JP2005512500A - 神経糸タンパク質（ＮｅｕｒａｌＴｈｒｅａｄＰｒｏｔｅｉｎ）の好ましいセグメントとその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は神経糸タンパク質(NeuralThreadProtein:NTP)の好ましい反復配列、その好ましい該配列のペプチド、模倣体、抗体、および核酸、ならびにそのような好ましいNTP配列を用いた診断および治療の方法に関する。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えば、結合アッセイ、タンパク質と抗体の精製、治療用剤および診断用剤に有用な神経糸タンパク質（Neural Thread Protein）の好ましいセグメントに関する。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病(ＡＤ)は現在のところ、治癒不可能な神経変性性疾患であり、全世界で少なくとも1200万人が罹患している。ＡＤの患者は高齢者が圧倒的に多く、65才では約1%の発生率で、85才では推定40%に上昇する。医学の進歩、余命の延長、およびベビーブーム世代の高齢化による人口構成の全体としての高齢化につれて、ＡＤの総合的発生率は上昇するものと考えられ、ヘルスケアシステムに対して、および患者とその患者をケアする人々およびその患者の家族に対して、より大きな負荷となるものと考えられる。
【０００３】
現在ＡＤの有効な治療法はない。現在利用できる治療法、例えばAricept(登録商標)(塩酸ドネペジル；Pfizer Corp.)、Exelon(登録商標)(酒石酸リバスチグミン；Novaltis Pharmaceuticals Corp.)、およびCognex(登録商標)(タクリン；Warner Lambert Corp.)は、軽度から中等度のＡＤの患者の症状の軽減のための方策を提供することを意図したもので、この疾患の原因に作用させることは考えられていない。
【０００４】
ＡＤの臨床診断も不完全なものである；正確性は一般の開業医での約50〜60%から患者照会センター(referral center)でのアルツハイマー病のスペシャリストでの80〜90%まで様々である(Molsaら、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48(11):1085-90(1985)；Roccaら、Ann. Neurol., 19:415-424(1986)；Burnsら、BMJ, 301(6759):1026(1990)；Risseら、Am. J. Psychiatry, 147(2):168-72(1990)；Gilleardら、Acta Psychiatr. Scand., 85(4):264-9(1992)；Mendezら、Alzheimer Dis. Assoc. Disord., 6:35-43(1992)；Flemingら、Mayo Clin. Proc., 7:1093-1107(1995)；Corey-Bloomら、Neurology, 45:211-218(1995)；およびBowlerら、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 64(1):18-24(1998))。症状の初発からＡＤの診断が下されるまで平均してほぼ3年間の遅れがある(Jorstら、J. Am. Geriatr. Soc., 43(11):1248-55(1995))。
【０００５】
信頼できるバイオマーカーがあればＡＤの正確で早期の診断に大いに助けとなると考えられてきた(Growdonら、Neurobiol. Aging, 19:109-116(1998))。生化学的および遺伝的マーカーがいくつか現在用いられているが、日常的に臨床使用するには臨床-病理相関性が通常は低すぎる。例えば、アポリポプロテインE ε4アレルは遺伝的危険因子であるがＡＤ症例の50%に見出されるにすぎず(Myersら、Neurology, 46(3):673-7(1996))、脳脊髄液中のタウおよびβ-アミロイドタンパク質の測定および血清AβはＡＤと非ＡＤが著しくオーバーラップしており、そのため有用性は限定される(Pirttilaら、J. Neurol. Sci., 127(1):90-5(1994)；Araiら、Ann. Neurol., 38:649-652(1995)；Jensenら、Neurosci. Lett., 186(2-3):189-91(1995);Motterら、Ann. Neurol., 38(4):643-8(1995)；Munroeら、Ann. Clin. Lab. Sci., 25(3):207-17(1995)；Tataら、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr., 59:280-283(1995)；Vigo-Pelfreyら、Neurology, 45(4):788-93(1995)；Iwatsubo, T., Neurobiol. Aging, 19:161-163(1998)；Nitschら、Ann. Neurol., 37(4):512-8(1995)；van Goolら、Ann. Neurol., 37(2):277-9(1995)；Tamaokaら、J. Neurol. Sci., 151(1-2):65-8(1996)；およびPirtillaら、Arch. Neurol., 53(2):189-93(1996))。