ES2267259T3

ES2267259T3 - Formulaciones de escaramujo como medicina natural antiinflamatoria para aliviar/reducir sintomas asociados con inflamacion y artritis.

Info

Publication number: ES2267259T3
Application number: ES99913122T
Authority: ES
Inventors: Arsalan Kharazmi; Kaj Winther; Eydbjorg Rein
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: EP1071439B1; CY1105188T1; WO1999053934A1; ATE329605T1; EP1071439A1; JP4514333B2; AU3138099A; JP2002512197A; US6024960A; AU759394B2; DE69931907T2; NZ501790A; PT1071439E; DE69931907D1; DK1071439T3

Abstract

Un procedimiento para producir una formulación que contiene un concentrado de escaramujo que comprende: obtener una pluralidad de escaramujos; fracturar los escaramujos en pedazos; separar la pulpa de las semillas y del pelo; secar la parte de la pulpa a temperatura por debajo de de 50º en la oscuridad, hasta un contenido de agua del 5%; y triturar la parte de pulpa seca en un polvo con un tamaño de partícula de 0, 1-0, 5 mm.

Description

Formulaciones de escaramujo como medicina natural antiinflamatoria para aliviar/reducir síntomas asociados con inflamación y artritis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de escaramujo seco para la preparación de formulaciones para el tratamiento o profilaxis de varias afecciones asociadas con inflamación incluyendo artritis. La invención también se refiere a procedimientos de preparación de estas formulaciones.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades inflamatorias tales como artritis implican un amplio espectro de diferentes manifestaciones clínicas. La forma de artritis más conocida y mejor estudiada es la artritis reumatoide (AR). Varios principios generales se aplican a la patogénesis de la artritis: 1) diferentes tipos celulares tales como leucocitos polimorfonucleares, monocitos/macrófagos y células T están implicados y que estas células interaccionan entre si en esta enfermedad; 2) las citoquinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha), interleuquina-1 (IL-1) e interleuquina-6 (IL-6) controlan y amplifican los ciclos inflamatorios en muchos puntos de la evolución de la enfermedad; 3) otras vías biológicas se regulan negativa o positivamente durante la inflamación; y 4) las remisiones espontáneas no son infrecuentes en algunas formas de artritis tales como AR. Esto puede significar que ajustes menores en los factores regulatorios que activan o suprimen el proceso artrítico son suficientes para enfriar todo el proceso, dando como resultado el control de la respuesta inmune y la supresión de la inflamación y el daño tisular. En base a los principios implicados en la patogénesis de la artritis, se puede concluir que una terapia que induce una remisión verdaderamente eficaz de la artritis, probablemente no implicará necesariamente un fármaco citotóxico o un fármaco inmunosupresor potente, sino un producto menos dañino preferiblemente natural que, si se introduce o aplica de la manera correcta al paciente, puede desencadenar un proceso curativo y prevenir la progresión de la enfermedad.

La incidencia de la artritis parece ser aproximadamente la misma en la mayor parte de las poblaciones por todo el mundo, aproximadamente el 1% de mujeres adultas, y el 0,5% de hombres adultos. Se han observado algunas bolsas de mayor incidencia en ciertas partes del mundo. Sin embargo, el papel del sexo parece ser más fuerte que cualquier factor geográfico o racial como determinante de la enfermedad. Se reivindica que en el Mundo Oriental, aproximadamente el 70% de la población de edad superior a 70 tiene síntomas de osteoartritis.

Hay varias hipótesis generales sobre la causa de la enfermedad. Los determinantes genéticos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC-II) parecen estar asociados con la artritis. Factores medioambientales tales como estrés, virus tales como el virus Epstein-Barr y parvovirus, y colágeno como un autoinmunógeno también se han mencionado como factores relacionados con el desarrollo de la artritis. La enfermedad parece iniciarse mediante la activación de las células T. Las Citoquinas inflamatorias tales como TNF-\alpha están implicadas en la amplificación del proceso de la enfermedad. La proliferación de las células endoteliales en el sinovio reumatoide es un componente importante de la inflamación en la artritis. El auténtico daño tisular es causado por las células inflamatorias tales como PMN y monocitos/macrófagos. El daño se causa mediante la liberación de enzimas proteolíticas e hidrolíticas así como radicales reactivos a oxígeno tóxicos a partir de estas células activadas en el tejido y articulaciones.

La terapia para artritis implica alivio de los síntomas asociados con la enfermedad, tales como alivio del dolor, reducción de la inflamación y aumento de la capacidad de movimiento. Se han usado ácido acetilsalicílico tal como aspirina, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos tales como ibuprofeno, metotrexato y naproxeno, y glucocorticoides para el tratamiento de artritis. El control de los síntomas con estos fármacos requiere tratamiento diario de larga duración. Estos fármacos tienen diversos efectos tóxicos y otros efectos secundarios, tales como erosión gástrica y efectos adversos sobre los riñones y el hígado. Algunos de estos fármacos, particularmente los glucocorticoides, inhiben la respuesta inmune a infecciones. Por lo tanto, hay una gran necesidad de terapias alternativas para la gestión de la artritis que puedan eliminar la necesidad de fármacos tradicionales y sus efectos secundarios, particularmente para uso diario prolongado.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación para el tratamiento de los síntomas asociados con inflamación, incluyendo artritis.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación para la profilaxis de la enfermedad de artritis y la inflamación.

