KR100843792B1 - 신경 트레드 단백질의 바람직한 단편 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

신경 트레드 단백질의 바람직한 단편 및 이를 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경 트레드 단백질 (NTP)의 바람직한 반복 서열, 바람직한 서열의 펩티드, 모방제, 항체 및 핵산, 및 이러한 바람직한 NTP 서열을 사용한 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.
신경 트레드 단백질, 알츠하이머, 할릴 (Harlil), 신경퇴행성 질병

Description

신경 트레드 단백질의 바람직한 단편 및 이를 사용하는 방법{PREFERRED SEGMENTS OF NEURAL THREAD PROTEIN AND METHODS OF USING THE SAME}
본 발명은 예를 들면 결합 분석, 단백질 및 항체 정제에 유용한 신경 트레드 단백질 (neural thread protein)의 바람직한 단편, 치료제 및 진단제에 관한 것이다.
알츠하이머병 (AD)은 세계적으로 1200만 이상의 사람들이 걸린 현재로서는 불치의 신경퇴행성 질병이다. AD는 주로 노인에게서 발생하는 질병이고, 65세 노인은 발병율이 약 1%이고, 85세에 이르면 대략 40%로 증가한다. 의학의 발달, 평균 수명의 증가, 및 베이비 붐 세대의 노화로 인하여 전체적으로 인구가 노령화됨에 따라, AD의 전체 발병율이 상승되어 건강 관리 시스템에 또한 환자 및 그들의 간병인 및 가족에게 더 큰 부담이 가해질 것으로 예상된다.
AD에 대한 효과적 치료 방법이 현재 존재하지 않는다. 아리셉트 [Aricept(등록상표)(도네페질 HCl; Pfizer Corp.)], 엑셀론 [Exelon(등록상표) (리바스티그민 타르트레이트; Novartis Pharmaceutical Corp.)] 및 코그넥스 [Cognex(등록상표) (타크린; Warner Lambert Corp.)]와 같은 현재 사용가능한 치료제는 경도 내지 중등도의 AD 환자에게 증상적 완화의 조치를 제공하고자 하는 것이고 질병의 원인 을 다루지 않는다.
AD의 임상적 진단도 또한 불완전하다; 정확도는 일반 의사의 경우 대략 50-60%에서 진료의뢰 센터의 알츠하이머병 전문가의 경우 80-90% 까지로 차이가 있다 (Molsa et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48(11):1085-90 (1985); Rocca et al., Ann. Neurol., 19:415-424 (1986); Burns et al., BMJ, 301(6759):1026 (1990); Risse et al., Am. J. Psychiatry, 147(2):168-72 (1990); Gilleard et al., Acta Psychiatr. Scand., 85(4):264-9 (1992); Mendez et al., Alzheimer Dis. Assoc. Disord., 6:35-43 (1992); Fleming et al., Mayo Clin. Proc. 7:1093-1107 (1995); Corey-Bloom et al., Neurology, 45:211-218 (1995); 및 Bowler et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 64(1):18-24 (1998)). 초기 증상으로부터 AD의 진단이 이루어질 때까지 거의 평균 3년이 지체된다 (Jorst et al., J. Am. Geriatr. Soc., 43(11):1248-55 (1995)).
AD의 정확하고 빠른 진단에는 신뢰성 있는 바이오마커가 큰 도움이 되는 것으로 알려졌다 (Growdon et al., Neurobiol. Aging, 19:109-116 (1998)). 몇몇 생화학적 및 유전적 마커가 현재 이용가능하지만, 통상의 임상 용도를 위해서는 이들의 임상-병리적 상관관계가 일반적으로 너무 낮은 것으로 여겨진다. 예를 들면, 아포지단백 E ε4 대립유전자는 50%의 AD 사례에서만 발견되는 유전적 위험 인자이고 (Myers et al., Neurology, 46(3):673-7 (1996)), 뇌척수액 (CSF) 및 혈청 Aβ에서 타우 (tau) 및 β-아밀로이드 단백질 측정은 AD와 비-AD 수준 사이에 현저한 중복부분이 있어서, 그 유용성이 제한된다 (Pirttila et al., J. Neurol. Sci., 127(1):90-5 (1994); Arai et al., Ann. Neurol., 38:649-652 (1995); Jensen et al., Neurosci. Lett., 186(2-3):189-91 (1995); Motter et al., Ann. Neurol., 38(4):643-8 (1995); Munroe et al., Ann. Clin. Lab. Sci., 25(3):207-17 (1995); Tata et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr., 59:280-283 (1995); Vigo-Pelfrey et al., Neurology, 45(4):788-93 (1995); Iwatsubo T., Neurobiol. Aging, 19:161-163 (1998); Nitsch et al. Ann. Neurol., 37(4):512-8 (1995); van Gool et al., Ann. Neurol., 37(2):277-9 (1995); Tamaoka et al., J. Neurol. Sci., 151(1-2):65-8 (1996); 및 Pirtilla et al., Arch. Neurol., 53(2):189-93 (1996)). 제안된 다른 마커, 예를 들면 트로피카미드에 대한 동공 반사 (Scinto et al. Science, 266:1051-1054 (1994); 및 Growdon et al. Arch. Neurol., 54(7):841-4 (1997)) 및 p-97과 같은 혈청 인자 (Kennard et al., Nat. Med. 2(11):1230-5(1996))는 반복 대조 임상 연구에서 아직 확증되지 않았다. 제안된 대부분의 AD 마커의 주요 결점은 보통 이들이 AD 병리와 결부된 뇌-특이적 분자가 아니며, 말초액에서 신뢰성 있게 측정될 수 없다는 것이다.
신경 트레드 단백질 (NTP)은 최근 확인된 신규 군의 뇌 단백질이다. NTP는 신경돌기 발아 및 세포 사멸과 관련된 기능을 갖는 약 41 kD의 멤브레인 결합 인단백질이다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); 및 de la Monte et al., Alz., Rep., 2:327-332 (1999)). AD와 NTP를 연결하는 강력한 증거가 있다. NTP mRNA는 대조군에 비해 AD 뇌에서 상향조절되고, 뇌 및 CSF에서 NTP 단백질 수준이 대조군에서보다 AD에서 높고, NTP 면역반응성이 노인성 반, 신 경섬유 농축제 (NFT), AD 및 다운 증후군 뇌에서의 퇴화 뉴론, 신경망 트레드 및 이영양성 신경돌기 발아에서 확실히 발견된다 (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86 (3): 1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2):152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); 및 de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). 뉴론에서의 NTP 축적은 AD 신경퇴행 초기에 발생한다 (NFT 형성 전). NTP는 다운증후군 뇌 조직에서도 확인되었고 (Wands et al., 국제특허출원 공개 WO 90/06993호; de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). 대부분의 다운증후군 환자는 중년 이후 AD와 유사한 신경병리를 나타내고 인생의 말기에 AD와 유사한 많은 인지 결손이 발생한다.
AD 환자 및 대조군의 뇌척수액 (CSF)에서의 NTP 수준이 AD에서 일관되게 상승된 것으로 나타났다 (Chong et al., J. Clin. Lab Anal., 6(6):379-83 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32:733-742 (1992); de la Monte et al., J. Clin. Ivest., 100: 3093-3104 (1997); Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal., 12(4):223-6 (1998); Ghanbari et al., J. Contemp. Neurol., 1998:2-8 (1998); Kahle et al., Neurology, 54(7):1498-504 (2000)). AD에서는 비-AD 신경계 질병 대조군에 비하여 NTP 상승의 특이성이 나타났고, NTP 상승은 치매의 정도와 양의 상관관계가 있었다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); 및 de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999); 및 Kahle et al., Neurology, 54(7):1498-504 (2000)). 한 주요 연구에서, 초기 AD 환자의 89%가 CSF의 NTP 수준이 2 ng/mL를 넘었고, 비-AD 대조군의 89%가 CSF의 2 ng/mL 미만이었다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)).
이어서, 뇨 중 NTP 단백질을 고성능 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동 및 ELISA에 의해 확인하였다 (Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal., 12(4):285-288 (1998); 및 de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). 뇨의 NTP 수준은 AD 환자 및 대조군에서 CSF 수준과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌고, 비-AD 환자와 비교하여 AD 환자에게서 현저하게 상승하였다 (Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal., 12(4):285-288 (1998)). 액체 상 중에서 결합된 모노클로날 항-NTP와 함께 금 입자를 사용한 분석이 뇨 시료에 대해서 개발되었고 AD에 대해 매우 민감하면서도 특이적인 것으로 입증되었다 (Fitzpatrick et al., Alzheimer's Reprorts, 3(3):155-159 (2000)).
일반 의학 실험실 또는 의사의 사무실에서 수행될 수 있는 NTP에 대한 현장검사법 (point-of-care assays)을 개발할 필요성을 비롯하여 NTP에 대한 현존하는 분석법을 개선시킬 필요성이 있다. 비용 효율적인 방법으로 뇨로부터 천연의 NTP를 일상적으로 정제하는 방법과 같은 기술적 진보 또는 쉽게 제조되는 NTP에 대한 유사체의 개발에 의해 이러한 분석법이 개선될 것이다.
