ES2266296T3 - Segmentos preferidos de proteina de la cadena neural y procedimientos de uso de los mismos. - Google Patents

Segmentos preferidos de proteina de la cadena neural y procedimientos de uso de los mismos. Download PDF

Info

Publication number
ES2266296T3
ES2266296T3 ES01988772T ES01988772T ES2266296T3 ES 2266296 T3 ES2266296 T3 ES 2266296T3 ES 01988772 T ES01988772 T ES 01988772T ES 01988772 T ES01988772 T ES 01988772T ES 2266296 T3 ES2266296 T3 ES 2266296T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
ntp
peptides
protein
baselineskip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01988772T
Other languages
English (en)
Inventor
Judith Fitzpatrick
Paul Averback
Ma. Soledad S. Focht
Riza Bibiano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nymox Pharmaceutical Corp Canada
Original Assignee
Nymox Pharmaceutical Corp Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nymox Pharmaceutical Corp Canada filed Critical Nymox Pharmaceutical Corp Canada
Application granted granted Critical
Publication of ES2266296T3 publication Critical patent/ES2266296T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un péptido que no supera los 25 aminoácidos de longitud que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: (a) H H A R L; (b) H A R L I; (c) H A R L I L; (d) H H A R L C L; (e) A R L I L; (f) H H A R L I F; (g) T H A R L I L; (h) H A R L C L; (i) A R L C L; (j) M F A R L I L; (k) F A R L I L; (l) F A R L I; (m) H A R L I F.

Description

Segmentos preferidos de proteína de la cadena neural y procedimientos de uso de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a segmentos preferidos de proteína de la cadena neural útiles, por ejemplo, en ensayos de unión, purificación de proteína, terapia y diagnóstico.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa actualmente incurable que afecta al menos a 12 millones de personas en todo el mundo. La EA es predominantemente una enfermedad de la ancianidad, con una tasa de incidencia de aproximadamente un 1% para los 65 años de edad y elevándose estimadamente a un 40% para los 85 años de edad. Ya que la población en conjunto se hace mayor debido a los avances médicos, el aumento de las expectativas de vida y el envejecimiento de la generación del "baby boom", se espera que la incidencia global de la EA aumente y presente una carga aún mayor para los sistemas sanitarios y para los pacientes y sus cuidadores y familias.
No existe a día de hoy un tratamiento eficaz para la EA. Los tratamientos disponibles actualmente tales como Aricept® (HCl de donepezilo; Pfizer Corp.), Exelon® (tartrato de rivastigmina; Novartis Pharmaceuticals Corp.) y Cognex® (tacrina; Warner Lambert Corp.) pretenden proporcionar una medida de alivio sintomático para pacientes con EA leve a moderada y no se dirigen a las causas de la enfermedad.
El diagnóstico clínico de la EA es también imperfecto, la exactitud varía desde aproximadamente 50-60% para médicos de cabecera a 80-90% para especialistas en enfermedad de Alzheimer en centros de referencia (Moisa et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48(11): 1085-1090 (1985); Rocca et al., Ann. Neurol. 19: 415-424 (1986); Burns et al., BMJ, 301 (6759); 1026 (1990); Risse et al., Am. J. Psychiatry, 147(2): 168-172 (1990); Gilleard et al., Acta Psychiatr. Scand. 85(4): 264-269 (1992); Méndez et al., Alzheimer Dis. Assoc. Disord., 6: 35-43 (1992); Fleming et al., Mayo Clin. Proc., 7: 1093-1107 (1995); Corey-Bloom et al., Neurology, 45: 211-218 (1995) y Bowler et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 64(1): 18-24 (1998). Hay un retardo medio de casi tres años desde los síntomas iniciales hasta cuando se hace el diagnóstico de EA (Jorst et al., J. Am. Geriatr. Soc., 43(11); 1248-1255 (1995)).
Se ha reconocido que un biomarcador fiable sería una ayuda significativa en el diagnóstico exacto y temprano de la EA (Growdon et al., Neurobiol. Aging, 19: 109-116 (1998)). Aunque están actualmente disponibles diversos marcadores bioquímicos y genéticos, sus correlaciones clínico-patológicas se consideran generalmente demasiado bajas para uso clínico rutinario. Por ejemplo, el alelo \varepsilon4 de apolipoproteína E es un factor de riesgo genético que se encuentra sólo en un 50% de los casos de EA (Myers et al., Neurology 46(3): 673-677 (1996)), y las medidas de proteína tau y beta-amiloide en líquido cefalorraquídeo (LCR) y Ap sérica tienen una superposición significativa entre los niveles con EA y sin EA, limitando su utilidad (Pirttila et al., J. Neurol. Sci., 127(1): 90-95 (1994); Arai et al., Ann. Neurol., 38: 649-652 (1995); Jensen et al., Neurosci. Lett., 186(2-3); 189-191 (1995); Motter et al., Ann. Neurol., 38(4): 643-648 (1995); Munroe et al., Ann. Clin. Lab. Sci., 25(3): 207-217 (1995); Tata et al., J. Neural. Neurosurg. Psychiatr., 59: 280-283 (1995); Vigo-Palfrey et al., Neurology, 45(4): 788-793 (1995); Iwatsubo T., Neurobiol. Aging, 19: 161-163 (1998); Nitsch et al., Ann. Neurol., 37(4): 512-518 (1995); van Gool et al., Ann. Neurol., 37(2): 277-279 (1995); Tamaoka et al., J. Neurol. Sci., 151(1-2); 65-68 (1996) y Pirtilla et al., Arch. Neurol., 53(2): 189-193 (1996)). Otros marcadores propuestos, tales como la respuesta pupilar a la tropicamida (Scinto et al., Science, 266: 1051-1054 (1994) y Growdon et al., Arch. Neurol., 54(7): 841-844 (1997)) y factores séricos tales como p-97 (Kennard et al., Nat. Med., 2(11): 1230-1235 (1996)), no se han validado todavía en estudios clínicos controlados repetidos. Los mayores inconvenientes de la mayoría de marcadores de EA propuestos son que habitualmente son moléculas no específicas de cerebro asociadas a la patología de EA y que no son medibles fiablemente en fluidos periféricos.
Las proteínas de la cadena neural (NTP) son una nueva familia de proteínas cerebrales recientemente caracterizadas. La NTP es una fosfoproteína asociada a membrana de \sim41 kDa con funciones relacionadas con arborización neurítica y muerte celular (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); y de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). Existen evidencias convincentes que ligan la NTP con la EA. El ARNm de NTP se regula positivamente en el cerebro con EA en comparación con los controles; los niveles de proteína NTP en cerebro y LCR son mayores en EA que en los controles; y se encuentra claramente inmunorreactividad de NTP en placas seniles, en marañas neurofibrilares (NFT), en neuronas degeneradas, hebras de neuropilo y arborizaciones neuríticas distróficas en cerebros con EA y síndrome de Down (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113(2): 152-164 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733-742 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-1050 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2); 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-125 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997) y de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). La acumulación de NTP en las neuronas ocurre tempranamente en la neurodegeneración de EA (antes de la formación de NFT). Se ha identificado también NTP en tejido de cerebro con síndrome de Down (Wands et al., publicación de patente internacional nº WO 90/06993; de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). La mayoría de los pacientes con síndrome de Down exhiben una neuropatología similar a la de la EA después de la mediana edad y desarrollan muchos defectos cognitivos similares a los de la EA más adelante.
Se ha mostrado que los niveles de NTP en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EA y controles son consistentemente elevados en EA (Chong et al.. J. Clin. Lab. Anal. 6(6): 379-383 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol. 32: 733-742 (1992); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal. 12(4): 223-226 (1998); Ghanbari et al., J. Contemp. Neurol., 1998: 2-8 (1998); Kahle et al., Neurology, 54(7); 1498-1504 (2000)). Se ha mostrado la especificidad de la elevación de NTP en EA en comparación con controles de enfermedad neurológica no EA, y la elevación de NTP estaba correlacionada positivamente con el grado de demencia (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997) y de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999) y Kahle et al., Neurology, 54(7): 1498-1504 (2000)). En un estudio mayor, un 89% de los pacientes de EA temprana tenían niveles de NTP superiores a 2 ng/ml en LCR y un 89% de los controles sin EA inferiores a 2 ng/ml en LCR (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997)).
Posteriormente, se identificó la proteína NTP en la orina mediante cromatografía líquida de alta resolución, electroforesis capilar y ELISA (Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal. 12(4): 285-288 (1998) y de la Monte et al., Alz. Rep. 2: 327-332 (1999)). Se ha encontrado que los niveles de NTP urinaria se correlacionaban con los niveles de LCR en pacientes con EA y controles y que estaban significativamente elevados en pacientes con EA en comparación con pacientes sin EA (Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal., 12(4): 285-288 (1998)). Se ha desarrollado un ensayo que utiliza partículas de oro con anticuerpo monoclonal anti-NTP unido en la fase líquida para muestras de orina y se ha demostrado es tanto altamente sensible como específico de EA (Fitzpatrick et al., Alzheimer Reports, 3(3): 155-159 (2000)).