Es un objeto adicional proporcionar la formulación basada en un producto natural que evita sustancialmente los efectos secundarios asociados con los fármacos tradicionales usados para aliviar los síntomas asociados con la inflamación.

Es otro objeto proporcionar un procedimiento para producir una formulación obtenida de escaramujo para el tratamiento de los síntomas asociados con la inflamación, incluyendo artritis.

Estos y otros objetos de la presente invención se consiguen mediante una formulación que comprende un concentrado de escaramujo que contiene un alto contenido de vitaminas en relación con el escaramujo seco convencional. En una realización preferida, el concentrado de escaramujo comprende escaramujo molido y seco, el escaramujo se seca a temperaturas por debajo de 50ºC y en la oscuridad para mantener el alto contenido de vitaminas. El escaramujo se formula para administración oral, preferiblemente en forma de comprimido o cápsula. Pueden administrarse una o múltiples dosis de la formulación que totalicen aproximadamente 20-200 g por día.

Los inventores han descubierto una propiedad anti-inflamatoria de las formulaciones de escaramujo, y que el uso de las formulaciones, en un régimen profiláctico y/o terapéutico, previene o alivia y reduce los síntomas asociados con artritis, tal como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y otras formas de inflamación. La toma diaria de escaramujo como se describe en esta invención puede sustituir o suplementar las terapias de fármacos convencionales y mejorar la calidad de vida en pacientes que padecen artritis aliviando el dolor y mejorando la capacidad de movimiento en estos pacientes.

Escaramujo y osteoartritis

En conexión con exámenes preliminares con vistas a implantar extremidades artificiales en pacientes que padecen de osteoartritis grave en las articulaciones de la cadera y la rodilla, el departamento de cirugía ortopédica del hospital de \ring{A}benrá (\ring{A}benrá Sygehus) tenía 30 pacientes que antes de sus exámenes había tomado una combinación de aceite de pescado y formulación de escaramujo durante un periodo de 2 a 6 meses, y habían experimentado una fuerte reducción de su dolor articular. Todos los pacientes padecían osteoartritis grave y tenían una prolongada anamnesis de una triada dolorosa, es decir, dolores al caminar, al descansar y durante la noche, y todos tenían una grave destrucción de las articulaciones a juzgar por el examen clínico y los rayos X.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra la captación de vitamina C presente en el polvo de escaramujo administrado a voluntarios sanos. Una cantidad de polvo de escaramujo que tiene un equivalente de 250 mg de vitamina C presente en aproximadamente 45 g de polvo de escaramujo cuando se administra mediante toma oral a voluntarios sanos y el nivel de vitamina C en sangre se midió a diferentes puntos temporales. El polvo se tragó con ayuda de agua. Se administraron 500 mg de vitamina C disponible en el mercado en forma de comprimido a sujetos de control.

La Figura 2 es un gráfico que muestra los niveles de proteína C-reactiva (CRP) en sangre en individuos antes (día 0), durante (día 10 y día 28), y después del tratamiento (día 62) con 45 gramos de toma diaria de escaramujo durante 28 días. Los resultados se dan como valores medios y en mg/l de CRP.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la quimiotaxis de los leucocitos polimorfonucleares de sangre periférica de sujetos durante y 28 días después del cese del tratamiento, con 45 g de toma diaria de escaramujo durante 28 días. La quimiotaxis se determina hacia el péptido quimiotáctico fMLP. Los resultados se dan como cantidad media de células migradas de 17 sujetos.

La Figura 4 es un gráfico que muestra la quimiotaxis de leucocitos polimorfonucleares de sangre periférica de sujetos durante y 28 días después del cese del tratamiento con 45 gramos de toma diaria de escaramujo durante 28 días. La quimiotaxis se determina hacia suero activado con zimosan (ZAS). Los resultados se dan como cantidad media de células migradas de 17 sujetos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a una formulación que usa concentrado de escaramujo que contiene un alto contenido de vitaminas. El escaramujo se recoge de manera generalmente conocida cuando los escaramujos están completamente maduros. Pueden usarse Los escaramujos de arbustos silvestres de rosa, particularmente rosa canina, rosa gallica, rosa condita y rosa rugosa, pero los escaramujos de la rosa canina son particularmente adecuados para uso en la invención.