NTP가 AD의 발병기전에 직접적 역할을 할 수 있으므로, NTP를 AD의 치료에 대한 약물 개발의 표적으로 삼을 수 있는 증거가 있다. NTP는 신경돌기 발아와 관련되고, 비정상적 신경돌기 발아는 AD와 관련된다. NTP의 과발현은 포스포-타우 (phospho-tau)의 세포내 축적을 유발할 수 있으며, 이는 AD에서 치매와 신경해부학적으로 중요한 상관관계에 있는 NFT의 형성을 진행시킨다 (de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). 또한, NTP의 과발현은 산화적 스트레스와 관련된 아포프토시스 성질의 세포 사멸의 증가를 유발할 수 있다 (de la Monte et al., 1999). NTP의 발현 또는 생화학적 작용을 억제함으로써 AD를 효과적으로 치료할 수 있는 하나의 유망한 경로가 제공된다.
NTP에 대한 유전자 및 예정된 단백질 서열이 확인되었고 기재되어 있다 (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)). 신경 트레드 단백질은 "신경 트레드 단백질 유전자 발현 및 알츠하이머병의 검출"이라는 제목으로 미국 특허 제5,948,634호, 5,948,888호 및 5,830,670호에 처음으로 기재되고 특허청구되었다.
신경 트레드 단백질의 다른 종 (∼26 kD, ∼21 kD, ∼17 kD 및 ∼15 kD)이 확인되었고 신경외배엽 종양, 성상세포종 및 교모세포종과, 또한 저산소증, 허혈 또는 뇌경색으로 인한 손상과의 관계가 밝혀졌다 (de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); 및 de la Monte et al., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)).
당 기술분야에는 AD 및 다운증후군과 관련된 치료제 및 진단제에 유용한 개선된 NTP 조성물, 및 신경외배엽 종양, 성상세포종, 교모세포종 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한, 또한 저산소증, 허혈 및 뇌경색으로 인한 손상에 대한 치료제 및 진단제에 유용한 다른 종의 신경 트레드 단백질과 관련된 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 "H A R L I L"의 공통 서열을 갖는 NTP의 신규 반복 서열 및 그의 상동체의 군에 관한 것이다. 본 발명에 포함되는 할릴 (Harlil) 펩티드는 "H A R L I L," "H A R L C L," "H H A R L C L," "H A R L," "M F A R L I L," "A R L I L," "H A R L I F," "H H A R L I F," 및 그의 상동체 및 결합 파트너를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이 그룹의 NTP 단백질, 상동성 펩티드를 총괄적으로 "할릴 펩티드"라고 부른다.
본 발명은 할릴 펩티드가 다음과 같은 독특한 결합 특성을 갖는다는 예상외의 발견으로부터 비롯되었다:
- 할릴 펩티드는 NTP에 결합하는 친화성이 있으므로 NTP를 포착하는 결합 파트너로서 뇨, CSF 또는 혈액과 같은 체액으로부터 NTP의 정제, 뇨, CSF 또는 혈액과 같은 체액에서 NTP의 검출 및 측정, AD 및 다운증후군에 대한 약물 개발 및 하기에 개시되는 다른 사항에 유용하고;
- 할릴 펩티드는 많은 면역글로불린에 결합하는 친화성이 있으므로 면역글로 불린의 정제, 이러한 면역글로불린의 검출 및 측정에 유용하고;
- 할릴 펩티드는 그 자체에 결합하는 친화성이 있으므로, 그에 접합되는 단백질의 분리, 분석 측정, 및(또는) 정제, 분석에서 NTP 유사체로서의 용도 및 하기에 개시되는 다른 사항에 유용하고; 또한
- 할릴 펩티드는 자기-조립 및(또는) 다른 단백질과 NTP와 상호작용하여 기능하는 것으로 보이므로 치료 표적으로서 유용하다.
본 발명은 할릴 펩티드 서열에 관한 항체 및 이러한 항체의 기능적 단편을 포함한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 NTP 단백질 상의 할릴 서열의 결합 파트너에 관한 것이다. 이러한 결합 파트너는 상동성 펩티드, 유기 펩티드 모방제, 항체 또는 항체의 일부분 및 파라로그 (paralogue)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 할릴 펩티드에 상응하는 핵산, 1 이상의 할릴 펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산을 포함하는 벡터 및 이러한 벡터를 증식시키기 위한 숙주 세포, 예를 들면 이. 콜라이 또는 다른 유용한 세균 또는 효모 종을 포함한다. 벡터는 예를 들면 치료적 처치 또는 할릴 펩티드를 제조하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 해당 기술분야에서 공지된 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 할릴 펩티드, 항체 및 핵산을 제조하는 방법을 개시한다.
본 발명의 또다른 측면은 1 이상의 할릴 펩티드, 할릴 펩티드 모방제, 및(또는) 그에 대한 결합 파트너를 포함하는 제약 조성물 및 1 이상의 할릴 펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 제약 조성물 은 예를 들면 AD, 신경외배엽 종양, 성상세포종, 교모세포종 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 치료적 처치에 유용할 수 있다.
본 발명은 AD, 신경외배엽 종양, 성상세포종, 교모세포종 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 진단제에 할릴 펩티드, 상응하는 핵산, 또는 할릴 모방제의 용도를 포함한다. 1 이상의 할릴 펩티드를 사용하는 진단 시험법은 NTP의 존재를 나타내는, NTP 또는 할릴 펩티드 서열에 대한 항체의 존재를 시험하는데 유용할 수 있다. NTP가 모든 인간에서 발견되지만, AD에 걸린 것으로 의학적으로 진단된 환자 (즉, DSM4 환자)에게서는 상승된 양이 발견된다. 별법으로, 진단 시험은 NTP의 존재를 검출하는데 유용한, 1 이상의 할릴 펩티드 서열에 대한 1 이상의 항체를 사용할 수 있다. NTP의 양은 AD, 신경외배엽 종양, 성상세포종, 교모세포종, 다른 신경퇴행성 장애의 존재와 상관관계가 있다. 마지막으로, 진단 시험은 1 이상의 할릴 펩티드를 코딩하는 1 이상의 핵산을 사용할 수 있다. 이러한 핵산과 생물 시료 중의 핵산 사이의 혼성화는 NTP의 존재를 나타낸다. 여기서도, NTP의 양은 AD, 신경외배엽 종양, 성상세포종, 교모세포종 및 다른 신경퇴행성 장애의 존재와 상관관계가 있다. 본 발명의 할릴 펩티드, 할릴 모방제, 항체 및 핵산은 이러한 진단 시험에서 표지될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 진단 방법을 실행하기 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다. 이러한 시험 키트는 1 이상의 할릴 펩티드, 할릴 모방제, 항체, 할릴 결합 파트너 및(또는) 핵산 및 적절한 시약을 포함한다.
본 발명은 할릴 펩티드 또는 할릴 모방제를 사용하는 용액으로부터 NTP를 정 제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법을 적용하기 위한 키트는 본 발명에 포함된다. 이러한 키트는 1 이상의 할릴 펩티드, 할릴 모방제 또는 그의 혼합물 및 적절한 시약을 포함한다.
또한 본 발명의 할릴 펩티드를 사용하여 항체를 정제하는 방법 및 그를 위한 키트도 본 발명에 포함된다. 이러한 키트는 본 발명의 할릴 펩티드 및 적절한 시약을 포함한다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 포유류에 본 발명의 1 이상의 할릴 펩티드, 할릴 모방제 (할릴 펩티드 모방제에 한정되지 않음), 항체 및(또는) 핵산의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, AD, 신경외배엽 종양, 성상세포종, 교모세포종 또는 다른 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 일반적 기재 및 하기 상세한 설명 모두는 예시적이고 설명적인 것으로서 특허청구된 본 발명을 더 설명하고자 하는 것이다. 다른 목적, 이점, 및 신규 특징은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 완전한 NTP 서열 및 완전한 NTP 서열 내의 할릴 서열의 위치를 나타낸다 (de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55:1038-1050 (1996)).
도 2는 토끼의 항-마우스 이뮤노글로불린 접합체가 할릴 펩티드 (NTP-3)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합하는 것의 억제를 경쟁하는 NTP-3/RGG 농도 (x 축)의 함수로서 나타낸다 (실시예 5에 기재된 데이터).
도 3은 할릴 펩티드 기초 멤브레인 분석을 사용한 107 개의 생물 시료의 분 석 결과를 나타낸다 (실시예 4에 기재된 데이터).
도 4는 NTP가 결합하는 항체의 부분을 결정하는 분석의 결과를 나타낸다 (실시예 6에 기재된 데이터).
도 5는 ELISA 형식 경쟁적 NTP 분석에서 뇨 대조군 시료 및 재조합 NTP의 직선성을 비교한 것이다 (실시예 8에 기재된 데이터).
도 6은 할릴 펩티드를 사용하는 ELISA 형식에서 연령이 맞춰진 정상치에 대해 AD로 진단된 시료를 구별하기 위한 경쟁적 친화성 분석의 결과를 나타내고, 이는 AD-양성 환자에 존재하는 역치량을 나타낸다 (실시에 8에 기재된 데이터).
본 발명은 "할릴 서열"이라고 지칭되는 NTP의 신규 반복 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 서열은 NTP의 아미노산 서열에서 4 번 나타난다:
(a) 45-51 T H A R L I L
(b) 90-96 H H A R L C L
(c) 263-269 M F A R L I L
(d) 292-296 H H A R L I F
도 1 참조.
