ES2268863T3

ES2268863T3 - Receptores quimericos.

Info

Publication number: ES2268863T3
Application number: ES99919447T
Authority: ES
Inventors: Alastair David Griffiths Lawson; Helene Margaret Finney
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2019-05-06
Also published as: WO1999057268A1; EP1075517A1; DE69932511D1; ATE334200T1; JP2002513569A; EP1075517B1; GB9809658D0; AU3723399A; DE69932511T2; CA2328505A1; AU768761B2

Abstract

Reivindicaciones 1. ADN codificante para un receptor quimérico que contiene dos cadenas polipeptídicas independientes, cada una de las cuales comprende, en una secuencia del término N- al C-: (1) un dominio extracelular de asociación a ligando; (2) un dominio espaciador; (3) un dominio de transmembrana; y (4) uno o más dominios intracelulares; con la condición de que: el dominio de asociación a ligando de una de las cadenas polipeptídicas del receptor quimérico codificado, sea un dominio VH o un fragmento del mismo, con unión al ligando; y el dominio de asociación a ligando de la otra cadena polipeptídica del receptor quimérico codificado, sea un dominio VL o un fragmento del mismo, con unión al ligando; al menos dos de los dominios mencionados en una cadena no se fusionen de manera natural con el otro; y los dominios de asociación a ligando, y los dominios espaciadores y transmembrana son seleccionados de tal modo que cada cadena polipeptídica puede ser expresada independientemente, y se mantenga sin asociarse con la otra cadena, en ausencia de ligando.

Description

Receptores quiméricos.

Esta invención se refiere a los receptores quiméricos, al ADN que por lo tanto los codifica, y al uso de los receptores en medicina.

Los receptores quiméricos habían sido diseñados para apuntar a células como las células T, hacia otras células que expresen el antígeno en su superficie celular. La unión del antígeno con el receptor en el contexto correcto, desencadena una serie de eventos intracelulares que llevan a la activación de la célula que porta al receptor. La activación puede llevar a un incremento de la proliferación; a la expresión de citoquinas, con respuestas pro- o anti-inflamatorias, por ejemplo; a la estimulación de la actividad citolítica, de la diferenciación o de otras funciones efectoras; a la secreción de anticuerpos; a la fagocitosis; a la infiltración tumoral y/o a la adhesión incrementada. Evidentemente, cada activación puede tener beneficios terapéuticos, y los receptores quiméricos que pueden facilitar esto, se utilizan en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos.

Los receptores quiméricos descritos previamente proporcionan reconocimiento del antígeno, o en una cadena única, por ejemplo en una cadena única, Fv o CD4, enlazada a una región señaladora intracelular [Eshhar, Z et al, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720; Stancovski, I et al (1993) J. Inmunol. 151, 6577; Hwu, P et al, (1993) J. Exp. Med. 178, 361; Brocker, T et al, (1993) Eur. J. Immunol. 23, 1435; Moritz, D. et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318; Roberts, M. et al, (1994) Blood 84, 2878; Hwu, P et al, (1995) Cancer Res. 55, 3369; Tran, A-C et al (1995) J. immunol. 155, 1000; Hekele, A et al (1996) Int. J. Cancer 68, 232; Altenschmidt, U et al (1996) Clin. Cancer Res. 2, 1001; Brocker, T et al (1996) Eur. J. Immunol. 26, 1770; Weitjens, M et al (1996) J. Immunol. 157, 836; Alvarez-Vallina, L and Hawkins, R E (1996) Eur. J. Immunol. 26, 2304]; o en dos cadenas, como en V_{L}-TCR\alpha con V_{H}-TCR\beta o V_{H}-TCR\alpha con V_{L}-TCR\beta, pero sin secuencias señaladoras intracelulares unidas [Kuwana, Y et al, (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 960; Gross, G et al (1989) Proct. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10024].

Los mecanismos mediante los que estos receptores convierten el suceso de la unión extracelular en una señalización intracelular, son muy poco claros, y es probable que involucren la agrupación y asociación con moléculas efectoras celulares endógenas. Una desventaja en su diseño es que no existe un mecanismo inherente para prevenir la activación constitutiva en ausencia de estimulación antigénica. Esto no es deseable puesto que puede provocar una activación inapropiada de la célula. Otro problema con los receptores quiméricos descritos previamente es que son susceptibles de señalización al unirse a un antígeno soluble. Esto limita su utilidad en el tratamiento de algunos trastornos, por ejemplo en la terapia de tumores, donde muchas células asociadas a antígenos tumorales son también vertidas al sistema vascular, y pueden por lo tanto inducir una señalización inapropiada debido al receptor quimérico, que está lejos del sitio del tumor.

La presente invención proporciona un receptor quimérico mejorado que minimiza la activación constitutiva en ausencia de antígeno, y que se activa menos fácilmente por el antígeno soluble, que los diseños descritos previamente. En una forma particularmente ventajosa, el receptor obtenido según la invención, incluye un mecanismo a través del cual, muchos componentes de la señalización pueden ser localizados sobre la unión del antígeno para actuar cooperativamente, para generar eficazmente una señal intracelular.