Existe la necesidad de mejorar los ensayos existentes de NTP, incluyendo la necesidad de desarrollar ensayos en el punto de atención para NTP que puedan realizarse en un laboratorio médico general o la consulta de un médico. Los avances técnicos tales como procedimientos para purificar rutinariamente NTP nativa a partir de orina de manera eficaz de costes o el desarrollo de análogos de NTP fabricados fácilmente mejoraría también cualquiera de dichos ensayos.
Existen evidencias que muestran que la NTP puede desempeñar un papel directo en la patogénesis de la EA, haciéndola así una diana para el desarrollo de fármacos para el tratamiento de la EA. La NTP está asociada a arborización neurítica, la arborización neurítica anormal está asociada a la EA. La sobreexpresión de NTP puede causar acumulaciones celulares de fosfo-tau, que a su vez preceden a la formación de NFT, un correlato neuroanatómico importante de demencia en la EA (de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)). Además, la sobreexpresión de NTP puede causar una muerte celular aumentada de naturaleza apoptótica ligada al estrés oxidativo (de la Monte et al., 1999). Inhibir la expresión de la acción bioquímica de NTP ofrece una ruta prometedora para un tratamiento eficaz de la EA.
Se han identificado y descrito las secuencias génica y proteica predicha para NTP (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997)). La proteína de la cadena neural se describió y reivindicó por primera vez en las patentes de EE.UU. nº 5.948.634, 5.948.888 y 5.830.670, todas de "Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer’s Disease".
Se han identificado otras especies de proteína de la cadena neural (\sim26 kDa, \sim21 kDa, \sim17 kDa y \sim15 kDa) y asociado a tumores neuroectodérmicos, astrocitomas y glioblastomas y a lesiones debidas a hipoxia, isquemia o infarto cerebral (de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55(10): 1038-1050 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-125 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3194 (1997) y de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)).
El documento WO 00/58495 da a conocer péptidos que tienen una secuencia derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cadena neural (NTP) y que comprende un motivo ARL, incluyendo las secuencias MFARUL y HARUL, así como ácidos nucleicos que contienen las secuencias peptídicas, anticuerpos dirigidos contra estas secuencias y el uso de péptidos para diagnosticar, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer.
El documento US-A-5948634 da a conocer la proteína de la cadena neural completa que comprende las secuencias THARLIL, HHARLCL, MFARUL y HHARLIF. La publicación proporciona también el gen que codifica la NTP, anticuerpos dirigidos contra la NTP y su uso para purificar NTP, así como procedimientos de diagnóstico de enfermedad de Alzheimer que comprenden detectar la NTP.
El documento WO 00/55198 da a conocer un péptido de 85 aminoácidos derivado de NTP y anticuerpos contra el péptido y su uso para el diagnóstico de enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer.
El documento WO 96/18646 da a conocer un péptido de 15 unidades que comprende la secuencia ARLI, y el documento WO 00/01720 da a conocer un péptido de 15 unidades que comprende la secuencia HARL.
El documento WO 99/16710 da a conocer péptidos de 27 unidades que comprenden la secuencia FARL.
El documento EP-A-0068375 proporciona un péptido de 22 unidades que comprende la secuencia ARLC, así como el gen que codifica el péptido.
Finalmente, el documento WO 96/14334 y Vasilakos, J.P. et al., J. Immunol., vol. 150, 6, 1993, pág. 2346-2355 describen péptidos de menos de 25 aminoácidos de longitud y que contienen las secuencias FARL y ARLIF.
Existe la necesidad en la técnica de composiciones de NTP mejoradas, útiles en terapia y diagnóstico relacionados con EA y síndrome de Down, y de composiciones relacionadas con otras especies de proteína de la cadena neural útiles en terapia y diagnóstico de tumores neuroectodérmicos, astrocitomas, glioblastomas y otros trastornos neurodegenerativos y lesiones debidas a hipoxia, isquemia e infarto cerebral. La presente invención satisface estas necesidades.
Sumario de la invención
La presente invención está dirigida a una familia de nuevas secuencias repetidas de NTP que tienen la secuencia consenso "H A R L I L". Los péptidos Harlil comprendidos en la invención incluyen, pero sin limitación, "H A R L I L", "H A R L C L", "H H A R L C L", "M F A R L I L", "A R L I L", "H A R L I F", "H H A R L I F". Este grupo de péptidos de NTP se designan colectivamente como "péptidos Harlil".
La invención surge del descubrimiento inesperado de que los péptidos Harlil tienen características de unión únicas:
-
tienen afinidad de unión a NTP, haciéndolos así útiles para purificación de NTP a partir de fluidos corporales tales como orina, LCR o sangre; como asociado de unión para la captura de NTP, para la detección y medida de NTP en fluidos corporales tales como orina, LCR o sangre; para el desarrollo de fármacos para EA y síndrome de Down, así como otras cuestiones dadas a conocer a continuación;
-
tienen afinidad de unión a muchas inmunoglobulinas, haciéndolos así útiles para la purificación de inmunoglobulinas, la detección y la medida de dichas inmunoglobulinas;
-
tienen afinidad de unión a sí mismos, haciéndolos así útiles para la separación, medida de ensayo y/o purificación de proteínas conjugadas a ellos, el uso como análogo de NTP en un ensayo, así como otras cuestiones dadas a conocer a continuación; y
-
parecen funcionar en autoensamblaje y/o interacción con NTP con otras proteínas, haciéndolos útiles como dianas terapéuticas.
La invención abarca ácidos nucleicos correspondientes a los péptidos Harlil.
Otro aspecto de la invención está dirigido a composiciones que comprenden uno o más péptidos Harlil. Las composiciones pueden ser útiles, por ejemplo, en tratamientos terapéuticos para EA y otros trastornos neurodegenerativos.
La invención abarca el uso de un péptido Harlil en el diagnóstico de EA y otros trastornos neurodegenerativos. Aunque la NTP se encuentra en todos los seres humanos, se encuentra una cantidad elevada en pacientes diagnosticados médicamente por tener EA (concretamente, pacientes DSM4). La cantidad de NTP se correlacionada con la presencia de EA, tumores neuroectodérmicos, astrocitomas, glioblastomas y otros trastornos neurodegenerativos.
Los péptidos Harlil de la invención pueden estar marcados en dichos ensayos de diagnóstico.
Aún otro aspecto de la presente invención está dirigido a kits de ensayo de diagnóstico para desarrollar un procedimiento de diagnóstico de la invención. Dichos kits de ensayo comprenden uno o más péptidos Harlil y reactivos adecuados.
La invención abarca también procedimientos de purificación de NTP a partir de una muestra biológica utilizando un péptido Harlil.
Tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplares y explicativas, y se pretende que proporcionen una explicación adicional de la invención reivindicada. Otros objetos, ventajas y nuevos rasgos resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada siguiente de la invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: muestra la secuencia de NTP completa y la localización de las secuencias Harlil dentro de la secuencia NTP completa (de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55: 1038-1050 (1996));
Figura 2: muestra la inhibición de la unión del conjugado de inmunoglobulina de conejo anti-ratón a una placa de microvaloración recubierta con péptido Harlil (NTP-3) en función de la concentración de NTP-3/RGG competitivo (eje x) (datos descritos en el ejemplo 5);
Figura 3: muestra los resultados de ensayos de 107 muestras biológicas utilizando un ensayo de membrana basado en péptido Harlil (datos mostrados en el ejemplo 4);
Figura 4: muestra los resultados de un ensayo que determina la porción de un anticuerpo al que se une NTP (datos mostrados en el ejemplo 6);
Figura 5: compara la linealidad de una muestra de control de orina y NTP recombinante en un ensayo de NTP competitivo de formato ELISA (datos mostrados en el ejemplo 6);
Figura 6: muestra los resultados de un ensayo de afinidad competitivo para distinguir las muestras diagnosticadas como EA de las de individuos normales de edad coincidente en formato ELISA utilizando un péptido Harlil, que demuestra una cantidad umbral presente en pacientes positivos de EA (datos descritos en el ejemplo 8).
Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida a una composición que comprende una nueva secuencia repetida de NTP, designada como "la secuencia Harlil". La secuencia aparece cuatro veces en la secuencia de aminoácidos de NTP:
(a) 45-51 T H A R L I L
(b) 90-96 H H A R L C L
(c) 263-269 M F A R L I L
(d) 292-296 H H A R L I F
Véase la fig. 1.