その他の提案されているマーカー、例えばトロポカミドに対する瞳孔応答(Scintoら、Science, 266:1051-1054(1994)；およびGrowdonら、Arch. Neurol., 54(7):841-4(1997))およびp-97などの血清因子(Kennardら、Nat. Med., 2(11):1230-5(1996))は、対照をおいた臨床試験の反復による検証がまだなされていない。提案されているＡＤマーカーの主な欠点はそれらがＡＤの病理に伴う脳に特異的な分子というわけではないことであり、末梢の体液中で高信頼度で測定し得ないことである。
【０００６】
神経糸タンパク質(NTP)は最近その特徴が明らかとなった脳タンパク質の新規のファミリーである。NTPは〜41kDの膜関連リンタンパク質で、神経発芽および細胞死に関連する機能を有している(de la Monteら、J. Clin. Invest., 100;3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep.,2:327-332(1999))。NTPとＡＤとを結びつける確かな証拠はある。NTP mRNAはＡＤの脳中では対照と比べてアップレギュレートされている；脳中およびCSF中のNTPタンパク質レベルはＡＤでは対照よりも高い；また、ＡＤおよびダウン症候群の脳の老人斑中、神経原線維変化(NFT)中、変性ニューロン、神経網スレッド、および栄養障害性神経突起発芽(dystrophic neuritic sprouts)中ではNTPに対する免疫反応性が明確に認められる(Ozturkら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423(1989)；de la Monteら、J. Clin. Invest., 86(3):1004-13(1990)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 113(2):152-64(1992)；de la Monteら、Ann. Neurol., 32(6):733-42(1992)；de la Monteら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 135(2):118-25(1996)；de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。ニューロン中へのNTPの蓄積はＡＤでの神経変性の初期(NFT形成以前)に起こる。NTPはまた、ダウン症候群の脳組織でも同定されている(Wandsら、International Patent publication WO 90/06993；de la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。ダウン症候群の患者の大多数は、中年以後のＡＤの神経病理学的所見と類似の所見を示し、晩年のＡＤと類似の多数の認知の欠損を発症する。
【０００７】
ＡＤ患者と対照の脳脊髄液(CSF)中のNTPレベルを比較すると、ＡＤでは一貫して上昇していることが示されている(Chongら、J. Clin. Lab. Anal., 6(6):379-83(1992)；de la Monteら、Ann. Neurol., 32(6):733-742(1992)；de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；Ghanbariら、J. Clin. Lab. Anal., 12(4):223-6(1998)；Ghanbariら、J. Contemp. Neurol., 1998:2-8(1998)； Kahleら、Neurology, 54(7):1498-504(2000))。ＡＤ患者でのNTP上昇の特異性はＡＤ以外の神経疾患を対照として比較することによって示され、NTPの上昇は痴呆の程度と正の相関が認められた(de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999)；ならびにKahleら、Neurology, 54(7):1498-504(2000))。ある大規模な研究では、早期ＡＤの患者の89%がCSF中のNTPレベルが2ng/mLを超え、非ＡＤの対照患者の89%ではCSF中で2ng/mL未満であった(de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997))。
