PT1631672E

PT1631672E - Vector de expressão circular destinado a aplicações na terapia genetica

Info

Publication number: PT1631672E
Application number: PT03817243T
Authority: PT
Inventors: Matthias Schroff; Colin Smith
Original assignee: Mologen Ag
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2003-06-10
Publication date: 2007-01-31
Also published as: EP1631672B1; US20060183703A1; EP1631672A1; JP2007523593A; WO2004111247A1; ES2273097T3; JP4451842B2; DE50305146D1; ATE340264T1; AU2003246536A1; DK1631672T3

Description

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DESCRIÇÃO

"VECTOR DE EXPRESSÃO CIRCULAR DESTINADO A APLICAÇÕES NA TERAPIA GENÉTICA" A invenção é relativa tanto a um processo de fabrico de um vector de expressão minimalista, composto por uma cadeia dupla de ADN fechada em forma de anel, circular; como também a um vector de expressão de ADN correspondente. Este tipo de vectores de expressão deverão sobretudo ser empregues na área da terapia genética. Terapia genética trata-se da inclusão de um mais genes estranhos no organismo com utilidades terapêuticas para o indivíduo. A terapia genética está sobretudo dependente do desenvolvimento de métodos de transferência de genes não perigosos e de fácil aplicação in vivo, que permitam uma expressão genética eficiente e estável em determinados órgãos alvos, ou a inibição dirigida ao alvo da expressão proteica de genes específicos.

Devido à multiplicidade de barreiras (membrana plasmática, endossoma, núcleo da célula) aquando da transferência de material genético para a célula, a transfecção de ADN é uma operação rara e pouco previsível. Assim, a insuficiente eficiência de transfecção dos vectores desenvolvidos até à data constitui um grande problema, visto que na injecção de ADN no tecido, uma grande parte das células no tecido alvo não é transfectada. Além disso, as células transfectadas com êxito exprimem as sequências de ADN transfectadas com uma força variável.

Em princípio, deverá ser feita uma distinção entre métodos 2 de transferência genética virais e não virais. Os métodos de transferência virais utilizam vírus geneticamente modificados, como veículo de transporte para o material genético. Dado que os vírus tipo selvagem e os vectores derivados destes também mostram normalmente uma boa especificidade de tecido, a par de uma elevada eficiência de transfecção, eles são actualmente os com mais frequência empregues na transferência genética.

Contudo, a sua utilização é acompanhada de riscos de segurança não desprezáveis, que se opõem de forma maciça à sua utilização na terapia genética. Assim, a possibilidade da recombinação dos componentes virais introduzidos com os vírus que existem naturalmente no paciente, representa um risco de segurança inerente. A partir desta recombinação descontrolada de vírus capazes de se multiplicarem e de outros incapazes de se multiplicarem, podem surgir novos vírus híbridos patogénicos. Do mesmo modo, as reacções imunológicas, que são provocadas pela imunidade anti-vector, são um efeito secundário de peso na utilização de vectores virais. Por conseguinte, a aplicação de uma grande dose de um adenovírus numa experiência clínica leva à morte do paciente, sendo evidentemente a causa disso uma forte reacção excessiva do sistema imunitário (Lehrman, 1999, "Nature" 401: 517 - 518). Os casos de doença por leucemia, depois da terapia com sistemas de transferência genética virais, mostram que os problemas também não se encontram actualmente ainda resolvidos e representam uma forte regressão na terapia genética (Buckley RH, 2002, Lancet 360: 1185-6) .

Estas desvantagens são prevenidas pelos sistemas de transferência genética não virais, que derivam normalmente 3 de plasmídeos e que também são denominados ADN "nu". Porém, estes também apresentam - além de taxas de transfecção bastante baixas e das taxas de expressão como isso também mais baixas das sequências transfectadas - uma falta de especificidade celular ou tecidular.

Outra desvantagem dos sistemas de transferência genética não virais conhecidos é a proporção relativamente grande de sequências de ADN bacterianas, que estão contidas nos plasmídeos. Estas provocam problemas consideráveis nos organismos alvos. Assim sendo, as sequências imunoestimulantes naturalmente existentes no plasmídeo ("ISS", por exemplo, dinucleótido não metilado de citosina-guanina, "CpG") levam à estimulação das células efectoras do sistema imunitário e, com isso, à libertação de interferonas e de citoquinas inflamatórias (Krieg, 2002, Annu Rev Immunol 20: 709-60) . Nos casos em que a produção de um fenótipo Thl imunológico não é desejável ou está até mesmo contra-indicado, dever-se-á evitar isto. A estes casos pertencem todas as doenças com componentes autoimunes, como o Lupus Eritematoso Sistémico ou a doença de Crohn, assim como uma multiplicidade de indicações para a terapia genética, que decorrem totalmente sem participação do sistema imunitário, como a doença metabólica mucoviscidose ou a falta de alfa-l-antitripsina.

