ES2250999T3

ES2250999T3 - Expresion en alto grado de la proteina verde fluorescente.

Info

Publication number: ES2250999T3
Application number: ES96935882T
Authority: ES
Inventors: Brian Seed; Jurgen Haas
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2016-09-20
Also published as: CA2231394A1; US5795737A; EP0851868B1; ATE310015T1; WO1997011086A1; JPH11511334A; DE69635452T2; EP0851868A4; EP0851868A1; DE69635452D1; JP4185164B2; DK0851868T3

Abstract

LA INVENCION CARACTERIZA UN GEN SINTETICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA NORMALMENTE EXPRESADA EN UNA CELULA DE MAMIFERO O EN UNA CELULA EUCARIOTA EN DONDE AL MENOS UN CODON NO PREFERIDO O MENOS PREFERIDO EN EL GEN NATURAL QUE CODIFICA LA PROTEINA DEL MAMIFERO HA SIDO REEMPLAZADO POR UN CODON PREFERIDO QUE CODIFICA EL MISMO AMINOACIDO.

Description

Expresión en alto grado de la proteína verde fluorescente.

Campo de la invención

La invención se refiere a un gen que codifica la proteína verde fluorescente de la medusa Aequorea Victoria y a métodos para expresarla en alto grado en células eucariotas.

Antecedentes de la invención

La expresión de productos génicos eucariotas en procariontes está limitada a veces por la presencia de codones que se emplean de forma infrecuente en E. coli. La expresión de tales genes se puede potenciar mediante la sustitución sistemática de los codones endógenos por codones hiper-representados en genes procariotas de expresión elevada (Robinson y col., 1984). Se supone en general que los codones raros provocan una detención del ribosoma, lo que conduce a un fallo para concluir la cadena polipeptídica naciente y un desemparejamiento de la trascripción y la traducción. El extremo 3' del ARNm del ribosoma detenido se expone a ribonucleasas celulares que disminuyen la estabilidad del transcrito.

Sumario de la invención

La invención caracteriza un gen que codifica la proteína verde fluorescente de la medusa Aequorea Victoria, en donde al menos 50% de los codones no preferidos y menos preferidos en el gen natural se han sustituido por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido, seleccionándose dichos codones preferidos entre el grupo que consiste en gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac y gtg, seleccionándose dichos codones menos preferidos entre el grupo que consiste en ggg, att, ctc, tcc y gtc, siendo dichos codones no preferidos, todos los codones distintos de dichos codones preferidos y dichos codones menos preferidos, en donde dicho gen permite incrementar la expresión de dicha proteína verde fluorescente en una célula hospedadora de mamífero, cuando se compara con dicho gen natural en un sistema de cultivo de células de mamífero in vitro, bajo condiciones
idénticas.

Los codones preferidos son: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac); Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac); y Val (gtg). Los codones menos preferidos son: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc).Todos los codones que no encajan con la descripción de los codones preferidos o los codones menos preferidos son codones no preferidos. En general, el grado de preferencia de un codón en particular se indica por la prevalencia del codón en genes humanos con expresión elevada, tal y como se indica en la Tabla 1 con el encabezamiento "Alto". Por ejemplo, "atc" representa el 77% de los codones de Ile en genes de mamíferos con expresión elevada y es el codón preferido para Ile; "att" representa el 18% de los codones de Ile en genes de mamífero con expresión elevada y es el codón para Ile menos preferido. La secuencia "ata" representa sólo el 5% de los codones de Ile en genes humanos con expresión elevada y por ello es un codón no preferido. La sustitución de un codón por otro codón que es más prevalente en genes humanos muy expresados, generalmente incrementará la expresión del gen en las células de mamífero. Por consiguiente, la invención incluye la sustitución de un codón menos preferido por un codón preferido, así como la sustitución de un codón no preferido por un codón preferido o un codón menos preferido.

La invención se refiere adicionalmente a un método para preparar un gen tal, que comprende

(a): identificar los codones no preferidos y menos preferidos en el gen natural que codifica la proteína verde fluorescente de la medusa Aequorea Victoria y

(b): sustituir al menos 50% de dichos codones no preferidos y menos preferidos por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido, seleccionándose dichos codones preferidos entre el grupo consistente en gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac y gtg, seleccionándose dichos codones menos preferidos entre el grupo consistente en ggg, att, ctc, tcc y gtc, siendo dichos codones no preferidos todos los codones distintos de dichos codones preferidos y dichos codones menos preferidos.