La invención abarca péptidos que tienen la secuencia de cualquiera de las regiones (a), (b), (c), (d) u homólogos de éstas (incluyendo, pero sin limitación, "H A R L M L"). Los péptidos Harlil pueden tener también restos de aminoácidos adicionales antes o después de la secuencia Harlil en péptidos de engarce. Los restos de aminoácidos adicionales o péptidos de engarce pueden ser aquellos encontrados en la secuencia de NTP antes o después de la secuencia Harlil. Por ejemplo, los restos de aminoácidos G I T G M C T aparecen antes del resto 46 y los restos de aminoácidos Y F F L V aparecen después del aminoácido 50 en la secuencia de NTP. Por tanto, un péptido Harlil abarcado por la invención incluye el péptido de NTP G I T G M C T H A R L I L Y F F L V. Para los péptidos Harlil indicados en (b), (c) y (d), los restos de aminoácidos adicionales son aquellos que flanquean la secuencia Harlil en la secuencia de NTP. Sin embargo, no hay evidencias de que las secuencias flanqueantes sirvan como otra cosa que un engarce. El péptido Harlil que tiene restos de aminoácidos adicionales no supera los 25 restos de aminoácidos totales de longitud.
La secuencia repetida Harlil tiene las siguientes características únicas: (1) puede unirse a NTP, (2) puede unirse a muchas inmunoglobulinas y (3) puede unirse a sí misma. Estas características únicas posibilitan y sugieren diversas aplicaciones de diagnóstico y terapia como se describen a continuación.
A. Composiciones
La presente invención está dirigida a péptidos Harlil de NTP, al uso de dichos péptidos como asociados de unión por afinidad de NTP para ensayo o purificación de NTP, al uso de los péptidos Harlil para bloquear los sitios de péptido Harlil en NTP. Están también abarcados por la presente invención ácidos nucleicos que codifican los péptidos Harlil.
Los péptidos Harlil pueden prepararse utilizando técnicas de síntesis peptídica convencionales.
Los ácidos nucleicos que codifican péptidos Harlil pueden prepararse, por ejemplo, utilizando (a) procedimientos recombinantes estándar, (b) técnicas sintéticas o (c) combinaciones de los mismos.
B. Propiedades de los péptidos Harlil 1. Unión a NTP
La secuencia Harlil muestra especificidad de unión a NTP. Cuando se inmoviliza un péptido Harlil, puede utilizarse para purificar NTP a partir de soluciones. Cuando se utiliza para capturar NTP como parte de un ensayo de afinidad, la unión a NTP es muy específica y no está afectada por el pH de 3,5 a 8. La sensibilidad de este ensayo de afinidad es al menos tan alta como un inmunoensayo. Por ejemplo, un conjunto de orina positiva que contiene aproximadamente 0,5 ng/ml de NTP según ELISA puede diluirse casi 4 veces y seguir diferenciándose de un conjunto negativo mediante este ensayo de afinidad (esto se describe con más detalle en el ejemplo 6 siguiente). Además, la sensibilidad del ensayo puede mejorarse utilizando un medio de detección más sensible, tal como utilizando sustratos fluorescentes o quimioluminiscentes o ensayos radiomarcados.
Debido a que los péptidos Harlil de la invención se unen específicamente a NTP, pueden utilizarse en ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de NTP en una muestra biológica. Se ha mostrado que niveles superiores a lo normal de NTP en fluidos corporales indican la presencia de EA, síndrome de Down u otras enfermedades cerebrales degenerativas.
2. Unión a inmunoglobulinas
Los péptidos Harlil se unen a muchas inmunoglobulinas. La unión peptídica parece ser mediante la porción Fc del anticuerpo, y no mediante la porción Fab. La unión a inmunoglobulinas aparece a pH fisiológico, aunque algunas inmunoglobulinas se unen también a pH menores. La unión a un pH menor indica la fuerte afinidad entre el péptido Harlil y ciertos anticuerpos, y elimina la posibilidad de que la unión fuera debida a interacciones carga/carga en lugar de afinidad.
Debido a que los péptidos Harlil se unen a inmunoglobulinas, son útiles en la purificación de moléculas de inmunoglobulina. La afinidad del monómero de Harlil por la inmunoglobulina es bastante baja y, por tanto, la avidez de los conjugados de Harlil puede controlarse controlando la densidad peptídica. Con una densidad de péptido Harlil aumentada, aumenta la afinidad por inmunoglobulina. Es deseable utilizar columnas de afinidad baja a moderada porque las columnas de alta afinidad requieren condiciones de elución drásticas que pueden desnaturalizar proteínas y anticuerpos y eluir en picos diluidos anchos, lo que es indeseable debido a la dilución de los productos eluídos (Wikström et al., J. of Chromatography, 597: 83-92 (1992)). Dicha dilución requiere una concentración adicional de las proteínas o anticuerpos eluídos, y da como resultado una pérdida y/o daño del producto de proteína o anticuerpo.
En contraposición, la cromatografía de baja afinidad, tal como la que puede utilizarse con un péptido Harlil, tiene la ventaja de estrechar el pico de elución y evitar condiciones drásticas. Ibid. Dichos procedimientos de purificación son valiosos para purificar anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico, proporcionando proteínas purificadas útiles en aplicaciones farmacéuticas y de diagnóstico.
Los análogos peptídicos conocidos anteriores útiles para purificación de inmunoglobulina tienen secuencias mucho más largas que la de un péptido Harlil y parecen requerir o imitar una estructura secundaria mediante la que interaccionar con inmunoglobulinas (Fassina et al., J. of Mol. Recognition, 9: 564-569 (1996); Guerrier et al., J. of Mol. Recognition, 11: 107-109 (1998); Palombo et al., J. of Mol. Recognition, 11: 247-249 (1998); Braisted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 5688-5692 (1996); Fassina et al., J. of Mol. Recognition, 11: 128-133 (1998); Palombo et al., J. of Mol. Recognition, 11: 243-246 (1998); Li et al., Nat. Biotechnol., 16: 190-195 (1998) y las patentes de EE.UU. nº 5.084.559, 5.100.788, 6.013.763. Los péptidos Harlil relativamente cortos de la invención son mucho más fáciles y eficaces de costes para producir y almacenar.
Aún otra aplicación de los péptidos Harlil de la invención se refiere a su uso en ensayos de diagnóstico en formatos tales como ELISA y tiras de inmunocromatografía. Debido a que los péptidos Harlil de la invención se unen a inmunoglobulinas, los péptidos proporcionan un material de captura eficaz de costes sustituto de anti-anticuerpo y proteína A y G para captura, separación o anclaje en sistemas de inmunoensayo. Los materiales de captura actuales empleados en ELISA y tiras de inmunocromatografía, concretamente, anti-anticuerpo y proteínas A y G, son caros de preparar y mantener. Esto está en contraposición con los péptidos Harlil de la invención, relativamente sencillos de preparar y eficaces de costes para almacenar.
3. Unión a sí mismos
Los péptidos Harlil y análogos de la invención son capaces de unirse a sí mismos y por tanto, cuando se conjugan a proteínas, las proteínas autoagregarán si no se mantienen a un pH muy bajo o a una dilución muy baja. La proteína vehículo puede autoagregar y precipitar de la solución a pH neutro.
Además, debido a su característica única de autounión, puede utilizarse un péptido Harlil como análogo de NTP en un ensayo. Esto es debido a que el péptido Harlil duplica la característica de autounión de la NTP. En un ensayo secuencial o competitivo, la NTP se unirá al péptido Harlil conjugado en fase sólida, y permanece durante los lavados bloqueando la unión de inmunoglobulina (tal como IgG de conejo). Los péptidos Harlil pueden utilizarse también como reemplazo de anticuerpo de captura en un ensayo de sándwich. Los péptidos Harlil de la invención son materiales de ensayo menos caros y más eficaces de costes que la proteína NTP.
La propiedad de autoagregación de los péptidos Harlil puede tener aplicaciones terapéuticas. Debido a que las secuencias Harlil causan que las proteínas a las que se conjugan se unan entre sí, esto indica que mediante estas secuencias la NTP se autoasocia y/o se asocia con otras proteínas. Esta asociación podría ser intramolecular o intermolecular. La capacidad de una columna de afinidad y una placa de microvaloración de unirse a NTP libre (como se describe en
los ejemplos siguientes) indica que en NTP nativa la secuencia Harlil es probablemente accesible a la superficie.
Es posible que la toxicidad de la NTP sea debida completa o parcialmente a las altamente interactivas secuencias Harlil. Por tanto, la toxicidad de la NTP podría ser debida a la autoagregación o podría ser debida a la interacción de las altamente reactivas secuencias Harlil con otros componentes cerebrales. Al bloquear esta secuencia de NTP, puede bloquearse su capacidad interactiva.