Después de que los escaramujos se han recogido, se pican en pedazos. Si el procedimiento posterior se retrasa, los escaramujos pueden congelarse para almacenarlos. En cualquier caso, la próxima etapa es secar los escaramujos picados hasta un contenido de agua de aproximadamente el 5% en peso. Es esencial que el secado se realice de forma que conserve el contenido de vitaminas de los escaramujos. Preferiblemente, el secado se realiza a temperatura por debajo de 50º con aire y evitando la luz solar. Dicho polvo tiene un alto contenido de vitaminas B, E y C, con aproximadamente 560 mg de vitamina C por 100 g de polvo. Puede ser beneficioso utilizar baja presión así como baja temperatura para facilitar el secado. Por encima de 50º, es posible un deterioro notable del contenido de vitaminas.

Los escaramujos secos y picados, pasan después a través de una etapa de separación para retirar semillas, pelos, y otros materiales extraños que pueden acompañar a los escaramujos durante la recogida. La pulpa restante se machaca después en un molino de pulverización. Puede obtenerse un polvo de material granular que tiene un tamaño de partícula por debajo de 1 mm, con aproximadamente de 0,1 a 0,5 mm preferido. Para facilitar la ilustración, el término "polvo" se usará para cubrir todo el espectro de los escaramujos secos sea cual sea la forma sólida que tomen. El polvo puede denominarse en este documento en ocasiones como "un concentrado" o como "un extracto" y se entenderá, por supuesto, que el polvo puede presentarse y usarse en forma de solución, suspensión o emulsión, y la invención no se limita a la forma sólida.

El polvo puede envasarse de manera convencional en bolsas, puede granularse, o colocarse directamente en cápsulas con un vehículo fisiológicamente aceptable para formulación en dosificaciones unitarias. Una ventaja del polvo de escaramujo es que puede, sin procesamiento especial, incorporarse a las comidas o bebidas tales como alimentos horneados, alimentos no horneados, frutas y otras bebidas. Así como formularse con otros suplementos dietéticos tales como vitaminas, minerales, y otros materiales que pueden ofrecer efectos beneficiosos complementarios, tales como antioxidantes. Esto simplifica sustancialmente la capacidad de una persona que padece inflamación incluyendo artritis para obtener y mantener la cantidad necesaria de la toma diaria del polvo de escaramujo para obtener resultados beneficiosos.

Una dosificación unitaria puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del polvo de escaramujo para una única administración diaria (por ejemplo, por vía oral o mediante un tubo de alimentación en una dieta enteral); o puede formularse en cantidades más pequeñas para proporcionar múltiples dosis en un día. En cualquier caso, la formulación de esta invención puede fabricarse en comprimidos, cápsulas, comprimidos encapsulados, elixires, formulaciones enterales o incorporadas en vehículos de liberación lenta. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen agua, emulsiones en aceite, alcohol o cualquiera de las formulaciones de comida/bebida descritas en este documento.

Una dosificación unitaria, como se ha afirmado anteriormente, dependerá de muchos factores incluyendo la edad, afección y estado de la enfermedad del paciente y la cantidad de veces que la unidad se tomará en un sólo día. En cualquier caso, la dosificación diaria total será la que sea fisiológicamente aceptable para un individuo y pueda administrarse diariamente durante un periodo de tiempo prolongado.

Una dosificación unitaria preferida del polvo de la invención será de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 2,0 g/kg/día. Por tanto, la cantidad total probablemente será de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 g/día, siendo preferido 40-120 g/día.

Como alternativa, las formulaciones pueden incorporarse a o usarse sobre muchas de las comidas y bebidas que se pueden consumir en un día. Comidas y bebidas adecuadas que pueden fabricarse incluyen, aunque sin limitación, bebidas nutritivas, refrescos, bebidas y zumos de fruta, bebidas que contienen electrolitos, pudins, alimentos horneados (es decir, galletas, brownies (pastelillos de chocolate), dulce de azúcar, pasteles, panes), comidas no horneadas extruidas (es decir, barras), aliños de ensalada, condimentos, golosinas (es decir, caramelos), aperitivos (es decir, patatas fritas, pretzels (lacitos), tortillas), gotas y pastas para untar, helado, golosinas congeladas y novedades, productos lácteos tales como yogur, pastas para untar similares a margarina, aliños tales como para carne, aves de corral, pescados y ensaladas. Esta invención abarca versiones sin grasa, con grasa reducida y de bajas calorías de estos alimentos. La incorporación de la formulación en comidas/bebidas proporciona las ventajas de la conformidad del paciente durante un periodo pro-
longado de uso y en una forma que es más deseable para el consumidor, en lugar de en la forma de un medicamento.