Por "proteína que se expresa normalmente en una célula de mamífero" se entiende una proteína que se expresa en mamíferos bajo condiciones naturales. La expresión incluye genes en el genoma de mamíferos, tales como el Factor VIII, el Factor IX, las interleuquinas y otras proteínas. La expresión también incluye genes que se expresan en una célula de mamífero bajo condiciones de enfermedad, tales como oncogenes, así como genes que son codificados por un virus (incluyendo un retrovirus) que se expresan en células de mamífero después de la infección. Por "proteína que se expresa normalmente en una célula eucariota" se entiende una proteína que se expresa en un eucarionte bajo condiciones naturales. La expresión también incluye genes que se expresan en una célula de mamífero bajo condiciones de enfermedad tales

En realizaciones preferidas, el gen es capaz de expresar la proteína de mamífero o eucariota en un grado de al menos 110%, 150%, 200%, 500%, 1.000%, 5.000% o 10.000% del expresado por dicho gen natural en un sistema de cultivo de células de mamífero in vitro, bajo condiciones idénticas (es decir, mismo tipo celular, mismas condiciones de cultivo, mismo vector de expresión).

Los sistemas de cultivo celular adecuados para medir la expresión del gen y del gen natural correspondiente, se describen más abajo. Otros sistemas de expresión adecuados que emplean células de mamífero son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los libros de consulta de biología molecular convencionales, mencionados más abajo. Los vectores adecuados para expresar los genes sintéticos y naturales se describen a continuación y en los libros de consulta convencionales descritos a continuación. Por "expresión" se entiende la expresión de una proteína. La expresión se puede medir empleando un anticuerpo específico para la proteína de interés. Tales anticuerpos y técnicas de medición son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por "gen natural" se entiende la secuencia génica (que incluye las variantes alélicas presentes en la naturaleza) que codifica la proteína en la naturaleza.

En otras realizaciones preferidas, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de los codones en el gen natural, son codones no preferidos.

La invención también muestra un método para preparar un gen que codifica una proteína que se expresa normalmente en una célula de mamífero o en otra célula eucariota. El método incluye identificar los codones no preferidos y menos preferidos en el gen natural que codifica la proteína y sustituir uno o varios de los codones no preferidos y menos preferidos por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido que el codón sustituido.

En ciertas circunstancias (p. ej., para permitir la introducción de un sitio de restricción) puede ser deseable sustituir un codón no preferido por un codón menos preferido, en lugar de un codón preferido.

No es necesario sustituir todos los codones menos preferidos o no preferidos por codones preferidos. Se puede conseguir una expresión incrementada incluso con una sustitución parcial. En ciertas circunstancias, puede ser deseable sustituir sólo parcialmente los codones no preferidos por codones preferidos o menos preferidos para obtener un grado medio de expresión.

En otras realizaciones preferidas, la invención muestra vectores (que incluyen vectores de expresión) que comprenden uno o varios de los genes sintéticos.

Por "vector" se entiende una molécula de ADN, obtenida, p. ej., a partir de un plásmido, bacteriófago o de un virus de mamífero o de insecto, en la que se pueden insertar o clonar fragmentos de ADN. Un vector contendrá uno o varios sitios de restricción únicos y puede ser capaz de una replicación autónoma en un hospedador definido o en un organismo de vehículo, de modo que la secuencia clonada es reproducible. Por tanto, por "vector de expresión" se entiende cualquier elemento autónomo capaz de dirigir la síntesis de una proteína. Tales vectores de expresión de ADN incluyen plásmidos de mamífero y virus.

La invención también caracteriza fragmentos génicos que codifican una parte deseada de la proteína. Tales fragmentos génicos sintéticos son similares a los genes sintéticos de la invención, exceptuando que codifican sólo una parte de la proteína. Tales fragmentos génicos codifican preferentemente al menos 50, 100, 150 o 500 aminoácidos contiguos de la proteína.

Al construir los genes de la invención puede ser deseable evitar las secuencias CpG, ya que estas secuencias pueden causar silenciamiento génico.

Los genes de la invención se pueden introducir en las células de un organismo vivo. Por ejemplo, los vectores (víricos o no víricos) se pueden utilizar para introducir un gen en células de un organismo vivo para la terapia génica.

