ES2273097T3 - Constructo de expresion circular para aplicaciones de terapia genica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un constructo de expresión circular, cerrado en forma de anillo, a partir de una doble cadena de ADN, que se compone de los siguientes pasos: a) Corte de una secuencia de ADN bicatenario de un plásmido amplificable en células procarióticas o eucarióticas mediante una digestión primaria con endonucleasas de restricción, b) en la que los sitios de corte limitan directamente por ambos lados y sin bases intercaladas las secuencias de un casete de expresión compuesto por i. al menos una secuencia promotora, ii. al menos una secuencia codificante y iii. al menos una secuencia de poliadenilación, y c) ligación intramolecular siguiente de los fragmentos de restricción generados de manera que la reacción de ligación proporcione una doble cadena de ADN cerrada covalentemente (cierre de anillo), seguida de d) una digestión secundaria de la mezcla de reacción con una endonucleasa de restricción que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento que no está presente en el constructo de expresión que se ha de preparar pero que sí aparece al menos una vez en el resto del plásmido biológicamente amplificable, y e) degradación simultánea o posterior del resto de cadena abierta del plásmido biológicamente multiplicable con una exonucleasa específica para los extremos 3'''' y 5'''' del ADN y f) purificación del casete de expresión cerrado en forma de anillo de una doble cadena de ADN.
Description
Constructo de expresión circular para
aplicaciones de terapia génica.
La invención se refiere tanto a un procedimiento
para la preparación de un constructo de expresión minimalista de una
doble cadena de ADN circular cerrada en forma de anillo, como
también a un constructo de expresión de ADN correspondiente. Este
tipo de constructos de expresión (vectores) se han de usar, en
particular, en el campo de la terapia génica. Por terapia génica se
ha de entender la incorporación en el organismo de uno o varios
genes extraños con una utilidad terapéutica para el individuo.
La terapia génica depende sobre todo del
desarrollo de procedimientos de transferencia de genes in
vivo inocuos y fáciles de aplicar que permitan bien una
expresión génica eficaz y estable en determinados órganos diana o
bien una inhibición selectiva de la expresión de proteínas de genes
específicos.
Debido a la pluralidad de barreras (membrana
plasmática, endosoma, núcleo celular) que se han de superar a la
hora de transferir material genético a la célula, la transfección de
ADN es un proceso poco frecuente y difícil de predecir. Así, la
insuficiente eficacia de transfección de los vectores desarrollados
hasta la fecha constituye un gran problema, puesto que una gran
parte de las células del tejido diana no se transfecta cuando se
inyecta ADN en el tejido. Además, las células transfectadas con
éxito expresan las secuencias de ADN transfectadas con intensidad
variable.
Básicamente, se distingue entre procedimientos
de transferencia de genes víricos y no víricos. Los procedimientos
de transferencia víricos utilizan virus genéticamente modificados
como vehículos transportadores para el material genético. Dado que
los virus de tipo natural y los vectores derivados de ellos
generalmente también muestran una buena especificidad de tejido
además de una elevada eficacia de transfección, son éstos los que
más se usan actualmente para la transferencia de genes.
Sin embargo, su uso conlleva riesgos para la
seguridad que no se deben subestimar y que se oponen masivamente a
su uso en la terapia génica. Así, la posibilidad de que se dé una
recombinación de los componentes víricos incorporados con virus
presentes de forma natural en el paciente constituye un riesgo
inherente para la seguridad. Esta recombinación incontrolada de
virus capaces de reproducirse con aquellos que son incapaces de
reproducirse puede generar nuevos virus híbridos patógenos. También
las reacciones inmunológicas provocadas por la inmunidad
anti-vector constituyen un fenómeno concomitante
importante del uso de vectores víricos. Así, en un estudio clínico,
la administración de una dosis alta de un adenovirus produjo la
muerte del paciente, cuya causa fue, obviamente, una fuerte
hiperreacción del sistema inmunológico (Lehrman, 1999, Nature
401:517-518). Los casos de enfermedades leucémicas
observadas después de la terapia génica con sistemas de
transferencia de genes víricos demuestran que los problemas siguen
sin resolverse y significan un fuerte retroceso en la terapia génica
(Buckley RH, 2002, Lancet 360:1185-6).
Estos inconvenientes se evitan con los sistemas
de transferencia de genes no víricos, que generalmente derivan de
plásmidos y también se denominan ADN "desnudo". Estos, sin
embargo, además de presentar unas tasas de transfección mucho
menores y, en relación con ello, unas reducidas tasas de expresión
de las secuencias transferidas, también carecen de especificidad
celular o tisular.