Los receptores quiméricos mejorados según la invención, generalmente presentan dos o más cadenas de polipéptidos, cada una de las cuales contiene un dominio de asociación con un ligando extracelular unido a un dominio de señalización a través de una transmembrana, y opcionalmente uno o más dominios separadores. Los dominios de asociación con ligandos son capaces de actuar cooperativamente con el otro, en presencia de un ligando, para formar un sitio de unión a ligandos. Cada cadena puede ser expresada de tal modo que se sitúe en una membrana celular con una orientación en la que el dominio de asociación es extracelular, y el dominio de señalización es intracelular. Mediante una selección cuidadosa de los dominios de asociación con ligandos y de los dominios de transmembrana y/o separadores no asociantes, cada cadena de polipéptidos puede ser expresada independientemente y permanecerá durante mucho tiempo sin asociarse con los otros, en ausencia de ligando. La presencia del ligando, especialmente ligando expresado en superficie celular, induce a una interacción estable entre los dominios de asociación a ligandos, estableciendo específicamente una proximidad espacial muy cercana de las cadenas de polipéptidos, y facilitando la interacción entre los dominios intracelulares de señalización. Los dominios de señalización pueden ser seleccionados de tal modo que uno forma un sustrato para el otro, por lo que se incrementa la eficacia del suceso de señalización.

El receptor quimérico según la invención, puede ser expresado en una célula huésped transformada con ADN codificante para cada cadena polipeptídica. De este modo, de acuerdo con un aspecto de la invención, proporcionamos ADN codificante para un receptor quimérico que contiene una o más cadenas polipeptídicas independientes, comprendiendo cada una de dichas cadenas, en una secuencia de término con N- o C-:

(1): un dominio extracelular de asociación a ligandos;

(2): un dominio de transmembrana; y

(3): uno o más dominios intracelulares;

siempre que al menos dos de estos dominios en una cadena, no se fusionen uno con el otro de manera natural.

Para evitar toda duda, el término "no se fusionen uno con el otro de manera natural" tal como se usa aquí, intenta significar que dos o más dominios no están enlazados en la manera que generen un polipéptido descubierto en la naturaleza. Claramente, de este modo se intenta excluir de la invención a los receptores que aparecen de modo natural. Con tal de que al menos dos dominios no estén naturalmente fusionados, de este modo otros dominios pueden estar enlazados en una manera que suceda naturalmente, donde se desee.

Tal como se utiliza aquí el término dominio extracelular de asociación a ligandos, se intenta incluir a cualquier oligo- o polipéptido que sea capaz de interactuar con las moléculas expresadas en la superficie celular de una célula objetivo, o de una célula huésped.

Por tanto, el dominio puede ser escogido para reconocer un marcador de superficie expresado en células objetivo asociadas con un estado de enfermedad como son, por ejemplo, aquellas asociadas con células infectadas viralmente; células infectadas con bacterias; células de cáncer, como el receptor de bombesina expresado en células de tumor pulmonar, antígeno carcinoembriónico, mucina epitelial polimórfica y CD33; moléculas de adhesión a superficie; células inflamatorias presentes en una enfermedad autoinmune; o un receptor o antígeno de célula T, elevando la autoinmunidad.

Alternativamente, el dominio de asociación a ligando puede escogerse de tal modo que interactúe con uno o más de los otros dominios de asociación con ligandos de los receptores quiméricos expresados por la célula huésped, para alcanzar la multiplicación de los dominios asociados capaces de reconocer un marcador de superficie expresado en una célula objetivo, tal como se ha descrito.

Los dominios de asociación a ligandos particularmente útiles, incluyen partes de los receptores asociados con las moléculas asociadas a la unión con la superficie celular, e incluyen especialmente a un dominio de región variable (V_{H} o V_{L}) de anticuerpo, a un dominio de región variable del receptor de célula T (TCR\alpha, TCR\beta, TCR\gamma, TCR\delta) o una cadena seleccionada de CD8\alpha, CD8\beta, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD61, CD41 o CD51. Los fragmentos de esos dominios y cadenas pueden utilizarse donde sea apropiado.

Cada dominio de asociación en el receptor quimérico puede ser el mismo, aunque es deseable que los dominios de asociación sean estructuralmente distintos. En una forma de realización preferida, los dominios son capaces de actuar cooperativamente unos con otros, para formar un sitio de unión. Ejemplos particulares incluyen un dominio V_{H} emparejado con un dominio V_{L}, dos o más dominios TCR\alpha, TCR\beta, TCF\gamma, y/o TCR\delta, un homo- o heterodímero CD8\alpha o \beta, CD18 emparejado con uno o más de CD11a, b o c, CD29 emparejado con uno o más de CD49a, b, c, d, e, o f, y CD61 emparejado con CD41c y/o CD51.

En la unión con el ligando, cada dominio de asociación se mueve para formar un sitio de unión al ligando, y al hacerlo establece una proximidad espacial cercana de los dominios intracelulares que forman las regiones C-terminales de las cadenas polipeptídicas que constituyen el receptor quimérico. Los dominios de asociación a ligando particularmente útiles incluyen a los dominios V_{H} y V_{L} de anticuerpo y fragmentos de los mismos, especialmente en un receptor de dos cadenas donde uno de los dominios de asociación es un dominio V_{H} o un fragmento del mismo, y el otro es un dominio V_{L} o un fragmento del mismo.