Além disso, os plasmídeos já conhecidos contêm genes de resistência a antibióticos, que são necessários à sua selecção. Como consequência da possibilidade de uma recombinaçao com bactérias que existem ubiquamente no organismo, surge o risco da maior ocorrência de bactérias resistentes a antibióticos. Este aumento dos níveis de resistência a antibióticos é um grande problema em termos 4 de aplicações que são necessárias repetidas vezes do gene terapêutico, não sendo por isso defensável.

Coutelle et al. conseguiu, através da redução das sequências de ADN bacterianas nos plasmideos, produzir o denominado ADN de minicirculo, que levou em experiências in vitro a taxas de expressão até 10 vezes maiores em comparação com os plasmideos convencionais (Coutelle et al. , 2001, J of Biol. Chem. 25: 23018 - 23027) . Neste caso, empregou-se plasmideos que continham duas sequências de reconhecimento de uma recombinase. Visto que estas variedades de recombinação inseridas são de origem bacteriana, este tipo de vector também contém resíduos de ADN bacteriano, reduzindo-se mas não eliminado-se as desvantagens dos plasmideos convencionais. Uma transferência genética dirigida ao alvo também não é conseguida pelo minicirculo, visto que a estrutura do minicirculo não consegue atingir uma ligação específica e com isso controlada de ligandos mediadores de transferência. A patente US 6 143 530, também utiliza plasmideos com um teor reduzido de ADN de origem bacteriana. No entanto, o processo de fabrico aí referido também tem lugar recorrendo a recombinases bacterianas, condicionando assim a presença de sequências de ADN bacterianas que possam levar a processos inflamatórios induzidos por vectores.

Na patente US 6 265 218, é feita a descrição de um processo para o fabrico de um vector sem gene de marcação de selecção. Os vectores produzidos pelo processo reivindicado devem ser utilizados na terapia genética ou no fabrico de medicamentos farmacêuticos destinados à terapia genética. 5

Os vectores unicamente exequíveis nesta publicação, são produzidos mediante a utilização de um sistema de recombinase. Isto limita forçosamente os vectores de expressão que contenham sequências vectoriais.

Outro tipo de vectores não virais é representado por vectores de expressão fechados, apenas em parte de cadeia dupla, minimalistas. A representação deste tipo de vectores de expressão com topologia fechada de forma covalente, linear é mostrada no EP 0 941 318 BI. Estes vectores em forma de haltere têm apenas a informação sequencial absolutamente necessária à expressão do gene alvo, e previnem assim as desvantagens dos plasmídeos com sequências bacterianas. Uma desvantagem dos vectores de expressão em forma de haltere é a de induzirem uma menor expressão em proteínas terapêuticas, em comparação com os plasmídeos de cadeias duplas de ADN fechadas em círculo.

Para induzir uma resposta imunitária, como desejável na inoculação profilática ou terapêutica, estes vectores lineares são contudo claramente superiores aos plasmídeos convencionais, visto que levam a uma resposta imunitária significativamente melhorada em termos qualitativos e quantitativos (Lutz et ai., 2000, J Virol: 74 (22): 10447- 57) :

Para aumentar a eficiência de transfecção, conhece-se a transferência genética mediada por ligandos. Aos vectores ligam-se ligandos mediadores de transferência, como, por exemplo, o sinal de localização do núcleo (NLS, sequência de aminoácidos PKKKRKV) do vírus SV-40 ou a proteína transactivadora TAT do vírus HIV-1, de modo a forçar a entrada através da membrana celular e depois no núcleo da 6 célula. Devido a isto, procura-se imitar os mecanismos virais da entrada bem sucedida nas células e dotar os vectores não virais de sistemas eficientes de localização do alvo.

Assim, foi possível detectar um título de anticorpo 10 a 15 vezes superior numa experiência de imunização, depois de acoplamento do péptido NLS a uma cassete de expressão linear codificadora do HBsAg (Hepatitis small surface Antigen), em comparação com uma cassete de expressão não acoplada (Schirmbeck et al., J. Mol Med. 2001 Jun; 7 9 (5 -6): 343-50). Em termos de desvantagens, também aqui a taxa de expressão é claramente mais baixa, quando comparada com os vectores do estado da técnica.