Resulta evidente que la NTP participa en la cascada neurodegenerativa. La capacidad de interrumpir o redirigir la cascada dirigiéndose a NTP ofrece una oportunidad terapéutica. Por ejemplo, puede ser posible intervenir terapéuticamente utilizando la capacidad de los péptidos Harlil de interaccionar con sitios de unión de NTP, bloqueando así sitios reactivos potenciales en NTP. Como alternativa, los péptidos Harlil y miméticos de la invención pueden ser útiles para dirigir fármacos a células que expresan la secuencia Harlil.
Se han utilizado péptidos que se autoasocian en biomateriales como bioadhesivos. Por tanto, pueden utilizarse las cualidades autoasociativas o de autorreconocimiento del péptido para inducir a proteínas o péptidos no asociativos a asociarse, para anclar restos a superficies o para dirigir moléculas a sitios blanco. Se reconoce que dichos péptidos que inducen la adhesión celular podrían ser útiles en el diseño de tejidos y órganos sintéticos (Mayo, K.H., TIBTECH, 187: 212-217 (mayo de 2000). Dichos materiales se han mostrado también útiles por sí mismos en la construcción de sistemas de gel que son sensibles al pH y la unión (Id.). Además, la polimerización y/o múltiples repeticiones de las secuencias del péptido Harlil podrían proporcionar composiciones que tengan rasgos estructurales y mayor avidez.
La repetición de la secuencia Harlil en la secuencia de NTP indica que la secuencia Harlil probablemente desempeña un papel en el ensamblaje o polimerización de la NTP. Por ejemplo, en colágeno las regiones de las cadenas separadas que se autoasocian en sitios que posteriormente forman engarces de piridinolina exhiben también una alta homología, indicando que estas regiones homólogas autoidentificativas sirven a un propósito estructural y funcional clave. Es probable que los sitios "HARLIL" interaccionen individualmente o en serie polimérica con otras proteínas cerebrales y sean claves en la funcionalidad de la NTP.
Si la sobreproducción de NTP contribuye a la patología de EA y enfermedades neurodegenerativas relacionadas, entonces podrían inhibirse la producción o plegado de la proteína NTP, y/o podría evitarse la polimerización o la interacción de NTP con otros componentes, con terapias basadas en el modelo HARLIL. Por ejemplo, si mediante la administración de uno o más péptidos Harlil pudiera inhibirse la agregación, plegado o ensamblaje de NTP, podría esperarse una degradación por proteasa potenciada de la NTP. Por tanto, podría conseguirse la eliminación de la NTP en exceso mediante la administración de uno o más péptidos Harlil. Como alternativa, una terapia con péptido Harlil puede ser útil para controlar la interacción de monómero o agregado de NTP con otros componentes de la cascada neurodegenerativa.
Numerosas proteínas que se autoensamblan o polimerizan tienen estructuras repetidas. La mejor conocida es el colágeno, que porta la secuencia repetida corta gly X Y del orden de seis veces por cadena (Lacy et al., "Identification of FLRT1, FLRT2 and FLRT3: a novel family of transmembrane leucine rich repeat proteins", Genomics, 62(3): 417-426 (1999)). Otros estudios han mostrado que la secuencias repetidas específicas están implicadas en la nucleación de la unión (Snellman et al., "A short sequence in the N-terminal region is required for the trimerization of type XIII collagen and is conserved in other collagenous transmembrane proteins", EMBO J., 19(19): 5051-5059 (2000)). Además, hay estudios que muestran que el péptido de colágeno Pro Pro Gly, que es crítico para el autoensamblaje, es también crítico en la interacción de procolágeno con el chaperón HSP7 (Koide et al., "Conformational requirements of collagenous peptides for recognition by the chaperone protein HSP47", Biol. Chem. 275(36): 27957-27963 (2000)). Se ha estudiado la especificidad del autoreconocimiento en laminina (Schittny, J.C., "Affinity Retardation Chromatography: Characterization of the Method and its Application", Anal. Biochem., 222: 140-148 (1994)).
Por tanto, resulta evidente que las proteínas que polimerizan o forman estructuras fibrilares lo hacen generalmente autoensamblando sobre sí mismas a través de dominios específicos en los dominios específicos de reconocimiento de proteína (autorreconocimiento). Además, estas proteínas pueden utilizar estos mismos sitios de reconocimiento para interacciones con otras proteínas. Como con las interacciones de proteína A con Fc (Deisenhofer, J., "Crystallographic Refinement and Atomic Models of a Human Fc Fragment and its complex with Fragment B of Protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A Resolution", Biochem., 20(9): 2361-2370 (1981)), estas interacciones como las de la secuencia Harlil parecen ser a través de interacciones hidrófobas e iónicas.
En el caso de NTP, parece que los dominios Harlil, que funcionan lo más probablemente en autoensamblaje, son altamente homólogos y, es más, casi completamente conservados. La "cremallera de leucina" utiliza un autorreconocimiento en el que se unen entre sí regiones ricas en leucina. Sin embargo, una cremallera de leucina no es tan única cono la secuencia Harlil. La secuencia Harlil se prevé que desempeñe un papel crítico en el autoensamblaje y la interacción de NTP con otros componentes cerebrales.
Los priones y experimentos con elementos priónicos en levadura proporcionan evidencias de que las proteínas pueden asumir una conformación autoagregante (Serio et al., "Nucleated Conformational Conversion and the Replication of Conformational Information by a Prion Determinant", Science, 289: 1317-1321 (2000); y Sparrer H.E., "Evidence for the Prion Hypothesis: Induction of the Yeast (PSI+) Factor by in vitro-Converted Sup35 protein", Science, 289 (5479): 595-599 (2000)).
Li y Lindquist han mostrado que pueden conferir la actividad priónica SUP a una proteína no relacionada fusionando genéticamente porciones de la proteína SUP que contienen la secuencia peptídica 22-69. Por tanto, demostraron que la característica de atribución priónica de la proteína SUP35 reside en el péptido SUP 22-69. Por analogía, la presente invención está dirigida a un péptido autoidentificativo que causa agregación. Al injertar la secuencia en una proteína (mediante conjugación), puede conferirse autoagregación a esa proteína: como resultado, se observa la precipitación inmediata de hasta un 95% del conjugado de proteína Harlil a pH fisiológico.
Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que la invención no está limitada a las condiciones o detalles específicos descritos en estos ejemplos.
Ejemplo 1
El propósito de este ejemplo era identificar varias secuencias Harlil de proteína de la cadena neural y determinar su reactividad con NTP.
Se sintetizaron las siguientes secuencias Harlil (Synpep, Dublín, CA) y se conjugaron con IgG de conejo activada con maleimida (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y se evaluó su inmunorreactividad NTP. Se añadió un engarce que es una repetición de la secuencia proteica que aparece antes y después de la secuencia 90-96 H H A R L C L de NTP.
100
La conjugación a proteínas vehículo fue a través de una cisteína. Por tanto, los péptidos NTP-1 y NTP-2 produjeron resultados conjugados mixtos debido a que hay más de un resto de cisteína. Por lo tanto, para los péptidos NTP-5 y NTP-6, se bloqueó la cisteína secundaria con ACM.
Se muestra en la Fig. 1 la localización de las secuencias identificadas en la secuencia NTP. Aunque todos los análogos de Harlil mostraron algo de reactividad, se seleccionó NTP-3 para la mayoría de los estudios porque proporcionaba una buena reactividad, siendo más fácil para trabajar al tener un solo resto de cisteína.
No parece haber una razón para que las secuencias flanqueantes de NTP sean necesarias excepto como espaciadores, ya que sólo la secuencia del péptido Harlil tiene actividad. Los cambios introducidos en las secuencias flanqueantes se realizaron para volver al péptido menos básico o hidrófobo.
Ejemplo 2
El propósito de este ejemplo era demostrar el uso de NTP-3 como ligando de afinidad para la purificación por afinidad de NTP. En este proceso, se purificó la NTP en columna de afinidad a partir de una muestra de orina obtenida a partir de un paciente con EA.
Preparación de la muestra de orina que contiene NTP para ensayo: La fuente biológica de NTP utilizada fue la orina de un paciente (BOU1) diagnosticado con EA. Antes de la aplicación al material de columna, se procesó la muestra biológica según el siguiente protocolo para procesar la orina para ensayo de EA.
1.
Se ensayó la orina con un Ames Multistix™ (Bayer, Indiana). Se desechan las muestras si (a) son positivas por contaminación bacteriana, (b) son positivas por niveles patológicamente altos de proteína tales como los asociados a enfermedad renal (este ensayo no excluye muestras positivas por NTP que carecen de niveles patológicos de proteínas), cetonas, sangre, urobilógeno, nitrito, leucocitos, (c) tienen un pH mayor de 7,5 o menor de 4,5, o (d) tienen una densidad relativa mayor de 1,025.