Tal como se usa aquí el término dominio intracelular, se pretende que signifique cualquier oligo- o polipéptido que puede participar en la transducción de una señal que de lugar a activación directa o indirecta de uno o más sistemas mensajeros intracelulares. Los sistemas mensajeros intracelulares particulares incluyen por ejemplo a uno o más rutas quinasa, como las que involucran a la tirosinquinasa, a la proteína quinasa C, o a la MAP quinasa; las rutas mediadas por la proteína G o por la fosfolipasa; las rutas mediadas por calcio; y las rutas que implican la síntesis de una citoquina como la interleuquina, p.e. la IL-2, incluyendo las rutas mediadas por NFAT y AMPc.

Cada dominio intracelular puede derivarse de una o más secuencias de polipéptidos de señalización que aparezcan naturalmente. Ejemplos de secuencias apropiadas incluyen, por ejemplo secuencias derivadas del receptor de la célula T, como un todo o como parte de la cadena zeta, eta o épsilon; CD28; CD4; CD8; la cadena g de un receptor Fc; o los componentes de señalización de un receptor de citoquina, p.e. los receptores de interferón, TNF e interleuquina, un receptor del factor estimulante de colonias, p.e. GMCSF, una tirosínquinasa, p.e. ZAP-70, fyn, lck, Itk y syk, y los dominios de unión a los mismos; una molécula de adhesión, p.e. LFA-1 y LFA-2, B29, MB-1, CD3 delta, CD3 gamma, CD5 o CD2.

Al menos un componente en cada dominio intracelular será capaz de interactuar cooperativamente con uno o más de los otros componentes en otros dominios intracelulares. La interacción cooperativa incluye, por ejemplo, la asociación de dos o más componentes para formar un sustrato capaz de participar en uno de los sistemas de mensajeros intracelulares descritos arriba. Sin embargo, la cooperación interactiva preferiblemente significa uno de los componentes actuando como un sustrato para uno o más de los otros, de tal manera que el sustrato inicia un suceso de señalización. Esto puede llevar, o a una activación, o a una regulación baja de la cascada de señalización. Puede obtenerse un ejemplo particular de este tipo de cooperación interactiva, cuando uno de los componentes en un dominio intracelular, se deriva de una cadena intracelular CD4 que contiene al dominio de unión a lck, y un componente en el otro dominio intracelular, es una cadena zeta derivada del receptor de la célula T. La unión del ligando a las cadenas del receptor quimérico provoca la asociación de lck con zeta, facilitando la fosforilación de los residuos de tirosina ARAM de zeta, lo que es un suceso temprano en la generación de la señal.

El dominio de transmembrana en cada cadena polipeptídica del receptor quimérico, sirve generalmente para anclar cada cadena a la membrana celular de la célula huésped. Los dominios de transmembrana pueden ser en general cualquier oligo- o polipéptido, y pueden derivarse de una amplia variedad de fuentes, como son todas, o parte de las cadenas alfa, beta o zeta del receptor de las células T, CD28, CD8, CD4, CD3\varepsilon, CD45 y los miembros de la familia del tetraspan, p.e. CD9, CD37, un receptor de citoquina, p.e. un receptor de interleuquina, receptor de TNF, o receptor de interferón, o un receptor de factor estimulante de colonias, p.e. GMCSF.

Cualquiera que sea la derivación de cada dominio de transmembrana, será escogido o modificado deseablemente, para minimizar su asociación constitutiva con cualquier otro dominio en el receptor quimérico, pero también para permitir la asociación de las cadenas polipeptídicas del receptor, cuando el ligando se une por uno o más dominios de asociación extracelulares. Esto reduce la generación indeseable de señales aleatorias, asegurando que los dominios intracelulares solo interactúan cuando el ligando está unido a los dominios de asociación extracelulares. Esto representa un aspecto importante del diseño de los receptores de la invención.

Además de la selección de los dominios transmembrana apropiados, puede mejorarse la capacidad de cada cadena polipeptídica del receptor para mantenerse sin asociarse, excepto si esta presencia de un ligando unido, incorporando una región separadora entre cada dominio de asociación extracelular y cada dominio transmembrana. Por lo tanto, de acuerdo con aspecto preferido de la invención, proporcionamos ADN codificante de un receptor quimérico que contiene dos o más cadenas polipeptídicas independientes, comprendiendo cada una de ellas, en la secuencia que va de N- al término C-:

(1) un dominio extracelular de asociación a ligando;

(2) un dominio separador;

(3) un dominio de transmembrana; y

(4) uno o más dominios intracelulares; con tal de que al menos dos de los dominios mencionados no estén fusionados naturalmente en una cadena con la otra.

El término dominio separador, tal como se usa aquí, significa generalmente cualquier oligo- o polipéptido que sirva para enlazar los dominios de asociación y transmembrana en cada cadena. Los dominios espaciadores pueden comprender, por ejemplo, hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 20 a 100 aminoácidos, y más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos.

Los espaciadores pueden derivarse de todas, o parte, de las moléculas que aparecen naturalmente, como toda o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28; o todo, o parte de una región constante de un anticuerpo, incluyendo la región bisagra. Pueden utilizarse también todos, o parte de los componentes espaciadores naturales entre las partes funcionales de las moléculas intracelulares de señalización, por ejemplo los espaciadores entre ITAMS (Motivos de Activación de Inmunorrecepetores basados en tirosina). Alternativamente, el espaciador puede ser una secuencia que aparece de manera no natural.