Por otro lado, puede ser deseable sustituir los codones preferidos en un gen presente en la naturaleza por codones menos preferidos, como un medio de disminuir la expresión.

Los libros de consulta convencionales que describen los principio generales de la tecnología de ADN recombinante incluyen Watson, J.D. y col., Molecular Biology of the Gene, volúmenes I y II, the Benjamin/Cummings Publishing Company Inc. editor, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J. E. y col., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc. editor, Nueva York, N.Y. (1986); Old, R. W. y col., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2ª edición, University of California Press, editor, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T., y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory , editor, Cold Spring Harbor, NY (1989); y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Wiley Press, Nueva York, NY (1992).

Descripción detallada Descripción de los dibujos

El documento de patente internacional WO 86/07595 describe un factor de crecimiento fibroblástico básico, sustancialmente puro (bFGF), un polipéptido con 146 residuos de aminoácidos. La secuencia de residuos de aminoácidos de bFGF se describe también como una cadena de ADN que codifica el polipéptido. Insertando de forma adecuada una cadena de ADN sintetizada en un vector de clonación y empleando el vector de clonación para transformar las células, se puede obtener bFGF sintético a partir de líneas celulares transformadas, tanto procariotas como
eucariotas.

En el documento de patente de EE.UU. nº 5.270.171 se describe que se ha aislado un factor de reconocimiento del cáncer (factor SCM) útil en la interpretación de la complejidad espacial del ensayo de la matriz citoplásmica (SCM), que se ha purificado hasta una homogeneidad sustancial y que se ha caracterizado.

En el documento de patente internacional WO 95/07463 se describe una célula que comprende una molécula de ADN que tiene un elemento regulador procedente de un gen distinto de un gen que codifica una proteína verde fluorescente, ligada funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica la proteína verde fluorescente. Esta invención también proporciona organismos vivos que comprenden la célula descrita anteriormente. Esta invención también proporciona un método para seleccionar células que expresan una proteína de interés que comprende: a) introducir en las células una molécula de ADNI que tenga una secuencia de ADN que codifica la proteína de interés y una molécula de ADNII que tenga la secuencia de ADN que codifica una proteína verde fluorescente; b) cultivar las células introducidas bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína verde fluorescente y la proteína de interés; y c) seleccionar las células cultivadas que expresan la proteína verde fluorescente, seleccionando para ello las células que expresan la proteína de interés. Finalmente, esta invención proporciona varios usos de la proteína verde fluorescente.

Coulombe y Skup (Gene 46, 89-95, 1986) han construido un gen del interferón (IFN) recombinante cuya región codificadora es un gen (HU)IFN-\alpha_{1} humano, sintetizado químicamente que codifica la misma proteína que su duplicado natural, aunque posee modificaciones importantes. Estas modificaciones se introdujeron para: (1) cambiar el uso de los codones, (2) destruir la integridad de los oligodesoxinucleótidos repetidos y complementarios en la región codificadora, (3) introducir un intrón, (4) sustituir otras secuencias por las secuencias que flanquean en 3' y 5', específicas de IFN y (5) eliminar la secuencia líder (que codifica el péptido señal). Coulombe y Skup describen, además, la transfección y el aislamiento de células de múridos que contienen inserciones con bajo número de copias del gen recombinante. Estas líneas mantienen un alto grado de estado en equilibrio de HuIFN-\alpha biológicamente activa en el citoplasma, producida a partir de ARNm de M_{r} esperada para los transcritos procesados correctamente. Estos resultados muestran directamente que la secuencia líder es esencial para la secreción de las proteínas de IFN. También argumentan en contra de un papel crucial de las características particulares de la secuencia transcrita del gen
HuIFN-\alpha_{1} natural para regular su expresión.

Haseloff y Amos (Trends in Genetics, vol. 11, nº 8, 1 de agosto de 1995, pág. 328-329) informan sobre el uso de GFP en plantas.

En el documento de patente internacional WO 96/27675 se describe una secuencia de ADN que codifica la Proteína Verde Fluorescente (GFP), estando modificada la secuencia en relación con la secuencia de tipo silvestre de modo que permite una expresión más eficaz de un polipéptido GFP funcional en una célula vegetal. También se describe un polipéptido de GFP modificado que comprende una sustitución de aminoácidos, en relación con la secuencia de la proteína de tipo silvestre que muestra características útiles cuando se expresa en muchos tipos diferentes de célula hospedadora.