【０００８】
その後、NTPタンパク質が、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、およびELISAによって尿中で同定された(Ghanbariら、J. Clin. Lab. Anal., 12(4):285-288(1998)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。尿中NTPレベルはＡＤ患者と対照でのCSF中のレベルと相関していることが示され、ＡＤ患者では非ＡＤの患者と比較すると著しく上昇していた((Ghanbariら、J. Clin. Lab. Anal., 12(4):285-288(1998))。尿サンプルの分析用に液相中にモノクローナル抗NTPを結合させた金粒子を用いたアッセイ法が開発され、ＡＤに対して特異的でかつ高感度であることが示された(Fitzpatrickら、Alzheimer's Reports, 3(3):155-159(2000))。
【０００９】
NTPの既存のアッセイ法を改良する必要があり、そのような改良には一般的な臨床検査室やドクターのオフィスで行いうる、ケアを行う場所でのNTPアッセイ法の開発の必要性も含まれる。尿から天然の状態のNTPを安価に日常的に精製しうる方法や、容易に製造しうるNTPの類似体の開発などの技術的進歩もそれらのアッセイ法を改良することとなろう。
【００１０】
NTPがＡＤの病因に直接的な役割を果たしていることを示す証拠があり、そのことによってNTPはＡＤ治療用薬剤開発の標的の１つとされている。NTPは神経突起の発芽に伴って見出される；ＡＤには異常な神経突起発芽が伴う。NTPの過剰発現はリン-タウの細胞内の蓄積を生じさせ、その蓄積が今度は、ＡＤでの痴呆と神経解剖学的に見て重要な相関性のあるNFTの形成に先行する(de la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999)。さらに、NTPの過剰発現は酸化ストレスに関連するアポトーシス性の細胞死の増加を起こしうる(de la Monte, 1999)。NTPの発現または生化学的作用を阻害することはＡＤの有効な治療法への１つの有望な道筋である。
【００１１】
NTPの遺伝子およびそれから予言されるタンパク質の配列は既に同定され、報告されている(de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997))。神経糸状タンパク質(Neural thread protein)が最初に報告され特許請求されたのは、米国特許第5,948,634号、第5,948,888号、および第5,830,670号で、それらは全て「アルツハイマー病の神経糸タンパク質遺伝子発現と検出」と題されている。
【００１２】
神経糸タンパク質の別の種類のもの(〜26kD、〜21kD、〜17kD、および〜15kD)も同定されており、それらは神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、および膠芽腫、ならびに低酸素症、虚血、もしくは脳梗塞に伴って出現する(de la Monteら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 135(2):118-25(1996)；de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。
【００１３】
当業界ではNTP組成物を改善し、ＡＤとダウン症候群に関する治療と診断に有用なNTP組成物を改善したもの、ならびに神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、および膠芽腫、ならびに低酸素症、虚血、もしくは脳梗塞の治療と診断に有用な神経糸状タンパク質(Neural Thread Protein)のその他の種類のものに関する組成物が必要とされている。本発明はこれらの必要を満たす。
【００１４】
発明の要約
本発明はNTPの反復配列の新規のもののファミリーに向けられたものであって、それらは"HARLIL"というコンセンサス配列を有するもの、およびそれらの類似体である。本発明で包含されるHarlilペプチドとしては、限定はされないが、"HARLIL"、"HARLCL"、"HHARLCL"、"HARL"、"MFARLIL"、ARLIL"、"HARLIF"、"HHARLCL"、ならびにそれらの類似体および結合相手を含む。この群のNTPペプチドおよび類似のペプチドをまとめて「Harlilペプチド」と呼ぶ。
【００１５】
本発明はHarlilペプチドが次のような独特の結合性を持つという予期せぬ発見から生じたものである。
【００１６】
・HarlilペプチドはNTPに結合するアフィニティーを有しており、それによって、尿、CSF、または血液などの体液からのNTPの精製においてNTPを捕捉するための結合相手として、ならびに尿、CSF、または血液などの体液中のNTPの検出および測定に、ＡＤとダウン症候群のための薬剤開発に、また、下記に開示している事項に有用である；