본 발명은 영역 (a), (b), (c), (d) 중 어떠한 서열이라도 갖는 펩티드 또는 이들의 상동체 ("H A R L M L")를 포함하지만 이에 한정되지는 않음)를 포함한다. 또한 할릴 펩티드는 할릴 서열의 앞 또는 뒤에 링커 펩티드 상에 추가적 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 추가적 아미노산 잔기 또는 링커 펩티드는 할릴 서열의 앞 및 뒤의 NTP 서열에서 발견되는 것일 수 있다. 예를 들면 NTP 서열에서 아미노산 잔기 G I T G M C T는 46번 잔기의 앞에 나타나고 아미노산 잔기 Y F F L V는 50번 아미노산 뒤에서 나타난다. 따라서, 본 발명에 포함되는 할릴 펩티드는 NTP 펩티드 G I T G M C T H A R L I L Y F F L V를 포함한다. (b), (c) 및 (d)에 언급된 할릴 펩티드에 대해서는, 추가적 아미노산 잔기는 NTP 서열에서 할릴 서열에 플랭킹된 것이다. 그러나, 플랭킹 서열이 링커 이외로 작용한다는 증거는 없다. 바람직하게는, 추가적 아미노산 잔기를 갖는 할릴 펩티드는 길이가 총 25 개의 아미노산 잔기를 넘지 않는다.
할릴 펩티드의 상동체 및 변이체도 본 발명의 범위에 포함된다. 하나의 아미노산을 다른 것으로 치환함으로써 펩티드 서열을 변경하는 것이 통상적이다. 아미노산을 변경하는 목적에 따라, 아미노산은 유사하거나 상동성의 아미노산으로 또는 비유사한 아미노산으로 대체될 수 있다. 아미노산을 유사 또는 상동성인 것으로 평가하는 많은 척도가 있다 (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p.123-39 (Academic Press, New York, NY 1987).
할릴 반복 서열은 다음의 독특한 특성을 갖는다: (1) NTP에 결합할 수 있다; (2) 많은 면역글로불린에 결합할 수 있다; 및 (3) 그 자체에 결합할 수 있다. 이 독특한 특성은 하기하는 바와 같은 많은 진단 및 치료적 적용을 가능하게 하고 제시한다.
A. 조성물
본 발명은 NTP의 할릴 펩티드, NTP의 분석 또는 정제를 위한 NTP의 친화성 결합 파트너로서 이 펩티드, 펩티드 모방제, 결합 파트너, 및(또는) 상동체의 용도, NTP 상의 할릴 펩티드를 차단하기 위한 할릴 펩티드, 펩티드 모방제 및 그의 상동체의 용도, 또는 할릴 서열을 통해 NTP와 상호작용하는 물질의 용도에 관한 것이다. 본 발명에는 또한 이러한 할릴 펩티드 서열에 대한 항체, 및 할릴 펩티드 및 그의 상동체에 상응하는 핵산을 포함한다.
할릴 펩티드 및 그의 상동체는 통상의 펩티드 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 할릴 펩티드의 모방제는 조합 화학 기술을 사용하여 개발할 수 있다.
할릴 펩티드에 서열에 대한 모노클로날 항체는 예를 들면 문헌 [Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들면 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체 (예를 들면, 항혈청)는 예를 들면 토끼 또는 양과 같은 숙주 동물을 면역원으로서 할릴 펩티드를 사용하여 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 면역화는 통상적으로 2 번 이상 약 1 주일 간격으로 면역원으로 반복하여 접종하는 것을 포함한다. 이러한 접종은 면역원에 대한 면역 반응을 상승시키고 접종된 숙주의 면역계가 면역원에 대한 항체를 생산하게 한다. 면역화된 숙주로부터의 혈청은 보통 마지막 추가접종 후 약 3 내지 10일에 수거될 것이다. 면역글로불린은 황산 암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 또는 기타 통상의 분리 및 정제 기술에 의해 혈청으로부터 분리할 수 있다.
할릴 펩티드에 상응하는 핵산은 예를 들면 (a) 표준 재조합 방법, (b) 합성 기술 또는 (c) 이들의 조합을 사용하여 제조할 수 있다.
B. 할릴 펩티드의 성질
1. NTP에의 결합
할릴 서열은 NTP에 대한 결합 특이성을 나타낸다. 할릴 펩티드 또는 그의 유사체가 고정되면 용액으로부터 NTP를 정제하기 위하여 사용될 수 있다. 할릴 펩티드가 친화성 분석의 일부로서 NTP를 포착하기 위하여 사용될 때, NTP에의 결합은 매우 특이적이고 pH 3.5 내지 pH 8에 의해 영향받지 않는다. 이 친화성 분석의 민감성은 최소한 면역분석법과 같은 정도로 높다. 예를 들면, ELISA로 측정시 약 0.5 ng/mL NTP를 함유하는 양성 뇨 풀은 약 4 배 희석되어도 이 친화성 분석에 의한 음성 풀로부터 여전히 구별될 수 있다 (이는 하기 실시예 6에 더 자세히 기재된다). 또한, 분석 민감도는 더 민감한 검출 수단, 예를 들면 형광 또는 화학 발광 기질 또는 방사성-표지 분석을 사용함으로써 개선될 수 있다.
본 발명의 할릴 펩티드가 NTP에 특이적으로 결합하기 때문에, 생물 시료에서 NTP 또는 NTP에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 진단 분석에 사용될 수 있다. 체액에서 정상 수준을 넘는 NTP는 AD, 다운증후군 또는 다른 퇴행성 뇌 질병의 존재를 나타내는 것으로 알려졌다.
2. 면역글로불린에의 결합
할릴 펩티드는 많은 면역글로불린에 결합한다. 펩티드 결합은 항체의 Fab 부분을 통한 것이 아니라 Fc 부분을 통한 것으로 보인다. 면역글로불린에의 결합은 생리적 pH에서 발생하지만, 몇몇 면역글로불린은 더 낮은 pH에서도 결합한다. 낮은 pH에서의 결합은 할릴 펩티드 및 특정 항체 사이의 강한 친화성을 암시하고, 결합이 친화성이 아니라 전하/전하 상호작용에 기인했다는 가능성을 없앤다.
할릴 펩티드가 면역글로불린에 결합하므로, 이들은 면역글로불린 분자의 정제에 유용하다. 면역글로불린에 대한 할릴 단량체 친화성은 꽤 낮으므로, 할릴 접합체의 결합활성은 펩티드 밀도를 조절함으로써 조절될 수 있다. 할릴 펩티드 밀도가 증가하면, 면역글로불린에 대한 친화성이 증가한다. 낮거나 중등도의 친화성 컬럼을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 높은 친화성 컬럼은 단백질 및 항체를 변성시킬 수 있는 가혹한 용출 조건을 필요로 하고, 용출된 생성물의 희석 때문에 바람직하지 않은, 넓고 희석된 피크로 용출되기 때문이다 (Wikstrom et al., J. of Chromatography, 597:83-92 (1992)). 이러한 희석은 용출된 단백질 또는 항체의 추가적 농축을 필요로 하고, 단백질 또는 항체 생성물의 손실 및(또는) 손상이 일어날 수 있다.
대조적으로, 할릴 펩티드와 함께 사용될 수 있는 것과 같은 낮은 친화성 크로마토그래피는 용출 피크를 뽀족하게 하고, 가혹한 조건을 피할 수 있는 장점이 있다 (상기 참조). 이러한 정제 과정은 제약 및 진단 분야에 유용한 정제된 단백질을 제공함으로써 치료 및 진단 항체를 정제하는데 유용하다.
면역글로불린 정제에 유용한 공지의 펩티드 유사체는 할릴 펩티드보다 훨씬 긴 서열을 갖고, 이들이 면역글로불린과 상호작용하는데 필요한 2차 구조를 필요로 하거나 모방하는 것으로 보인다 (Fassina et al., J. of Mol. Recognition, 9:564-569 (1996); Guerrier et al., J. of Mol. Recognition, 11:107-109 (1998); Palombo et al., J. of Mol. Recognition, 11:247-249 (1998); Braisted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5688-5692 (1996); Fassina et al., J. of Mol. Recognition, 11:128-133 (1998); Palombo et al., J. of Mol. Recognition, 11:243-246 (1998); Li et al., Nat. Biotechnol., 16:190-195 (1998); 및 미국특허 제5,084,559호; 5,100,788호; 6,013,763호). 본 발명의 상대적으로 짧은 할릴 펩티드는 생산 및 저장이 훨씬 쉽고 비용 효율적이다.
본 발명의 할릴 펩티드의 또다른 적용은 ELISA 및 면역크로마토그래피 스트립과 같은 형식의 진단 시험에 있어서 이들의 용도에 관계된다. 본 발명의 할릴 펩티드가 면역글로불린에 결합하므로, 할릴 펩티드는 면역분석 시스템에서 포착, 분리 또는 고정을 위한 항-항체 및 단백질 A 및 G에 대한 비용 효율적인 트랩 물질 대체물을 제공한다. ELISA 및 면역크로마토그래피 스트립에 사용되는 현재의 트랩 물질, 즉 항-항체 및 단백질 A 및 G는 제조 및 유지하기에 비용이 많이 든다. 이는 제조하기가 상대적으로 간단하고 저장하기에 비용-효율적인 본 발명의 할릴 펩티드와는 대조적이다.