El documento de patente internacional WO 96/09378 se refiere a un gen sintético que codifica una proteína que se expresa normalmente en células de mamífero, en donde al menos un codón no preferido o un codón menos preferido en el gen natural que codifica la proteína de mamífero, se ha sustituido por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido.

La Figura 1, panel A es una fotografía de células COS transfectadas sólo con un vector que muestra la falta de fluorescencia de GFP. La Figura 1, panel B es una fotografía de células COS transfectadas con un plásmido de expresión CDM7 que codifica GFP natural preparada por ingeniería genética, para que incluya una secuencia de iniciación de la traducción de consenso. La Figura 1, panel C es una fotografía de células COS transfectadas con un plásmido de expresión que tiene las mismas secuencias flanqueantes y de consenso para la iniciación que en la Fig. 1, panel B, pero que son portadoras de una secuencia génica optimizada del codón. La Figura 1, panel D es una fotografía de células COS transfectadas con un plásmido de expresión como en la Fig. 1 panel C, pero que es portador de una Thr en el residuo 65 en lugar de Ser.

La Figura 2 muestra una secuencia de ADN que codifica la GFP de la medusa Aequorea Victoria.

Descripción de las realizaciones preferidas Reacción en cadena de la polimerasa

Oligonucleótidos cortos, solapantes de 15 a 25 mer o bases que se reasociaban por ambos extremos, se emplearon para amplificar los oligonucleótidos largos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las condiciones típicas para la PCR eran: 35 ciclos, 55ºC de temperatura de reasociación, 0,2 s de tiempo de extensión. Los productos de la PCR se purificaron en gel, se extrajeron con fenol y se emplearon en una PCR posterior para generar fragmentos más largos que constaban de dos fragmentos pequeños adyacentes. Estos fragmentos más largos se clonaron en un plásmido obtenido a partir de CDM7 que contenía una secuencia líder de la molécula de la superficie de CD5, seguida de un polienlazador Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1.

Las siguientes soluciones se emplearon en estas reacciones: 10x tampón de PCR (KCl 500 mM, Tris HCl 100 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 8 mM, 2 mM de cada dNTP). El tampón final se complementó con DMSO al 10% para incrementar la fidelidad de la polimerasa Taq.

Preparación de ADN a pequeña escala

Las bacterias transformadas se dejaron crecer en cultivos de 3 ml de LB durante más de 6 horas o durante una noche. Aproximadamente 1,5 ml de cada cultivo se vertió en tubos para microfuga de 1,5 ml, se centrifugaron durante 20 segundos para sedimentar las células y se resuspendieron en 200 \mul de solución I. A continuación, se añadieron 400 \mul de solución II y 300 \mul de solución III. Los tubos para microfuga se taparon, se mezclaron y se centrifugaron durante > 30 seg. El material sobrenadante se transfirió a tubos de nuevo aporte y se extrajeron una vez con fenol. El ADN se precipitó mediante llenado de los tubos con isopropanol, se mezcló y se centrifugó en una microfuga du-
rante > 2 minutos. Los sedimentos se lavaron en etanol al 70% y se resuspendieron en 50 \mul de dH_{2}O que contenía 10 \mul de ARNasa A. Los siguientes medios y soluciones se emplearon en estos procedimientos: medio LB (1,0% de NaCl, 0,5% de extracto de levadura, 1,0% de triptona); solución I (EDTA 10 mM, pH 8,0); solución II (NaOH 0,2 M, 1,0% de SDS); solución III (KOAc 2,5 M, ácido acético glacial 2,5 M); fenol (pH ajustado a 6,0, cubierto con TE); TE (Tris HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0).