Em resumo, deve salientar-se que, apesar dos muitos anos de investigação intensiva, não foi possível desenvolver vectores de ADN que apresentassem uma elevada eficiência de transfecção e que, ao mesmo tempo, pudessem ser empregues sem considerações de segurança na terapia genética ou na vacinação genética de humanos e animais. A partir deste estado da técnica, a presente invenção tem por objectivo arranjar um processo com o qual seja possível produzir vectores de expressão não virais, com uma elevada eficiência de transferência e de expressão; e ainda conseguir um respectivo vector de expressão e apresentar as possibilidades de utilização do mesmo. Neste caso, dever-se-á evitar as desvantagens dos sistemas de expressão virais conhecidos, que não empregues no âmbito da terapia genética. A presente invenção resolve este problema técnico, por meio 7 de um processo para o fabrico de um vector de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2, portanto, por meio de um vector de expressão de ADN (circular) em forma de anel, isento de ADN virai e bacteriano, circular, capaz de transfectar células de forma eficaz e dirigida ao alvo.

Um vector de expressão circular trata-se, no sentido da invenção, de um vector de ADN, que consiste somente numa cadeia dupla de ADN circular. 0 ADN de cadeia dupla consiste em pelo menos uma cassete de expressão, sendo a cassete de expressão composta por pelo menos um promotor, pelo menos uma sequência codificadora e, eventualmente, pelo menos uma sequência de poliadenilação. Convém que o vector não tenha - tendo em vista a protecção contra a decomposição de exonuclease - extremidades livres, sendo em vez fechado de forma anular.

Noutra forma de realização de acordo com a reivindicação 2, o vector está fechado de forma covalente através da utilização de um oligodesoxirribonucleótido, que fecha por covalência as extremidades do fragmento coesas da cassete de expressão cortada.

Este oligodesoxirribonucleótido pode apresentar uma ou mais bases modificadas, que permitem o acoplamento a um ou mais ligandos.

Em função da sequência do oligodesoxirribonucleótido utilizado, podem formar-se motivos estruturais discretos, que permitem uma acessibilidade livre e com isso melhor e mais eficiente ao ligando. Neste contexto, os ligandos deverão tratar-se também de péptidos, proteínas e/ou de outras moléculas orgânicas, por exemplo, moléculas de 8 açúcar e moléculas esteróides, que, ligados por covalência a vectores, levam a uma transfecção dirigida ao alvo e eficaz das células. A transfecção trata-se da introdução na célula de sequências de ácidos nucleicos por métodos biológicos, químicos ou físicos, que leva por consequência a uma expressão contínua ou temporária das transcrições de ARN de eficácia catalítica, ou das proteínas codificadas por estas sequências na célula transfectada. No entanto, também é possível introduzir os denominados vectores "anti-sentido", que por hibridização com o ARN mensageiro complementar impedem a translação e assim a expressão proteica.

Com o processo segundo a invenção, produz-se vectores de expressão genética circulares, modificados por ligandos, a partir de uma cadeia dupla de ADN corrente. Visto que as cassetes de expressão destes vectores de expressão segundo a invenção, se encontram limitadas aos mecanismos de controlo absolutamente necessários à expressão do gene terapêutico, encontram-se na sequência dos vectores apenas nucleótidos definidos com precisão, que não são nem de origem bacteriana nem virai. Isto reduz o tamanho do vector em 2-3 quilobases e tem a ver com a redução do teor de sequências de CpG em cerca de 90%. Os vectores de expressão produzidos pelo processo segundo a invenção, não podem ser ampliados a nível biológico, ou seja, não podem ser aumentados nem em células procarióticas nem em células eucarióticas.

Os vectores de expressão circulares segundo a invenção são isolados pela clivagem com uma endonuclease de restrição do tipo IIS, de preferência Eco 311, a partir de um plasmídeo 9 a isso adequado, que contém as sequências genéticas a serem expressas. 0 fragmento coeso originado, que contém a cassete de expressão, é depois fechado por ligação em forma de anel. Numa forma de realização, está ou estão acoplado (s) um ou mais ligandos a um ODN, que fecha as extremidades coesas do fragmento da cassete de expressão clivada. Na produção destes vectores ligados por péptidos, liga-se antes ao ODN por ligação covalente um ou mais ligandos mediadores de transferência. 0 ODN pode ser quimicamente modificado por uma ou mais funções alquilicas de ácido carboxílico, de amina, de tiol ou de aldeido. A cadeia principal de plasmideo, que é cortada numa digestão de restrição secundária por uma endonuclease de restrição, e para a qual não existe nenhuma sequência de reconhecimento na cassete de expressão, é enzimaticamente decomposta pela função de exonuclease da T7 ADN polimerase; e o vector de expressão do ADN, de acordo com a invenção, fechado, de cadeia dupla e circular que fica é purificado por uma etapa cromatográfica. Além disso, o vector de expressão pode ainda ser purificado por precipitação com isopropanol. Com este processo segundo a invenção, remove-se do vector de expressão todos os elementos sequenciais necessários à produção do plasmideo, logo também as sequências bacterianas ou virais. sequências sem