3. 그 자체에의 결합
본 발명의 할릴 펩티드 및 유사체는 그 자체에 결합할 수 있으므로 단백질에 접합될 때 단백질이 매우 낮은 pH 또는 매우 낮은 희석율로 유지되지 않는다면 자기-응집될 것이다. 담체 단백질은 중성 pH에서 자기-응집되고 용액으로부터 침전될 수 있다.
또한, 그의 독특한 자기-결합 특성으로 인하여, 할릴 펩티드는 분석에서 NTP 유사체로서 사용될 수 있다. 이는 할릴 펩티드가 NTP의 자기-결합 특성을 복제하 기 때문이다. 순차 또는 경쟁적 분석에서, NTP는 할릴 펩티드 접합체 고상에 결합할 것이고, 세척하는 동안 그대로 유지되어 면역글로불린 (예를 들면 토끼 IgG)의 결합을 차단한다. 할릴 펩티드는 샌드위치 분석에서 포착 항체 대체물로서 사용될 수도 있다. 본 발명의 할릴 펩티드는 NTP 단백질보다 저가이고 더 비용효율적인 분석 물질이다.
할릴 펩티드의 자기-응집 성질은 치료적으로 적용될 수 있다. 할릴 서열은 그들이 접합된 단백질이 서로 결합되게 하므로, 이는 이 서열을 통하여 NTP가 자기-결합하고(하거나) 다른 단백질과 결합한다는 것을 암시한다. 이 결합은 분자내 또는 분자간 결합일 수 있다. 친화성 컬럼 및 마이크로타이터 플레이트가 유리 NTP를 결합시키는 능력 (하기 실시예에 기재함)은 천연 NTP 및 할릴 서열이 표면에 접근할 수도 있다는 것을 나타낸다.
NTP의 독성은 전체적으로 또는 부분적으로 상호작용성이 높은 할릴 서열에 기인할 가능성이 있다. 따라서, NTP의 독성은 자기-응집 때문일 수 있거나 다른 뇌 성분과의 반응성이 높은 할릴 서열의 상호작용 때문일 수 있다. NTP의 이 서열을 차단함으로써 그의 상호작용 능력을 차단할 수 있다.
NTP가 신경퇴행의 일련의 반응에 관여한다는 것은 분명하다. NTP를 표적화함으로써 이 일련의 반응을 방해하거나 방향을 바꾸는 능력에 의해 치료적 가능성이 제공된다. 예를 들면, 할릴 펩티드가 NTP 결합 위치와 상호작용하는 능력을 사용하여 치료적으로 개입함으로써, NTP 상의 잠재적 반응 위치를 차단할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 할릴 펩티드 및 모방제는 할릴 서열을 발현하는 세포로 약물 을 표적화하는데 유용할 수 있다.
자기 결합하는 펩티드는 생체부착제 (bioadhesive)로서 생체물질에 사용되었다. 따라서 펩티드의 자기 결합 또는 자기 인식 성질을 사용하여 비-결합성 단백질 또는 펩티드가 결합되도록 유도하거나, 모이어티를 표면에 고정시키거나, 표적 위치로 약물을 보낼 수 있다. 펩티드를 유도하는 이러한 세포 부착은 합성 조직 및 장기의 디자인에 유용할 수 있다 (Mayo, K. H., TIBTECH, 18:212-217 (May, 2000)). 이러한 물질은 또한 pH 및 결합 민감성인 겔 시스템의 제작에 유용한 것으로 나타났다 (상기 참조). 또한, 할릴 펩티드 서열의 중합 및(또는) 다수 반복은 구조적 특징 및 높은 결합활성을 갖는 조성물을 제공할 수 있다.
NTP 서열에서 할릴 서열의 반복은 할릴 서열이 NTP의 조립 또는 중합에서 일정한 역할을 할지도 모른다는 것을 암시한다. 예를 들면, 콜라겐에서 추후 피리디놀린 연결기를 형성하는 위치에서 자기 결합하는 분리된 가닥의 영역은 역시 높은 상동성을 나타내고, 이는 이 자기-확인 상동성 영역이 주요한 구조적 및 기능적 목적을 수행한다는 것을 암시한다. "HARLIL" 위치는 개별적으로 또는 중합체 배열에서 다른 뇌 단백질과 상호작용하며 NTP의 기능성에 중요한 것 같다.
NTP 과잉생산이 AD 및 관련 신경퇴행성 질병 병인에 기여한다면, HARLIL 모델에 기초한 치료제에 의해 NTP 단백질의 생산 또는 폴딩은 억제될 것이고(이거나), NTP의 중합 또는 다른 성분과의 상호작용이 방지될 것이다. 예를 들면, 1 이상의 할릴 펩티드 또는 할릴 모방제의 투여에 의해 NTP 응집 또는 폴딩 또는 조립이 억제될 수 있다면, NTP의 프로테아제 분해의 상승이 기대될 것이다. 따라서, 1 이상의 할릴 펩티드 또는 할릴 모방제의 투여에 의해 과잉 NTP의 제거를 달성할 수 있을 것이다. 별법으로, 할릴 펩티드 또는 할릴 모방제 치료제는 신경퇴행의 일련의 반응의 다른 성분들과 NTP 단량체 또는 응집체의 상호작용을 조절하는데 유용할 수 있다.
자기 조립 또는 중합되는 많은 단백질은 반복 구조를 갖는다. 가장 잘 알려진 것은 짧은 반복 서열인 gly X Y를 사슬 당 6 번 갖는 콜라겐이다 (Lacy et al., "Identification of FLRT1, FLRT2 and FLRT3: a novel family of transmembrane leucine rich repeat proteins," Genomics, 62(3):417-26(1999)). 다른 연구에서는 특정 반복 서열이 결합의 핵형성에 관여하는 것으로 밝혀졌다 (Snellman et al., "A short sequence in the N-terminal region is required for the trimerization of type XIII collagen and is conserved in other collagenous transmembrane proteins," EMBO J., 19(19):5051-59 (2000)). 또한 자기 조립에 있어서 중요한 콜라겐 펩티드 Pro Pro Gly가 샤페론 (chaperone) HSP7과 프로콜라겐의 상호작용에서도 역시 중요하다는 것을 밝히는 연구가 있다 (Koide et al., Conformational requirements of collagenous peptides for recognition by the chaperone protein HSP47," Biol. Chem., 275(36):27957-27963 (2000)). 라미닌에서 자기 인식의 특이성이 연구되었다 (Schittny, J.C., "Affinity Retardation Chromatography: Charaterization of the Method and Its Application," Anal. Biochem., 222:140-148 (1994)).
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따라서, 섬유상 구조를 형성하거나 중합하는 단백질은 일반적으로 자기에게 있는 특정 도메인을 인식하는 (self-recognition) 단백질 상의 특정 도메인을 통한 자기 조립에 의해 그렇게 하는 것이 분명하다. 또한, 이 단백질은 다른 단백질과의 상호작용에 있어서 동일한 이 인식 위치를 사용할 수 있다. Fc와 단백질 A의 상호작용의 경우 (Deisenhofer, J., "Crystallographic Refinement and Atomic Models of a Human Fc Fragment and Its complex with Fragment B of Protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A Resolution," Biochem., 20(9):2361-2370 (1981)), 이 상호작용은 할릴 서열의 상호작용과 같이 소수성 및 이온성 상호작용을 통한 것으로 보인다.
NTP의 경우, 자기 조립에서 작용할 가능성이 가장 높은 할릴 도메인은 상동성이 매우 높고, 실제로 거의 완전히 보존되는 것으로 보인다. "류신 지퍼 (leucine zipper)"는 류신이 많은 범위가 서로 결합하는 자기-인식을 사용한다. 그러나 류신 지퍼는 할릴 서열처럼 독특하지는 않다. 할릴 서열은 자기 조립 및 다른 뇌 성분과 NTP의 상호작용에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
효모에서 프라이온 및 프라이온 요소를 사용한 실험에 의해 단백질이 자기 응집 배좌를 취할 수 있다는 증거가 제공된다 (Serio et al.,"Nucleated Conformational Conversion and the Replication of Conformational Information by a Prion Determinant," Science, 289:1317-21 (2000); 및 Sparrer H.E., "Evidence for the Prion Hypothesis: Induction of the Yeast (PSI+) Factor by in vitro-Converted Sup35 protein," Science, 289(5479):595-599 (2000)).
리 (Li) 및 린드퀴스트 (Lindquist)는 펩티드 서열 22-69를 포함하는 SUP 단 백질의 유전적 융합 부분에 의해 SUP 프라이온 활성을 비관련 단백질 상에 부여할 수 있다는 것을 밝혔다. 따라서, 이들은 SUP35 단백질의 특성을 부여하는 프라이온이 SUP 22-69 펩티드에 존재한다는 것을 입증하였다. 유사하게, 본 발명은 응집을 유발하는 자기-확인 펩티드에 관한 것이다. 서열을 단백질 상에 접목시킴으로써 (접합에 의해), 그 단백질 상에 자기 응집성을 부여할 수 있다. 그 결과, 생리적 pH에서 할릴 단백질 접합체의 95% 이하의 즉시 침전이 관찰된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 그러나, 본 발명은 이 실시예에 기재된 특정 조건 또는 세부 사항에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 명세서 전체에서, 미국 특허를 비롯하여 공개적으로 입수가능한 문헌에 대한 모든 참고문헌은 본원에 인용함으로써 도입된다.