El polvo de la invención tiene diversas vitaminas y minerales como se determina de acuerdo con procedimientos convencionales. Estos se muestran en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1

Análisis (por 400 g)	Resultado
Vitamina A	<10 \mug/100 g
Vitamina B1	<0,2 mg/100 g
Vitamina B2	0,99 mg/100 g
Vitamina B6	0,20 mg/100 g
Vitamina B12	<0,5 \mug/100 g
Vitamina C	560 mg/100 g
Vitamina K1	63 \mug/100 g
Vitamina E	4,6 mg/100 g
Niacina	0,96 mg/100 g
Calcio	630 mg/100 g

TABLA 1 (continuación)

Análisis (por 400 g)	Resultado
Fósforo	160 mg/100 g
Magnesio	170 mg/100 g
Hierro	1,9 mg/100 g
Potasio	0,97%
Sodio	0,018%
Azufre	1000 mg/kg
Zinc	1,0 mg/100 g
Cobre	10,900 \mug/100 g
Manganeso	3,900 \mug/100g
Silicio	85 mg/kg
Yodo	93 \mug/100 g
Selenio total	< 0,020 mg/kg
Cromo	< 0,020 mg/kg
Molibdeno	0,21 mg/kg
Cobalto	< 0,050 mg/kg
Níquel	0,79 mg/kg
Aluminio	8,7 mg/kg
Boro	15 mg/kg
Flúor	2 mg/kg
Cloro	0,5 g/kg
Litio	0,041 mg/kg

Análisis de los contenidos

Como se muestra en la Tabla 1, el polvo de escaramujo de la invención contiene varias vitaminas tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina E, y vitamina K así como varios minerales.

Captación a través del tracto gastrointestinal

Se administraron 45 g del polvo de la invención que tenían un equivalente de 250 mg de vitamina C a voluntarios sanos mediante toma oral, con 500 mg de vitamina C dados a un grupo de control. Se midió la concentración de vitamina C en la sangre en 0, 5, 10, 15, 20 y 25 horas después de la toma. En otro estudio, se administraron diferentes cantidades del polvo de la invención a seis voluntarios sanos y la concentración de vitamina C en la sangre se midió a 0, 2 y 4 horas después de la toma.

Preparación del extracto de escaramujo

Se mezclaron 20 mg/ml de polvo de escaramujo con 4 ml de medio esencial mínimo (MEM) y se incubaron durante 19 horas a 5ºC. Después de la incubación, la mezcla se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se diluyó adicionalmente para los ensayos de función de leucocitos.

Leucocitos polimorfonucleares y monocitos

Los leucocitos polimorfonucleares (PMN) y los leucocitos mononucleares que contenían monocitos se aislaron de la sangre periférica de individuos sanos en vidrio citrado. Las células se separaron mediante un gradiente de densidad de dextrano y separación de lymphoprep. La pureza de los PMN era mayor del 98%, y la viabilidad celular según lo determinado mediante exclusión con tinte azul de tripano fue mayor del 98%. Los porcentajes de monocitos en la fracción celular mononuclear fueron de entre el 15 y el 35% y la viabilidad celular fue mayor del 98%.

Quimiotaxis

El ensayo de quimiotaxis se realizó usando una técnica de cámara de Boyden modificada como se ha descrito previamente en Jensen, P., y Kharazmi, A., Computerassisted image analysis assay of human neutrophil Chemotaxis in vitro. J. Immunol. Methods. 144:43. 1991. Los PMN o células mononucleares purificadas se preincubaron con diferentes diluciones de extracto de escaramujo durante 30 min a 37ºC. Después de la preincubación, se ensayó la quimiotaxis de las células hacia el péptido quimiotáctico f-Met-Leu-Phe (fMLP) o suero activado con zimosan (ZAS) que contiene el quimioatrayente biológicamente activo C5a. Las células migradas se contaron mediante un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador.

Quimioluminiscencia

El ensayo de quimioluminiscencia se usó como una medida de la generación de radicales de oxígeno por los PMN activados. El procedimiento se realizó como se ha descrito previamente en Kharazmi, A., Hoiby, N., Doring, G., y Valerius, N.H. Pseudomonas aeruginosa exoproteases inhibit human neutrophil chemiluminescence. Infect. Immun. 44:587, 1984. Los PMN se preincubaron con diferentes concentraciones del extracto de escaramujo de la invención y después se estimularon con fMLP o con zimosan opsonizado. La respuesta de estallido oxidativo de las células activadas se midió con un luminómetro 1250 LKB de Wallace.

Estudios in vivo Sujetos

Se incluyeron en este estudio dieciocho voluntarios sanos estando representados ambos sexos con una edad media de 48 años, en un intervalo de 30 a 62 años. Uno de los voluntarios dejó el estudio después de tres días de terapia, puesto que no pudo cambiar su programa de trabajo y estar presente en los días de toma de muestras de sangre, dejando 17 voluntarios para el estudio. Todos los objetos incluidos no tenían trastornos cardiovasculares, inmunológicos, renales, hepáticos, alérgicos, reumatológicos, o hematológicos. Tres de los sujetos, todos hombres, padecían osteoartritis leve, para la que no tomaron medicación.

