Debe esperarse de 15 a 30 segundos (s), para observar la aparición de una eventual coloración, tiempo necesario para la hidrólisis del substrato para la aminopeptidasa bacteriana.

Se procedió a someter a test de ensayo sesenta y una cepas, sobre diferentes medios, tales como: gelosa, chocolate Polyvitex (marca registrada), medio CPS ID2 (marca registrada), TSA +/- sangre y Columbia +/- sangre, test de ensayo éste que se realizó con escobillones impregnados con \alpha-naftol, ferricianato de potasio y AlaDMpPD y, a continuación, se secaron. Este estudio, mostró el hecho de que, el sistema, era compatible con la mayoría de los medios convencionales y cromogénicos usuales.

Para mejorar todavía más el tiempo de reacción, en el medio, se incorpora un activador de la reacción.

En este contexto de activación de la reacción, se ha verificado el hecho de que, la adición en el medio, de una reducida cantidad de AlaDMpPD y/o de \alpha-naftol, permite la detección de la reacción, sin disminuir la sensibilidad. Además, el tiempo de detección, disminuye así, de esta forma, de una modo considerable, debido al hecho de que, éste, se lleva de 0 a 10 segundos. Esta reducida cantidad, corresponde a una concentración de 0,01 a 0,5 g/l, de una forma preferible, de 0,05 a 0,1 g/l y, por ejemplo, de 0,075 g/l.

Según una variante de realización, es igualmente posible el añadir ligante sobre el escobillón. El aporte de ligante, permite, a la vez, apretar las fibras del cabezal del escobillón, y limitar la liberación de los productos presentes en el escobillón, en la suspensión del inóculo. Un ligante de este tipo, puede estar constituido por la polivinilpirrolidona (PVP), la cual puede no únicamente responder a los criterios precedentes, sino también, aumentar sensiblemente la especificidad. En la composición precedentemente descrita, con las concentraciones, el PVP, se introduce en los constituyentes del cabezal de viscosa del escobillón, en una concentración comprendida dentro de unos márgenes que van de 1 a 50 g/l, de una forma preferible, de 10 a 25 g/l, y por ejemplo, de 15 g/l.

1º) Experimentación

Se procedió, por lo tanto, a realizar una evaluación sobre ciento treinta y tres (133) cepas repartidas según las especies siguientes. La tabla 1, la cual se facilita a continuación, enumera las especies sometidas a test de ensayo, así como el número de cepas para cada especie.

TABLA 1 Especies sometidas a test de ensayo y número de cepas para cada especie

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La tabla 2, enumera los resultados obtenidos:

TABLA 2 Sensibilidad y especificidad de las especies sometidas a test de ensayo

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Entre los resultados obtenidos sobre las cepas sometidas a tests de ensayo, ciertas cepas, son falsos negativos. Estos falsos negativos, son dos (2) de las cuatro (4) cepas de P. aeruginosa, dos (2) de las cinco (5) cepas de P. fluorescens, y una (1) de las dos (2) cepas de H. influenzae. Ciertas cepas, son falsos positivos. Estos falsos positivos, se encuentran constituidos por las dos (2) cepas de C. ulcerans, una (1) de cinco (5) cepas de E. faecalis, las tres (3) cepas de S. pyogenes, dos (2) de la cuatro (4) cepas de S. agalactiae, la cepa de C. guilliermondii y la cepa de C. parapsilosis.

2º) Lisibilidad del test de ensayo

La casi totalidad de las bacterias a Gram negativo, con la excepción de las Pseudomonas, proporcionan una coloración gris violeta franca, cuya intensidad, es superior estrictamente a 2 (sobre una escala semi-cuantitativa que va hasta 4), mientras que, las bacterias a Gram positivo, o que son falsos positivos, con la excepción de S. pyogenes, tienen una intensidad de coloración inferior a 1, sobre esta misma escala.