2.
Se centrifugó la orina a 3.000 x g durante 15 minutos para retirar el desecho celular.
3.
Se filtró la orina utilizando una jeringuilla a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 \mum, y se llevó al filtrado a azida al 0,05%.
4.
Se dispuso la alícuota resultante en el depósito superior de un Amicon Centricon® YM-10 Millipore, y se centrifugó a 3.000 x g durante 1 hora.
5.
Se retiró la muestra, que era entonces aproximadamente un 25% del volumen original, de la centrífuga y se restauró el volumen original con 1,5 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS).
6.
Se repitieron las etapas 4 y 5, en las que la muestra se centrifugó de nuevo a 3.000 x g durante 30 minutos, seguido de retirada de la muestra de la centrífuga, y se añadieron 1,5 ml de TBS a la muestra.
7.
Se centrifugó después la muestra a 3.000 x g durante 30 minutos, seguido de retirada de la muestra de la centrífuga. La muestra era entonces un cuarto del volumen original.
8.
Se transfirió después la muestra a un vial de vidrio de borosilicato y se almacenó congelada a -20ºC.
Preparación de la columna: Se conjugó NTP-3 con agarosa activada con bromuro de cianógeno (Sigma, St. Louis, MO) según las instrucciones del fabricante. Una vez preparado, se almacenó el material de columna en solución salina tamponada con Tris 25 mM (TBS), pH 7, con 0,01% de azida.
Cromatografía: Se incubaron 11 ml del material de columna de afinidad durante 1 hora con 25 ml de la muestra de orina (procesada como se describe anteriormente para obtener una muestra concentrada cuatro veces en TBS (pH 7)) y 25 ml de tampón de glicina 0,025 M (pH 3,5). Se recogió el material no absorbido (atravesado). Se lavó después la columna con 5 volúmenes de 1 x TBS (pH 7) y se eluyó con 11 ml de glicina 0,1 M (pH 2). Inmediatamente después de la elución, se ajustó el eluído a pH 7 con NaOH, seguido de concentración a 1 ml utilizando un Amicon Centricon® YM-10 (Millipore, Beverly MA) como en el ejemplo 1.
Análisis de la actividad NTP presente en el eluído de columna de afinidad: Se ensayó la actividad del ensayo de afinidad utilizando tiras 7C Gold™, que ensayan la proteína de la cadena neural en orina (Nymox Pharmaceutical Corp., Maywood, NJ. Véase, por ejemplo, Fitzpatrick et al., Alzheimer Reports 3(3): 155-159 (2000)). Toda la actividad ensayada por la tira 7C Gold™ estaba en la fracción eluída a pH 2.
Concentraciones de proteína: La concentración de proteína en el eluído era de 108 \mug, determinada mediante tinción con azul de Coomasie (BioRad, Hercules, CA). Ésta es aproximadamente un 3% de la concentración de proteína de partida. La concentración de proteína era de 145 \mug, determinada mediante el kit de ácido bicinconínico (nº cat. 23223, BioRad). La absorbancia corregida para el tampón a 280 nm era de 390, indicando 390 \mug de proteína. La mayor cantidad de proteína obtenida con medida de absorbancia es probablemente el resultado de la presencia de una gran cantidad de aminoácidos aromáticos en la NTP, que pueden causar una sobreestimación de la proteína utilizando esta técnica de medida.
Análisis de la proteína NTP a partir del eluído de columna de afinidad mediante electroforesis en gel: Se corrió 1 \mug del eluído (aproximadamente 110-145 ng) en un mini-gel con 12,5% de dodecilsulfato de sodio (SDS) (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia) y se tiñó con plata. Se observaron bandas aproximadamente a 29 kDa, 33 kDa, 40-45 kDa y 60 kDa. Se cortó el gel en bandas de 20-35 kDa, 35-45 kDa y 45-65 kDa, se dispuso en 100 \mul de TBS y se dejó dializar frente TBS durante una noche. Se concentraron después los eluídos de banda utilizando un Amicon Centricon® YM-10 como en el ejemplo 1, y se ensayó la actividad utilizando el ensayo 7C Gold™.
Se observó reactividad NTP en la banda de 35-45 kDa, aproximadamente a 41 kDa. No se observó actividad para las otras bandas. La NTP tiene un peso molecular reseñado de 41 kDa. Por tanto, los datos indican que la NTP-3 unida a la columna de afinidad se unía selectivamente a la proteína NTP presente en la muestra de orina del paciente con EA.
Este ejemplo demuestra la unión específica del péptido Harlil NTP-3 a NTP, y el uso de un péptido Harlil, tal como NTP-3, como ligando de afinidad para purificación por afinidad de NTP.
Ejemplo 3
El propósito de este ejemplo era mostrar la capacidad de autoagregación de un péptido Harlil. El péptido Harlil NTP-3 forma puentes disulfuro (debido al resto de cisteína) y dimeriza a pH neutro. Puesto que el péptido dimerizado puede unirse a dos inmunoglobulinas, puede causar precipitación. Esta propiedad de los péptidos Harlil se demostró utilizando inmunoglobulina de conejo.
Se añadió 1 mg del péptido Harlil NTP-3 en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 3,4 mg de IgG de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a pH 7. Se dejó dializar la mezcla durante una noche, y se observó un precipitado blanco claro la mañana siguiente. Se retiró el precipitado mediante centrifugación y se determinó la concentración de proteína del sobrenadante mediante absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer modelo Lambda 3B. Los resultados se muestran en la Tabla 1. La precipitación de inmunoglobulina se evita a pH bajo, por ejemplo, pH de 3,5 o menor de 3,5.
TABLA 1
Inmunoglobulina precipitada utilizando un péptido Harlil
Concentración de Concentración final % de proteína
partida de NTP-3 precipitada
3,4 mg RGG* + 1 mg 2,7 mg 39%
*IgG de conejo
Este ejemplo demuestra la capacidad de los péptidos Harlil de utilizarse para aislar y/o purificar inmunoglobulinas.
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra la utilidad de los péptidos Harlil para detectar y cuantificar la presencia de NTP.
Ensayo basado en membrana: El ensayo 7C Gold™ consiste en una tira de 5 mm x 45 mm con dos trampas y una zona receptora de muestra localizada en la tira. Las trampas 1 y 2 están localizadas 16 y 24 mm distales de la zona receptora de muestra, respectivamente. Cada trampa es de aproximadamente 4 cm de profundidad.
1
Las partículas de oro marcadas migran a la trampa 1 ó 2. La relación de oro marcado en las trampas 1 y 2 se correlaciona con la cantidad de NTP presente en la muestra. Véase la patente de EE.UU. nº 6.121.008 de Fitzpatrick et al.
Preparación de conjugado de NTP-3: Se llevó inmunoglobulina de ratón activada con maleimida (RGG) (Pierce, Rockford, IL)) a una concentración de 3,8 mg/ml a un pH de 3,5 utilizando citrato 1 M. Se añadió después el péptido Harlil NTP-3, en DMSO a un exceso molar de 30 veces, a la RGG. Se controló el pH del conjugado NTP-3/RGG y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente con agitación lenta. Se dializó después concienzudamente el conjugado frente a tampón citrato-fosfato 0,5 mM, pH 3,5.
Preparación de ensayo de tira 7C Gold™: Se diluyó la NTP-3 conjugada con RGG dializada a 1 mg/ml en tampón citrato-fosfato 0,5 mM, pH 3,5. Después de reposar durante una noche, se recubrieron 6 \mul/cm del conjugado sobre una membrana (Loprodyne 3, Pall, East Hills, NY) utilizando XY3000™ Biodot (Irvine, CA) en la trampa 1. A continuación, se recubrieron 0,5 mg/ml de inmunoglobulina de cabra anti-ratón (nº DAKO 20109, Dinamarca) sobre la membrana 1 cm por encima del conjugado de NTP-3/RGG en la trampa 2 (utilizando los mismos parámetros que el recubrimiento de NTP-3/RGG). Se secó con aire caliente la membrana, o tira 7C Gold™, durante 30 minutos, se cortó en tiras de 5 mm y se almacenó con desecante. Esta trampa se unirá a oro recubierto con anticuerpo anti-NTP en ausencia de NTP. El ensayo 7C Gold™ utiliza un anticuerpo N314 anti-NTP (de la Monte, et al., J. of Neuropath. Exp. Neurol. 55: 1038-1050 (1996)). La base de este ensayo es que la NTP se secuestra por el anticuerpo N314 anti-NTP sobre oro y es transportada a la trampa NTP-3, donde la NTP se retira por competencia con N314 y se une a la trampa 1. Al hacer esto, la NTP bloquea la unión del anticuerpo sobre oro a la trampa 1 y, como resultado, el oro migra a la trampa 2. Por tanto, en presencia de NTP migra más oro a la trampa 2.