Diseño del estudio in vivo

Los voluntarios se trataron con 45 gramos del polvo de escaramujo de la invención diariamente durante 28 días, seguidos de otros 28 días durante los cuales no se tomó polvo de escaramujo. Antes de su inclusión, todos los voluntarios se sometieron a un procedimiento de exploración para asegurar que ninguna de las enfermedades mencionadas anteriormente estaba presente. Además, antes de la inclusión se tomaron muestras de sangre para la proteína C-reactiva (CRP) para asegurar que ninguno de los voluntarios incluidos padecía enfermedades infecciosas desconocidas. Además, se midieron el potasio en sangre, el sodio en sangre, la creatinina en suero, la alanina-amino transferasa, la fosfatasa alcalina, el lactato deshidrogenasa, la bilirrubina, la hemoglobina y el colesterol total antes del inicio del tratamiento. Todas las medidas se realizaron de acuerdo con la rutina convencional de laboratorio. Todos los parámetros mencionados anteriormente excepto la creatinina en suero y el CRP se repitieron después de 5, 10, 21, y 28 días de terapia, y de nuevo 28 días después de la interrupción de la terapia con escaramujo. La creatinina en suero y la proteína C reactiva (CRP) se ensayaron antes de la terapia, después de 10 y de 28 días de terapia y finalmente 28 días después del cese del tratamiento. El escaramujo se tomaba junto con una comida a las 12:00 AM. Los días de toma de muestra de sangre, el polvo de escaramujo se tomaba junto con una comida ligera a las 9:00 AM, dos horas antes de la toma de muestra de sangre. La toma de muestra de muestra de sangre se realizó siempre después de 15 minutos de descanso sentados en una silla. Después de 28 días de terapia con escaramujo las muestras de sangre se recogieron en tubos de ensayo especiales y se analizaron para quimiotaxis de leucocitos polimorfonucleares usando una técnica de cámara de Boyden como se ha descrito anteriormente. La quimiotaxis de PMN se comparó después a los valores obtenidos en un periodo durante el cual los voluntarios no tomaron nada de escaramujo en los siguientes
28 días.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los datos se realizó usando un ensayo de Wilcoxon por parejas. Los valores P de menos de 0,05 se consideraron significativos.

Resultados Captación a través del tracto gastrointestinal

Como se muestra en la Figura 1, la captación de la vitamina C presente en el polvo de la invención fue tan buena o incluso mejor que la captación de vitamina C cuando se da en forma de comprimido. Las concentraciones y cinéticas de la captación a través del tracto gastrointestinal de un equivalente de 250 mg de vitamina C en el polvo de escaramujo de la invención fue similar al de 500 mg de vitamina C en forma de comprimido. La mejor absorción de la vitamina C en el polvo de escaramujo pudo deberse a una mayor área superficial del polvo de escaramujo en comparación con los comprimidos de vitamina C.

Quimiotaxis

El efecto del extracto de escaramujo sobre los leucocitos polimorfonucleares (PMN) de la sangre periférica humana, según lo medido mediante un ensayo modificado de cámara de Boyden se muestran en la Tabla 2. El extracto de escaramujo se preparó incubando el polvo de escaramujo en MEM durante 19 horas a 5ºC. Después de la incubación, la preparación se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se diluyó en MEM a concentraciones apropiadas. Las células se preincubaron con diferentes concentraciones del extracto durante 30 minutos a 37ºC. Después de la preincubación, se determinó la quimiotaxis de las células hacia el péptido quimiotáctico fMLP o el suero activado con zimosan (ZAS) que contiene C5a. Los datos son de dos experimentos representativos realizados por triplicado y presentados como porcentaje de inhibición de la quimiotaxis en comparación a la respuesta de células de control preincubadas solamente con el tampón.

TABLA 2

concentraciones de extracto de escaramujo	Experimento 1
(\mug/ml)	fMLP	ZAS
5000 (pH 4,62)	98	100
2500 (pH 5,33)	95	100
1000 (pH 6,39)	69	94
500 (pH 6,76)	49	92
100 (pH 7,06)	25	64

concentraciones de extracto de escaramujo	Experimento 2
(mg/ml)	fMLP	ZAS
5000 (pH 4,66)	100	100
5000 (pH 7,2)	100	98
2500 (pH 5,41)	100	100
2500 (pH 7,2)	99	100
1000 (pH 6,47)	93	100
1000 (pH 7,2)	93	100

Como se muestra en la Tabla 2, el extracto de escaramujo a concentraciones tan bajas como 100 \mug/ml inhibió la quimiotaxis de los neutrófilos de la sangre periférica humana. A concentraciones mayores de 100 \mug/ml, la inhibición de la quimiotaxis fue del 100%. El extracto de escaramujo ajustado a pH a concentraciones de 100 \mug/ml y mayores era un inhibidor tan potente como el extracto de escaramujo no ajustado a pH.

