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CCN1 (CYR61) ist ein Mitglied der Gruppe matrizellulärer Proteine. CCN1 ist impliziert in Mechanismen der Zelladhäsion, Zellmigration und Angiogenese.
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EP0888452B1 zeigt die Sequenzen für cyr61 des Menschen. Die Anwendung von CCN1/CYR61 im medizinischen Bereich ist in verschiedenen Zusammenhängen vorgeschlagen worden; die Indikationen sind dabei durch die genannten Eigenschaften von CCN1 bestimmt, Zelladhäsion, Zellmigration und Angiogenese positiv zu beeinflussen.
US2004/0023910 zeigt die Anwendung erhöhter cyr61-Expression bei uterinem Leinmyom.
EP2022511A1 zeigt die Verwendung von CCN1 als Beschichtung von Implantaten. Ebenfalls wird berichtet, dass CCN1 Kardiomyozyten vor oxidativem Stress z. B. bei Infarkten über die Modulation des Beta1-Integrin-Akt Signalwegs schützt.
WO200198359A2 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs durch Hemmung von CYR61.
WO2004093911A1 zeigt die Kontrolle der Expression von CYR61 zur Behandlung von Hypertrophie und Neoplasie der Prostata.
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Über eine Implikation von CCN1 in immunologischen Mechanismen ist wenig bekannt. Wenn, wurde CCN1 als Verstärker der Wirkung von Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFa) gezeigt (Chen u. Lau, J. Cell Commun. Signal. Nov 7, 2009; Chen et al., EMBO J. 2007, 26, 1257–67). In Patienten mit Morbus Krohn und Colitis Ulcerosa wurde eine erhöhte Expression von CCN1 gefunden (Koon et al., Am. J. Pathol. 173, 400 ff.).
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Eine Vielzahl von Erkrankungen beruht auf einer Fehlsteuerung der Vorgänge, die mit der Migration, Aktivierung und Desaktivierung von Immunzellen zusammenhängen. Rheumatoide Arthritis, Auto-immun-Myokarditis, Colitis Ulcerosa, Morbus Krohn oder Diabetes Typ 1 sind nur einige der medizinisch und volkswirtschaftlich schwer wiegenden Indikationen, in denen fehlgeleitete Entzündungsreaktionen kausal impliziert sind. Auch die Abstoßungsreaktion von Transplantaten allogener Spender gehört zu den immunologischen Reaktionen, deren Steuerung bzw. Unterdrückung aus medizinischer Sicht wünschenswert ist.
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Eine Vielzahl von Mitteln zur pharmakologischen Intervention bei Entzündungserkrankungen ist bekannt, allerdings weisen diese Nebenwirkungen auf.
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Der vorliegenden Erfindung liegt das Problem zu Grunde, Modulatoren der Immunreaktion und Entzündung zur Verfügung zu stellen.
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Dieses Problem wird gelöst durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Arzneimittel zur Prävention oder Therapie von entzündlichen Erkrankungen oder Dysfunktionen des Immunsystems zur Verfügung gestellt, welches die Polypeptidsequenz des CCN1 (CYR61) oder eine funktionell äquivalente Polypeptidsequenz mit mindestens 85% Sequenzidentität, bevorzugt 90% Sequenzidentität, noch bevorzugter 95% Sequenzidentität, umfasst.
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Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann die Polypeptidsequenz des CCN1 (CYR61) durch Fusion mit stabilisierenden Polypeptid- oder Proteinsequenzen zu einem CCN1-Fusionsprotein stabilisiert werden. Eine solche stabilisierende Sequenz ist der Fc-Teil des gamma-Immunglobulins. Beispiele für deren Verwendung zur Stabilisierung von Proteinen sind in der
WO01/03737 gezeigt.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann die Polypeptidsequenz des CCN1 (CYR61) oder das CCN1-Fusionsprotein durch kovalente Modifikation mit reaktiven Gruppen wie Sialinsäuren stabilisiert werden.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann die Polypeptidsequenz des CCN1 (CYR61) oder das CCN1 Fusionsprotein durch gerichtete Mutation von Protease-Schnittstellen stabilisiert werden.