Oro coloidal: Se preparó oro coloidal como se describe en "Colloidal Gold", M.A. Hayat ed. (Academic Press Limited, Londres (1991)) y se recubrió con anticuerpo N314 anti-NTP purificado a una concentración de 20 \mug/ml. Se diluyó después el oro coloidal recubierto con anticuerpo en tampón de crioconservación (Serex Inc, Maywood, NJ) y se liofilizó. Se liofilizó una cantidad suficiente para una tira en un vial de borosilicato de 2 ml (nº Wheaton 223683, Millville, NJ) utilizando un liofilizador Virtus (Gardiner, NY) modelo 600SL & 12 SL.
Muestras de paciente: Se procesaron y concentraron 107 muestras de pacientes como se describe en el ejemplo 2.
Ensayo de 7C Gold™: Se añadieron 50 \mul de cada muestra de paciente procesada y concentrada a oro liofilizado recubierto con anticuerpo de NTP. Se incubó la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se dispuso la tira 7C Gold™ en el vial hasta terminación del ensayo, como se indica por la aparición de una línea verde en la parte superior de la tira. Se retiró la tira y se dejó secar.
Sumario de los resultados: En ausencia de NTP, la mayoría del oro recubierto con anticuerpo de NTP se une a la trampa de péptido Harlil NTP-3. La placa de microvaloración en fase sólida de péptido Harlil de NTP se une a anticuerpo de ratón con muy baja afinidad, pero en su estado agregado sobre oro, el anticuerpo monoclonal N314 se une a la trampa. Se leyó después la intensidad del color en las bandas 1 y 2 utilizando un densitómetro (Gretag D19C, Suiza). Se calculó el valor de relación, que es igual a la reflectancia de la trampa 1 dividida entre la reflectancia en la trampa 1 más la reflectancia en la trampa 2, y se dividió el valor de relación de la muestra entre el valor de relación de una muestra índice o de corte. Este valor se designó como el valor indexado. Los resultados del ensayo, representados en la Figura 3, muestran una excelente separación de muestras normales a partir de muestras de EA.
Ejemplo 5
El propósito de este ejemplo era mostrar que la unión de NTP a una placa de microvaloración recubierta con péptido Harlil podía inhibirse mediante péptido Harlil no conjugado.
Preparación de placa de microvaloración: Se recubrió el complejo péptido Harlil/inmunoglobulina NTP3-RGG en una relación de 30:1 y preparado como en el ejemplo 4 sobre una placa de microvaloración Immulon 4 (Dynex, Chantilly, VA) a una concentración de 0,5 \mug/pocillo.
Patrones: NTP recombinante en TBS (descrito en de la Monte et al., J. of Neuropath. Exp. Neurol., 55: 1038-1050 (1996)). Se diluyó en serie azida al 0,01% (Nymox, Pharm. Corp., lote 4-7-98) en TBS. Se incubaron 100 \mul de cada dilución a pH 3,5 durante 1 hora. Se lavaron después las diluciones durante 15 minutos en TBS, albúmina al 0,1% y Tween 80 al 0,05%. Esto fue seguido por tres lavados con TBS y Tween 80 al 0,05%.
Ensayo de placa de microvaloración: Se añadieron después 100 \mul de dilución 1:8.000 de IgG de conejo conjugada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y se dejó reaccionar durante 30 minutos. Se lavó dos veces la placa de microvaloración con TBS y Tween 80 al 0,05%, seguido de la adición de 150 \mul de tetrametilbenceno (TMB) (Serex Inc., Maywood, NJ). Se incubó después la mezcla durante 10 min y se detuvo con 50 \mul de HCl 2 N. Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro STL 340 ATTC.
Utilizando este sistema, se muestra que el monómero NTP-3 inhibe la unión de conjugado a la placa. Véase la Fig. 2.
Ejemplo 6
El propósito de este ejemplo era demostrar que los anticuerpos se unen específicamente a una placa de microvaloración recubierta con péptido Harlil y ensayar cuál porción del anticuerpo (Fc o Fab) se une a la placa recubierta con Harlil.
Anticuerpos ensayados: Se obtuvieron los siguientes anticuerpos a partir de Jackson Immunoresearch (West Grove, PA): (1) anticuerpo IgG de conejo anti-ratón purificado por afinidad marcado con fosfato alcalino (AP); (2) IgG de conejo anti-ratón purificada por afinidad marcada con AP (Fab2) y (3) IgG de conejo anti-pollo purificada por afinidad marcada con AP.
Se utilizó IgG de conejo anti-pollo (anticuerpo (3)) para eliminar la posibilidad de que el anticuerpo de conejo anti-ratón (anticuerpo (2)) reconociera la RGG en el conjugado NTP-3/RGG. El anticuerpo (2) era idéntico al anticuerpo (1), excepto porque el anticuerpo (2) carecía de la porción Fc de la IgG.
El formato de ensayo era como en el ejemplo 5. Se añadieron IgG de conejo, pollo y ratón purificadas no inmunes hasta 1 mg/ml (véase la Fig 4). Los controles eran BSA (albúmina de suero bovino) 1 mg/ml, alfa-glicoproteína, orina positiva por EA y control negativo y 80, 40, 20, 10 y 5 unidades de NTP recombinante. Tanto las IgG de conejo como de pollo retiraron por competencia al conjugado de AP de manera dependiente de la dosis. Véase la Fig. 4. Fab2 no se unió a la placa.
Sumario de resultados: Ambas moléculas enteras, de conejo anti-ratón y de conejo anti-pollo, se unieron a una placa de microvaloración recubierta con NTP-3/IgG de conejo. El anticuerpo marcado con Fab no exhibía ninguna unión (resultados no mostrados). Estos resultados indican que la unión a anticuerpo del péptido Harlil se efectúa mediante el reconocimiento de la región Fc de anticuerpo.
La afinidad de los péptidos Harlil por IgG de diferentes especies varía. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ratón exhibía mucha menor afinidad por los conjugados de NTP-3 que la IgG de conejo. Véase la Fig. 4.
Ejemplo 7
El propósito de este ejemplo era determinar si la NTP reconoce la secuencia en la proteína G que reconoce la porción Fc de anticuerpo.
La proteína G se une a anticuerpo a través de la región Fc. Puesto que los resultados de este ejemplo sugieren que los péptidos Harlil se unen también a la porción Fc de inmunoglobulinas, y no a la porción Fab, se determinó si la NTP reconoce la secuencia en la proteína G que reconoce la porción Fc de anticuerpo. Específicamente, puesto que los péptidos Harlil reconocen péptidos Harlil, los péptidos Harlil reconocen la región Fc de anticuerpo, y la proteína G reconoce la región Fc de anticuerpo, este experimento determinó si la proteína G reconoce NTP.
Se pasaron tanto muestras positivas de NTP como negativas de NTP a través de una columna de proteína G. La NTP no se redujo significativamente. Estos resultados apoyan la conclusión de que la proteína G no se une a NTP.
La unión a través de la región Fc puede tener implicaciones terapéuticas, ya que la región Fc se utiliza para reconocer receptores en el sistema inmune.
Ejemplo 8
El propósito de este ejemplo era demostrar un ensayo de afinidad competitiva en un formato de ensayo de placa de microvaloración utilizando un péptido Harlil.
Preparación de la placa de microvaloración. Se recubrió el complejo péptido/inmunoglobulina NTP-3/RGG, a una relación de 30:1 y preparado como en el ejemplo 4, sobre una placa de microvaloración Immulon II (Dynex, Chantilly, VA) a una concentración de 20 \mug/pocillo.
Preparación de muestras: Se prepararon 30 muestras de orina para ensayo como se describe en el ejemplo 2. Se ensayó el filtrado después de centrifugar la muestra en un 100 K Amicon Centricon (Millipore Inc., Beverly, MA) para retirar cualquier anticuerpo, ya que el Fc de anticuerpo podría interferir con el ensayo. (Para evitar falsos positivos en los ensayos de diagnóstico, se desactiva la capacidad de un péptido Harlil de unirse a anticuerpos no NTP. Por ejemplo, las muestras que tienen niveles de inmunoglobulina mayores de 100 \mug/ml deben reducir los niveles de imunoglobulina a menos de 100 \mug/ml antes del ensayo).
Controles: Se pasó un conjunto de orina preparado a partir de orina de individuos sin diagnóstico de enfermedad neurodegenerativa sobre una columna de afinidad preparada como se describe en el ejemplo 2. El conjunto de orina resultante se designa como orina "depurada".