El efecto del extracto de escaramujo sobre la respuesta quimiotáctica a los leucocitos mononucleares en la sangre periférica humana (PBMC) según lo medido con un ensayo modificado de cámara de Boyden se muestra en la Tabla 3. El extracto de escaramujo se preparó incubando polvo de escaramujo en MEM durante 19 horas a 5ºC. Después de la incubación, la preparación se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 min y el sobrenadante se diluyó en MEM a concentraciones apropiadas. El pH del extracto de escaramujo se ajustó a pH 7,0. Las células se preincubaron con diferentes concentraciones del extracto durante 30 minutos a 37ºC. Después de la preincubación, se determinó la quimiotaxis de las células hacia el péptido quimiotáctico fMLP o el suero activado con zimosan (ZAS) que contiene C5a. Los datos son de un experimento representativo realizado por triplicado y se presentan como porcentaje de inhibición de quimiotaxis en comparación con la respuesta de células de control preincubadas solamente con el tampón.

TABLA 3

Concentraciones de extracto de escaramujo
(\mug/ml)
	fMLP	ZAS
2000	90	85
1000	94	95
500	77	90

La Tabla 3 muestra los resultados de quimiotaxis de monocitos de sangre periférica incubados con extracto de escaramujo. El extracto de escaramujo a concentraciones de 500 \mug/ml inhibió la quimiotaxis de monocitos humanos en aproximadamente el 80-90%.

Quimioluminiscencia

El efecto del extracto de escaramujo sobre los leucocitos polimorfonucleares de sangre periférica humana (PMN) según lo medido mediante un luminómetro LKB se muestra en la Tabla 4. El extracto de escaramujo se preparó incubando polvo de escaramujo en MEM durante 19 horas a 5ºC. Después de la incubación la preparación se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se diluyó en MEM a concentraciones apropiadas. Las células se preincubaron con diferentes concentraciones de extracto de escaramujo durante 30 minutos a 37ºC. Después de la preincubación, se determinó la respuesta de quimioluminiscencia de las células activadas con zimosan opsonizado. Los datos son de tres experimentos realizados por duplicado y se presentan como porcentaje de inhibición de quimioluminiscencia en comparación con la respuesta de células de control preincubadas solamente con el tampón.

TABLA 4

concentraciones de extracto de
escaramujo (\mug/ml)	Experimento 1	Experimento 2	Experimento 3
5000	71	46	68
2500	37	27	57
1000	8	8	12
500	0	0	ND
100	0	0	0
50	0	ND	ND

ND: no determinado.

Como se muestra en la Tabla 4, el extracto de escaramujo inhibió la quimioluminiscencia de PMN activadas por zimosan opsonizado. El ajuste del pH a valores fisiológicos en el extracto no influyó marcadamente en el efecto inhibitorio.

Vitamina C

Se usó vitamina C como control. La vitamina C de forma cristalina hasta una concentración de 5.000 \mug/ml casi no tuvo efecto sobre la quimioluminiscencia de PMN cuando el pH de la solución de vitamina C se ajustó al pH fisiológico 7,2.

Vitamina E

También se usó vitamina E (alfa-tocoferol) como un antioxidante de control conocido. La vitamina E a una concentración superior a 1 \mug/ml inhibió la quimioluminiscencia.

Estudio de los pacientes Química sanguínea

Los niveles sanguíneos de potasio, sodio, alanina-amino transferasa (AL/AT), fosfatasa alcalina, lactato deshidrogenasa (LDH), bilirrubina y colesterol total de antes de tratamiento y en los días 10 y 28 durante el tratamiento y 34 días después del tratamiento se muestran en la Tabla 5. Los datos se presentan como valores medios de 17 sujetos.

TABLA 5

	DIA 0	Día 10	Día 28	Día 62
Potasio (mmol/l)	4,11	4,08	4,21	4,13
Sodio(mmol/l)	138,2	137,5	139,1	141,8
AL/AT (Unidades/l)	19,18	18,12	18,71	16,56
Fosfatasa alcalina (Unidades/l)	162,7	150,7	158,2	159,1
LDH (Unidades/l)	318,8	303,7	312,4	327,3
Bilirrubina (\mumol/l)	9,41	8,00	8,29	9,43
Colesterol (mmol/l)	6,20	6,04	6,05	6,25

Como se muestra en la Tabla 5, no se produjeron cambios significativos en el potasio, sodio, alanina-amino transferasa, fosfatasa alcalina, lactato deshidrogenasa, bilirrubina, hemoglobina y colesterol total comparando los valores de antes de la terapia con los valores obtenidos después de 5, 10, 21, y 28 días de terapia y los valores obtenidos 28 días después de interrumpir la terapia. La creatinina en suero, sin embargo, disminuyó de forma significativa en comparación con los valores iniciales (92,00 \pm 82 \mumol/l) con los valores obtenidos después de 10 días (88,63 \pm 80,5) y 28 días (86,47 \pm 81,32) de terapia, respectivamente (p < 0,001). Cuando el tratamiento se había interrumpido durante 28 días los niveles de creatinina en suero aumentaron significativamente (95,56 \pm 81,20) (p < 0,001) y fueron similares a los valores obtenidos antes de la terapia.