실시예 1
이 실시예의 목적은 신경 트레드 단백질의 몇몇 할릴 서열을 확인하고 NTP와 이들의 반응성을 측정하는 것이었다.
하기 할릴 서열을 합성하고 (Synpep, Dublin CA) 말레이미드로 활성화된 토끼 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove PA)에 접합시키고 이들의 NTP 면역반응성을 평가하였다. NTP의 90-96번째 H H A R L C L 서열의 전후에서 나타나는 단 백질 서열의 반복인 링커를 첨가하였다.
Figure 112003014946315-pct00001
* 아세트아미도 메틸 (C3H6NO)로 블로킹됨.
담체 단백질로의 접합은 시스테인을 통해서 이루어졌다. 따라서, 펩티드 NTP-1 및 NTP-2는 1 이상의 시스테인 잔기가 있으므로 혼합 접합체를 생성했다. 그러므로, 펩티드 NTP-5 및 NTP-6의 경우, 2차적 시스테인을 ACM으로 차단시켰다.
NTP 서열에서 확인된 서열의 위치를 도 1에 나타냈다. 모든 할릴 유사체가 어느 정도 반응성을 나타내었으나, 대부분의 연구에서 NTP-3를 선택했는데, 이는 NTP-3가 양호한 반응성을 나타내면서 하나의 시스테인 잔기를 가지므로 작업하기에 용이하기 때문이다.
상기한 바와 같이, 할릴 펩티드의 상동체 및 변이체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이 실시예의 상동성 펩티드의 제작을 위해, 상동성 아미노산을 사용하였다. 사용된 치환 기준은 전하 및(또는) 크기였다. 따라서, NTP 펩티드 3에서 시스테인 대신 메티오닌을 선택하여 치환한 것은 이 두 아미노산 사이에 전체적 유사성이 있고 반응성 시스테인을 이 중요한 아미노산의 범위로부터 제거하고자 하는데 기초한 것이었다. 시스테인 대신 프롤린을 선택하여 치환한 것은 이러한 치환이 단백질 내에 있고 시스테인이 디설파이드 결합으로 있을 때 펩티드의 배좌 형태를 모방하는지를 보려는 시도였다.
친화성 상호작용에 영향을 미치거나 이를 연구하기 위한 당업자에게 공지된 다른 변화는 예를 들면, 류신을 다른 소수성 아미노산, 예를 들면 이소류신, 발린, 알라닌 또는 글리신으로 교환하는 것, 산성 아미노산 또는 염기성 아미노산을 교환하는 것, 전하 대 공간의 효과를 측정하기 위하여 히스티딘을 페닐알라닌으로 교환하는 것, 전하 대 공간의 효과를 평가하기 위하여 아스파라긴을 아스파르트산으로 또는 글루타민을 글루탐산으로 교환하는 것 및 세린을 트레오닌으로, 트레오닌을 시스테인으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 아르기닌을 라이신 또는 히스티딘으로, 티로신을 트립토판 또는 페닐알라닌으로 교한하는 것을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
할릴 펩티드 서열만이 활성을 가지므로 NTP의 플랭킹 서열이 스페이서로서의 역할을 제외하고는 필요한 이유가 없는 것으로 보인다. 플랭킹 서열에 도입된 변화는 펩티드의 염기성 또는 소수성을 감소시키기 위해 행해졌다.
실시예 2
이 실시예의 목적은 NTP의 친화성 정제를 위한 친화성 리간드로서 NTP-3의 용도를 입증하기 위한 것이었다. 이 과정에서, 친화성 컬럼 상에서 AD 환자로부터 얻은 뇨 시료로부터 NTP를 정제하였다.
시험을 위한 NTP를 함유하는 뇨 시료의 제조: 사용된 NTP의 생물학적 공급 원은 AD로 진단된 환자의 뇨 (BOU1)였다. 컬럼 재료에 도입하기 전, 생물 시료를 AD 시험을 위한 뇨의 처리에 관한 하기 프로토콜을 따라서 처리하였다:
1. 뇨를 에임스 멀티스틱스TM (Ames Multistix) (Bayer, Indiana)로 시험하였다. 시료가 (a) 세균 오염에 대해 양성 반응을 나타내거나; (b) 신장병과 관련된 것과 같은 단백질 (이 시험은 NTP가 없는 병적 수준의 단백질에 대해 양성인 시료를 배제하지 않는다), 케톤, 혈액, 유로빌로겐, 니트라이트, 백혈구의 병적으로 높은 수준에 대해 양성 반응을 나타내거나; (c) pH가 7.5 보다 높거나 4.5 미만이거나; (d) 비중이 1.025보다 크다면 시료를 버렸다.
2. 시료를 3000 xg에서 15 분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
3. 뇨를 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 시린지를 사용하여 여과하고, 여액을 0.05% 아지드가 되게 하였다.
4. 결과의 분취량을 아미콘 센트리콘 (Aimcon Centricon)(등록상표) YM-10 밀리포어 (Millipore)의 상층 용기에 넣고 3000 xg에서 1 시간 동안 원심분리하였다.
5. 원래 부피의 약 25%로 된 시료를 원심분리기에서 빼내고 1.5 mL의 트리스 완충 식염수 (TBS)를 가하여 다시 원래 부피가 되게 하였다.
6. 시료를 다시 3000 xg에서 30 분 동안 원심분리한 후, 원심분리기로부터 시료를 빼내고, 1.5 mL의 TBS를 시료에 첨가하는 단계 4 및 5를 반복하였다.
7. 시료를 3000 xg에서 30 분 동안 원심분리한 후, 원심분리기로부터 시료를 빼내었다. 시료는 원래 부피의 4분의 1로 되었다.
8. 그 후 시료를 보로실리케이트 유리 바이알에 옮기고 -20℃에서 냉동 저장하였다.
컬럼의 제조: NTP-3를 제조자의 지시에 따라 시아노겐 브로마이드로 활성화된 아가로스 (Sigma, St. Louis, MO)에 접합시켰다. 제조 후, 컬럼 재료를 0.01% 아지드를 함유하는 pH 7의 25 mM 트리스 완충 식염수 (TBS) 중에 저장하였다.
크로마토그래피: 11 mL의 친화성 컬럼 재료를 25 mL의 뇨 시료 (상기한 바와 같이 처리하여 TBS (pH 7) 중의 4 배 농축된 시료를 얻음) 및 25 mL의 0.025 M 글리신 완충액 (pH 3.5)과 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 흡착되지 않은 (통과된) 물질 을 수거하였다. 그 후 컬럼을 5 배 부피의 1x TBS (pH 7)로 세척하고 11 mL의 0.1 M 글리신 (pH 2)로 용출시켰다. 용출 후 즉시, 용출액을 NaOH로 pH 7로 조정한 후, 실시예 1에서와 같이 아미콘 센트리콘(등록상표) YM-10 (Millipore, Beverly MA)을 사용하여 1 mL로 농축하였다.
친화성 컬럼 용출액에 존재하는 NTP 활성의 분석: 뇨 중의 신경 트레드 단백질에 대하여 시험하는 7C 골드TM (Gold) 스트립을 사용하여 친화성 분석 활성을 분석하였다 (Nymox Pharmaceutical Corp., Maywood NJ. 예를 들면 문헌 [Fitzpatrick et al., Alzheimer's Reports, 3(3):155-159 (2000)] 참조). 7C 골드TM 스트립에 의해 분석된 모든 활성은 pH 2의 용출액 분획에 있었다.
단백질 농도: 용출액 중의 단백질 농도는 코마시 블루 (Comassie Blue) 염색 (BioRad, Hercules, CA)에 의하여 측정할 때 108 ㎍이었다. 이는 출발 단백질 농도의 약 3%이다. 바이신코니닉 에시드 키트 (Bicinchoninic Acid Kit)(Cat. # 23223, BioRad)로 측정시 단백질 농도는 145 ㎍이었다. 완충액에 대해 보정된 280 nm에서의 흡광도는 390이었고, 이는 390 ㎍의 단백질을 나타낸다. 흡광도 측정으로 단백질 양이 더 많이 얻어진 것은 NTP에 방향족 아미노산이 다량 존재한 결과인 것 같고, 방향족 아미노산은 이 측정 기술을 사용하면 단백질의 과대평가를 야기할 수 있다.
친화성 컬럼 용출액으로부터 겔 전기영동에 의한 NTP 단백질의 분석: 1 ㎍의 용출액 (약 110-145 ng)을 12.5% 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 미니-겔 (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) 상에서 전기영동시키고 은으로 염색하였다. 약 29 kD, 33 kD, 40-45 kD 및 60 kD에서 밴드가 관찰되었다. 겔을 20-35 kD, 35-45 kD, 및 45-65 kD의 밴드로 자르고 100 ㎕의 TBS에 넣고, TBS에 대해 밤새 투석되게 하였다. 그 후 밴드 용출액을 실시예 1에서와 같이 아미콘 센트리콘(등록상표) YM-10을 사용하여 농축하고 7C 골드TM 분석을 사용하여 활성을 분석하였다.