Otro inconveniente de los sistemas de
transferencia de genes no víricos conocidos reside en la proporción
relativamente alta de secuencias de ADN bacterianas que están
contenidas en los plásmidos. Estas causan problemas considerables en
el organismo diana. Así, las secuencias inmunoestimuladoras
("ISS", por ejemplo dinucleótidos de
citosina-guanina no metilados, "CpG") presentes
de forma natural en el plásmido producen la estimulación de las
células efectoras del sistema inmunológico y, por lo tanto, la
liberación masiva de citocinas inflamatorias e interferones (Krieg,
2002, Annu Rev Immunol 20:709-60). Esto debe
evitarse en todos los casos en los que no se desee o incluso esté
contraindicada la generación de un fenotipo inmunológico Th1. Estos
casos incluyen todas las enfermedades con componentes autoinmunes,
tales como el lupus eritematoso sistémico o la enfermedad de Crohn,
así como las numerosas indicaciones para la terapia génica que
cursan sin la menor participación del sistema inmunológico, tales
como la enfermedad metabólica mucoviscidosis o la deficiencia de
alfa-1-antitripsina.
Los plásmidos ya conocidos contienen además
genes de resistencia a antibióticos que son necesarios para su
selección. La consecuencia de una posible recombinación con
bacterias distribuidas en el organismo de forma ubicua conlleva el
riesgo de que aumente la aparición de bacterias resistentes a
antibióticos. Esta extensión de resistencias a antibióticos es un
serio problema con vistas a las repetidas administraciones
necesarias de los genes terapéuticos, y, por lo tanto, no es
admisible.
Reduciendo las secuencias de ADN bacterianas en
los plásmidos, Coutelle y col. lograron preparar el denominado ADN
minicircular que en ensayos in vitro produjo unas tasas de
expresión de hasta diez veces mayores respecto a los plásmidos
convencionales (Coutelle y col., 2001, J. of Biol. Chem.
25:23018-23027). Se usaron plásmidos que contenían
dos secuencias de reconocimiento para una recombinasa. Puesto que
estos sitios de recombinación insertados son de origen bacteriano,
también este tipo de vector contiene restos de ADN bacteriano, de
modo que los inconvenientes de los plásmidos convencionales se han
reducido pero siguen estando presentes. Los minicírculos tampoco
permiten una transferencia de genes dirigida al objetivo puesto que
con la estructura de los minicírculos no se puede lograr una unión
específica y, por tanto, controlable de los ligandos que median la
transferencia.
El contenido de la patente de Estados Unidos
6.143.530 son igualmente plásmidos con una proporción reducida de
ADN de origen bacteriano. Sin embargo, también el proceso de
preparación allí descrito se realiza con la ayuda de recombinasas
bacterianas, condicionando así la presencia de secuencias de ADN
bacterianas que pueden producir procesos inflamatorios inducidos por
el vector.
En la patente de Estados Unidos 6.265.218 se
describe un procedimiento para la preparación de un vector sin gen
marcador para la selección. Los vectores preparados según el
procedimiento reivindicado se han de usar en la terapia génica o
para la preparación de medicamentos farmacéuticos para la terapia
génica. Los únicos vectores realizables en este documento se
preparan usando un sistema de recombinasas. Esto lleva forzosamente
a constructos de expresión que contienen secuencias vectoriales.
Otro tipo de vectores no víricos son los
constructos de expresión minimalistas cerrados que sólo son
parcialmente bicatenarios. En el documento EP0941318 B1 se muestra
la síntesis de este tipo de constructos de expresión con una
topología lineal cerrada covalentemente. Estos constructos en forma
de halterio llevan únicamente la información de secuencia
absolutamente necesaria para la expresión del gen de interés y
evitan, por lo tanto, los inconvenientes de los plásmidos con
secuencias bacterianas. Un inconveniente de los constructos de
expresión en forma de halterio reside en que inducen una menor
expresión de las proteínas terapéuticas en comparación con los
plásmidos formados por dobles cadenas de ADN circulares
cerradas.
Sin embargo, para la inducción de una respuesta
inmunológica como la que se desea obtener en el caso de la vacuna
profiláctica o terapéutica, estos vectores lineales son claramente
superiores a los plásmidos convencionales puesto que provocan una
respuesta inmunológica significativamente mejorada desde los puntos
de vista cualitativo y cuantitativo (Lutz y col., 2000, J Virol:
74(22):10447-57).
Para aumentar la eficacia de la transfección se
conoce la transferencia de genes mediada por ligandos. Al vector se
unen ligandos que median la transferencia, como, por ejemplo, la
señal de localización nuclear (NLS, secuencia de aminoácidos
PKKKRKV) del virus SV-40 o la proteína
transactivadora TAT del virus VIH-1, para forzar la
entrada a través de la membrana celular y, posteriormente, en el
núcleo celular. De este modo se intenta imitar los mecanismos
víricos que permiten la penetración con éxito en las células y dotar
los vectores no víricos de sistemas eficaces para encontrar el
objetivo.