Se utilizó después la orina depurada para preparar un control de intervalo medio mediante la dilución apropiada de un conjunto concentrado. El conjunto concentrado se preparó a partir de una colección de muestras de pacientes diagnosticados con EA que se probaron positivas en el ensayo de NTP (véase el ejemplo 4).
Patrones. Se diluyó NTP recombinante (Nymox Pharmaceutical Corp., Montreal, Canadá) en TBS formando patrones. Se asignaron a los patrones valores unitarios de 40, 20, 10 y 0. Debido a que hay evidencias de que la NTP en la orina puede estar parcialmente degradada, se expresó la cantidad de NTP en unidades de NTP recombinantes y no en peso. La Figura 5 compara la linealidad de una muestra control de orina y NTP recombinante en un ensayo de NTP competitivo en formato de microvaloración.
El ensayo. Se ensayaron las muestras de pacientes en el ensayo del modo siguiente: Se añadieron 50 \mul de una dilución 1:5.000 de IgG de conejo conjugada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y 50 \mul de muestra o patrón a los pocillos de la placa. Se incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavó tres veces con TBS, albúmina al 0,1% y Tween 80 al 0,05%. Se añadieron 100 \mul de PNPP (fosfato de paranitrofenilo) (Moss, Pasadena, MD) a cada pocillo. Se leyó la DO a 405 nm en un lector BioRad durante 30 minutos y después de ello a intervalos de 15 minutos hasta que la DO del patrón de TBS estuvo entre 2-2,5. Los resultados, mostrados en la Figura 6, demuestran que, aunque se encuentra NTP en todas las muestras, hay una cantidad elevada presente en pacientes positivos de EA. Esta cantidad elevada puede determinarse fácilmente utilizando controles de edad coincidente. Por tanto, un ensayo de diagnóstico que determina la cantidad de NTP en una muestra biológica puede ser útil en el diagnóstico de EA u otros trastornos neurodegenerativos con alta exactitud.
<110> NYMOX PHARMACEUTICALS CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SEGMENTOS PREFERIDOS DE PROTEÍNA DE LA CADENA NEURAL Y PROCEDIMIENTOS DE
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
USO DE LOS MISMOS 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 018792/0195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US01/42813
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 25-10-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/697.590
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 27-10-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Organismo desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo desconocido: secuencia de ADN de NTP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(1139)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
2
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Organismo desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo desconocido: secuencia de aminoácidos de NTP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Arg Leu Met Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-1 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-2 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Asn Asn Asn Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-3 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-4 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His Ala Arg Leu Pro Leu Ala Asn Phe Cys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-5 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Thr Gly His His Ala Arg Cys Leu Ala Asn Phe Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-6 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Glu Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-7 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Thr His His Ala Arg Leu Ile Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido NTP-8 sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser His His Ala Arg Leu Ile Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Cys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (27)

1. Un péptido que no supera los 25 aminoácidos de longitud que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(a)
H H A R L;
(b)
H A R L I;
(c)
H A R L I L;
(d)
H H A R L C L;
(e)
A R L I L;
(f)
H H A R L I F;
(g)
T H A R L I L;
(h)
H A R L C L;
(i)
A R L C L;
(j)
M F A R L I L;
(k)
F A R L I L;
(l)
F A R L I;
(m)
H A R L I F.
2. Un péptido constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por
(a)
H H A R L;
(b)
H A R L;
(c)
H A R L I;
(d)
H A R L I L;
(e)
H H A R L C L;
(f)
A R L I L;
(g)
H H A R L I F;
(h)
T H A R L I L;
(i)
A R L I;
(j)
A R L;
(k)
H A R L C L;
(l)
A R L C L;
(m)
A R L C;
(n)
M F A R L I L;
(o)
F A R L I L;
(p)
F A R L I;
(q)
F A R L;
(r)
H A R L I F; y
(s)
A R L I F.
3. El péptido según la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo constituido por
(b)
H A R L;
(c)
A R L I;
(d)
F A R L, y
(e)
A R L.
4. Una composición que comprende uno o más péptidos según la reivindicación 1 y un vehículo para ellos.
5. Un polímero de un péptido según la reivindicación 1, que comprende al menos dos repeticiones del péptido.
6. Un ácido nucleico que codifica un péptido según la reivindicación 1.
7. Una composición que comprende uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 6 y un vehículo para ellos.
8. Un procedimiento para purificar proteína de la cadena neural a partir de una muestra biológica que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra biológica con uno o más péptidos que se unen específicamente a proteína de la cadena neural, teniendo dichos péptidos una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1;
(b)
aislar los conjugados péptido/proteína de la cadena neural resultantes; y
(c)
separar la proteína de la cadena neural del péptido o péptidos para obtener la proteína de la cadena neural purificada.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra biológica con uno o más péptidos que se unen específicamente a proteína de la cadena neural, teniendo dichos péptidos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(i)
A R L I;
(ii)
H A R L;
(iii)
F A R L;
(iv)
A R L; y
(v)
A R L C;
en el que el péptido comprende al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean la terminación N o C del péptido;
(b)
aislar los conjugados péptido/proteína de la cadena neural resultantes; y
(c)
separar la proteína de la cadena neural del péptido o péptidos para obtener la proteína de la cadena neural purificada.
10. Un ensayo de diagnóstico in vitro para determinar la presencia de enfermedad de Alzheimer u otro trastorno neurodegenerativo, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra biológica con uno o más péptidos que se unen específicamente a proteína de la cadena neural, teniendo dichos péptidos una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1;
(b)
determinar la cantidad de proteína de la cadena neural presente en la muestra; y
(c)
determinar si la cantidad de proteína de la cadena neural presente en la muestra está por encima de una cantidad umbral indicativa de la presencia de enfermedad de Alzheimer u otro trastorno neurodegenerativo.
11. Un ensayo de diagnóstico in vitro según la reivindicación 10, que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra biológica con uno o más péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(i)
A R L I;
(ii)
H A R L;
(iii)
F A R L;
(iv)
A R L; y
(v)
A R L C;
en el que el péptido comprende al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean la terminación N o C del péptido;
(b)
determinar la cantidad de proteína de la cadena neural presente en la muestra; y
(c)
determinar si la cantidad de proteína de la cadena neural presente en la muestra está por encima de una cantidad umbral indicativa de la presencia de enfermedad de Alzheimer u otro trastorno neurodegenerativo.
12. Un kit de diagnóstico para determinar la presencia de enfermedad de Alzheimer u otro trastorno neurodegenerativo, que comprende:
(a)
uno o más péptidos según la reivindicación 1 que se unen específicamente a proteína de la cadena neural; y
(b)
reactivos para determinar la cantidad de proteína de la cadena neural en una muestra.
13. Un kit de diagnóstico según la reivindicación 12, que comprende:
(a)
uno o más péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(i)
A R L I;
(ii)
H A R L;
(iii)
F A R L;
(iv)
A R L; y
(v)
A R L C;
en el que el péptido comprende al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean la terminación N o C del péptido; y
(b)
reactivos para determinar la cantidad de proteína de la cadena neural en una muestra.
14. Un procedimiento in vitro de uso de un péptido como análogo de proteína de la cadena neural en un ensayo terapéutico o de diagnóstico, que comprende reemplazar la proteína de la cadena neural por el péptido en dicho ensayo, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(a)
A R L I;
(b)
H A R L;
(c)
F A R L;
(d)
A R L; y
(e)
A R L C;
en el que el péptido comprende al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean la terminación N o C del péptido;
16. Un procedimiento in vitro de uso de un péptido como material de captura en un ensayo de diagnóstico o terapéutico, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(a)
A R L I;
(b)
H A R L;
(c)
F A R L;
(d)
A R L; y
(e)
A R L C;
en el que el péptido comprende al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean la terminación N o C del péptido.
18. Un procedimiento de aislamiento de inmunoglobulinas de una muestra que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra que comprende inmunoglobulinas con al menos dos péptidos para permitir la interacción inmunoglobulina/péptido; y
(b)
aislar los conjugados péptido/inmunoglobulina resultantes, en el que los péptidos tienen una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18, que comprende
(a)
poner en contacto una muestra que comprende inmunoglobulinas con al menos dos péptidos para permitir la interacción inmunoglobulina/péptido; y
(b)
aislar los conjugados péptido/inmunoglobulina resultantes, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(a)
A R L I;
(b)
H A R L;
(c)
F A R L;
(d)
A R L; y
(e)
A R L C;
en el que el péptido comprende al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean la terminación N o C del péptido.
20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, en el que los conjugados de péptido/inmunoglobulina se aíslan mediante precipitación.
21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, en el que los conjugados péptido/inmuno-
globulina se aíslan en una columna de afinidad.
22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en el que las inmunoglobulinas se purifican posteriormente.