・Harlilペプチドは多数の免疫グロブリンと結合するアフィニティーを有しており、それによって免疫グロブリンの精製、そのような免疫グロブリンの検出と測定に有用となる。
【００１７】
・Harlilペプチドはそれら同士を結合させるアフィニティーを有しており、それによってHarlilペプチドにコンジュゲートされたタンパク質の分離、アッセイ、および/または精製に、アッセイでのNTP類似体として、また、下記に開示するその他の事項にも有用となる；ならびに、
・Harlilペプチドはセルフアセンブリーおよび/またはNTPとの相互作用において、他のタンパク質と共に機能して治療のための標的として有用なものとなると考えられる。
【００１８】
本発明はまた、Harlilペプチド配列に対する抗体、およびそのような抗体の機能を有するフラグメントをも包含する。該抗体はモノクローナルまたはポリクローナルの抗体とすることができる。
【００１９】
本発明の別の1態様はNTPタンパク質上のHarlil配列の結合相手についてのものである。そのような結合相手としては、限定はされないが、相同のペプチド、有機ペプチド類似体、抗体および抗体の部分、ならびにパラログ(paralogue)が含まれる。
【００２０】
本発明は、Harlilペプチドに対応する核酸、少なくとも1個のHarlilペプチドをコードする少なくとも1個の核酸を含有するベクター、およびそのようなベクターを増殖させるための宿主細胞、例えば大腸菌(E.coli)もしくはその他の有用な細菌、または酵母などを包含する。そのようなベクターは例えば、治療用に、またはHarlilペプチドを作成する方法で用いることができる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のHarlilペプチド、抗体、および核酸を当業界で既知の従来の技法を用いて作成する方法を開示している。
【００２２】
本発明の別の1態様は、1種以上のHarlilペプチド、Harlilペプチド模倣体、および/またはそれらへの結合相手を含んでなる医薬組成物、ならびに1種以上のHarlilペプチドをコードする1種以上の核酸を含んでなる医薬組成物に向けられたものである。該医薬組成物は例えばＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の治療に有用なものとなろう。
【００２３】
本発明はHarlilペプチド、それに対応する核酸、またはHarlil模倣体のＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患での使用を包含する。1種以上のHarlilペプチドを用いる診断試験法は、NTPに対する抗体またはHarlilペプチド配列に対する抗体の存在、それらはNTPの存在を示すものであるが、そのような抗体を試験するために有用であり得る。NTPは全ての人に見出されるが、ＡＤであるとの医学的診断を受けた患者(すなわち、DSM4患者)ではその量は増加している。あるいはまた、診断試験法を、1種以上のHarlilペプチド配列に対する1種以上の抗体を用いて行うことができ、それはNTPの存在の検出に有用なものである。NTPの量は、ＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の存在と相関している。最後に、診断試験法は、1種以上のHarlilペプチドをコードする1種以上の核酸を用いて行うことができる。生物学的サンプル中でのそのような核酸と核酸の間のハイブリダイゼーションによってNTPの存在が示される。ここでもNTPの量は、ＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の存在と相関している。本発明のHarlilペプチド、Harlil模倣体、抗体、および核酸はそのような診断試験法において標識して用いることができる。
【００２４】
本発明のまた別の1態様は、本発明の診断方法を実施するための診断試験法キットに向けられている。そのような試験キットは1種以上のHarlilペプチド、Harlil模倣体、抗体、Harlilの結合相手、および/または核酸、ならびに適切な試薬を含んでなる。
【００２５】
本発明はまた、HarlilペプチドまたはHarlil模倣体を用いて溶液中からNTPを精製する方法をも包含する。そのような方法に適用するキットは本発明に包含される。そのようなキットは少なくとも1種のHarlilペプチド、Harlil模倣体、またはそれらの混合物、ならびに適切な試薬を含んでなる。
【００２６】
本発明にはまた、本発明のHarlilペプチドを用いた抗体の精製のための方法とキットも包含される。そのようなキットは本発明のHarlilペプチドと適切な試薬を含んでなる。
【００２７】