Através da redução para as informações sequenciais necessárias à expressão, é possível produzir o vector segundo a invenção numa nova dimensão reduzida. Assim, é possível o fabrico deste tipo de vectores dentro de gamas de tamanhos de 200 - 10 000 bp, de preferência 1 000 - 2 500 bp. Comparativamente a isto, o tamanho médio de um plasmideo convencional sem sequências genéticas 10 codificadoras é de 2 000 - 3 000 bp e, na maior parte dos casos, não pode ser reduzido por condições de fabrico. A ligação covalente dos ligandos ao ODN ocorre por meio de uma molécula de ligação e representa com isso uma ligação química definida. Constitui uma vantagem que os ligandos possam ser ligados em posições definidas ao vector de ADN. Está assim excluída uma possível perda funcional do promotor ou do gene funcional por ligação dos ligandos dentro de uma área funcionalmente sensível da sequência. Do mesmo modo, é com vantagem possível ligar ao vector de expressão vários ligandos independentes uns dos outros, por sua vez posicionados de forma definida. O presente processo segundo a invenção também pode encontrar-se, com vista à aplicação industrial simples, na forma de um kit destinado à produção do vector de expressão conforme a invenção. Um kit deste género inclui: (a) um plasmídeo, que contém as sequências de reconhecimento necessárias às enzimas de restrição, e se adequa à amplificação da cassete de expressão, (b) uma primeira mistura enzimática, composta por enzima de restrição e ligase, (c) uma segunda mistura enzimática, composta por enzima de restrição e polimerase, (d) um meio em princípio conhecido para a purificação do 11 vector de expressão, (e) meios de reacção usuais, tais como tampões, ATP, DTT, água, etc., (f) um vector de controlo para a comprovação funcional dos componentes do kit. A condição prévia para um kit deste género é a presença de uma sequência codificadora (opcional), que seja clonada com métodos usuais no plasmídeo (a).

Outras vantagens da invenção encontram-se descritas nas demais reivindicações, na descrição e nas figuras. A acção surpreendente do vector modificado por ligando, circular segundo a invenção, de uma cadeia dupla de ADN, assim como o processo em conformidade com a invenção, tornam-se claros a partir das figuras e dos exemplos de realização; assim sendo as figuras mostram:

Fig. 1: A representação esquemática do processo de fabrico dos vectores de ADN segundo a invenção circulares; com os significados: a) plasmídeo; b) Eco 311; c) ligante de oligonucleótido modificado por ligando; d) cassete de expressão; e) ADN residual bacteriano; 12 f) Eco 311; g) mistura de ADN residual bacteriano (e) e produto (i); h) T7 ADN polimerase; i) produto.

Fig. 2: A estruturação funcional dos vectores de ADN ligados por péptidos segundo a invenção, em que existem os seguintes significados: a) sequência do gene de expressão; b) região promotora; c) ligante de oligonucleótido modificado por ligando; d) poli(A)-sinal.

Fig. 3: A comparação da expressão in vitro do vector de acordo com a invenção, do plasmideo convencional e dum vector linear, com base na expressão da luciferase do pirilampo depois da transfecção de células K562, medida em riu (unidades de luz relativas). Neste caso, existem os seguintes significados:

Plasmideo = plasmideo pMOK, que codifica a luciferase; Vector lin = vector linear, que codifica a luciferase; Vector-2NLS circ = vector ligado por péptidos 2NLS segundo a invenção, circulares. 13

Fig. 4: A comparação da expressão in vitro do vector de acordo com a invenção, do plasmídeo convencional e de um vector linear, com base na expressão da luciferase de pirilampo depois de transfecção de células Hela, medida em riu (unidades de luz relativas). Neste caso, existem os seguintes significados:

Plasmídeo = plasmídeo pMOK, que codifica a luciferase; Vector lin = vector linear, que codifica a luciferase; Vector circ = vector segundo a invenção, circular, sem ligação peptídica.