Para minimizar la asociación constitutiva de los dominios espaciadores y/o de transmembrana, los dominios de asociación no naturales pueden ser seleccionados inicialmente, y/o los dominios pueden ser modificados para reducir la asociación. Esto se puede conseguir mediante la supresión, el cambio o la modificación de los aminoácidos de las secuencias que aparecen naturalmente en los dominios espaciadores y/o de transmembrana, que tienen cadenas laterales capaces de interactuar covalente o no covalentemente con las cadenas laterales de aminoácidos en la otra cadena. Ejemplos particulares de aminoácidos de esos tipos, incluyen los residuos de cisteína, los aminoácidos cargados o los aminoácidos como la serina o la treonina, con sitios de glicosilación potenciales.

El ADN según la invención, contendrá adicionalmente secuencias codificantes para un componente señal para cada una de las cadenas del receptor quimérico, para permitir que cada cadena sea transportada hasta la membrana de la célula huésped. Cada señal estará unida al término-N del dominio de asociación de cada cadena. El componente señal puede ser el que se asocie naturalmente con el dominio de asociación, o puede derivarse de otras fuentes. Ejemplos de señales de secreción incluyen las secuencias señal de inmunoglobulina.

Los dominios señal, de asociación, espaciadores, transmembrana e intracelulares de cada cadena en el receptor quimérico, se derivan preferiblemente de secuencias humanas, o están basadas en las mismas.

El ADN particularmente útil de acuerdo con la invención, es el que codifica para un receptor quimérico que contiene dos cadenas de polipéptidos independientes, tal como las aquí descritas. En los receptores de este tipo, una de las cadenas tiene preferiblemente un dominio de asociación con ligandos, que es un dominio V_{H} o un fragmento del mismo, y la otra tiene un dominio de asociación con ligandos, que es un dominio V_{L} o un fragmento del
mismo.

Las secuencias codificantes de ADN para el uso en la invención, están disponibles de modo amplio en la literatura y en las bases de datos. El ADN puede obtenerse de fuentes de ADN fácilmente disponibles, como por ejemplo ADNc o genotecas de ADNc disponibles comercialmente, utilizando procedimientos estándar de biología molecular y/o química, por ejemplo mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos o las técnicas de síntesis dirigida a oligonucleótidos, el corte enzimático o el rellanado enzimático de huecos de oligonucleótidos. Estas técnicas se describen en Maniatis et al in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1989, y en particular en los Ejemplos aquí descritos más adelante.

El ADN puede usarse en asociación con un transportador. El transportador puede ser un vector u otro transportador disponible para la introducción del ADN ex-vivo o in-vivo en las células diana y/o en las células diana huésped. Ejemplos de vectores disponibles incluyen vectores virales, como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, EBV, y HSV; y vectores no virales, como vectores liposomales y vectores basados en agentes que condensan el ADN, por ejemplo lípidos catiónicos; tal como los describen en las Especificaciones Internacionales de Patentes números WO96/10038, WO97/18185, WO97/25329, WO97/30170 y WO97/31934. Donde sea apropiado, el vector puede incluir de manera adicional, secuencias promotoras/reguladoras y/o funciones de replicación de virus como los retrovirus LTRs, repeticiones AAV, SV40 y promotores hCMV, y/o señales potenciadoras, de empalme y de poliadenilación; funciones de replicación de virus BK y EBV. También se pueden usar las secuencias específicas reguladoras del tejido, como son el promotor TCR-\alpha, el promotor E-selectina y el promotor CD2, y las regiones de control del locus. Alternativamente, el transportador puede ser un anticuerpo.

Cada molécula de ADN codificante para una cadena polipeptídica del receptor quimérico, puede incorporarse en distintos transportadores de los arriba mencionados. Sin embargo, el ADN se incorpora preferiblemente en el mismo transportador. Para ello, el ADN puede situarse, por ejemplo, en plásmidos separados, o puede formar parte ventajosamente de un único plásmido que contenga adicionalmente una o más secuencias promotoras y/o reguladoras, y/o funciones de regulación como las descritas. Por tanto, esta invención se extiende hasta los plásmidos que comprende ADN codificante para un receptor quimérico de acuerdo con la invención. Plásmidos particularmente útiles de este tipo, incluyen al plásmido pHMF374 descrito en los Ejemplos descritos más adelante, y plásmidos que contienen otros dominios de asociación con ligandos, espaciadores y/o de transmembrana, y dominios intracelulares, análogos a los especificados aquí.

Para su uso ex-vivo, el ADN de la invención puede ser introducido en células efectoras extraídas del huésped diana, utilizando métodos bien conocidos en el arte, p.e. transfección, transducción, técnicas biolísticas, fusión de protoplasto, transformación de ADN precipitado con fosfato cálcico, electroporación, lipofección catiónica, o liposomas diana. Las células efectoras son reintroducidas entonces en el huésped, utilizando técnicas estándar.

Puede emplearse una amplia variedad de huéspedes diana de acuerdo con la presente invención, como por ejemplo mamíferos, y especialmente humanos.