Así, en un ensayo de inmunización se pudo
detectar, después de acoplar el péptido NLS a un casete de expresión
lineal que codifica el HBsAg (antígeno superficial pequeño de la
hepatitis), un título de anticuerpos 10 a 15 veces mayor que en el
caso de un casete de expresión no acoplado (Schirmbeck y col., J.
Mol Med., junio de 2001;
79(5-6):343-50). El
inconveniente reside también aquí en que la tasa de expresión es
claramente menor que la de los vectores del estado de la
técnica.
En resumen, cabe destacar que, pese a largos
años de intensa investigación, no se pudieron desarrollar vectores
de ADN que presentaran una elevada eficacia de transfección y, al
mismo tiempo, pudieran usarse sin reparos en cuanto a la seguridad
en la terapia génica o en la vacunación genética de hombres y
animales.
Partiendo de este estado de la técnica, el
objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento
con el que se puedan preparar constructos de expresión no víricos
con una elevada eficacia de transferencia y de expresión, crear
asimismo un constructo de expresión correspondiente e indicar los
usos posibles del mismo. De este modo deben evitarse los
inconvenientes de los sistemas de expresión víricos conocidos que se
usan en el marco de la terapia génica.
La presente invención soluciona este problema
técnico mediante un procedimiento para la preparación de un vector
de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, es decir,
mediante un constructo de expresión de ADN circular, exento de ADN
bacteriano y vírico y que puede transfectar células de forma eficaz
y selectiva.
Por un constructo de expresión circular se
entiende en el sentido de la invención un vector de ADN que está
formado únicamente por una doble cadena de ADN circular. El ADN
bicatenario está formado por al menos un casete de expresión,
componiéndose el casete de expresión por al menos un promotor, al
menos la secuencia codificante y, dado el caso, al menos una
secuencia de poliadenilación. Para la protección contra la
degradación por exonucleasas, el vector convenientemente no posee
extremos libres sino que está cerrado en forma de anillo.
En otra forma de realización según la
reivindicación 2, el vector está cerrado covalentemente mediante el
uso de un oligodesoxinucleótido que une de forma covalente los
extremos del fragmento cohesivo del casete de expresión cortado.
Este oligodesoxirribonucleótido puede presentar
una o varias bases modificadas que permiten el acoplamiento con uno
o varios ligandos.
Dependiendo de la secuencia del
oligodesoxirribonucleótido usado, pueden formarse motivos
estructurales discretos que permiten acceder al ligando libremente
y, por lo tanto, mejor y con mayor eficacia. Por ligandos también se
han de entender en este contexto péptidos, proteínas y/u otras
moléculas orgánicas, por ejemplo moléculas de azúcar o esteroideas,
que, unidas covalentemente a los vectores, conducen a una
transfección eficaz y selectiva de las células.
Por transfección debe entenderse la introducción
de secuencias de ácido nucleico en la célula mediante procedimientos
biológicos, químicos o físicos, a consecuencia de la cual se produce
en la célula transfectada una expresión permanente o transitoria de
las proteínas codificadas por estas secuencias o transcritos de ARN
catalíticamente activos. No obstante, también se pueden introducir
los denominados constructos "antisentido" que, por hibridación
con el ARN mensajero complementario, inhiben la traducción y, así,
la expresión de proteínas.
Mediante el procedimiento de acuerdo con la
invención se preparan constructos de expresión de genes circulares,
así como circulares y modificados por ligando, formados por una
doble cadena de ADN continua. Puesto que los casetes de expresión de
estos constructos de expresión de acuerdo con la invención están
limitados a los mecanismos de control absolutamente necesarios para
la expresión del gen terapéutico, sólo se encuentran nucleótidos
exactamente definidos en la secuencia de los vectores, que no son de
origen bacteriano ni vírico. Esto reduce el tamaño del vector en 2 a
3 kilobases y conlleva una disminución del contenido en secuencias
CpG de aproximadamente 90%. Los constructos de expresión preparados
según el procedimiento de acuerdo con la invención no se pueden
amplificar biológicamente, es decir, que no se pueden reproducir en
células procarióticas ni eucarióticas.