Fig. 5: Expressão in vivo de vectores circulares e lineares que codificam o Lac-Z. Neste caso, existem os seguintes significados:

Vector lin = vector linear, que codifica o Lac-Z;

Vector-NLS lin = vector linear, ligado pelo péptido NLS, que codifica o Lac-Z;

Vector-NLS circ = vector ligado pelo péptido NLS, segundo a invenção e circular, que codifica o Lac-Z.

Fig. 6: Secreção de interferon-gama de esplenócitos estimulados em ratos. Neste caso, existem os seguintes significados:

Vector-NLS lin = vector, ligado pelo péptido NLS, linear, que codifica HbsAg;

Vector-NLS circ = vector segundo a invenção, ligado pelo péptido NLS, circular, que codifica HbsAg. A comprovação da expressão recorrendo ao gene repórter luciferase decorreu in vitro em duas linhas celulares 14 humanas. Para comparar as taxas de expressão, empregou-se o plasmídeo codificador da luciferase, um vector linear convencional e um vector segundo a invenção com e sem ligação peptídica. De forma surpreendente, consegue-se com o vector reivindicado com a modificação peptídica NLS (sinal de localização do núcleo com a sequência de aminoácidos PKKKRKV do vírus SV-40), uma taxa de expressão que é mais do dobro da que se consegue com o plasmídeo convencional (ver a fig. 3) . Do mesmo modo, o vector circular segundo a invenção sem modificação peptídica mostra uma clara vantagem de expressão em relação aos vectores do estado da técnica da fig. 4.

Para estudos in vivo, aplicou-se em ratos um vector codificador do gene Lac-Z segundo a invenção ou convencional. Com base na expressão quantitativa da β-galactosidase, ocorreu uma comparação da expressão induzida por vector da β-galactosidase. Neste caso, também é claramente vantajoso o vector segundo a invenção (denominado "vector-NLS circ") . Comparável aos resultados in vitro da fig. 3 e da fig. 4, também a taxa de expressão in vivo aumenta em mais de 50%, por meio dos vectores reivindicados (ver a fig. 5).

Outra experiência in vivo serve para estudar os processos imunológicos depois da inoculação com vectores lineares e de acordo com a invenção. Nesse intuito, inoculou-se ratos com os vectores de codificação do HBsAg e comparou-se o perfil de citoquina assim originado com base na libertação do interferon-gama (IFN-gama). O interferon-gama desempenha um papel-chave na resposta imunitária e na defesa anti-viral. Os vectores segundo a invenção são capazes, de acordo com a fig. 6, de induzir esplenócitos de secreção do 15 IFN-gama específico de antigénio, enquanto os vectores lineares não levam, com a baixa quantidade empregue de 5 μg de ADN de vector, à libertação do IFN-gama. Para a inoculação ou para a imunoterapia de diversas doenças, parece vantajosa a produção de uma reacção imunitária típica de Thl, verificando-se isto em particular no caso dos parasitas intracelulares, como leishmaniose e malária, e doenças virais como o HIV.

Além das vantagens do aumento significativo da expressão genética e da produção de uma resposta imunitária mediada a nível celular reforçada, este novo tipo de vectores não tem genes marcadores ou sequências de codificação de origem virai ou bacteriana, consistindo apenas em sequências directamente necessárias à expressão dos genes terapêuticos, e proporciona com isso a maior segurança possível aos pacientes. Por um lado, previne-se processos imunológicos ou inflamatórios indesejados, como os provocados por ADN bacteriano ou virai; por outro, a redução com isso relacionada do tamanho do vector parece levar com vantagem a uma maior taxa de transferência para o núcleo da célula.