本発明はさらにＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の治療方法に関し、その方法は本発明のHarlilペプチド、Harlil模倣体(Harlilペプチド模倣体に限定はされない)、および/または核酸の1種以上の治療上有効な量を、治療を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる。
【００２８】
上述の一般的説明および下記の詳細な説明は、どちらも例示および説明のためのものであり、特許請求の範囲に記載されている本特許についてさらに説明を提供することを意図したものである。その他の目的、利点、および新規性の特徴については、当業者であれば、本発明に関する下記の詳細な説明から容易に判るであろう。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、「Harlil配列」と呼ばれるNTPの新規の反復配列を含んでなる組成物に向けられたものである。その配列はNTPのアミノ酸配列中で4回出現する：
(a) 45-51 THARLIL
(b) 90-96 HHARLCL
(c) 263-269 MFARLIL
(d) 292-296 HHARLIF
図１を参照せよ。
【００３０】
本発明は、領域(a)、(b)、(c)、(d)のいずれかの配列またはこれらの相同体(「HARLML」を含むがそれに限定されない)を有するペプチドを包含する。該Harlilペプチドはまた、リンカーペプチド上でHarlil配列の前または後ろに追加のアミノ酸残基を持つものとすることもできる。その追加のアミノ酸残基またはリンカーペプチドは、NTP配列中でHarlil配列の前または後ろに見出されるものとすることができる。例えば、アミノ酸残基GITGMCTはNTP配列中で第46番目の残基の前に出現し、アミノ酸残基YFFLVはNTP配列中で第50番目のアミノ酸の後ろに出現する。従って、本発明に包含されるHarlilペプチドは、NTPペプチドGITGMCTHARLILYFFLVを含む。(b)、(c)、および(d)に示したHarlilペプチドについては、追加のアミノ酸残基はNTP配列中のHarlil配列に隣接するものである。しかし、それらの隣接配列がリンカー以外の作用があるとの証拠はない。好ましくは、追加のアミノ酸残基を有するHarlilペプチドはその長さがアミノ酸残基数の総計で25個を超えないものである。
【００３１】
Harlilペプチドの相同体および変異体も本発明の範囲に包含される。1個のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することによってペプチド配列を変えることは一般的に行われている。アミノ酸を変える目的に応じて、そのアミノ酸を類似のもしくは相同のアミノ酸と、または類似していないアミノ酸と置換することができる。アミノ酸を類似または相同であるとランク付けをすることのできる、多数の尺度がある(Gunnar von Heijne, 「分子生物学における配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」, p123-39(Academic Press, New York, NY 1987)。
【００３２】
該Harlil反復配列は下記のユニークな特徴を有している：(1)この配列はNTPに結合することができる；(2)この配列は多数の免疫グロブリンに結合することができる；および(3)この配列はそれ自体と結合することができる。これらのユニークな特徴によって、下記に示すとおりの、種々の診断および治療的適用が可能となり、それらを行いうることが示唆される。
【００３３】
A. 組成物
本発明は、NTPのHarlilペプチド、NTPのアッセイもしくは精製のためのNTPのアフィニティー結合パートナーとしてのそのようなペプチド、ペプチド模倣体(mimetic)、結合パートナーおよび/または相同体の使用、Harlilペプチド、ペプチド模倣体、およびそれらの相同体のNTP上のHarlilペプチド部位をブロックするための使用、または、Harlil配列を介してNTPと相互作用する物質の使用に向けられたものである。本発明はまた、そのようなHarlilペプチド配列に向けられた抗体、および該Harlilペプチドおよびその相同体に対応する核酸をも包含する。
【００３４】
Harlilペプチドおよびその相同体は従来のペプチド合成技法を用いて作製することができる。Harlilペプチドの模倣体はコンビナトリアル化学技法を用いて開発することができる。
【００３５】
Harlilペプチド配列に対するモノクローナル抗体は、例えば、KohlerとMilstein, Nature, 256:495(1975)によってはじめて報告されたハイブリドーマ法、または組換えDNA法(例えば米国特許第4,816,567号参照)によって作製することができる。ポリクローナル抗体(すなわち抗血清)は、例えば、ウサギまたはヒツジなどの宿主動物にHarlilペプチドを免疫原として免疫することによって作製することができる。そのような免疫には典型的には、その免疫原による反復接種が含まれ、典型的には少なくとも2回を約1週間間隔で行う。そのような接種によって免疫原に対する免疫応答が生じ、接種された宿主の免疫系がその免疫原に対する抗体を産生するようになる。その免疫された宿主由来の血清は通常は最終ブースターの約3日〜10日後に採取されるだろう。その血清から、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、またはその他の従来の分離および精製技法によって免疫グロブリンを分離することができる。