Los constructos de expresión circulares de
acuerdo con la invención se aíslan recortándolos con una
endonucleasa de restricción de tipo IIS, preferentemente Eco 31l, de
un plásmido adecuado para ello que contiene las secuencias génicas
que se han de expresar. El fragmento cohesivo generado, que contiene
el casete de expresión, se cierra después en forma de anillo por
ligación. En una forma de realización, están acoplados uno o varios
ligandos a un ODN que une los extremos del fragmento cohesivo del
casete de expresión cortado. Para la preparación de estos vectores
acoplados a péptidos se acoplan previamente al ODN por enlace
covalente uno o varios ligandos que median la transferencia. El ODN
se puede modificar químicamente mediante una o varias funciones
alquílicas ácido carboxílico, amino, tiol o aldehído.
El esqueleto plasmídico, que en una digestión de
restricción secundaria se corta mediante una endonucleasa de
restricción para la que no existe ninguna secuencia de
reconocimiento en el casete de expresión, se degrada enzimáticamente
mediante la función exonucleasa de la ADN-polimerasa
de T7 y el constructo de expresión de ADN circular cerrado
bicatenario de acuerdo con la invención que queda se purifica en un
paso cromatográfico. El constructo de expresión se puede purificar
adicionalmente por precipitación en isopropanol. Mediante este
procedimiento de acuerdo con la invención se eliminan del constructo
de expresión todos los elementos de secuencia necesarios para la
preparación del plásmido, es decir, también las secuencias
bacterianas o víricas.
Limitándose a las informaciones de secuencia
necesarias para la expresión, es posible preparar un vector de
acuerdo con la invención de una pequeñez novedosa. Así, resulta
posible preparar este tipo de vectores de un tamaño comprendido en
el intervalo de 200 a 10.000 pb, preferentemente de 1.000 a 25.000
pb. En comparación, el tamaño medio de un plásmido convencional sin
las secuencias génicas codificantes asciende a de 2.000 a 3.000 pb
y, en la mayoría de los casos, no se puede reducir a causa de las
condiciones de preparación.
El acoplamiento covalente de los ligandos al ODN
se lleva a cabo a través de una molécula de unión y, por lo tanto,
constituye un enlace químico definido. Resulta ventajoso que los
ligandos se puedan ligar al vector de ADN en posiciones definidas.
De este modo se excluye la posible pérdida de función del promotor o
de los genes funcionales por unión de los ligandos dentro de una
región funcionalmente sensible de la secuencia. Asimismo es posible
ventajosamente ligar al vector de expresión varios ligandos
independientes, situados en cada caso en puntos
definidos.
definidos.
Para una fácil aplicación industrial, el
presente procedimiento de acuerdo con la invención también puede
presentarse en forma de un kit para la preparación del constructo de
expresión de acuerdo con la invención. Un kit de este tipo
comprende
(a) un plásmido que
- -
- contiene las secuencias de reconocimiento necesarias para las enzimas de restricción y
- -
- es adecuado para la amplificación del casete de expresión,
(b) una primera mezcla de enzimas compuesta por
una enzima de restricción y una ligasa,
(c) una segunda mezcla de enzimas compuesta por
una enzima de restricción y una polimerasa,
(d) un agente esencialmente conocido para la
purificación del constructo de expresión,
(e) medios de reacción habituales, tales como
tampones, ATP, DTT, agua, etc.,
(f) un vector de control para demostrar la
función de los componentes del kit.
La condición previa para un kit de este tipo es
la presencia de una secuencia codificante (cualquiera) que se clone
en el plásmido (a) mediante procedimientos habituales.
\newpage
Las ventajas adicionales de la invención se
describen en las demás reivindicaciones, en la descripción y en las
figuras. El efecto sorprendente del vector circular de una doble
cadena de ADN y modificado con ligandos de acuerdo con la invención,
así como el procedimiento de acuerdo con la invención se explica
mediante las figuras y los ejemplos de realización; muestran:
la Fig. 1 una representación esquemática del
proceso de preparación de los vectores de ADN circulares de acuerdo
con la invención, en la que significan
- a)
- plásmido
- b)
- Eco 31l
- c)
- oligonucleótido conector modificado con ligando
- d)
- casete de expresión
- e)
- ADN bacteriano residual
- f)
- Eco 311
- g)
- mezcla de ADN bacteriano residual (e) y producto (i)
- h)
- ADN-polimerasa de T7
- i)
- producto,
la Fig. 2 la estructura funcional de los
vectores de ADN acoplados a péptidos de acuerdo con la invención, en
la que significan
- a)
- secuencia del gen que se ha de expresar,
- b)
- región promotora
- c)
- oligonucleótido conector modificado con ligando
- d)
- señal de poli(A),
la Fig. 3 la comparación de la expresión in
vitro del vector de acuerdo con la invención, del plásmido
convencional y de un vector lineal basándose en la expresión de la
luciferasa de luciérnaga después de la transfección de células K562,
medida en ulr (unidades lumínicas relativas). Significan:
- Plásmido: el plásmido pMOK que codifica la luciferasa,
- vector lin: el vector lineal que codifica la luciferasa,
- vector2NLS circ: el vector circular de acuerdo con la invención acoplado a 2 péptidos NLS,
la Fig. 4 la comparación de la expresión in
vitro del vector de acuerdo con la invención, del plásmido
convencional y de un vector lineal basándose en la expresión de la
luciferasa de luciérnaga después de la transfección de células Hela,
medida en ulr (unidades lumínicas relativas). Significan:
- Plásmido: el plásmido pMOK que codifica la luciferasa,
- vector lin: el vector lineal que codifica la luciferasa,
- vector circ: el vector circular de acuerdo con la invención no acoplado a péptidos,
la Fig. 5 la expresión in vivo de
vectores circulares y lineales que codifican Lac-Z.