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Alternativ kann das erfindungsgemäße Arzneimittel ein zyklisches RGD-Peptid enthalten. Bevorzugt ist dabei Cyclo(-Ala-Arg-Gly-Asp-3-aminomethylbenzoyl) oder dessen funktionelle Äquivalente. Ebenso kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittel eine Kombination von CNN1-Polypeptid und zyklischen RGD-Peptiden enthalten.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Arzneimittel zur Prävention oder Therapie von entzündlichen Erkrankungen oder Dysfunktionen des Immunsystems zur Verfügung gestellt, welches eine Nukleinsäuresequenz zur Expression der Polypeptidsequenz des CCN1 (CYR61) gemäß vorstehender Definition umfasst.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz zur Expression der Polypeptidsequenz des CCN1 (CYR61) eine DNA-Sequenz. Besonders bevorzugt sind dabei DNA-Sequenzen unter Kontrolle eines in menschlichen Zellen operablen RNA-Polymerase-II-Promotors, wie beispielsweise des immediate-early-CMV-Promotors oder des SV40-Promotors.
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DNA-Expressionskonstrukte zur Expression von CCN1-kodierenden Nukleinsäuren sind bekannt. Dies können sog. „nackte” zirkuläre DNA-Plasmide, welche zur Vermehrung der DNA in Bakterien notwendige Sequenzabschnitte tragen, oder lineare oder zirkuläre Konstrukte sein, welche nur die zu exprimierende Sequenz sowie die notwendigen Promotor- und Terminatorsequenzen tragen (
EP0967274 ;
EP1631672 ).
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Weiterhin sind als Vektoren für therapeutische Nukleinsäuren zahlreiche modifizierte Viren bekannt, wobei Adenoviren und Adenoassoziierte Viren (AAV) am häufigsten verwendet werden. Es können auch Nanopartikel auf Basis von AAV-Vektoren als Gentransfervehikel eingesetzt werden. Ebenfalls ist bekannt, Gentransfervektoren einzusetzen, die auf Lentiviren oder Herpesviren beruhen.
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Bevorzugt ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels bei Krankheiten, die mit myokardialer oder kardiovaskulärer Inflammation assoziiert sind, wie kardiale Virusinfektionen und inflammatorische Kardiomyopathien.
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Weiterhin kann das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Behandlung von Autoimmun-Myokarditis und weiteren Autoimmunerkrankungen sowie im Rahmen von Transplantionen eingesetzt werden.
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Der vorliegenden Erfindung liegt der überraschende Befund zugrunde, dass erstens CCN1 auf verschiedene Immunzellen chemotaktisch wirkt, jedoch insbesondere Monozyten gegenüber chemotaktischen Stimuli unempfindlich werden, wenn sie länger CCN1 ausgesetzt waren. Dabei betrifft diese Unempfindlichkeit nicht nur die Stimulation durch CCN1 selbst, sondern auch Stimuli anderer pathogenetisch wichtiger Chemokine wie SDF-1, MCP-1 oder MIP-1a.
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Ein weiteres Ergebnis der Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, ist, dass CCN1 in physiologisch relevanten Konzentrationen im Blut zirkuliert. CCN1 kommt dadurch die Rolle eines Signalmoleküls zu, welches den funktionellen Status des zellulären Immunsystems modifiziert, und eröffnet die Möglichkeit der therapeutischen Modulation der Immunzell-Chemotaxis durch CCN1. Dies macht die überraschenden Eigenschaften des CCN1 der Nutzung als Mittel der pharmakologischen Intervention zugänglich.
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Überexpression von CCN1 verbessert das klinische Bild der experimentell induzierten auto-immun-Myokarditis (EAM). Mit CCN1-Vektoren behandelte Tiere zeigen deutlich reduzierte Einwanderung von Monozyten und Lymphozyten in den Herzmuskel. Dabei bleiben die Expressionsniveaus der Chemokin- bzw. Rezeptorexpression der Herzmuskelzellen unberührt von der CCN1-Expression, und das rekombinante Molekül bindet ebenso wenig an Herzzellen. Der Mechanismus des CCN1-Effektes ist vielmehr eine Modulation der Reaktivität von Immunzellen hinsichtlich chemotaktischer Stimuli. Dies betrifft eine breites Spektrum entzündungsrelevanter Chemokine, SDF-1, MCP-1 oder MIP-1a.
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Die Wirkung von CCN1 auf die Zellmigration verläuft danach biphasisch ab. Initial werden Immunzellen stimuliert, doch bereits nach kurzer Exposition werden sie refraktär gegenüber der Wirkung der genannten chemotaktischen Proteine und auch gegenüber CCN1 selbst. Dies eröffnet die Anwendung für therapeutische Zwecke, unteranderem die therapeutische Beeinflussung von immunpathologischen Prozessen wie der Autoimmun-Myokarditis. Die therapeutische Wirkung beruht hier auf der Suppression der Migration pathogenetisch wirksamer Immunzellen in das im Rahmen des Autoimmunprozesses geschädigte Organ.