【００３６】
Harlilペプチドに対応する核酸は、例えば、(a)標準的な組換え法、(b)合成技法、または(c)それらの組み合わせを用いて作製することができる。
【００３７】
B. Harlil ペプチドの性質
１ . NTP への結合
Harlil配列はNTPに対して結合特異性を示す。Harlilペプチドまたはその類似体を固定化すると、それを溶液からのNTPの精製に用いることができる。アフィニティーアッセイの一部としてNTPの捕捉に用いられる場合には、NTPへの結合は非常に特異的であり、pH 3.5からpH 8までの間ではpHの影響を受けない。このアフィニティーアッセイの感度は少なくともイムノアッセイと同程度に高い。例えば、ELISAによって約0.5ng/mLのNTPを含んでいるとされた陽性の尿のプールをほぼ4倍に希釈しても、このアフィニティーアッセイでは依然として陰性のプールと区別することができる(このことは下記の実施例6でより詳細に述べられている)。さらに、アッセイ感度はより高感度な検出手段、例えば蛍光もしくは化学発光物質、または放射性標識アッセイなどを用いることによって改善することができる。
【００３８】
本発明のHarlilペプチドはNTPと特異的に結合するので、Harlilペプチドを生物学的サンプル中のNTPまたはNTPに対する抗体の存在を検出するための診断アッセイに用いることができる。体液中のNTPが正常レベルを上回っていることが、ＡＤ、ダウン症候群、またはその他の変性性脳疾患の存在を示すものであることが示されている。
【００３９】
２ . 免疫グロブリンへの結合
Harlilペプチドは多数の免疫グロブリンと結合する。そのペプチドの結合は抗体のFab部分を介してではなくFc部分を介して行われているものと考えられる。免疫グロブリンとの結合は生理学的pHで起こるが、いくつかの免疫グロブリンではより低いpHでも結合する。より低いpHでの結合はHarlilペプチドとある特定の抗体との間の強いアフィニティーを示し、この結合がアフィニティーではなく電荷/電荷相互作用によるものであるという可能性を排除するものである。
【００４０】
Harlilペプチドは免疫グロブリンと結合するので、Harlilペプチドは免疫グロブリン分子の精製に有用である。Harlilモノマーの免疫グロブリンに対するアフィニティーはきわめて低く、従ってHarlilコンジュゲートの結合活性はペプチドの密度を制御することによって制御することができる。Harlilペプチドの密度を増加させると、免疫グロブリンに対するアフィニティーが増大する。低アフィニティーから中程度のアフィニティーのカラムを用いることが望ましいが、それは高アフィニティーのカラムは厳しい溶出条件を必要とし、それがタンパク質および抗体を変性させ、幅広い希釈ピークで溶出されうるので、それは溶出産物が希釈されることとなるので望ましくない(Wikstromら、J. of Chromatography, 597:83-92(1992))。そのような希釈が起こると溶出されたタンパク質または抗体をさらに濃縮する必要があり、それによってタンパク質または抗体産物の損失および/または損傷が起こる。
【００４１】
これに対して低アフィニティークロマトグラフィー(例えばHarlilペプチドを用いて行いうるようなもの)では溶出ピークが鋭くなり厳しい条件が避けられるという利点がある(上述の文献)。このような精製方法は、製薬上のおよび診断適用に有用な精製タンパク質を提供することによって、治療用および診断用の抗体を精製するために価値のあるものである。
【００４２】
免疫グロブリンの精製に有用な既知のペプチド類似体はHarlilペプチドよりもはるかに長い配列を有しており、免疫グロブリンと相互作用するための二次的構造を必要としている、またはそのような構造を模倣しているものと思われる(Fassinaら、J. of Mol. Recognition, 9:564-569(1996)；Guerrierら、J. of Mol. Recognition, 11:107-109(1998)；Palomboら、J. of Mol. Recognition, 11:247-249(1998)；Braistedら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5688-5692(1996)；Fassinaら、J. of Mol. Recognition, 11:128-133(1998)；Palomboら、J. of Mol. Recognition, 11:243-246(1998)；Liら、Nat. Biotechnol., 16:190-195(1998)；ならびに米国特許第5,084,559号；米国特許第5,100,788号；米国特許第6,013,763号)。本発明のHarlilペプチドは比較的短く、生産と貯蔵がはるかに容易で費用効率が高い。