Exemplo 1: Produção dos vectores circulares 0 plasmídeo pMOK-Luc foi totalmente digerido com a enzima de restrição Eco 311, durante 2 h nos 37 °C. Através da digestão de restrição, produziu-se dois fragmentos de ADN. Um era composto pelo gene de resistência à camicina e por outras sequências necessárias à propagação do plasmídeo em bactérias; o outro fragmento era composto pelas sequências que deveriam ser parte do vector segundo a invenção, nomeadamente o promotor CMV, da sequência genética a ser expressa e da sequência de poliadenilação do SV-40. Através 16 da enzima T4 ADN ligase (em tampão ligase: 400 mM de Tris-HC1, 100 mM de MgCÍ2, 5 mM de ATP) , ocorreu a ligação uma à outra das extremidades complementares produzidas pelo Eco 311 do fragmento de ADN que forma o vector, durante a noite nos 4 °C. A mistura resultante de ácidos nucleicos foi tratada com a enzima Eco 1471. Para decompor o ADN residual de origem vectorial, adicionou-se a enzima T7 ADN polimerase à mistura. A cassete de expressão circular permanecente foi purificada por cromatografia de permuta aniónica e foi precipitada com isopropanol. A figura 1 mostra neste ponto a representação esquemática do processo de fabrico dos vectores de ADN segundo a invenção circulares: através da digestão do plasmideo (a) com Eco 311 (b) , produz-se os fragmentos de ADN residual bacteriano (e) e cassete de expressão (d). Com a enzima T4 ADN ligase (f) e na presença da Eco 311 (f) , ocorre a ligação do ligante de oligonucleótido (c), modificado por ligando, a (d) . Esta mistura, composta por ADN residual bacteriano (g) e pelo produto (i) é tratada na última etapa (h) com T7 ADN polimerase e leva ao produto (i).

Exemplo 2a: Ligação de ligandos

Construiu-se cassetes de expressão circulares com ligação peptídica como se segue: o péptido NLS PKKKRKV (polina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina) foi ligado em duas etapas a opcionalmente um ou aos dois oligonucleótidos. Primeiro, activou-se o oligonucleótido modificado (5,-PH-d(GGGAACCTTCAGTxAGCAATGG ou 5,-PH-d(AGGGCCATTGCTxACTGAAGG, representando xT base timina aminomodifiçada com ligante amina C2) (0,1 mM) com sulfo-KMUS (5 mM) em tampão de ligação (50 mM de NaPC>4 e 75 mM de NaCl, 0,5x, pH = 7,6), nos 37 °C durante 2 h. A reacção foi 17 interrompida com 50 mM de tris-(hidroximetil)-aminometano (pH de 7,5), e o ODN activado foi obtido depois de precipitação com etanol (300 mM de NaOAc, pH de 5,2, 5,5 mM de MgCl2, 100% de etanol) , de centrifugação e de uma lavagem com 70% de etanol. O ODN (0,1 mM) assim obtido foi dissolvido em tampão de ligação (50 mM de NaP04 e 75 mM de NaCl, 0,5x, pH de 7,0) e reagiu com o péptido (0,2 mM) , durante 1 h nos 37 °C. A reacção foi analisada por meio de um gel desnaturado de poliacrilamida (20%) e coloração com brometo de etidio. O ODN ligado por NLS originado foi purificado por HPLC e utilizado na síntese dos vectores de expressão circulares.

Exemplo 2b: Produção dos vectores circulares com ligação peptídica 0 plasmídeo pMOK-Luc foi totalmente digerido com a enzima de restrição Eco 311, durante 2 h nos 37 °C. Através da digestão de restrição, obteve-se dois fragmentos de ADN. Por meio da enzima T4 ADN ligase, ocorreu a ligação, ao fragmento de ADN que forma o vector, dos oligodesoxinucleótidos 5' fosforilados complementares e anteriormente hibridizados nos 90 °C durante 3 min (TIBMolBiol, Berlim) 5'-PH-GGGAACCTTCAGTxAGCAATGG-3' e 5'PH-AGGGCCATTGCTxACTGAAGG-3' (xT representa base timina aminomodifiçada com ligante amina C2, a que se ligou por covalência o péptido de sinal NLS, opcionalmente através de uma molécula de ligante cruzado), na presença da enzima de restrição Eco 311, durante a noite nos 4 °C (ver o exemplo 1) . A mistura resultante de ácidos nucleicos foi tratada com a enzima T7 ADN polimerase. O produto foi purificado por cromatografia de permuta aniónica e precipitado com isopropanol. 18

Exemplo 3: Transfecgão das células, detecção da expressão Células da linha celular K562 foram transfectadas com o plasmídeo pMOK-Luc, com um vector linear e com o vector de acordo com a invenção, com ligação por ligando por electroporação. A realização foi numa preparação tripla, tendo-se empregue, depois de determinação prévia da concentração, 100 ng de ADN respectivamente. Por cada preparação, empregou-se 2,5 x 108 células/250 μΐ, que foram transfectadas nos 300 V e 1 050 μΕ. Depois de uma incubação por 24 h nos 37 °C, ocorreu a detecção da expressão por determinação da actividade da luciferase no luminómetro. Os resultados encontram-se representados na fig. 3.