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Aufgrund seiner Überexpression bei Gewebeschädigung und Remodelling und dem Befund, dass CCN1 im Blut zirkuliert, kann CCN1 auch als diagnostischer und prognostischer Marker eingesetzt werden. CCN1 wird dazu im Serum mittels ELISA bestimmt.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 zeigt die Konstruktion eines Adenoviralen Vektors zur Expression rekombinanten CCN1-Proteins (A) sowie Western-Blots des rekombinanten Proteins (F)
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2 zeigt die Ergebnisse der Behandlung von Mäusen mit experimentell induzierter autoimmun-Myokardiopathie mit CCN1-exprimierendem Adenovirus
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3 zeigt Experimente zur Migration von Lymphozyten mit und ohne Prä-Stimulation durch CCN1.
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4 zeigt die chemotaktische Wirkung von CCN1, SDF-1α und MCP-1 auf monozytische THP1-Zellen.
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Beispiele
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Entwicklung adenoviraler CCN1-Vektoren
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Murine CCN1 cDNA wurde vom Vektor pAdTrackCMV amplifiziert (NM_010516 [194-1333]). Das PCR-Produkt wurde durch gerichtete Rekombination in das adenovirale Transferplasmid pZS2 gebracht (AdV-mCCN1, das Konstrukt ist in 1A oberes Bild gezeigt). Das rekombinante Plasmid pZS2-mCCN1 wurde in den langen Arm des Adenovirus-Stamm RR5 ligiert und das Produkt in Zellen der Linie HEK293 transfiziert. Der rekombinante Adenovirus AdV-CMV-mCCN1 wurde amplifiziert und durch Cäsiumgradienten-Ultrazentrifugation gereinigt. Zur Kontrolle wurde ein mit Hemaglutinin (HA) markiertes (Epitop YPYDVPDYA) rekombinantes CCN1 produzierender Stamm erzeugt (AdV-mCCN1-HA, 1A unteres Bild).
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Der Verbleib der rekombinanten Proteine wurde in vivo verfolgt. AdV-mCCN1 bzw. AdV-mCCN1-HA wurde in EAHy926 Zellen exprimiert. CCN1 Protein konnte durch Western-Blot in Seren damit behandelter Mäuse als Banden des Molgewichts 50–42 kDa, entsprechend glykosyliertem CCN1 voller Länge bzw. dem unglycosilierten, sowie einem 21 kDa Fragment, welches durch Verdau durch Plasmin entstanden ist, nachgewiesen werden (1F).
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Experimentell induzierte Autoimmun-Myokarditis (EAM)
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Um den Effekt systemischer Überexpression von CCN zu untersuchen, wurden Mäusen i. v. CCN1-exprimierenden Vektoren oder Kontrollvektoren gespritzt. Die Tiere wurden sodann mit MyHC-α immunisiert, was EAM induziert. Wie in 2B gezeigt, bewirkt die Behandlung mit CCN1 eine signifikante Abnahme der nach histologischen Parametern bewerteten Schwere der Erkrankung, wobei der Vergleich zu unbehandelten Herzen zum Zeitpunkt der maximalen Stärke der Ausprägung der EAM drei Wochen nach Immunisierung erfolgt.
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2B zeigt dabei die Bewertung der Schwere der Myokarditis nach Sichtung von Haematoxylin-Eosin Schnitten durch eine semiquantitative Skalierung von 0 bis 4, wobei 0 der Abwesenheit inflammatorischer Infiltrate entspricht, 1 kleinen Foci inflammatorischer Zellen zwischen den Myozyten, 2 größeren Foci von 100 inflammatorischen Zellen, 3 einer Beteiligung von mehr als 10% eines Schnittes und 4 mehr als 30%. Die Schwere der Erkrankung war in CCN1-behandelten Tieren (CCN1, n = 10) gegenüber Kontrollen (RR5, n = 12) signifikant (** p < 0.01) reduziert.
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2D zeigt dabei Migrationsuntersuchungen von Splenozyten, welche aus Mäusen zum Zeitpunkt maximaler Entzündungsreaktion entnommen wurden (3 Wochen nach der zweiten Immunisierung). CCN1-behandelte Tiere (n = 6) zeigten dabei im Vergleich zu Kontrolltieren (n = 6) eine significant (** p < 0.01) erniedrigte Migration von Monozyten (linke Tafel) und Lymphozyten (rechte Tafel). Die Versuche wurden in Kulturschalen mit übereinander liegenden Medienvolumina, die durch eine permeable Membran verbunden sind, durchgeführt (Transwell-Schalen).