NTP 반응성은 35-45 kD 밴드에서, 약 42 kD에서 관찰되었다. 나머지 밴드에서는 활성이 관찰되지 않았다. NTP는 보고된 분자량이 41 kD이다. 따라서, 이 데이터는 친화성 컬럼에 결합된 NTP-3가 AD 환자의 뇨 샘플에 존재하는 NTP 단백질에 선택적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
이 실시예는 할릴 펩티드 NTP-3가 NTP에 특이적으로 결합한다는 것 및 NTP-3 와 같은 할릴 펩티드가 NTP의 친화성 정제를 위한 친화성 리간드로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3
이 실시예의 목적은 할릴 펩티드의 자기-응집 능력을 보이는 것이었다. 할릴 펩티드 NTP-3는 디설파이드 결합을 형성하고 (시스테인 잔기 때문), 중성 pH에서 이량체로 된다. 이량체로 된 펩티드는 두 개의 면역글로불린에 결합할 수 있으므로, 침전을 일으킬 수 있다. 할릴 펩티드의 이러한 성질을 토끼 면역글로불린을 사용하여 입증하였다.
1 ml의 디메틸설폭시드 (DMSO) 중의 1 mg의 할릴 펩티드 NTP-3를 pH 7의 토끼 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 3.4 mg에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 투석하여, 다음날 아침 투명한 백색 침전이 관찰되었다. 침전물을 원심분리에 의해 제거하고 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 분광광도계 모델 람다 3B를 사용하여 상청액의 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다. 예를 들면 pH 3.5 또는 그 미만과 같은 낮은 pH에서 면역글로불린의 침전이 방지되었다.
할릴 펩티드를 사용하여 침전된 면역글로불린
출발 농도 최종 농도 침전된 단백질 %
3.4 mg RGG* + 1 mg NTP-3 2.7 mg 39%
* 토끼 IgG
이 실시예는 면역글로불린을 단리하고(하거나) 정제하기 위하여 사용될 할릴 펩티드의 능력을 입증한다.
실시예 4
이 실시예는 NTP의 존재를 검출하고 정량하는데 있어서 할릴 펩티드의 유용성을 나타낸다.
멤브레인 기초 분석: 7C 골드TM 분석은 두개의 트랩 및 스트립 상에 위치한 시료 수용대를 구비한 5 mm x 45 mm 스트립으로 이루어진다. 트랩 1 및 2는 각각 시료 수용대로부터 16 및 24 mm 떨어져서 위치해 있다. 각 트랩은 약 4 cm 깊이이다.
Figure 112003014946315-pct00002
표지된 금 입자는 트랩 1 또는 2로 이동한다. 트랩 1 및 2에 표지된 금의 비율은 시료에 존재하는 NTP의 양과 상관관계가 있다. 피츠패트릭 (Fitzpatrick) 등의 미국 특허 제6,121,008호 참조.
NTP-3 접합체의 제조: 3.8 mg/mL 농도의 말레이미드로 활성화된 토끼 면역글로불린 (RGG) (Pierce, Rockford, IL)을 1 M 시트레이트를 사용하여 pH 3.5로 만들었다. DMSO 중의 30 배 과잉 몰농도의 할릴 펩티드 NTP-3를 RGG에 첨가하였다. NTP-3/RGG 접합체를 pH에 대해 모니터하고 밤새 실온에서 서서히 교반하면서 반응시켰다. 그 후 접합체를 0.5 mM, pH 3.5의 시트레이트 포스페이트 완충액에 대해 완전히 투석시켰다.
7C 골드 TM 스트립 분석의 제조: 투석된, RGG에 접합된 NTP-3 접합체를 0.5 mM, pH 3.5 시트레이트 포스페이트 완충액 중에서 1 mg/mL로 희석하였다. 밤새 정치시킨 후, 6 ㎕/cm의 접합체를 XY3000TM 바이오도트 (Biodot)(Irvine, CA)를 사용하여 트랩 1에서 멤브레인 (Loprodyne 3, Pall, East Hills, NY) 상에 코팅하였다. 그 후, 0.5 mg/mL의 염소의 항-마우스 면역글로불린 (DAKO #20109, Denmark)을 트랩 2에서 NTP-3/RGG 접합체의 1 cm 위의 멤브레인에 코팅하였다 (NTP-3/RGG 코팅과 같은 파라미터를 사용). 멤브레인 또는 7C 골드TM 스트립을 30 분 동안 뜨거운 공기로 건조시키고, 5 mm 스트립으로 자르고, 건조제와 함께 저장하였다. 이 트랩은 NTP가 없을 때 항-NTP-항체로 코팅된 금과 결합할 것이다. 7C 골드TM 분석은 항-NTP 항체 N3I4 (de la Monte et al., J. of Neuropath. Exp. Neurol. 55:1038-1050 (1996))를 사용한다. 이 분석의 기초는 NTP가 금 상의 N3I4 항-NTP 항체에 의해 포착되고, NTP-3 트랩으로 운반되며, 여기서 NTP는 경쟁되어 N3I4로부터 떨어지고 트랩 1에 결합하는 것이다. 이 과정에서, NTP는 금 상의 항체가 트랩 1에 결합하는 것을 차단하고, 그 결과, 금은 트랩 2로 이동한다. 따라서, NTP가 존재하면, 더 많은 금이 트랩 2로 이동한다.
콜로이드성 금: 콜로이드성 금을 문헌 [Colloidal Gold, M.A. Hayat ed., Academic Press Limited, London (1991)]에 기재된 바와 같이 제조하고, 20 ㎍/mL 농도의 정제된 N-3I4 항-NTP 항체로 코팅했다. 그 후, 항체-코팅된 콜로이드성 금을 저온보존 (cryopreservative) 완충액 (Serex Inc., Maywood, NJ)로 희석하고 동결건조하였다. 하나의 스트립에 충분한 양을 비르투스 (Virtus) (Gardiner, NY) 모델 600SL & 12 SL 동결 건조기를 사용하여 2 mL 보로실리케이트 바이알 (Wheaton #223683; Millville, NJ) 내에서 동결건조하였다.
환자 시료: 107 명의 환자 시료를 실시예 2에 기재된 바와 같이 처리하고 농축하였다.
7C 골드 TM 분석: 각각 처리되고 농축된 환자 샘플 50 ㎕를 NTP 항체로 코팅된 동결건조된 금에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15 분 동안 인큐베이션한 후, 분석이 완료될 때까지 7C 골드TM 스트립을 바이알에 넣었고, 분석의 완료는 스트립의 상단에 녹색 선이 나타나는 것으로 알 수 있다. 스트립을 꺼내서 건조시켰다.
결과의 요약: NTP가 없을 때, 대부분의 NTP 항체로 코팅된 금은 할릴 펩티드 NTP-3 트랩에 결합한다. NTP 할릴 펩티드 고상 마이크로타이터 플레이트는 매우 낮은 친화성으로 마우스 항체에 결합하지만, 금 상에서 응집된 상태에서는 N3I4 모노클로날 항체가 트랩에 결합한다. 그 후 덴시토미터 (Gretag D19C, Switzerland)를 사용하여 밴드 1 및 2에서 색상의 강도를 측정하였다. 트랩 1 반사율을 트랩 1에서의 반사율과 트랩 2에서의 반사율을 더한 값으로 나눈 값인 비율 값 (Ratio Value)을 계산하고, 시료의 비율 값을 지표 또는 컷오프 샘플의 비율 값으로 나눴다. 이 값을 지표값 (indexed value)으로 불렀다. 도 3에 도시된 분석의 결과는 정상 시료가 AD 시료로부터 확실히 구별되는 것을 보여준다.
실시예 5
이 실시예의 목적은 NTP가 할릴 펩티드로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합하는 것이 비접합 할릴 펩티드에 의해 억제될 수 있는 것을 보여주는 것이었다.
마이크로타이터 플레이트의 제조: 실시예 4에서와 같이 제조되고 30:1의 비율의 할릴 펩티드/면역글로불린 컴플렉스 NTP3-RGG를 0.5 ㎍/웰의 농도로 이뮬론 (Immulon) 4 마이크로타이터 플레이트 (Dynex, Chantilly, VA) 상에 코팅하였다.
표준시료: TBS 중의 재조합 NTP (문헌 [de la Monte et al., J. of Neuropath. Exp. Neurol., 55:1038-1050 (1996)]에 기재됨), 0.01% 아지드 (Nymox Pharm. Corp., Lot 4-7-98)를 TBS로 연속적으로 희석하였다. 100 ㎕의 각 희석액을 pH 3.5에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 희석액을 15 분 동안 TBS, 0.1% 알부민 및 0.05% 트윈 80 중에서 세척하였다. 그 후, TBS 및 0.05% 트윈 80 중에서 3 번 세척하였다.