Las concentraciones de proteína C-reactiva en diferentes individuos antes, (día 0), durante (día 10 y día 28) y después del tratamiento (día 62) con 45 gramos de toma diaria de escaramujo durante 28 días, se muestran el la Tabla 6. Los resultados se dan como mg/l de CRP.

TABLA 6

Sujetos	Día 0	Día 10	Día 28	Día 62
1	6	3	4	5
2	6	5	7	6
3	5	2	5	6
4	4	2	5	5
5	4	6	3	3
6	9	8	10	16
7	7	6	4	10
8	5	3	8	5
9	5	9	5	6
10	3	6	3	5
11	6	3	3	4
12	4	1	4	4
13	5	4	4	5
14	9	4	4	7
15	5	1	2	6
16	5	4	3	8
Media	5,50	4,19	4,56	6,31
\pm Des. típica	1,67	2,34	2,10	3,07

Los datos sobre proteína C-reactiva se muestran en la Tabla 6 y en la Figura 2. Estos resultados fueron similares a los obtenidos cuando se evalúa la creatinina en suero. El valor medio inicial de CRP fue de 5,50 \pm 1,67, disminuyó hasta 4,18 \pm 2,34 y 4,56 \pm 2,09 mg/l, después de 10 y 28 días de terapia, respectivamente (p < 0,05). Después de interrumpir la terapia durante 28 días, los niveles aumentaron hasta 6,31 \pm 3,07 mg/l (p < 0,02) en comparación al punto temporal previo.

Quimiotaxis de leucocitos polimorfonucleares

La quimiotaxis de leucocitos polimorfonucleares de sangre periférica de sujetos, durante y 28 días después del cese de tratamiento con 45 gramos de toma de escaramujo durante 28 días se muestran en la Tabla 7. La quimiotaxis se determina hacia el péptido quimiotáctico fMLP y el suero activado con zimosan (ZAS) como se muestra en la Tabla 7. Los resultados se dan como cantidad de células migradas.

TABLA 7

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	fMLP	ZAS
Sujetos	Durante	Después	Durante	Después
1	352	338	389	336
2	180	299	419	612
3	234	420	642	743
4	181	331	548	730
5	389	468	645	752
6	289	377	534	661
7	25	355	81	561
8	3	397	36	687
9	214	257	462	611
10	11	427	20	679
11	6	299	33	536
12	6	290	44	535
13	38	106	132	483
14	21	250	43	500
15	55	262	87	496
16	25	297	76	282
17	66	175	309	378
Media	123	315	265	564
\pm Desv. típica	131	92	238	141

Los datos se muestran en la Tabla 7 y en las Figuras 3 y 4. El valor medio de quimiotaxis de PMN hacia el péptido quimiotáctico fMLP fue de 123 \pm 131 cuando se ensayó en el día 28º de tratamiento con escaramujo en comparación a 315 \pm 92 cuando las muestras de sangre se tomaron 28 días después del cese del tratamiento con escaramujo
(p < 0,001). La quimiotaxis media de PMN hacia el tratamiento de zimosan con suero activado (ZAS) que contiene el factor quimiotáctico biológicamente activo C5a era de 265 \pm 288 en comparación con 564 \pm 141 cuando se ensayó 28 días después del cese del tratamiento con escaramujo (p < 0,001).

La disminución de la respuesta de quimiotaxis a fMLP fue de un 67%, una disminución considerable de la respuesta de quimiotaxis en 16 de los 17 voluntarios. La disminución en la respuesta de quimiotaxis a ZAS fue del 53%, también una disminución considerable 16 de los 17 voluntarios. Fue el mismo voluntario el que no respondió a la terapia en los dos ensayos.

Descubrimientos clínicos

Los tres voluntarios, aquejados de dolores leves de origen osteoartrítico informaron de que su dolor disminuyó después de 14 días de terapia con escaramujo. En los tres casos, el dolor volvió 12-14 días después de interrumpir la terapia. Seis voluntarios informaron de que habían dormido mejor durante la noche en el tratamiento con escaramujo. También informaron que ya no necesitaban visitar un baño durante la noche en el tratamiento con escaramujo. No se observaron reacciones alérgicas durante la terapia, pero dos voluntarios se quejaron de leves trastornos de gases gastrointestinales al final del estudio.