Ejemplos de células efectoras apropiadas incluyen a las células asociadas con el sistema inmune, como son los linfocitos, p.e. linfocitos T citotóxicos, linfocitos infiltrantes de tumor, células asesinas naturales, neutrófilos, basófilos o células ayudantes T; células dendríticas, células B, células madre hematopoyéticas, macrófagos, monocitos, o células NK. Se prefiere especialmente el uso de linfocitos T citotóxicos.

El ADN según la invención, es particularmente apropiado para la administración in vivo. En un ejemplo preferido, puede estar en forma de un sistema administrador dirigido, en el que un transportador como el descrito arriba, es capaz de dirigir el ADN hasta la célula efectora deseada. Ejemplos particulares de estos sistemas de reparto dirigidos, incluyen ADN desnudo dirigido, liposomas dirigidos encapsulados y/o formando un complejo con el ADN, sistemas retrovirales dirigidos, y ADN condensado dirigido, como el ADN condensado de polilisina y protamina.

Los sistemas dirigidos son bien conocidos en el arte, e incluyen el uso, por ejemplo, de anticuerpos, o fragmentos de los mismos, contra antígenos de superficie celular expresados en células diana in vivo, como la CD8; CD16; CD4; CD3; selectinas, p.e. E-selectina; CD5; CD7; CD34; antígenos de activación, p.e. CD69 e IL-2R. Alternativamente, pueden usarse otras interacciones de receptor-ligando para la dirección, p.e. CD4 para dirigir las células diana que expresan HIV_{gp}160.

En general, se prefiere el uso de ADN dirigido de anticuerpos, particularmente ADN desnudo dirigido de anticuerpos, ADN condensado dirigido de anticuerpos, y especialmente liposomas dirigidos de anticuerpos. Los tipos particulares de liposomas que se pueden usar incluyen por ejemplo liposomas sensibles al pH, donde los ligadores cortados a bajo pH, pueden ser utilizados para unir el liposoma al anticuerpo. También pueden usarse los liposomas catiónicos que se fusionan con la membrana celular, y que liberan el ADN del receptor quimérico recombinante según la invención, directamente en el citoplasma. Los liposomas a usar en la invención pueden tener también grupos hidrofílicos, como por ejemplo polímeros de polietilen glicol, enganchados a su superficie para incrementar su vida media de circulación. Hay muchos ejemplos en el arte, de grupos apropiados para engancharse a liposomas u otros transportadores; ver por ejemplo las Memorias de Patentes Internacionales Nos. WO 88/04924, WO 90/09782, WO 91/05545, WO 91/05546, WO 93/19738, WO 94/20073 y WO 94/22429. El anticuerpo u otra molécula dirigida, puede unirse al ADN, ADN condensado, o liposoma, mediante grupos convencionales de unión fácilmente disponibles, y grupos funcionales reactivos en el anticuerpo, p.e. tioles, o aminas y similares, y en el ADN o en materiales que contienen ADN.

También pueden usarse sistemas transportadores no dirigidos, y en estos, la expresión dirigida del ADN es ventajosa. La expresión dirigida del ADN puede alcanzarse usando por ejemplo sistemas promotores específicos de células T, como el promotor zeta y el promotor CD2, y la región de control de locus, los promotores CD4, CD8, TCR\alpha y TCR\beta, los promotores de citoquinas como el promotor IL2, y el promotor de perforina.

El ADN según la invención puede ser utilizado ex vivo y, en un aspecto más avanzado, la invención proporciona células efectoras trasnfectadas con ADN según la invención. Las células efectoras pueden ser cualquiera de las descritas anteriormente más arriba, que son apropiadas para el uso ex vivo y son preferiblemente células T, y más preferiblemente células T citotóxicas.

El ADN según la invención puede tomar la forma de una composición farmacéutica. Esta puede ser una composición diagnóstica o terapéutica, y puede tomar cualquier forma apropiada disponible para la administración. Será preferiblemente en una forma apropiada para la administración parenteral, p.e. mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección en bolo, o infusión continua, o inyección mediada por partículas. Donde la composición se usa mediante inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación como son los agentes de suspensión, preservadores, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la composición puede estar en forma seca, para la reconstitución mediante un líquido estéril apropiado, antes de su uso. Para la administración mediada por partículas, el ADN puede estar recubierto de partículas como partículas de oro microscópicas.

Si la composición es apta para la administración oral, la formulación puede contener, además del ingrediente activo, aditivos como: almidón -p.e. almidón o celulosa de patata, maíz, o trigo-, o derivados del almidón como la celulosa microcristalina; sílice; varios azúcares como la lactosa; carbonato magnésico y/o fosfato cálcico. Es deseable que, si la formulación es para administración oral, esta será bien tolerada por el sistema digestivo del paciente. Para ello, puede ser deseable incluir resinas y precursores de mucus. También puede ser deseable mejorar la tolerancia mediante la formulación de las composiciones en una cápsula que sea insoluble en los jugos gástricos. También puede ser preferible incluir la composición en una formulación de liberación controlada.

El ADN según la invención se usa en medicina, y la invención se extiende a un método de tratamiento de un sujeto humano o animal, comprendiendo el método la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un sistema de administración de ADN descrito arriba. La cantidad exacta a ser usada dependerá de la edad y condición del paciente, la naturaleza de la enfermedad o trastorno, y la ruta de la administración, pero puede ser determinada utilizando medios convencionales, por ejemplo mediante extrapolación de datos derivados de experimentación animal. En particular, para el uso ex vivo puede establecerse el número de células efectoras transfectadas requeridas, mediante transfección ex vivo, y reintroducción en una modelo animal de un intervalo de número de células efectoras.