Preparación de ADN a gran escala

Cultivos de un litro de bacterias transformadas se dejaron crecer de 24 a 36 horas (MC1061p3 transformadas con derivados de pCDM) o 12 a 16 horas (MC1061 transformadas con derivados de pUC) a 37ºC en medio bacteriano M9 (derivados de pCDM) o LB (derivados de pUC). Las bacterias se sedimentaron por centrifugación en botellas de 1 litro empleando una centrífuga J6 de Beckman a 4.200 rpm durante 20 minutos. El sedimento se resuspendió en
40 ml de solución I. Posteriormente, se añadieron 80 ml de solución II y 40 ml de solución III y las botellas se agitaron semivigorosamente hasta que se formaron agrupaciones de 2 a 3 mm de tamaño. La botella se centrifugó a 4.200 rpm durante 5 minutos y el material sobrenadante se vertió a través de una venda de algodón en una botella de 250 ml. Se añadió isopropanol a la parte superior y la botella se centrifugó a 4.200 rpm durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en 4,1 ml de solución I y se añadió a 4,5 g de cloruro de cesio, 0,3 ml de 10 mg/ml de bromuro de etidio y 0,1 ml de solución X100 de Tritón al 1%. Los tubos se agitaron en una centrífuga de alta velocidad de Beckman J2 a 10.000 rpm durante 5 minutos. El material sobrenadante se transfirió a tubos para ultracentrífuga Quick Seal de Beckman, los cuales se habían sellado y se centrífugo en una ultracentrífuga de Beckman empleando un rotor de ángulo fijo NVT90 a 80.000 rpm, durante >2,5 horas. La banda se extrajo mediante luz visible, empleando una jeringa de 1 ml y una aguja del calibre 20. Se añadió un volumen igual de dH_{2}O al material extraído. El ADN se extrajo una vez con n-butanol saturado con cloruro sódico 1 M, seguido de la adición de un volumen igual de acetato de amonio 10 M/EDTA 1 mM. El material se vertió en un tubo preparado de 13 ml que a continuación se había rellenado hasta arriba con etanol absoluto, se mezcló y se centrifugó en un centrífuga Beckman J2 a 10.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 0,5 hasta 1 ml de B_{2}O. La concentración de ADN se determinó midiendo la densidad óptica a 260 nm en una dilución de 1:200 (1 DO_{260} = 50 \mug/ml).

Los medios siguientes y tampones se emplearon en estos procedimientos: medio bacteriano M9 (10 g de sales de M9, 10 g de casaminoácidos (hidrolizados), 10 ml de adiciones de M9, 7,5 \mug/ml de tetraciclina (500 \mul de una solución de reserva de 15 mg/ml), 12,5 \mug/ml de ampicilina (125 \mul de una solución de reserva de 10 mg/ml); adiciones de M9 (CaCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 100 mM, 200 \mug/ml de tiamina, 70% de glicerol); medio LB (1,0% de NaCl, 0,5% de extracto de levadura, 1,0% de triptona); Solución I (EDTA 10 mM, pH 8,0); Solución II (NaOH 0,2 M, 1,0% de SDS); Solución III (KOAc 2,5 M, HOAc 2,5 M).

Secuenciación

Los genes se secuenciaron por el método didesoxi de Sanger. En resumen, se desnaturalizaron 20 a 50 \mug de ADN bicatenario plasmídico, en NaOH 0,5 M durante 5 minutos. Posteriormente, el ADN se precipitó con 1/10 volúmenes de acetato sódico (pH 5,2) y 2 volúmenes de etanol y se centrifugó durante 5 minutos. El sedimento se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en una concentración de 1 \mug/\mul. La reacción de reasociación se realizó con 4 \mug de ADN molde y 40 ng de cebador en un tampón de reasociación 1x, con un volumen final de 10 \mul. La reacción se calentó hasta 65ºC y se enfrió lentamente hasta 37ºC. En un tubo separado se añadió 1 \mul de DTT 0,1 M, 2 \mul de mezcla de marcación, 0,75 \mul de dH_{2}O, 1 \mul de [^{35}S]dATP (10 \muCi) y 0,25 \mul de Sequenase® (12 U/\mul) a cada reacción. Cinco \mul de esta mezcla se añadieron a cada tubo de cebador-molde reasociados y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para cada reacción de marcación, se añadieron 2,5 \mul de cada una de las cuatro mezclas de terminación, sobre una placa Terasaki y se precalentó a 37ºC. Al final de cada periodo de incubación, se añadieron 3,5 \mul de la mezcla de marcación a cada una de las 4 mezclas de terminación. Después de 5 minutos, se añadieron 4 \mul de solución de detención a cada reacción y la placa de Terasaki se incubó a 80ºC durante 10 minutos en un horno. Las reacciones de secuenciación se realizaron sobre un gel de poliacrilamida al 5% desnaturalizado. Una solución de acrilamida se preparó añadiendo 200 ml de tampón TBE 10x y 957 ml de dH_{2}O a 100 g de acrilamida:bisacrilamida (29:1). 5% de poliacrilamida, 46% de urea y 1x de gel TBE se prepararon combinando 38 ml de solución de acrilamida y 28 g de urea. La polimerización se inició con la adición de 400 \mul de peroxodisulfato de amonio al 10% y 60 \mul de TEMED. Los geles se vertieron empleando placas de vidrio silanizadas y peines de dientes de tiburón y se dejaron correr en tampón 1x TBE a 60-100 W durante 2 a 4 horas (dependiendo de la región que se iba a leer). Los geles se transfirieron a papel para transferencia de Whatman, se secaron a 80ºC durante aproximadamente 1 hora y se expusieron a una película de rayos X a temperatura ambiente. El tiempo típico de exposición eran de 12 horas. Las siguientes soluciones se emplearon en estos procedimientos: 5x tampón de reasociación (Tris HCl 200 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 100 mM, NaCl 250 mM); mezcla de marcación (7,5 \muM de cada uno, dCTP, dGTP y dTTP); mezclas de terminación (80 \muM de cada dNTP, NaCl 50 mM, ddNTP 8 \muM (uno de cada)); solución de detención (95% de formamida, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,05%, xilencianol al 0,05%); 5x TBE (Tris borato 0,9 M, EDTA 20 mM); solución de poliacrilamida (96,7 g de poliacrilamida, 3,3 g de bisacrilamida, 200 ml de 1x TBE, 957 ml de dH_{2}O).