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Beispiel 3: Migrationsassays in humanen Immunzellen
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Wie in 3A gezeigt, ist die basale Migration (Zellzahlen) in frisch isolierten humanen CD14-positiven Zellen signifikant (** p < 0.01) erniedrigt, wenn die Zellen 24 h mit Medium präinkubiert werden, welches CCN1 einer Konzentration von 200 ng/ml enthielt (n = 12).
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3B zeigt, wie längere Exposition gegenüber CCN1 (+CCN1 24 hPre) dazu führte, dass die Chemotaxis-stimulierenden Effekte von CCN1 selbst, sowie die der Chemokine MCP-1 and MIP-1 erloschen. Nach Präinkubierung über 24 h mit 200 ng/ml CCN1 konnten die Chemokine keine Chemotaxis mehr stimulieren (* p < 0.05, ** p < 0.01). Die Daten sind mit den in 2D vergleichbar.
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Dieser Effekt ist auch in 3C bei Untersuchung von präinkubierten Monozyten der Linie THP1 erkennbar.
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Beispiel 4: Zyklische RGD-Peptide sind CCN1-mimetische Wirkstoffe
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4A zeigt die chemotaktische Wirkung von CCN1, SDF-1α und MCP-1 auf monozytische THP1-Zellen, jeweils bei einer Konzentration von 200 ng/ml. Vorherige Inkubation mit CCN1 bei 200 ng/ml (CCN1-Pre) führte zu einer signifikanten (* p < 0.05, ** p < 0.01) Unterbrechung der chemotaktischen Effekte von CCN1, SDF-1α und MCP-1 (linke Tafel). Vergleichbare Ergebnisse können durch Präinkubation mit 10 μM eines cRGD Peptids erzielt werden (rechte Tafel) (n = 9–12).
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4B zeigt die Dosisabhängigkeit dieses Effekts.
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Be idem verwendeten cyclischen RGD-Peptid handelt es sich um Cyclo(-Ala-Arg-Gly-Asp-3-aminomethylbenzoyl), erhältlich bei Bachem Nr: H-4772, ein bekanntes Synonym für die Verbindung ist XJ735.
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Bezugszeichenliste
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Fig. 1:
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- 1 – Ad5 5'-ITR
- 2 – CMV Promotor
- 3 – CCN1 cDNA
- 4 – bGH TS
- 5 – XBaI*
- 6 – Ad5 3'-ITR
- 7 – HA tag
- 8 – SalI
- 9 – unbehandelt
- 10 – RR5
- 11 – AdV-CCN1
- 12 – kDa
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Fig. 2
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- 20 – Schweregrad der Erkrankung
- 21 – RR5 Δ
- 22 – CCN1
- 23 – Mittel
- 24 – Monozyten Migration [× 103 Zellen]
- 25 – Lymphozyten Migration [× 103 Zellen]
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Fig. 3
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- 30 – Zell-Anzahl Migration CD14+ [+ SEM]
- 31 – 24 h basale Migration
- 32 – 24 h CC1-Pre
- 33 – Verhältnis der Migration CD14+ zur Kontrolle [+ SEM]
- 34 – CCN1 24 h Pre
- 35 – Mittel
- 36 – CCN1
- 37 – MCP1
- 38 – MIP1α
- 39 – Verhältnis der Migration THP1 zur Kontrolle [+ SEM]
- 40 – SDF1α
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Fig. 4
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- 41 – Verhältnis THP1 Migration zu nicht-stimuliert [Mean + SEM]
- 42 – CNN1-Pre [h]
- 43 – CNN1
- 44 – SDF1α
- 45 – MCP1
- 46 – cRGD4227-Pre [μM] CCN1-Pre
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 0888452 B1 [0002]
- US 2004/0023910 [0002]
- EP 2022511 A1 [0002]
- WO 200198359 A2 [0002]
- WO 2004093911 A1 [0002]
- WO 01/03737 [0009]
- EP 0967274 [0015]
- EP 1631672 [0015]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Chen u. Lau, J. Cell Commun. Signal. Nov 7, 2009 [0003]
- Chen et al., EMBO J. 2007, 26, 1257–67 [0003]
- Koon et al., Am. J. Pathol. 173, 400 ff. [0003]