Significan:
- Vector lin: un vector lineal que codifica Lac-Z,
- vector-NLS lin: un vector acoplado a un péptido NLS y que codifica Lac-Z,
- vector-NLS circ: el vector circular de acuerdo con la invención acoplado a un péptido NLS y que codifica Lac-Z,
\newpage
la Fig. 6 la secreción de interferón gamma de
esplenocitos estimulados en ratones. Significan:
- Vector-NLS lin: un vector lineal acoplado a un péptido NLS y que codifica HBsAg,
- vector-NLS circ: el vector circular de acuerdo con la invención acoplado a un péptido NLS y que codifica HBsAg.
La detección de la expresión con la ayuda del
gen informador de la luciferasa se llevó a cabo in vitro en
dos líneas celulares humanas. Para la comparación de las tasas de
expresión se usaron un plásmido que codifica la luciferasa, un
vector lineal convencional y un vector de acuerdo con la invención
con y sin acoplamiento a péptidos. Mediante el constructo
reivindicado con la modificación peptídica NLS (señal de
localización nuclear, secuencia de aminoácidos PKKKRKV del virus
SV-40) se alcanza sorprendentemente una tasa de
expresión más de dos veces mayor que con el plásmido convencional
(véase la Figura 3). Igualmente, el vector circular de acuerdo con
la invención sin modificación peptídica muestra una clara ventaja de
expresión frente a los vectores del estado de la técnica (Fig.
4).
Para los estudios in vivo se administró a
ratones un vector de acuerdo con la invención o un vector
convencional que codifican el gen Lac-Z. La
comparación de la expresión de la
\beta-galactosidasa inducida por los vectores se
realizó basándose en la expresión cuantitativa de la
\beta-galactosidasa. También en este caso el
vector de acuerdo con la invención (designado con
"vector-NLS circ") resulta claramente más
ventajoso. También la tasa de expresión in vivo se incrementa
en más del 50% mediante los vectores reivindicados (véase la Fig. 5)
y es comparable a los resultados in vitro de las Fig. 3 y
4.
Otro ensayo in vivo sirvió para estudiar
los procesos inmunológicos que tienen lugar tras la vacunación con
los vectores lineal y de acuerdo con la invención. Para ello se
vacunaron ratones con vectores que codifican HBsAg y se comparó el
perfil de citocinas inducido por ellos basándose en la secreción de
interferón gamma (IFN-gamma). El interferón gamma
desempeña un papel clave en la respuesta inmunológica y en la
defensa antiviral. De acuerdo con la Fig. 6, los vectores de acuerdo
con la invención son capaces de inducir esplenocitos específicos de
antígeno que secretan IFN-gamma, mientras que los
vectores lineales no producen la secreción de
IFN-gamma cuando se usa la cantidad reducida de 5
\mug de ADN vectorial. Para la vacunación o la inmunoterapia de
diferentes enfermedades parece ventajosa la generación de una
reacción inmunológica típica de Th1, lo que es especialmente válido
para parásitos intracelulares, como Leishmania y malaria, así como
para muchas afecciones víricas, tales como las causadas por VIH.
Además de las ventajas del aumento significativo
de la expresión génica y de la generación de una respuesta
inmunológica mediada más intensamente por células, este nuevo tipo
de vectores no posee genes marcadores ni secuencias codificantes de
origen vírico o bacteriano, sino que se compone únicamente de
secuencias que son directamente necesarias para la expresión de los
genes terapéuticos y, por lo tanto, ofrece la mayor seguridad
posible para el paciente. Por una parte se evitan los procesos
inmunológicos o inflamatorios no deseados causados por el ADN
bacteriano o vírico y, por otra, la reducción del tamaño del vector
relacionada con ello parece conducir ventajosamente a una mayor tasa
de transferencia al núcleo celular.
El plásmido pMOK-Luc se digirió
por completo durante 2 h a 37ºC con la enzima de restricción Eco31l.