Aislamiento del ARN

El ARN citoplásmico se aisló a partir de células 293T transfectadas con fosfato cálcico, 36 horas después de la transfección y a partir de células Hela infectadas con el virus vaccinia, 16 horas después de la infección, esencialmente tal y como describe Gilman. ("Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells". En Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., compiladores, Wiley & Sons, Nueva York, 1992). En resumen, las células se lisaron en 400 \mul de tampón de lisis, se separaron por centrifugación los núcleos y se añadió SDS y proteinasa K hasta 0,2% y 0,2 mg/ml, respectivamente. Los extractos citoplásmicos se incubaron a 37ºC durante 20 minutos, se extrajeron dos veces con fenol/cloroformo y se precipitaron. El ARN se disolvió en 100 \mul de tampón I y se incubó a 37ºC durante 20 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 25 \mul de tampón de detención y se precipitó de nuevo.

Las siguientes soluciones se emplearon en este procedimiento: tampón de lisis (TRUSTEE que contenía Tris
50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, 0,5% de NP40); tampón I (tampón TRUSTEE con MgCl_{2}10 mM, DTT
1 mM, 0,5 U/\mul de inhibidor de ARNasa de placenta, 0,1 U/\mul de ADNasa I exenta de ARNasa); tampón de detención (EDTA 50 mM, NaOAc 1,5 M, 1% de SDS).

Análisis de transferencia por hendidura

Para el análisis de la transferencia por hendidura se disolvieron 10 \mug de ARN citoplásmico en 50 \mul de dH_{2}O a los que se habían añadido 150 \mul de 10x SSC/18% de formaldehído. El ARN solubilizado se incubó a continuación a 65ºC durante 15 minutos y se aplicó en forma de manchas con un aparato de transferencia por hendidura. Las sondas marcadas radiactivamente de 1,5 kb de fragmentos de gp120IIIb y syngp120mn se emplearon para la hibridación. Cada uno de los dos fragmentos se marcó al azar en una reacción de 50 \mul con 10 \mul de 5x tampón de oligomarcación, 8 \mul de 2,5 mg/ml de BSA, 4 \mul de \alpha[^{32}P]-dCTP (20 \muCi/\mul; 6000 Ci/mmol) y 5 U del fragmento Klenow. Después de 1 a 3 horas de incubación a 37ºC, se añadieron 100 \mul de TRUSTEE y el \alpha[^{32}P]-dCTP no incorporado se eliminó empleando una columna de centrifugación G50. La actividad se midió en un contador beta de Beckman y se emplearon actividades específicas iguales para la hibridación. Las membranas se hibridaron previamente durante 2 horas y se hibridaron durante 12 a 24 horas a 42ºC con 0,5 x 10^{6} cpm de sonda por ml de fluido de hibridación. La membrana se lavó dos veces (5 minutos) con tampón de lavado I a temperatura ambiente, durante una hora en tampón de lavado II a 65ºC y a continuación se expuso a una película de rayos X. Resultados similares se obtuvieron empleando un fragmento Not1/Sfi1 de 1,1 kb de pCDM7 que contenía la región 3 no traducida. Las hibridaciones testigos se realizaron en paralelo con una sonda de beta-actina humana, marcada al azar. La expresión del ARN se cuantificó examinando las membranas de nitrocelulosa hibridadas con un fosfovisualizador de Magnetic Dynamics.