Similarmente, la cantidad de ADN requerido para el uso in vivo puede establecerse en animales, usando un intervalo de concentraciones de ADN.

El ADN según la invención, puede ser útil en el tratamiento de un número de enfermedades y trastornos. Estas enfermedades y trastornos pueden incluir los descritos bajo los títulos generales de enfermedades infecciosas, p.e. infección con HIV; autoinmunidad/enfermedad inflamatoria, p.e. artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino; cáncer; enfermedades alérgicas/atópicas, p.e. asma, eccema; enfermedades congénitas p.e. fibrosis quística, anemia drepanocítica; enfermedades dermatológicas, p.e. soriasis; enfermedades neurológicas, p.e. esclerosis múltiple; transplantes, p.e. rechazo del transplante de órganos, enfermedad de injerto-contra-huésped; enfermedad metabólica/idiopática p.e. diabetes.

El siguiente Ejemplo ilustra la invención. En el Ejemplo, los resultados demuestran que el receptor quimérico de dos cadenas no está activado constitutivamente, puesto que no se produjo IL-2 en ausencia de células diana (HL60), o en presencia de células que no expresan antígeno específico (NSO), y pueden ser disparadas para producir IL-2 solo en presencia de células que expresen antígeno específico (HL60 o NSO.CD33).

Ejemplo

Construcción de genes de receptor quimérico

Cada componente del receptor quimérico fue clonado con PCR o montado con PCR, mediante técnicas estándar (Protocolos PCR, Innis et al (1990) Academic Press Inc.), y sub-clonados en un formato de cassette, dentro de un pBluescript KS+(Stratagene), ver Figura 1. Los oligonucleótidos (oligos) se describen en la Figura 2.

a) Cassette Vl

La región variable de la cadena ligera del anticuerpo humano manipulado, hP67 (manipulado de acuerdo con la Memoria de Patente Internacional WO 91/09967), fue clonada con PCR con los oligos S4503 y S4504. El S4503 introduce un sitio Hind III 5', y el S4504 introduce un sitio Spe I 3'. El producto PCR se restringió con Hind III y Spe I, y se sub-clonó en pBluescript KS+.

b) Cassette Vh

La región variable de la cadena pesada del anticuerpo humano manipulado, hP67 (manipulado de acuerdo con la Memoria de Patente Internacional WO 91/0997), fue clonada con PCR con los oligos S4501 y S4502. El S4501 introduce un sitio Hind III 5', y el S4502 introduce un sitio Spe I 3'. El producto PCR se restringió con Hind III y Spe I, y se sub-clonó en pBluescript KS+.

c) Cassette espaciador CD8*

El cassette espaciador CD8* fue montado con PCR, usando oligos solapantes: S4881, S4882, S4883, S4884, S4885 y S4886. El producto PCR se restringió con Spe I y Not I, y se sub-clonó en pBluescript KS+.

d) Cassette CD4 TM / CD4

Los componentes intracelular y transmembrana del CD4 fueron clonados mediante PCR a partir de ADNc de leucocito humano (Clonetech), con oligos S4499 y S4500. El S4499 introduce un sitio Not I 5' y el S4500 introduce un sitio EcoR I 3' y un sitio Sac I. El producto PCR se restringió con Not I y Sac I, y se sub-clonó en pBluescript KS+.

e) Cassette CD4 TM / TCR Zeta

El componente intracelular del TCR Zeta fue clonado mediante PCR a partir de ADNc de leucocito humano (Clonetech), con oligos S4701 y S4700. El S4701 es un oligo largo que introduce tanto un sitio Not I 5' como un componente transmembrana del CD4. El S4700 introduce un sitio EcoR I 3'.

El producto PCR se restringió con Not I y EcoRi, y sustituyó al cassette CD4 TN / CD4 en el pBluescript KS+.

Todos los cassettes mencionados arriba fueron secuenciados (Applied Biosystems, Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing, Part Number 901497) en pBluescript KS+ antes de clonarlos en los vectores de expresión.

Esos cassettes fueron montados usando técnicas estándar de biología molecular para construir los siguientes receptores quiméricos de cadena separada, que al asociarse tienen el potencial para la especificidad por el CD33 humano.

a) VH / CD8* / CD4 TM / CD4

El receptor quimérico VH / CD8* / CD4 TM / CD4 está constituido por la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humano manipulado P67, unido, por un espaciador extracelular basado en parte de la bisagra del CD8 humano, a los componentes intracelular y transmembrana del CD4 humano.

El espaciador extracelular está constituido por los residuos 95 al 159 del CD8 humano (con la siguiente sustitución de aminoácidos: -Cys (143) cambió a Ala para eliminar un enlace disulfuro potencial, y Thr (117, 118 y 119) cambiaron a Gly, Ala y Gly respectivamente, para reducir la potencial carga negativa), seguido de un residuo Gly para introducir un sitio de restricción [Sukhatme et al, (1985) Cell, 40, 591-597]). El componente transmembrana e intracelular de CD4 está constituido por los residuos 375 a 435 [Maddon et al, (1985) Cell, 42, 93-104].

b) Vl / CD8* / CD4 TM / TCR Zeta

El receptor quimérico Vl / CD8* / CD4 TM / TCR Zeta está constituido por la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humano manipulado P67, unido, por un espaciador extracelular basado en parte de la bisagra del CD8 humano, a los componentes intracelular y transmembrana del CD4 humano.