3º) Tiempo de detección

Aproximadamente un 90% de las bacterias a Gram negativo, se detectan en un transcurso de tiempo que va de 0 a 10 segundos, la mayor parte de las bacterias a Gram positivo, o que son falsos positivos, se detectan después de un transcurso de tiempo de 10 segundos, con la excepción de las cepas de S. pyogenes.

El medio actual, presenta, por lo tanto, una buena sensibilidad y una buena especificidad. Las otras cepas falsos positivos, son generalmente de intensidad muy débil, y presentan un tiempo de detección superior a 10 segundos. Estas cepas, son por lo tanto más bien cepas dudosas, más bien que falsos positivos.

4º) Definición

El modelo de escobillón, particularmente interesante, es un escobillón que responde a los criterios siguientes:

-: un bastoncito de plástico, de un diámetro de 2,5 milímetros (mm) y de una longitud de 150 mm, y

-: con un cabezal de viscosa de un diámetro inferior a 4,5 mm.

5º) Forma de fabricación del escobillón

Las condiciones de fabricación del escobillón, son las siguientes:

-: imbibición en una solución tal y como la que se ha definido anteriormente, arriba, durante un tiempo de 2 a 3 minutos (mn),

-: secado, durante un tiempo de 2 horas (h), a una temperatura de 37°C,

-: acondicionamiento en saco de plástico estanco, y al abrigo de la luz.

6º) Acondicionamiento de los escobillones

Los escobillones, pueden por ejemplo almacenarse de una forma estéril (rayos gamma), en un embalaje que contiene uno (1), veinticinco (25) o cien (100) a mil (1000) de estos escobillones. No obstante, es del todo posible el pretender un acondicionamiento de veinte (20) a veinticinco (25) escobillones, no obligatoriamente esterilizados, después del secado. El acondicionamiento, se efectúa con o sin substancia de desecación, y al abrigo de la luz.

7º) Parámetros críticos

La utilización de los substratos aparejados, es por lo tanto idéntica a la expuesta en el inicio de la descripción. Así, de este modo, el cabezal del escobillón, contiene por lo menos dos moléculas. Así, en el ejemplo facilitado, una primera molécula (AlaDMpPD), se encuentra constituida por una parte marcador (DMpPD) no cromógena, asociada a por lo menos una parte específica (alanina) de la enzima (Alanina-aminopeptidasa) y una segunda molécula constituida por otra substancia no cromógena (\alpha-naftol), la parte marcador no cromógena (AlaDMpPD), una vez liberada, reacciona con la segunda molécula (\alpha-naftol), para formar una molécula cromógena.

La utilización del escobillón, sirve de soporte de los reactivos, y permite la utilización de la suspensión del inóculo, que se utilizará en otros sistemas de identificación y antibiograma, sobre la base de las mismas cepas que se han evaluado precedentemente. Esto disminuye por lo tanto, de una forma considerable, los errores, en el momento del transplante de nuevos microorganismos "parecidos", para efectuar las operaciones siguientes de identificación y de antibiograma, etc.

Además, es igualmente posible el realizar escobillones para otros tipos de tests de ensayo, por ejemplo, oxidasa, indol, esterasa, fosfatasa...

Claims

1. Composición que comporta dos substratos que permiten detectar la presencia de la actividad enzimática de por lo menos dos enzimas, caracterizada por el hecho de que ésta se encuentra constituida por lo menos por dos moléculas, una primera molécula constituida por una parte marcador no cromógena, asociada a por lo menos una parte específica diana de la primera enzima, y una segunda molécula constituida por otra parte marcador no cromógena, asociada a una parte específica diana de la segunda enzima, y por el hecho de que las partes marcador no cromógenas, una vez liberadas, reaccionan para formar una molécula cromógena,

encontrándose constituida, la parte marcador no cromógena de la primera molécula, por aminobenceno o uno de sus derivados,

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encontrándose constituida, la parte marcador no cromógena de la segunda molécula, por \alpha-naftol o uno de sus derivados:

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y encontrándose constituida, la molécula cromógena obtenida, por:

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fórmulas éstas en las cuales:

el radial R_{1}, se encuentra constituido por -OH -SH ó -NXZ,

el radical R_{10}, se elige entre H, -Br, -Cl, -I, ó los grupos de átomos retirados durante el acoplamiento oxidante,

cada radical R_{2} a R_{9}, R_{11} ó R_{12}, se elige entre -H, -OH, -Br, -Cl, -I, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3}, -OCH_{3}, -OCH_{2}CH_{3}, -COOH, y

X, y/ó Z, se encuentra constituido por -H, -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3,}

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2. Substrato, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, R_{10}, representa SH.

3. Substrato, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que, por lo menos uno de los acoplamientos de los radicales R_{2}/R_{3} y R_{4}/R_{5}, se encuentra constituido por un sistema aromático, alicíclico o heterocíclico.

4. Procedimiento de detección de por lo menos dos actividades enzimáticas, mediante la intermediación de substratos, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que éste consiste en:

-: poner las moléculas que constituyen por lo menos dos substratos en presencia de por lo menos un tipo de bacterias contenido en una muestra a someter a test de ensayo,

-: esperar que las bacterias hidrolicen los substratos, y

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que, las moléculas, se encuentran presentes en un material absorbente, y se ponen en contacto con la muestra, y por el hecho de que, después de la detección, los microorganismos de esta forma extraídos, se vuelven a poner en suspensión, con el fin de permitir análisis ulteriores (identificaciones, antibiogramas, etc.).

6. Procedimiento, según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por el hecho de que, la composición reactiva del substrato, eventualmente contenida en el material absorbente, comprende un oxidante.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que, el oxidante, es el ferricianato de potasio.

8. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que, la composición reactiva, comprende un activador de la reacción, tal como una reducida cantidad de la primera molécula y/o de la segunda molécula presente(s) en la muestra a someter a test de ensayo.

9. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por el hecho de que, la composición, comprende un ligante.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que, el ligante, es la polivinilpirrolidona (PVP).

11. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, para identificar el Gram de una especie bacteriana a someter a test de ensayo, caracterizado por el hecho de que, la primera molécula, se encuentra constituida por AlaDMpPD y que, la segunda molécula, se encuentra constituida por \alpha-naftol.

12. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado por el hecho de que, la composición del material absorbente, es la siguiente:

-: \alpha-naftol de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l,

-: ferricianato de potasio de 0,01 g a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l, y

-: AlaDMpPD de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que, el material absorbente, contiene 0,5 g/l de \alpha-naftol.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado por el hecho de que, el material absorbente, contiene 0,5 g/l de ferricianato de potasio.

15. Procedimiento, según la reivindicación 12 a 14, caracterizado por el hecho de que, el material absorbente, contiene 0,35 g/l de AlaDMpPD.

16. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que, el activador constituido por AlaDMpPD, tiene una concentración de 0,01 a 0,5 g/l, de una forma preferente, de 0,05 a 0,1 g/l.

17. Procedimiento, según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que, la concentración de AlaDMpPD, es de 0,075 g/l.

18. Procedimiento, según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado por el hecho de que, la composición, comprende, además, de 1 a 150 g/l, de una forma preferible, de 10 a 25 g/l.

19. Procedimiento, según la reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que, la composición, comprende 15 g/l de PVP.

20. Utilización de un substrato, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la detección de una actividad enzimática de tipo peptidasa.

21. Dispositivo para la detección, en una muestra, de por lo menos dos actividades enzimáticas, caracterizado por el hecho de que, éste, comporta un soporte inerte con respecto al material absorbente y de los substratos que éste contiene y de la muestra sometida a test de ensayo, un cabezal de material absorbente montado sobre este soporte, y una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

22. Dispositivo, según la reivindicación 21, caracterizado por el hecho de que, el soporte, es de plástico, y el material absorbente, es de viscosa.