Las siguientes soluciones se emplearon en este procedimiento:

: 5x tampón de oligomarcación (Tris HCl 250 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 25 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM, dATP 2 mM, dGTP 2 mM, dTTP 2 mM, Hepes 1 M pH 6,6, 1 mg/ml de hexanucleótidos [dNTP]6); Solución de hibridación (fosfato sódico _ M, NaCl 250 mM, 7% de SDS, EDTA 1 mM, 5% de sulfato de dextrano, 50% de formamida, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado); tampón de lavado I (2x SSC, 0,1% de SDS); tampón de lavado II (0,5 x SSC, 0,1% de SDS); 20 x SSC (NaCl 3 M, citrato de Na_{3}0,3 M, pH ajustado a 7,0).

Cultivo celular

Las líneas celulares de carcinoma de riñón de mono CV1 y Cos7, la línea celular de carcinoma de riñón humano 293T y la línea celular de carcinoma de cuello del útero humano Hela, se obtuvieron a partir de la "American Tissue Typing Collection" y se mantuvieron en IMDM suplementado. Se conservaron en placas de cultivo de tejidos de
10 cm y se dividieron típicamente de 1:5 hasta 1:20 cada 3 o 4 días. El siguiente medio se empleó en este procedimiento:

: IMDM suplementado (90% de medio Dulbecco modificado con Iseove; 10% de suero de ternera, complementado con hierro, termoinactivado 30 minutos a 56ºC, 0,3 mg/ml de L-glutamina, 25 \mug/ml de gentamicina, \beta-mercaptoetanol 0,5 mM (pH ajustado con NaOH 5 M, 0,5 ml).

Transfección

La transfección con fosfato cálcico de las células 293T se realizó añadiendo lentamente y con formación de vórtice, 10 \mug de ADN plasmídico en 250 \mul de CaCl_{2} 0,25 M al mismo volumen de 2x tampón HEBS, mientras que se formaba un vórtice. Después de incubar de 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, el ADN precipitado se añadió a una placa pequeña de células confluyentes en 50 a 70%.

Las siguientes soluciones se emplearon en este procedimiento: 2x tampón HEBS (NaCl 280 mM, KCl 10 mM,
1,5 mM filtrado estérilmente); CaCl_{2} 0,25 mM (autoclavado).

Proteína verde fluorescente

La eficacia de la sustitución de codones sugiere que la sustitución de codones no preferidos por codones menos preferidos o por codones preferidos (y la sustitución de los codones menos preferidos por codones preferidos) incrementará la expresión en células de mamífero de otras proteínas, p. ej., otras proteínas eucariotas.

La proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria (Ward, Photochem. Photobiol. 4:1, 1979; Prasher y col., Gene 111:229, 1992; Cody y col., Biochem. 32:1212, 1993) ha atraído recientemente la atención por su posible utilidad como marcador o informador de estudios de transfección y de estirpes (Charlie y col., Science 263:802, 1994).

El examen de una tabla de usos de codones, construidos a partir de la secuencia codificadora natural de GFP, mostraba que los codones de GFP favorecían tanto A como U en la tercera posición. La tendencia en este caso favorece a A menos que la tendencia de gp120, pero es sustancial. Se creó un gen en el que la secuencia natural de GFP se había creado de nuevo por ingeniería genética.