Conclusiones

En conclusión, los estudios descritos demuestran que el extracto de escaramujo inhibió, in vitro, la quimiotaxis y la respuesta de estallido oxidativo de los leucocitos polimorfonucleares de la sangre periférica humana, las más importantes y más abundantes células inflamatorias. El extracto también inhibió/redujo, la quimiotaxis de monocitos, otro tipo celular importante implicado en la inflamación y en la patogénesis de la artritis. Parece que la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos y la respuesta de estallido oxidativo por el extracto de escaramujo no se debió al contenido de vitamina C del extracto. Esto se demuestra mediante la incapacidad de la vitamina C ajustada a pH para inhibir la quimioluminiscencia mientras que el extracto ajustado a pH era tan inhibidor como el extracto no ajustado a pH. Las propiedades anti-inflamatorias y antioxidantes del escaramujo son importantes en la inhibición y/o reducción del daño tisular en la articulación inflamada. Además, la administración de escaramujo a pacientes con artritis dio como resultado un alivio en el dolor y una reducción en la inflamación y otros síntomas asociados con la artritis. El escaramujo administrado a una dosis de 45 gramos diariamente a voluntarios sanos durante un periodo de 28 días, inhibió la respuesta de quimiotaxis de leucocitos polimorfonucleares en aproximadamente un 50%. Además, el escaramujo rebajó el nivel de la proteína de fase agua proteína C-reactiva en los voluntarios con valores dentro de un intervalo normal, que está por debajo de 10 mg/l. Esta disminución fue significativa y se observó después de 10 días de terapia. El alivio/reducción de los síntomas físicos por escaramujo estaba en buena correlación con la quimiotaxis reducida de los neutrófilos de sangre periférica y el nivel reducido de proteína C-reactiva en los sujetos en terapia. Después de que los pacientes dejaron de tomar polvo de escaramujo, la quimiotaxis de neutrófilos y los niveles de proteína C-reactiva aumentaron hasta los valores sin tratamiento. Los datos de la química sanguínea presentados en esta invención demuestran que la toma de escaramujo no tuvo ningún efecto dañino sobre ninguno de los parámetros funcionales de hígado y riñón representados en este estudio.

Aunque el foco de la invención descrita anteriormente es para terapia en seres humanos, también se contempla usar la formulación herbal de esta invención como un producto terapéutico o profiláctico para mamíferos no humanos, incluyendo animales domésticos y de granja, que tengan artritis u otras enfermedades inmunes mediadas por células T, para las que es deseable reducir/suprimir la respuesta inmune o aliviar el dolor y la rigidez articular causados por estas enfermedades. El especialista en la técnica podría fácilmente determinar el modo y procedimiento de terapia en base al animal a tratar. Por ejemplo, la formulación podría incorporarse en la fuente de agua o comida del animal, o podría administrarse como un medicamento en forma de una cápsula, comprimido, líquido o similares.

Los fármacos disponibles hoy en día para la terapia de artritis incluyen ácido acetilsalicílico tal como aspirina, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos tales como ibuprofeno, metotrexato y naproxeno, y glucocorticoides. El control de los síntomas con estos fármacos requiere tratamiento diario de larga duración. Estos fármacos tienen diversos efectos secundarios tóxicos y de otra índole, tales como erosión gástrica y efectos adversos sobre los riñones y el hígado. Algunos de estos fármacos, particularmente los glucocorticoides, inhiben la respuesta inmune a infecciones. Por lo tanto, hay una gran necesidad de terapias alternativas para la gestión de la artritis que puedan eliminar la necesidad de los fármacos tradicionales y sus efectos secundarios, particularmente para el uso diario prolongado. El polvo de escaramujo de la invención posee estas propiedades, puesto que es eficaz, seguro y barato. Como producto natural, no tiene efectos secundarios. Puede administrarse sólo como cápsulas, comprimidos, polvo, té u otras preparaciones. También puede usarse escaramujo en polvo o extracto de escaramujo como un ingrediente incorporado en las comidas o bebidas adecuadas, sin requisito de procesado especiales, incluyendo, aunque sin limitación, alimentos horneados, golosinas, golosinas congeladas, pudins, aperitivos, aliños para ensalada, bebidas nutritivas, refrescos, bebidas de fruta, gotas y pastas para untar, helado, productos lácteos tales como yogur, pastas para untar similares a margarina, condimentos tales como condimentos para carne, aves, pescados y ensaladas, y alimentos no horneados. El polvo de escaramujo de la invención puede usarse también en combinación con otros suplementos dietéticos tales como vitaminas, minerales y antioxidantes. Las preparaciones que contienen escaramujo pueden diseñarse para consumo diario como parte de un régimen terapéutico para la artritis, o como un régimen profiláctico para individuos que tengan una predisposición genética o ambiental a la artritis.

Claims

1. Un procedimiento para producir una formulación que contiene un concentrado de escaramujo que comprende:

obtener una pluralidad de escaramujos;

fracturar los escaramujos en pedazos;

separar la pulpa de las semillas y del pelo;

secar la parte de la pulpa a temperatura por debajo de de 50º en la oscuridad, hasta un contenido de agua del 5%; y

triturar la parte de pulpa seca en un polvo con un tamaño de partícula de 0,1-0,5 mm.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además el uso de pedazos de escaramujo congelados antes de la etapa de separación.

3. Una comida o bebida que contiene la formulación que se consigue mediante el procedimiento de la reivindicación 1.