El espaciador extracelular está constituido por los residuos 95 al 159 del CD8 humano (con la siguiente sustitución de aminoácidos: -Cys (143) cambió a Ala para eliminar un enlace disulfuro potencial, y Thr (117, 118 y 119) cambiaron a Gly, Ala y Gly respectivamente, para reducir la potencial carga negativa), seguido de un residuo Gly para introducir un sitio de restricción [Sukhatme et al, (1985) Cell, 40, 591-597]). El componente transmembrana de CD4 está constituido por los residuos 375 al 395 [Sukhatme et al, (1985) Cell, 40, 591-597]. El componente intracelular del TCR Zeta está constituido por los residuos 31 al 142 [Weissman et al, (1988) PNAS, 85, 9709-9713. Moingeon et al (1990) Eur. J. Immunol, 20, 1741-1745].

Análisis de receptores quiméricos de cadena separada expresados en celulas jurkat a) Construcción de los plásmidos de expresión

Las construcciones de receptor quimérico fueron sub-clonadas de pBluescript KS+ en el vector de expresión pEE6hCMV.ne [Bebbington (1991), Methods 2, 136-145], en un fragmento de restricción Hind III hasta EcoR I, para generar los plásmidos pHMF367 y pHMF370 (ver Figura 3). Se construyó un vector de expresión expresando ambos genes del receptor quimérico de cadena separada, mediante sub-clonación de un fragmento de BgI a BamH I, constituido por el promotor hCMV, Vl / CD8* / CD4 TM / TCR Zeta y el sitio SV40 Poli A, en el sitio BamH I del pHMF367. Este plásmido con receptor doble es el pHMF374 (ver Figura 3).

b) Construcción de las líneas de células Jurkat

Se volvió a los plásmidos lineales, y se los transfectó en células Jurkat E6.1 (ECACC) mediante electroporación, utilizando un pulsador de gen Bio Rad. Se sometieron 30 \mug de ADN por 1x10^{7} células a dos pulsos de 100 V, 3 \muF en 1 ml de PBS. Se dejó que las células se recuperaran durante la noche, en un medio no selectivo, antes de seleccionarlas y cultivarlas en un medio complementado con el antibiótico G418 a 2 mg/ml. Después de aproximadamente 4 semanas, las células estaban listas para el análisis de producción de IL-2.

c) Análisis de producción del antígeno específico IL-2

Se incubaron durante toda la noche 1x10^{5} células Jurkat expresantes de plásmido de control, pEE6hCMV.ne (J. control) o de plásmido con doble receptor, pHMF374 (J.VL / VH) con células diana, a distintas proporciones efector (E):célula diana (D), en una placa de 96 pocillos (Falcon) a 37ºC/8% CO_{2}.

Las células diana usadas fueron: la línea celular de mielocitos humanos, HL60 que expresa CD33, o el mieloma de ratón, NSO transfectado con un plásmido de control, o con un CD33 humano expresante. Tras 20-24 horas, las células se centrifugaron y se sometió al sobrenadante a análisis para encontrar IL-2 (Quantikine kit, R & D Systems).

Resultados

La figura 4 muestra la producción de IL-2 a partir de células Jurkat expresantes de receptores quiméricos de cadena separada Vl / Vh, enfrentadas a células diana HL60 CD33-positivas. Las células Jurkat expresantes de un plásmido control, no produjeron IL-2 cuando se las incubó con células HL60, y las células Jurkat transfectantes expresantes de los receptores quiméricos de cadena separada no produjeron constitutivamente IL-2 en ausencia de células diana. IL-2 fue producido específicamente por transfectantes al enfrentarlos con células diana portadoras de antígenos, con la cantidad de IL-2 disminuyendo a medida que la proporción E:D aumentaba.

La Figura 5 muestra la especificidad antigénica de la producción de IL-2 a partir de transfectantes Jurkat expresantes de receptores quiméricos de cadena separada. Las células NSO transfectadas con un plásmido control fallaron al intentar obtener una respuesta IL-2 de células Jurkat expresantes de receptores quiméricos de cadena separada, sin embargo al enfrentar las células NSO que habían sido transfectadas con un plásmido CD33, y que habían mostrado expresión de CD33 en la superficie celular, los transfectantes Jurkat expresantes de receptores quiméricos de cadena separada, produjeron IL-2.