Además, la secuencia de iniciación de la traducción de GFP se sustituyó con secuencias correspondientes a la secuencia de consenso de iniciación de la traducción. La expresión de la proteína resultante se comprobó con la de la secuencia de tipo silvestre, preparada por ingeniería genética de forma similar para ser portadora de una secuencia de consenso de iniciación de la traducción perfeccionada (Fig. 1, panel B y Fig. 1, panel C). Adicionalmente, se examinó el efecto de incluir la mutación Ser 65-Thr, que se había informado que mejoraba la eficacia de la excitación de GFP a 490 nm y, por tanto, se prefería para la microscopía de fluorescencia (Heim y col., Nature 373:663, 1995) (Fig. 1, panel D). La preparación por ingeniería genética de codones confería un incremento significativo de la eficacia de la expresión (un porcentaje concomitante de células aparentemente positivas para la transfección) y la combinación de la mutación Ser 65-Thr y el perfeccionamiento del codón, daban como resultado un segmento de ADN que codifica una proteína marcadora de mamíferos muy visible (Fig. 1, panel D).

La secuencia codificadora de la proteína verde fluorescente, sintética, descrita anteriormente se ensambló a partir de seis fragmentos de aproximadamente 120 pb cada uno, empleando una estrategia de ensamblaje que se basaba en la capacidad de las enzimas de restricción BsaI y BbsI de cortar más allá de su secuencia de reconocimiento. Se sintetizaron oligonucleótidos largos que contenían partes de la secuencia codificadora de GFP embebidas en secuencias flanqueantes que codificaban EcoRI y BsaI en un extremo y BamHI y BbsI en el otro extremo. Por consiguiente, cada oligonucleótido tiene la configuración EcoRI/BsaI/fragmento de GFP/BbSI/BamHI. Los extremos de los sitios de restricción generados por los sitios BsaI y BbsI se diseñaron para conseguir extremos compatibles que pudieran ser empleados para unir fragmentos de GFP adyacentes. Cada uno de los extremos compatibles se diseñaron para ser únicos y no autocomplementarios. Los segmentos de ADN sintético en bruto se amplificaron mediante PCR, se insertaron entre EcoRI y BamHI en pUC9 y se secuenciaron. Posteriormente, la secuencia codificadora intacta se ensambló en una ligación de seis fragmentos, empleando fragmentos insertados preparados con BsaI y BbsI. Dos de los seis plásmidos resultantes de la ligación eran portadores de un inserto con el tamaño correcto y uno contenía la secuencia de longitud completa deseada. La mutación de Ser65 en Thr se realizó mediante mutagénesis convencional basada en la PCR, empleando un cebador que se solapaba con un único sitio BssSI en la GFP sintética.

Perfeccionamiento de codones como estrategia para mejorar la expresión en células de mamífero Uso

Los genes de la invención son útiles para la terapia génica.

Los genes de GFP se pueden emplear en cualquier aplicación en la que se pueda emplear un gen de GFP natural u otro gen informador. Un gen de GFP que emplea codones más preferidos que el gen de GFP natural, puede ser la base de un sistema informador altamente sensible. Un sistema tal se puede utilizar, p. ej., para analizar la influencia de elementos de promotor en particular o de factores que actúan en trans sobre la expresión génica. Por tanto, el gen de GFP se puede utilizar en la misma forma que se han empleado otros genes informadores, p. ej., la \beta-galactosidasa.

Claims

1. Un gen que codifica la proteína verde fluorescente de la medusa Aequorea Victoria, en donde al menos 50% de los codones no preferidos y de los codones menos preferidos en el gen natural se han sustituido por un codón preferido que codifica el mismo aminoácido, seleccionándose dichos codones preferidos entre el grupo consistente en gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac y gtg, seleccionándose dichos codones menos preferidos entre el grupo consistente en ggg, att, ctc, tcc y gtc, siendo dichos codones no preferidos, todos los codones distintos de dichos codones preferidos y dichos codones menos preferidos, en donde dicho gen permite incrementar la expresión de dicha proteína verde fluorescente en una célula hospedadora de mamífero, cuando se compara con dicho gen natural en un sistema de cultivo in vitro de células de mamífero, bajo condiciones idénticas.

2. El gen según la reivindicación 1, en donde al menos 90% de los codones no preferidos y de los codones menos preferidos presentes en dicho gen natural, han sido sustituidos por codones preferidos.

3. El gen según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de SEQ ID NO:40.

4. Un método para preparar un gen según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende

(a): identificar los codones no preferidos y menos preferidos en el gen natural que codifican la proteína verde fluorescente de la medusa Aequorea Victoria y

5. Un plásmido de expresión que comprende el gen según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Una célula de mamífero transfectada con el plásmido de expresión de la reivindicación 5.