Exemplo 4: Transfecgão com lipofectina

Em placas de 24 furos, fez-se a cultura de 40 000 células da linha celular humana Hela (20 000 células/cm2) , no dia antes da transfecção. As células foram transfectadas mediante a utilização de lipofectina com o seguinte ADN: plasmídeo pMOK, vector linear, vector circular sem ligação peptídica, por sua vez de codificação do gene repórter luciferase. A realização decorreu em preparação de 4 a 8 vezes, tendo-se empregue 800 ng de ADN respectivamente, depois de determinação prévia da concentração. O ADN foi incubado com o reagente de transfecção lipofectina em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) 45', nos 20 °C. Em seguida, ocorreu a transfecção por meio da adição da mistura de lipofectina-ADN às células. O período de incubação foi de 4 h nos 37 °C. Depois de uma troca do meio, foi feita a continuação da cultura das células durante 21 h nos 37 °C, a que se seguiu a detecção da expressão por meio de determinação da actividade da luciferase no luminómetro. Os resultados encontram-se representados na figura 4. 19

Exemplo 5: Injecção intratumoral de vectores de

codificação do Lac-Z

Três grupos, cada um com seis ratos, foram injectados intratumoralmente por um processo de injecção compressiva de vectores lineares e vectores circulares, com e sem ligação peptidica de codificação do gene Lac-Z. Os animais receberam ao todo 5 injecções. A concentração de ADN era por sua vez de 1 μg/μl. 48 h depois da última injecção, os animais foram mortos, o tumor foi retirado e foi conservado em nitrogénio liquido para mais análises. A preparação das células tumorais foi feita por homogeneização em 800 μΐ de tampão de lise (tampão de TE, pH = 8, contendo aprotinina = 10 mg/ml e PMSF = 10 μρ/ιηΐ) . Depois de centrifugação (14 000 rpm, 4 °C, 10 min) , obteve-se o produto de lise e realizou-se a determinação proteica recorrendo a um teste de Coomassie (Pierce, Rockford, EUA). A absorção foi determinada nos 595 nm. Os resultados são mostrados na fig. 5.

Exemplo 6: Secreção de interferon-gama depois de imunização com HBsAg

Ratos BALB/c com 6 a 8 semanas de idade foram imunizados i. d. com vectores de codificação do HBsAg (dissolvidos em 50 μΐ de 100 mM Na2P04) . Passadas 4 semanas, obteve-se o baço de dois ratos de cada grupo e isolou-se os esplenócitos. Os esplenócitos foram incubados com concanavalina A (ConA), com células que apresentam antigénio tratadas com mitomicina C (APC, como controlo negativo) e com APC's que tiveram contacto com o péptido HBsAg (controlo positivo), durante a noite nos 37 °C, sob 5% de CO2. As placas de 96 furos foram previamente revestidas com 8 μυ/ιηΐ de anticorpo IFN-gama anti-rato (Pharmingen). Depois da incubação, as 20 células foram removidas e deitou-se 100 μΐ de anticorpo IFN-gama anti-rato biotinilado (Pharmingen) com uma concentração de 2 μg/ml sobre a placa de 96 furos. Depois da incubação durante a noite nos 4 °C, as placas foram lavadas e procedeu-se a incubação depois da adição de 100 μΐ de uma diluição de 1 : 800 de avidin-peroxidase (Pharmingen), durante 1 h à temperatura ambiente. Através da adição de 100 μΐ de substrato DAB (Sigma), ocorreu a evolução. Passados 20 min, a reacção foi interrompida e os precipitados foram contados com um estereomicroscópio. Os resultados do controlo negativo foram retirados dos resultados do controlo positivo e determinou-se, assim, o número dos precipitados específicos de antigénio. Estes valores foram relacionados com os resultados dos esplenócitos incubados com ConA. Os resultados encontram-se representados na figura 6.

Lisboa, 29 de Novembro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o fabrico de um vector de expressão fechado em forma de anel, circular, constituído por uma cadeia dupla de ADN, processo esse que é composto pelas seguintes etapas: a) clivagem de uma sequência de ADN de cadeia dupla, por meio de uma digestão primária com endonucleases de restrição de um plasmídeo que pode ser amplificado em células procarióticas ou eucarióticas, b) em que os locais de clivagem limitam as sequências de uma cassete de expressão, composta por i. pelo menos uma sequência promotora, ii. pelo menos uma sequência de codificação e iii. pelo menos uma sequência de poliadenilação, directamente, sem bases intermédias, em ambos os lados, e c) posterior ligação intramolecular dos fragmentos de restrição originados, pelo que se origina na reacção de ligação uma cadeia dupla de ADN fechada de forma covalente (fecho em anel), a que se segue d) uma digestão secundária da mistura de reacção com uma endonuclease de restrição, que reconhece e cliva uma sequência de reconhecimento que não existe no vector de expressão a ser produzido, mas que surge pelo menos uma vez no resto do plasmídeo que pode ser biologicamente amplificado, e 2 e) decomposição simultânea ou seguida do resto de cadeia aberta do plasmídeo biologicamente replicável, com uma exonuclease especifica de extremidades de ADN 3' e 5', e f) purificação da cassete de expressão fechada em forma de anel, composta por uma cadeia dupla de ADN.