La digestión de restricción generó dos fragmentos de ADN. Uno de
ellos se componía del gen de resistencia a kanamicina, así como de
otras secuencias necesarias para la propagación del plásmido en
bacterias, y el otro fragmento se componía de las secuencias que
iban a formar parte del vector de acuerdo con la invención, a saber,
el promotor de CMV, la secuencia del gen que se ha de expresar y la
secuencia de poliadenilación del SV-40. Los extremos
complementarios generados por Eco31l en el fragmento de ADN que
forma el vector se ligaron entre sí durante toda la noche a 4ºC
mediante la enzima ADN-ligasa de T4 (en tampón de
ligasa: Tris-HCl 400 mM, MgCl_{2} 100 mM, ATP 5
mM). La mezcla resultante de ácidos nucleicos se trató con la enzima
Eco 1471. Para degradar el ADN residual de origen vectorial se
añadió a la mezcla la enzima ADN-polimerasa de T7.
El casete de expresión circular obtenido se purificó por
cromatografía de intercambio aniónico y se precipitó con
isopropanol.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática del proceso de preparación de los vectores de ADN
circulares de acuerdo con la invención: Mediante la digestión del
plásmido (a) con Eco 31l (b) se generan los fragmentos que
constituyen el ADN bacteriano residual (e) y el casete de expresión
(d). Con la ayuda de la enzima ADN-ligasa de T4 (f)
y en presencia de Eco 31l (f) se liga el oligonucleótido conector
(c) modificado con ligando con (d). Esta mezcla, que se compone de
ADN bacteriano residual (g) y producto (i), se trata, en el último
paso (h), con la ADN-polimerasa de T7 y conduce al
producto (i).
\newpage
Los casetes de expresión circulares acoplados a
péptidos se construyeron de la siguiente manera: El péptido NLS
PKKKRKV (prolina- lisina- lisina- lisina- arginina- lisina- valina)
se acopló en dos pasos a, opcionalmente, uno o ambos nucleótidos.
Primero se activó durante 2 h a 37ºC el oligonucleótido modificado
(5'-PH-d(GGGAACCTTCAGTx
AGCAATGG o 5'-PH-d
AGGGCCATTGCTxACTGAAGG, en el que xT representa la base timina
aminomodificada con aminoconector C2) (0,1 mM) con
sulfo-KMUS (5 mM) en tampón de acoplamiento
(NaPO_{4} 50 mM y NaCl 75 mM, 0,5x, pH 7,6). La reacción se detuvo
con Tris-(hidroximetil)-aminometano 50 mM (H 7,5), y
tras la precipitación en etanol (NaOAc 300 mM, pH 5,2, MgCl_{2}
5,5 mM, etanol al 100%), la centrifugación y un único lavado con
etanol al 70%, se obtuvo el ODN activado. El ODN así obtenido (0,1
mM) se disolvió en tampón de acoplamiento (NaPO_{4} 50 mM y NaCl
75 mM, 0,5x, pH 7,0) y se hizo reaccionar con el péptido (0,2 mM)
durante una hora a 37ºC. La reacción se comprobó en un gel de
poliacrilamida (20%) desnaturalizante y por tinción con bromuro de
etidio. El ODN generado acoplado a NLS se purificó por HPLC y se usó
para la síntesis de los vectores de expresión circulares.
El plásmido pMOK-Luc se digirió
por completo durante 2 h a 37ºC con la enzima de restricción Eco31l.
La digestión de restricción proporcionó dos fragmentos de ADN. Los
oligodesoxinucleótidos complementarios
5'-fosforilados (TIBMolBiol, Berlín),
5'-PH-GGGAACCTTCAGTxAGCAATGG-3'
y
5'-PH-AGGGCCATTGCTxACTGAAGG-3'
(xT representa la base timina aminomodificada con aminoconector C2
al que se unió de forma covalente el péptido señal NLS,
opcionalmente a través de una molécula de entrecruzamiento),
hibridados previamente durante 3 min a 90ºC, se ligaron durante toda
la noche a 4ºC y en presencia de la enzima de restricción Eco31l al
fragmento de ADN que forma el vector (véase el ejemplo 1). La mezcla
resultante de ácidos nucleicos se trató con la enzima
ADN-polimerasa de T7. El producto se purificó por
cromatografía de intercambio aniónico y se precipitó con
isopropanol.
Se transfectaron por electroporación células de
la línea celular K562 con el plásmido pMOK-Luc, con
un vector lineal y con el vector acoplado a ligando de acuerdo con
la invención. La realización se efectuó por triplicado, usándose en
cada caso 100 ng de ADN tras determinar previamente la
concentración. Se usaron 2,5x10^{8} células/250 \mul por
preparación, que se transfectaron a 300 V y 1050 \muF. Tras una
incubación de 24 h a 37ºC se llevó a cabo la detección de la
expresión por determinación de la actividad de la luciferasa en el
luminómetro. Los resultados se representan en la Figura 3.