23. Un procedimiento in vitro para evitar la interacción de proteína de la cadena neural que comprende bloquear uno o más dominios seleccionados del grupo constituido por:
(a)
H H A R L;
(b)
H A R L;
(c)
H A R L I;
(d)
H A R L I L;
(e)
H H A R L C L;
(f)
A R L I L;
(g)
H H A R L I F;
(h)
T H A R L I L;
(i)
A R L I;
(j)
A R L;
(k)
H A R L C L;
(l)
A R L C L;
(m)
A R L C;
(n)
M F A R L I L;
(o)
F A R L I L;
(p)
F A R L I;
(q)
F AR L;
(r)
H A R L I F; y
(s)
A R L I F
mediante el uso de uno o más péptidos que comprenden uno o más dominios (a) a (s).
24. Un péptido según la reivindicación 1 para uso en diagnóstico o terapia.
25. Un péptido según la reivindicación 24, que es
(a)
A R L I;
(b)
H A R L;
(c)
F A R L;
(d)
A R L; o
(e)
A R L C.
26. Uso in vitro de un péptido según la reivindicación 1 para determinar la presencia de enfermedad de Alzheimer u otro trastorno neurodegenerativo.
27. Uso según la reivindicación 26, en el que el péptido es
(a)
A R L I;
(b)
H A R L;
(c)
F A R L;
(d)
A R L; o
(e)
A R L C.
ES01988772T 2000-10-27 2001-10-25 Segmentos preferidos de proteina de la cadena neural y procedimientos de uso de los mismos. Expired - Lifetime ES2266296T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US697590 2000-10-27
US09/697,590 US7259232B1 (en) 2000-10-27 2000-10-27 Preferred segments of neural thread protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2266296T3 true ES2266296T3 (es) 2007-03-01

Family

ID=24801714

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01988772T Expired - Lifetime ES2266296T3 (es) 2000-10-27 2001-10-25 Segmentos preferidos de proteina de la cadena neural y procedimientos de uso de los mismos.

Country Status (15)

Country Link
US (2) US7259232B1 (es)
EP (2) EP1379650B1 (es)
JP (1) JP2005512500A (es)
KR (1) KR100843792B1 (es)
CN (1) CN1492926A (es)
AT (1) ATE330011T1 (es)
AU (1) AU2002232392A1 (es)
BR (1) BR0114977A (es)
CA (1) CA2427070A1 (es)
CY (1) CY1105380T1 (es)
DE (1) DE60120782T2 (es)
DK (1) DK1379650T3 (es)
ES (1) ES2266296T3 (es)
PT (1) PT1379650E (es)
WO (1) WO2002034915A2 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002302239B2 (en) * 2000-10-27 2006-12-14 Nymox Corporation Method of preventing cell death using segments of neural thread proteins
BR0209630A (pt) 2001-05-16 2004-03-30 Nymox Corp Método de impedir morte de célula usando segmentos de proteìnas em cadeia neurais
EP1541166B1 (en) * 2001-05-16 2007-12-19 Nymox Corporation Preventing cell death using segments of neural thread proteins
ATE350396T1 (de) * 2001-05-25 2007-01-15 Nymox Corp Von neurofilamentproteinen abgeleitete peptide und deren medizinische verwendung
US7544771B2 (en) * 2005-02-23 2009-06-09 Nymox Corporation Protein and its use in diagnosing Alzheimer's disease
US11628202B2 (en) 2015-07-24 2023-04-18 Nymox Corporation Methods of reducing the need for surgery in patients suffering from benign prostatic hyperplasia
US10183058B2 (en) 2016-06-17 2019-01-22 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the progression of prostate cancer
US10172910B2 (en) 2016-07-28 2019-01-08 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the incidence of acute urinary retention
US10532081B2 (en) 2016-09-07 2020-01-14 Nymox Corporation Method of ameliorating or preventing the worsening or the progression of symptoms of BPH
US10335453B2 (en) 2017-03-01 2019-07-02 Nymox Corporation Compositions and methods for improving sexual function

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0068375A3 (en) 1981-06-22 1983-04-13 G.D. Searle & Co. Recombinant dna techniques for the production of relaxin
SE8300693L (sv) 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5084559A (en) 1987-03-27 1992-01-28 Repligen Corporation Protein a domain mutants
AU4837990A (en) 1988-12-21 1990-07-10 General Hospital Corporation, The Method of detecting neurological disease or dysfunction
US5948634A (en) 1988-12-21 1999-09-07 The General Hospital Coporation Neural thread protein gene expression and detection of alzheimer's disease
DE69532485T2 (de) * 1994-03-07 2004-11-04 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Trehalose-freisetzendes Enzym, dafür kodierende DNA, Herstellung und Verwendung
GB9422175D0 (en) 1994-11-03 1994-12-21 Univ Dundee Indentification of the p21 waf1-pcna interaction site and therapeutic applications thereof
US5958416A (en) 1994-12-16 1999-09-28 Regents Of The University Of Minnesota Heat shock protein peptides and methods for modulating autoimmune central nervous system disease
US6610506B1 (en) * 1995-12-01 2003-08-26 University Technologies International, Inc. Transferrin binding proteins of Pasteurella haemolytica and vaccines containing same
US6013763A (en) 1996-06-04 2000-01-11 Genentech, Inc. Peptide variants of protein A
JP2001518455A (ja) 1997-09-30 2001-10-16 セル−サイ・コーポレーシヨン 単純疱疹ウイルスの処置のための免疫原性の複合ポリペプチド
WO2000001720A2 (en) 1998-07-02 2000-01-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for treating papillomavirus-infected cells
JP2002542766A (ja) 1999-03-12 2002-12-17 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ５０個のヒト分泌タンパク質
CA2368927A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Craig A. Rosen 45 human secreted proteins
BR0209630A (pt) 2001-05-16 2004-03-30 Nymox Corp Método de impedir morte de célula usando segmentos de proteìnas em cadeia neurais

Also Published As

Publication number Publication date
CA2427070A1 (en) 2002-05-02
ATE330011T1 (de) 2006-07-15
WO2002034915A3 (en) 2003-11-20
CN1492926A (zh) 2004-04-28
AU2002232392A1 (en) 2002-05-06
CY1105380T1 (el) 2010-04-28
KR100843792B1 (ko) 2008-07-03
EP1379650B1 (en) 2006-06-14
PT1379650E (pt) 2006-10-31
DK1379650T3 (da) 2006-10-23
BR0114977A (pt) 2006-05-09
EP1702985A3 (en) 2007-03-07
US7259232B1 (en) 2007-08-21
EP1379650A2 (en) 2004-01-14
KR20030067681A (ko) 2003-08-14
DE60120782T2 (de) 2007-05-24
EP1702985A2 (en) 2006-09-20
JP2005512500A (ja) 2005-05-12
DE60120782D1 (de) 2006-07-27
US20090258426A1 (en) 2009-10-15
WO2002034915A2 (en) 2002-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2259270B1 (es) Metodo de diagnostico in vitro de la enfermedad de alzheimer mediante un anticuerpo monoclonal.
US20090258426A1 (en) Preferred segments of neural thread protein and method of using the same
JP6486908B2 (ja) 肝細胞増殖因子に結合する設計アンキリン反復タンパク質
ES2063350T5 (es) Nuevas proteinas con efecto inhibidor del tnf y su obtencion.
JP6567577B2 (ja) Ｔｆｐｉインヒビターおよび使用法
US20080146508A1 (en) Soluble cyclic analogues of beta amyloid peptide
US20220009991A1 (en) Bi-specific therapeutic proteins and method of use thereof
ES2441210T3 (es) Asociados de enlace del factor de crecimiento placentario, en particular anticuerpos dirigidos contra el factor de crecimiento placentario, su producción y empleo
BR112021010990A2 (pt) Anticorpos anti-alfa-sinucleína e usos dos mesmos
EP4299124A1 (en) Anti-mglur2 nanobodies for use as biomolecule transporter
US7544771B2 (en) Protein and its use in diagnosing Alzheimer&#39;s disease
Das et al. Evidence for binding of the ectodomain of amyloid precursor protein 695 and activated high molecular weight kininogen
CN113621078A (zh) 一种融合多肽TAT-pY682及其在制备阿尔茨海默病药物中的应用
WO2005092923A2 (en) Cytonectin and gene inhibitors thereof
PL198079B1 (pl) Sposób wykrywania lub izolacji związków zdolnych do hamowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu ß-amyloidowego i/lub peptydem ß-amyloidowym i sposób testowania oddziaływania pomiędzy preseniliną a prekursorem peptydu ß-amyloidowego i/lub peptydem ß-amyloidowym
WO2009100893A1 (en) Neuroprotective peptides