<110> CELLTECH THERAPEUTICS LIMITED

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<120> RECEPTORES QUIMERICOS

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<130> P021625WO/CPM

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<140> PCT/GB99/01417

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<141> 1999-05-06

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<160> 14

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4501 de la Figura 2

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<400> 1

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cgcaagcttg ccgccaccat ggaatggagc

\hfill

30

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<210> 2

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4502 de la Figura 2

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<400> 2

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tggactagtt gaggcagaag acactgtcac

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30

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<210> 3

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4503 de la Figura 2

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<400> 3

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cgcaagcttg ccgccaccat gtctgtccc

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29

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<210> 4

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4504 de la Figura 2

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<400> 4

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tggactagtc gtacgtttta cttctacttt ag

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32

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<210> 5

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<211> 70

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4881 de la Figura 2

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<400> 5

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cgtgccggtc ttcctgccag cgaagcccgg tgcggggcca gcgccgcgac caccaacacc

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60

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ggcgcccacc

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70

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<210> 6

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4882 de la Figura 2

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<400> 6

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gaggcggcgc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcggcc

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60

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gccctgattg tg

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72

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<210> 7

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4883 de la Figura 2

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<400> 7

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cgccgctggc cgcgccgcct ctgggcgcag ggacaggggc tgcgacgcga tggtgggcgc

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60

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cggtgttggt gg

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72

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<210> 8

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<211> 65

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4884 de la Figura 2

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<400> 8

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cgctggcagg aagaccggca cgaagtggct gaagtacatg atggagttgc tcagggcact

\hfill

60

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agttg

\hfill

65

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<210> 9

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4885 de la Figura 2

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<400> 9

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caactagtgc cctgagcaac tcc

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23

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<210> 10

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4886 de la Figura 2

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<400> 10

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cacaatcagg gcggccgcga ag

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22

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<210> 11

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4499 de la Figura 2

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<400> 11

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ctgcagttcg cggccgccct gattgtgctg gggggcgtc

\hfill

39

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<210> 12

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4500 de la Figura 2

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<400> 12

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gccgagctcc tatatgaatt ctcaaatggg gctacatgtc ttctg

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45

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<210> 13

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4700 de la Figura 2

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<400> 13

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tatgaattct tagcgagggg gcagggcctg catg

\hfill

34

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<210> 14

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<211> 101

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligo S4701 de la Figura 2

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<400> 14

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ctggacttcg cggccgccct gattgtgctg gggggcgtcg ccggcctcct gcttttcatt

\hfill

60

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gggctaggca tcttcttcag agtgaagttc agcaggagcg c

\hfill

101

Claims

1. ADN codificante para un receptor quimérico que contiene dos cadenas polipeptídicas independientes, cada una de las cuales comprende, en una secuencia del término N- al C-:

(1): un dominio extracelular de asociación a ligando;

(2): un dominio espaciador;

(3): un dominio de transmembrana; y

(4): uno o más dominios intracelulares;

con la condición de que:

el dominio de asociación a ligando de una de las cadenas polipeptídicas del receptor quimérico codificado, sea un dominio V_{H} o un fragmento del mismo, con unión al ligando; y el dominio de asociación a ligando de la otra cadena polipeptídica del receptor quimérico codificado, sea un dominio V_{L} o un fragmento del mismo, con unión al ligando;

al menos dos de los dominios mencionados en una cadena no se fusionen de manera natural con el otro; y

los dominios de asociación a ligando, y los dominios espaciadores y transmembrana son seleccionados de tal modo que cada cadena polipeptídica puede ser expresada independientemente, y se mantenga sin asociarse con la otra cadena, en ausencia de ligando.

2. ADN según la Reivindicación 1, donde cada dominio codificado intracelular es una secuencia polipeptídica de señalización que aparece de manera natural.

3. ADN según la Reivindicación 2, donde cada dominio intracelular es toda, o parte de la cadena zeta, eta o epsilon, derivada del receptor de la célula T; CD28; CD4; CD8; o la cadena \gamma de un receptor Fc.

4. ADN según la Reivindicación 3, donde la secuencia del dominio intracelular en una cadena, se deriva de una cadena intracelular de CD4 que contiene el dominio de unión lck, y el dominio intracelular en la otra cadena es una cadena zeta derivada del receptor de la célula T.

5. ADN según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, donde el dominio codificado de transmembrana es un oligo- o polipéptido derivado de todo, o parte de la cadena alfa, beta o zeta, del receptor de la célular T, CD28, CD8, CD4, CD\varepsilon o CD45.

6. ADN según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, donde cada dominio espaciador es una polipéptido que comprende entre 20 y 100 aminoácidos.

7. ADN según la Reivindicación 6, donde los dominios espaciadores y/o de transmembrana han sido modificados mediante supresión, cambio o modificación de otro tipo, de los aminoácidos que tienen cadenas laterales capaces de interactuar covalente o no covalentemente con las cadenas laterales de los aminoácidos de la otra cadena.

8. ADN según la Reivindicación 7, donde los aminoácidos que han sido modificados son seleccionados de residuos de cisteína, aminoácidos cargados o aminoácidos con sitios de glicosilación potencial.

9. ADN según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, donde cada cadena polipeptídica independiente codificada, tiene adicionalmente una secuencia de señal de secreción unida al término N- del dominio de asociación de cada cadena.

10. ADN según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, en asociación con un transportador.

11. ADN según la Reivindicación 10, donde el transportador es un vector viral, un vector liposomal, un lípido catiónico o un anticuerpo.

12. ADN según la Reivindicación 11, donde el transportador es un transportador dirigido.

13. ADN según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, que está situado en un plásmido.

14. ADN según la Reivindicación 13, que está situado en el plásmido pHMF374 tal como se describe en la Figura 3.

15. Una célula efectora aislada que contiene ADN o un plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.