2. Processo para o fabrico de um vector de expressão fechado em forma de anel, circular, constituído por uma cadeia dupla de ADN, processo esse que é composto pelas seguintes etapas: a) clivagem de uma sequência de ADN de cadeia dupla, por meio de uma digestão primária com endonucleases de restrição de um plasmideo que pode ser amplificado em células procarióticas ou eucarióticas, b) em que os locais de clivagem limitam as sequências de uma cassete de expressão, composta por i. pelo menos uma sequência promotora, ii. pelo menos uma sequência de codificação e iii. pelo menos uma sequência de poliadenilação, directamente, sem bases intermédias, em ambos os lados, e c) posterior ligação intramolecular dos fragmentos de restrição originados, na presença de pelo menos um oligodesoxinucleótido, a que se encontra ligado pelo menos um ligando por covalência, através de modificação química, pelo que se origina na reacção de ligação uma 3 cadeia dupla de ADN fechada de forma covalente (fecho em anel), mediante inclusão do oligodesoxinucleótido, a que se segue d) uma digestão secundária da mistura de reacção, com uma endonuclease de restrição, que reconhece e cliva uma sequência de reconhecimento que não existe no vector de expressão a ser produzido, mas que surge pelo menos uma vez no resto do plasmídeo que pode ser biologicamente amplificado, e e) decomposição simultânea ou seguida do resto de cadeia aberta do plasmídeo biologicamente replicável, com uma exonuclease específica de extremidades de ADN 3' e 5', e f) purificação da cassete de expressão fechada em forma de anel, composta por uma cadeia dupla de ADN.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o oligodesoxinucleótido é quimicamente modificado por uma ou mais funções alquílicas de ácido carboxílico, de amina, de tiol ou de aldeído.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a digestão de restrição primária é realizada por uma ou mais endonucleases de restrição do tipo IIS, de preferência Eco 311.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a digestão de restrição secundária é preferencialmente realizada com a enzima Eco 1471. 4

6. Vector de expressão para o transporte de informação genética, composto por ADN de cadeia dupla, em que a) o vector de expressão é circular, fechado em forma de anel e está reduzido às informações sequenciais necessárias à expressão, e ainda b) o vector de expressão não pode ser amplificado em células procarióticas ou eucarióticas, e c) o vector de expressão consiste em pelo menos uma cassete de expressão de ADN de cadeia dupla, e em que uma cassete de expressão contém i. pelo menos uma sequência promotora, ii. pelo menos uma sequência de codificação e iii. pelo menos uma sequência de poliadenilação, e d) o vector de expressão inclui 200 a 10 000 bp.

7. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 6, tendo o vector de expressão pelo menos e preferencialmente 1 000 - 2 500 bp.

8. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 6 ou 7, contendo o vector de expressão pelo menos um oligodesoxinucleótido.

9. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 8, apresentando o oligodesoxinucleótido pelo menos uma base timina aminomodifiçada.

10. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 8 ou 5 9, em que o oligodesoxinucleótido pode ser quimicamente modificado por uma ou mais funções alquílicas de ácido carboxilico, de amina, de tiol ou de aldeído.

11. Vector de expressão de acordo com as reivindicações 6 a 10, estando ligado pelo menos um ligando por covalência ao oligodesoxinucleótido.

12. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 11, sendo o ligando um oligopéptido.

13. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 12, sendo o oligopéptido composto por 3 a 30 aminoácidos, em que pelo menos metade destes se trata dos aminoácidos básicos arginina e/ou lisina.

14. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 12, apresentando o oligopéptido uma sequência de localização do núcleo com a sequência de aminoácidos PKKKRKV.

15. Utilização do vector de expressão em conformidade com uma ou mais das reivindicações anteriores, no fabrico de vacinas.

16. Utilização do vector de expressão em conformidade com uma ou mais das reivindicações anteriores, como componente de um kit. Lisboa, 29 de Novembro de 2006