마이크로타이터 플레이트 분석: 퍼옥시다제와 접합된 토끼 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)의 1:8000 희석액 100 ㎕를 첨가하고 30 분 동안 반응시켰다. 마이크로타이터 플레이트를 TBS 및 0.05% 트윈 80으로 두 번 세척한 후, 150 ㎕의 테트라메틸벤젠 (TMB) (Serex Inc., Maywood, NJ)을 첨가하였다. 그 후 혼합물을 10 분 동안 인큐베이션하고 50 ㎕의 2 N HCl로 반응을 중단시켰다. SLT 340 ATTC 분광광도계에서 흡광도를 측정하였다.
이 시스템을 사용하여, 단량체 NTP-3이 접합체가 플레이트에 결합하는 것을 억제한다는 것을 알 수 있다. 도 2 참조.
실시예 6
이 실시예의 목적은 항체가 할릴 펩티드로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 특이적으로 결합하는 것을 입증하고 항체의 어느 부분 (Fc 또는 Fab)이 할릴 코팅된 플레이트에 결합하는지를 시험하기 위한 것이었다.
시험된 항체: 하기 항체를 잭슨 이뮤노리서치 (Jackson Immunoresearch)(West Grove, PA)로부터 입수하였다: (1) 알칼리 포스페이트 (AP)로 표지된 친화성 정제된 토끼의 항-마우스 IgG 항체; (2) AP로 표지된 친화성 정제된 토끼의 항-마우스 IgG (Fab2); 및 AP로 표지된 친화성 정제된 토끼의 항-닭 IgG.
토끼의 항-마우스 IgG (항체 (2))가 NTP-3/RGG 접합체에서 RGG를 인식하고 있을 가능성을 제거하기 위해 토끼의 항-닭 IgG (항체 (3))를 사용하였다. 항체 (2)가 IgG의 Fc 부분이 없다는 것을 제외하고는 항체 (2)는 항체 (1)과 동일하였다.
분석 형식은 실시예 5에서와 같았다. 비-면역 정제된 토끼, 닭, 및 마우스 IgG를 1 mg/mL까지 첨가하였다 (도 4 참고). 대조군은 1 mg/mL BSA (소 혈청 알부민), 알파-당단백질, AD 양성 및 음성 대조군 뇨, 및 80, 40, 20, 10 및 5 단위의 재조합 NTP였다. 토끼 및 닭 IgG 모두는 용량 의존적 방식으로 AP 접합체에 대하여 경쟁하였다. 도 4 참고. Fab2는 플레이트에 결합하지 않았다.
결과의 요약: 온전한 분자인 토끼의 항-마우스 및 토끼의 항-닭 IgG는 모두 NTP-3/토끼 IgG로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 결합하였다. Fab 표지된 항체는 어떠한 결합도 나타내지 않았다 (결과는 기재하지 않음). 이 결과는 할릴 펩티드 항체 결합이 항체 Fc 영역의 인식을 통해 이루어진다는 것을 나타낸다.
다른 종의 IgG에 대한 할릴 펩티드의 친화성은 변화된다. 예를 들면, 토끼 IgG에 비해 마우스 모노클로날 항체는 NTP-3 접합체에 대해 훨씬 낮은 친화성을 나타냈다. 도 4 참고.
실시예 7
이 실시예의 목적은 NTP가 항체의 Fc 부분을 인식하는 단백질 G에서의 서열을 인식하는지 여부를 결정하기 위한 것이었다.
단백질 G는 Fc 영역을 통해 항체에 결합한다. 이 실시예의 결과가 할릴 펩티드가 면역글로불린의 Fab 부분이 아니라 Fc 부분에 결합한다는 것을 제시하므로, NTP가 항체의 Fc 부분을 인식하는 단백질 G에서의 서열을 인식하는지가 결정되었다. 구체적으로, 할릴 펩티드가 할릴 펩티드를 인식하고, 할릴 펩티드가 항체의 Fc 영역을 인식하고, 단백질 G가 항체의 Fc 영역을 인식하므로, 이 실험은 단백질 G가 NTP를 인식하는지를 결정하였다.
NTP 양성 및 NTP 음성 시료 모두 단백질 G 컬럼을 통과시켰다. NTP는 현저하게 감소하였다. 이 결과는 단백질 G가 NTP에 결합하지 않는다는 결론을 뒷받침 한다.
Fc 영역이 면역계에서 수용체를 인식하기 위하여 사용되므로 Fc 영역을 통한 결합은 치료적 의미를 가질 수 있다.
실시예 8
이 실시예의 목적은 할릴 펩티드를 사용한 마이크로타이터 플레이트 분석 형식에서 경쟁적 친화성 분석을 입증하기 위한 것이었다.
마이크로타이터 플레이트의 제조: 실시예 4에서와 같이 제조되고 30:1의 비율인 할릴 펩티드/면역글로불린 컴플렉스 NTP-3/RGG를 이뮬론 II 마이크로타이터 플레이트 (Dynex Chantilly, VA) 상에 20 ㎍/웰의 농도로 코팅하였다.
시료의 제조: 30 개의 뇨 시료를 실시예 2에 기재된 바와 같이 시험을 위해 제조하였다. 항체 Fc가 분석을 방해할 수 있으므로 시료를 100 K 아미콘 센트리콘 (Millipore Inc., Beverly MA)에서 회전시켜서 모든 항체를 제거한 후 여액을 시험하였다 (진단 시험에서 가양성 (false positive)을 방지하기 위하여, 할릴 펩티드가 비-NTP 항체에 결합하는 능력을 없앴다. 예를 들면, 면역글로불린 수준이 100 ㎍/mL가 넘는 시료는 분석 전에 면역글로불린 수준을 100 ㎍/mL 미만으로 감소시켜야 한다).
대조군: 어떠한 신경퇴행성 질병의 진단도 받지 않은 개체의 뇨로부터 준비한 뇨 풀을 실시예 2에 기재된 대로 제조된 친화성 컬럼을 통과시켰다. 그 결과의 뇨 풀을 "제거 (stripped)" 뇨라고 지칭하였다.
그 후 제거 뇨를 사용하여 높은 풀의 적절한 희석에 의해 중간 범위의 대조 군을 제조하였다. 높은 풀은 NTP에 대한 분석에서 양성으로 시험된 AD로 진단받은 환자로부터의 시료를 수거하여 제조하였다 (실시예 4 참조).
표준시료: 재조합 NTP (Nymox Pharmaceutical Corp, Montreal Canada)를 TBS에 희석하여 표준시료를 만들었다. 표준시료는 40, 20, 10 및 0의 단위 값을 배정하였다. 뇨 중의 NTP가 부분적으로 분해될 수 있다는 증거가 있으므로, NTP의 양을 중량으로가 아니라 재조합 NTP 단위로 표현하였다. 도 5는 마이크로타이터 형식 경쟁적 NTP 분석에서 뇨 대조군 시료 및 재조합 NTP의 직선성을 비교한 것이다.
분석: 환자 시료를 다음과 같이 이 분석에서 시험하였다: 퍼옥시다제 접합된 토끼 IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)의 1:5000 희석액 50 ㎕ 및 시료 또는 표준시료 50 ㎕를 플레이트의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, TBS, 0.1% 알부민 및 0.05% 트윈 80 중에서 세 번 세척하였다. 100 ㎕의 PNPP (Para Nitro Phenyl Phosphate) (Moss, Pasadena, MD)를 각 웰에 첨가하였다. 405 nm에서의 OD를 바이오라드 리더 (BioRad Reader) 상에서 30 분에 읽은 후, 15 분 간격으로 TBS 표준시료의 OD가 2-2.5 사이가 될 때까지 읽었다. 도 6에 나타낸 결과는 NTP가 모든 시료에서 발견되었지만, AD-양성 환자에게서 상승된 양으로 존재한다는 것을 입증한다. 이 상승된 양은 연령을 맞춘 대조군을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 따라서, 생물 시료에서 NTP의 양을 측정하는 진단 시험은 높은 정확성의 AD 또는 다른 신경퇴행성 장애의 진단에 유용할 수 있다.