El día anterior a la transfección se sembraron
en placas de 24 pocillos 40.000 células de la línea celular humana
Hela (20.000 células/cm^{2}). Las células se transfectaron con el
siguiente ADN usando lipofectina: Plásmido pMOK, vector lineal,
vector circular no acoplado a péptido, que en cada caso codificaban
el gen informador de la luciferasa. La realización se efectuó entre
4 y 8 veces, usándose en cada caso 800 ng de ADN tras determinar
previamente la concentración. El ADN se incubó durante 45' a 20ºC
con el reactivo de transfección lipofectina en DMEM (medio de Eagle
modificado por Dulbecco). A continuación se llevó a cabo la
transfección añadiendo la mezcla ADN/lipofectina a las células. La
duración de la incubación fue de 4 h a 37ºC. Después de cambiar el
medio, las células se siguieron cultivando durante 21 h a 37ºC y a
continuación se detectó la expresión determinando la actividad de la
luciferasa en el luminómetro. Los resultados se representan en la
Figura 4.
A tres grupos de 6 ratones cada uno se
inyectaron intratumoralmente, mediante un procedimiento de inyección
a presión, vector lineal y vector circular con y sin acoplamiento de
péptido que codificaban el gen Lac-Z. Los animales
recibieron un total de 5 inyecciones. La concentración de ADN
ascendió en cada caso a 1 \mug/\mul. 48 h después de la última
inyección se sacrificaron los animales, se extrajo el tumor y se
conservó en nitrógeno líquido para posteriores análisis. La
preparación de las células tumorales se llevó a cabo por
homogeneización en 800 \mul de tampón de lisis (tampón TE, pH 8,
que contenía 10 mg/ml de aprotinina y 10 \mug/ml de PMSF). Tras la
centrifugación (14.000 rpm, 4ºC, 10 min) se obtuvo el lisado y se
realizó la determinación de proteínas con la ayuda de un ensayo de
Coomassi (Pierce, Rockford, EE.UU.). La absorción se determinó a 595
nm. Los resultados se muestran en la Fig. 5.
Se inmunizaron por vía intradérmica ratones
BALB/c de 6 a 8 semanas de edad con vectores que codificaban HBsAg
(disueltos en 50 \mul de Na_{2}PO_{4} 100 mM). Al cabo de 4
semanas se extirpó el bazo a 2 ratones de cada grupo y se aislaron
los esplenocitos. Los esplenocitos se incubaron durante toda la
noche a 37ºC y 5% de CO_{2} con células presentadoras de antígeno
tratadas con concanavalina A (ConA), con mitomicina C (APC, control
negativo) y con APCs que estuvieron en contacto con el péptido HBsAg
(control positivo). Las placas de 96 pocillos se recubrieron
previamente con 8 \mug/ml de anticuerpo
anti-IFN-gamma de ratón
(Pharmingen). Después de la incubación se retiraron las células y se
añadieron a las placas de 96 pocillos 100 \mul de anticuerpo
biotinilado anti-IFN-gamma de ratón
(Pharmingen) a una concentración de 2 \mug/ml. Tras incubarlas
durante toda la noche a 4ºC, las placas se lavaron, y tras añadir
100 \mul de avidina-peroxidasa (Pharmingen) en una
dilución de 1:800, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente.
El revelado se realizó añadiendo 100 \mul de sustrato DAB (Sigma).
Al cabo de 20 min se detuvo la reacción y se contaron los
precipitados con la ayuda de un estereomicroscopio. Los resultados
del control negativo se restaron de los resultados del control
positivo, hallando así el número de precipitados específicos de
antígeno. Estos valores se relacionaron con los resultados de los
esplenocitos incubados con ConA. Los resultados se representan en la
Figura 6.
Claims (16)
1. Procedimiento para la preparación de un
constructo de expresión circular, cerrado en forma de anillo, a
partir de una doble cadena de ADN, que se compone de los siguientes
pasos:
a) Corte de una secuencia de ADN bicatenario de
un plásmido amplificable en células procarióticas o eucarióticas
mediante una digestión primaria con endonucleasas de
restricción,
b) en la que los sitios de corte limitan
directamente por ambos lados y sin bases intercaladas las secuencias
de un casete de expresión compuesto por
- i.
- al menos una secuencia promotora,
- ii.
- al menos una secuencia codificante y
- iii.