본 발명의 취지 또는 범위에서 벗어나지 않고 본 발명의 방법 및 조성물에 다양한 변형 및 변경을 할 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 변형 및 변경이 첨부되는 청구범위 및 그 균등물의 범위 내라면 본 발명은 그것을 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NYMOX PHARMACEUTICALS CORPORATION <120> PREFERRED SEGMENTS OF NEURAL THREAD PROTEIN AND METHODS OF USING THE SAME <130> 018792/0195 <140> PCT/US01/42813 <141> 2001-10-25 <150> 09/697,590 <151> 2000-10-27 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1442 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: NTP DNA sequence <220> <221> CDS <222> (15)..(1139) <400> 1 tttttttttt tgag atg gag ttt tcg ctc ttg ttg ccc agg ctg gag tgc 50 Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys 1 5 10 aat ggc gca atc tca gct cac cgc aac ctc cgc ctc ccg ggt tca agc 98 Asn Gly Ala Ile Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser 15 20 25 gat tct cct gcc tca gcc tcc cca gta gct ggg att aca ggc atg tgc 146 Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys 30 35 40 acc cac gct cgg cta att ttg tat ttt ttt tta gta gag atg gag ttt 194 Thr His Ala Arg Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe 45 50 55 60 ctc cat gtt ggt cag gct ggt ctc gaa 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gccacaacac ccagccagtc acatttttta aacagttaca 1339 tctttatttt agtatactag aaagtaatac aataaacatg tcaaacctgc aaattcagta 1399 gtaacagagt tcttttataa cttttaaaca aagctttaga gca 1442 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: NTP amino acid sequence <400> 2 Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys Asn Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ala 20 25 30 Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys Thr His Ala Arg 35 40 45 Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe Leu His Val Gly 50 55 60 Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu 85 90 95 Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met Cys Pro Ser Trp 100 105 110 Ser Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp 115 120 125 Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu Phe Phe Leu 130 135 140 Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val Gln Trp Cys Asp 145 150 155 160 His Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys His Pro Pro Ala 165 170 175 Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His His Tyr Thr Trp 180 185 190 Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln Ser Leu Asn Ser 195 200 205 Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly Ser Leu Gln Pro 210 215 220 Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser 225 230 235 240 Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe Phe Val Phe Leu 245 250 255 Val Glu Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile Leu Ile Ser Gly 260 265 270 Pro Cys Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly 275 280 285 Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys Leu Phe Glu Met 290 295 300 Glu Ser His Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Pro Asn Leu Gly 305 310 315 320 Ser Leu Gln Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser 325 330 335 Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro His Pro Ala Asn 340 345 350 Phe Cys Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Trp 355 360 365 Ser Gln Thr Pro Asp Leu Arg 370 375 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 His Ala Arg Leu Met Leu 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-1 peptide <400> 4 Leu His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-2 peptide <400> 5 Leu Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly Asn Asn Asn Val 1 5 10 15 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-3 peptide <400> 6 Cys Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Met 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-4 peptide <400> 7 His His Ala Arg Leu Pro Leu Ala Asn Phe Cys Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-5 peptide <400> 8 Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-6 peptide <400> 9 Cys Glu Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-7 peptide <400> 10 Asp Asn Thr His His Ala Arg Leu Ile Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic NTP-8 peptide <400> 11 Ser His His Ala Arg Leu Ile Leu 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Ala Arg Cys Leu 1

Claims (53)

  1. (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 25 개의 아미노산을 초과하지 않는 펩티드.
  2. 1 이상의 제1항에 따른 펩티드 및 그에 대한 담체를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애를 진단 또는 치료하기 위한 조성물.
  3. (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 25 개의 아미노산을 초과하지 않는 펩티드.
  4. 1 이상의 제3항에 따른 펩티드 및 그에 대한 담체를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애를 진단 또는 치료하기 위한 조성물.
  5. 아미노산 서열 A R L I를 가지고, 상기 A R L I 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드.
  6. 아미노산 서열 H A R L을 가지고, 상기 H A R L 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드.
  7. 아미노산 서열 F A R L을 가지고, 상기 F A R L 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드.
  8. 아미노산 서열 A R L을 가지고, 상기 A R L 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드.
  9. 아미노산 서열 A R L C를 가지고, 상기 A R L C 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드.
  10. 삭제
  11. (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산.
  12. 1 이상의 제11항에 따른 핵산 및 그에 대한 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애를 진단 또는 치료하기 위한 조성물.
  13. (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산.
  14. 1 이상의 제13항에 따른 핵산 및 그에 대한 담체를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애를 진단 또는 치료하기 위한 조성물.
  15. 아미노산 서열 A R L I를 코딩하고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  16. 아미노산 서열 H A R L을 코딩하고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  17. 아미노산 서열 F A R L을 코딩하고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  18. 아미노산 서열 A R L을 코딩하고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  19. 아미노산 서열 A R L C를 코딩하고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산.
  20. (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 서열을 특이적으로 인식하는 항체.
  21. (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 서열을 특이적으로 인식하는 항체.
  22. (a) A R L I;
    (b) H A R L;
    (c) F A R L;
    (d) A R L; 및
    (e) A R L C
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드 서열을 특이적으로 인식하는 항체.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. (1) (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 1 이상의 펩티드와 생물 시료를 접촉시키는 단계;
    (2) 생성된 할릴 펩티드/신경 트레드 단백질(NTP) 접합체를 단리하는 단계; 및
    (3) 1 이상의 할릴 펩티드로부터 NTP를 분리하여 정제된 NTP를 얻는 단계
    를 포함하는 생물 시료로부터 NTP를 정제하는 방법.
  27. (1) (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 1 이상의 펩티드와 생물 시료를 접촉시키는 단계;
    (2) 생성된 할릴 펩티드/NTP 접합체를 단리하는 단계; 및
    (3) 1 이상의 할릴 펩티드로부터 NTP를 분리하여 정제된 NTP를 얻는 단계
    를 포함하는 생물 시료로부터 NTP를 정제하는 방법.
  28. (a) (i) A R L I;
    (ii) H A R L;
    (iii) F A R L;
    (iv) A R L; 및
    (v) A R L C
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 1 이상의 펩티드와 생물 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 생성된 할릴 펩티드/NTP 접합체를 단리하는 단계; 및
    (c) 1 이상의 할릴 펩티드로부터 NTP를 분리하여 정제된 NTP를 얻는 단계
    를 포함하는 생물 시료로부터 NTP를 정제하는 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. (a) (i) A R L I;
    (ii) H A R L;
    (iii) F A R L;
    (iv) A R L; 및
    (v) A R L C
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 1 이상의 펩티드를 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애를 진단 또는 치료하기 위한 조성물.
  32. (1) (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 1 이상의 펩티드; 및
    (2) 적절한 시약
    을 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애의 존재를 결정하기 위한 진단 키트.
  33. (1) (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 1 이상의 펩티드; 및
    (2) 적절한 시약
    을 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애의 존재를 결정하기 위한 진단 키트.
  34. (a) (i) A R L I;
    (ii) H A R L;
    (iii) F A R L;
    (iv) H A R L I; 및
    (v) A R L C
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 1 이상의 펩티드 및
    (b) 적절한 시약
    을 포함하는, 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 장애의 존재를 결정하기 위한 진단 키트.
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고 25개의 아미노산을 초과하지 않는 신경 트레드 펩티드를 포함하는, 진단 또는 치료 분석에서의 트랩 물질.
  39. (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고 25개의 아미노산을 초과하지 않는 신경 트레드 펩티드를 포함하는, 진단 또는 치료 분석에서의 트랩 물질.
  40. (a) A R L I;
    (b) H A R L;
    (c) F A R L;
    (d) A R L; 및
    (e) A R L C
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 신경 트레드 펩티드를 포함하는, 진단 또는 치료 분석에서의 트랩 물질.
  41. (1) (a) H H A R L;
    (b) H A R L;
    (c) H A R L I;
    (d) H A R L I L;
    (e) H H A R L C L;
    (f) A R L I L;
    (g) H H A R L I F;
    (h) T H A R L I L;
    (i) A R L I;
    (j) A R L;
    (k) H A R L C L;
    (l) A R L C L;
    (m) A R C L;
    (n) M F A R L I L;
    (o) F A R L I L;
    (p) F A R L I;
    (q) F A R L;
    (r) H A R L I F; 및
    (s) A R L I F
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 2 이상을 면역글로불린을 포함하는 시료와 접촉시켜서 면역글로불린/펩티드의 상호작용을 시키는 단계; 및
    (2) 생성된 펩티드/면역글로불린 접합체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 펩티드를 사용하여 시료로부터 면역글로불린을 단리하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, NTP 펩티드/면역글로불린 접합체가 침전에 의하여 단리되는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, NTP 펩티드/면역글로불린 접합체가 친화성 컬럼 상에서 단리되는 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 면역글로불린이 추후에 정제되는 것인 방법.
  45. (1) (a) L H A R L C L A N F C G R N R V;
    (b) L A R L C L A N F C G N N N V;
    (c) C A R Y R T G H H A R L M;
    (d) H H A R L P L A N F C G;
    (e) R T G H H A R L C* L A N F C;
    (f) C E S A R Y R T G H H A R L C*;
    (g) D N T H H A R L I L; 및
    (h) S H H A R L I L
    (여기서, *는 해당 아미노산이 아세트아미도 메틸로 블로킹(blocking)된 것을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 2 이상을 면역글로불린을 포함하는 시료와 접촉시켜서 면역글로불린/펩티드의 상호작용을 시키는 단계; 및
    (2) 생성된 펩티드/면역글로불린 접합체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 펩티드를 사용하여 시료로부터 면역글로불린을 단리하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 펩티드/면역글로불린 접합체가 침전에 의하여 단리되는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 펩티드/면역글로불린 접합체가 친화성 컬럼 상에서 단리되는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 면역글로불린이 추후에 정제되는 것인 방법.
  49. (1) (a) A R L I;
    (b) H A R L;
    (c) F A R L;
    (d) A R L; 및
    (e) A R L C
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고, 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 플랭킹하는 1 내지 25 개의 추가적 아미노산을 포함하는 펩티드 2 이상을 면역글로불린을 포함하는 시료와 접촉시켜서 면역글로불린/펩티드의 상호작용을 시키는 단계; 및
    (2) 생성된 펩티드/면역글로불린 접합체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 펩티드를 사용하여 시료로부터 면역글로불린을 단리하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 펩티드/면역글로불린 접합체가 침전에 의하여 단리되는 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 펩티드/면역글로불린 접합체가 친화성 컬럼 상에서 단리되는 것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 면역글로불린이 추후에 정제되는 것인 방법.
  53. 삭제
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