- al menos una secuencia de poliadenilación, y
c) ligación intramolecular siguiente de los
fragmentos de restricción generados de manera que la reacción de
ligación proporcione una doble cadena de ADN cerrada covalentemente
(cierre de anillo), seguida de
d) una digestión secundaria de la mezcla de
reacción con una endonucleasa de restricción que reconoce y corta
una secuencia de reconocimiento que no está presente en el
constructo de expresión que se ha de preparar pero que sí aparece al
menos una vez en el resto del plásmido biológicamente amplificable,
y
e) degradación simultánea o posterior del resto
de cadena abierta del plásmido biológicamente multiplicable con una
exonucleasa específica para los extremos 3' y 5' del ADN y
f) purificación del casete de expresión cerrado
en forma de anillo de una doble cadena de ADN.
2. Procedimiento para la preparación de un
constructo de expresión circular, cerrado en forma de anillo, a
partir de una doble cadena de ADN, que comprende los siguientes
pasos:
a) Corte de una secuencia de ADN bicatenario de
un plásmido amplificable en células pro- o eucarióticas mediante una
digestión primaria con endonucleasas de restricción,
b) en la que los sitios de corte limitan
directamente por ambos lados y sin bases intercaladas las secuencias
de un casete de expresión compuesto por
- i.
- al menos una secuencia promotora,
- ii.
- al menos una secuencia codificante y
- iii.
- al menos una secuencia de poliadenilación, y
c) ligación intramolecular siguiente de los
fragmentos de restricción generados en presencia de al menos un
oligodesoxinucleótido al que está unido covalentemente, mediante
modificación química, al menos un ligando, de manera que la reacción
de ligación proporcione una doble cadena de ADN cerrada
covalentemente (cierre de anillo) que incluya el oligonucleótido,
seguida de
d) una digestión secundaria de la mezcla de
reacción con una endonucleasa de restricción que reconoce y corta
una secuencia de reconocimiento que no está presente en el
constructo de expresión que se ha de preparar pero que sí aparece al
menos una vez en el resto del plásmido biológicamente amplificable,
y
e) degradación simultánea o posterior del resto
de cadena abierta del plásmido biológicamente multiplicable con una
exonucleasa específica para los extremos 3' y 5' del ADN y
f) purificación del casete de expresión cerrado
en forma de anillo de una doble cadena de ADN.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el oligodesoxinucleótido se modifica químicamente mediante
una o varias funciones alquílicas ácido carboxílico, amino, tiol o
aldehído.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la digestión de restricción primaria se realiza mediante
una o varias endonucleasas de restricción del tipo IIS,
preferentemente Eco31l.
5. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la digestión de restricción secundaria se realiza
preferentemente con la enzima Eco1471.
6. Constructo de expresión compuesto por ADN
bicatenario para el transporte de información genética, en el
que
a) el constructo de expresión es circular, está
cerrado en forma de anillo y está limitado a las informaciones de
secuencia necesarias para la expresión, además
b) el constructo de expresión no se puede
amplificar en células procarióticas ni eucarióticas y
c) el constructo de expresión se compone al
menos de al menos un casete de expresión de ADN bicatenario, en el
que un casete de expresión contiene
- i.
- al menos una secuencia promotora,
- ii.
- al menos una secuencia codificante y
- iii.
- al menos una secuencia de poliadenilación,
d) el constructo de expresión comprende entre
200 y 10.000 pb.
7. Constructo de expresión según la
reivindicación 6, comprendiendo el constructo de expresión
preferentemente al menos de 1.000 a 2.500 pb.
8. Constructo de expresión según la
reivindicación 6 ó 7, conteniendo el constructo de expresión al
menos un oligodesoxinucleótido.
9. Constructo de expresión según la
reivindicación 8, en el que el oligodesoxinucleótido presenta al
menos una base de timina aminomodificada.
10. Constructo de expresión según la
reivindicación 8 ó 9, en el que el oligodesoxinucleótido se puede
modificar químicamente mediante una o varias funciones alquílicas
ácido carboxílico, amino, tiol o aldehído.
11. Constructo de expresión según las
reivindicaciones 6 a 10, en el que está unido covalentemente al
menos un ligando al oligodesoxinucleótido.
12. Constructo de expresión según la
reivindicación 11, en el que el ligando es un oligopéptido.
13. Constructo de expresión según la
reivindicación 12, en el que el oligopéptido se compone de 3 a 30
aminoácidos de los cuales al menos la mitad son los aminoácidos
básicos arginina y/o lisina.
14. Constructo de expresión según la
reivindicación 12, en el que el oligopéptido presenta una secuencia
de localización nuclear con la secuencia de aminoácidos PKKKRKV.
15. Uso del constructo de expresión según una o
varias de las reivindicaciones precedentes para la preparación de
vacunas.
16. Uso del constructo de expresión según una o
varias de las reivindicaciones precedentes como componente de un
kit.
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