【００４３】
本発明のHarlilペプチドの別の1適用は、ELISAおよびイムノクロマトグラフィー用のストリップなどのフォーマットでの診断試験法での使用に関する。本発明のHarlilペプチドは免疫グロブリンと結合するので、イムノアッセイ系において、捕捉、分離、または固定のための抗抗体、ならびにプロテインAおよびGに代替する、費用効率が高いトラップ物質となる。ELISAおよびイムノクロマトグラフィー用のストリップで用いられている現行のトラップ物質、すなわち、抗抗体、ならびにプロテインAおよびGは作製し維持するために高い費用がかかる。これに対して本発明のHarlilペプチドでは作製が比較的単純であり、貯蔵が費用効率が高い。
【００４４】
３ . Harlil ペプチド自体への結合
本発明のHarlilペプチドと類似体はそれら自体と結合することができ、従ってタンパク質とコンジュゲートさせると、そのタンパク質は非常に低いpHまたは非常に低い希釈度に維持されていない限りは、自己凝集(self-aggregate)するだろう。その担体タンパク質は自己凝集し溶液から中性pHで沈殿させることができる。
【００４５】
さらに、そのユニークな自己結合特性によって、HarlilペプチドはアッセイにおいてNTP類似体として用いることができる。このことはHarlilペプチドがNTPの自己結合性を複製するからである。連続的または競合アッセイにおいては、NTPはHarlilペプチドコンジュゲートの固相と結合し、洗浄の間も固相上に留まり、そこで免疫グロブリン(ウサギIgGなど)の結合をブロックするだろう。Harlilペプチドはまたサンドイッチアッセイにおいて捕捉抗体の代替として用いることができる。本発明のHarlilペプチドはNTPタンパク質よりも高価でなく、費用効率が高いアッセイ材料である。
【００４６】
Harlilペプチドに自己凝集性があることにより治療に適用できる可能性がある。Harlil配列はそれらがコンジュゲートするタンパク質がお互いに結合するようにするが、そのことはこれらの配列を介してNTPが自己会合する、および/または他のタンパク質と会合することを示している。この会合は分子内、または分子間のものとすることができる。アフィニティーカラムおよびマイクロタイタープレートの遊離のNTPと結合する能力(下記の実施例に示すように)は、天然のNTPではHarlil配列がおそらくは表面にあって接近可能であることを示している。
【００４７】
NTPの毒性は、その全てまたは一部が、高度に相互作用性のHarlil配列によるものである可能性がある。従ってNTPの毒性は自己凝集によるものか、または反応性の高いHarlil配列の他の脳のコンポーネントとの相互作用によるものかもしれない。NTPのこの配列をブロックすることによって、この相互作用する能力をブロックすることができる。
【００４８】
NTPが神経変性カスケードに関与することは明らかである。NTPを標的とすることによる、そのカスケードを遮断する、または方向を変える能力は治療に役立つ可能性を提供する。例えば、HarlilペプチドのNTPの結合部位と相互作用する能力を用いてNTP上の潜在的な反応部位をブロックして治療的に介入することが可能であろう。あるいはまた、本発明のHarlilペプチドおよび模倣体は、Harlil配列を発現している細胞を薬剤が標的とするために有用であろう。
【００４９】
自己会合するペプチドは生物接着物質(bioadhesive)として生体材料中で用いられてきた。従ってそのようなペプチドの自己会合量または自己認識量を用いて、非会合性のタンパク質またはペプチドの会合を誘導すること、部分を表面に固定させること、または分子を標的部位に向かわせることができる。そのような細胞接着誘導ペプチドは合成組織および合成臓器のデザインに有用でありうると認識されている(Mayo, K. H., TIBTECH, 18:212-217(May, 2000))。またそのような材料はそれ自体がpHおよび結合に感受性のゲル系の構築に有用であることが示されている(上記の文献)。さらに、Harlilペプチド配列の重合および/または多数の反復によって、構造的特徴とより高い結合活性を有する組成物を提供しうる。
【００５０】
NTP配列中でHarlil配列が反復されていることは、Harlil配列がおそらくはNTPのアセンブリーまたは重合に役割を果たしていることを示している。例えば、コラーゲンでは、続いてピリジノリン結合を形成することとなる部位で自己会合する別々の鎖の領域が高い相同性をも示し、このことは、これらの自己同定性相同領域が構造的および機能的に主要な目的のために働いていることを示している。「HARLIL」部位が個々に、またはポリマーのアレイ中で他の脳タンパク質と相互作用しNTPの機能性に重要なものとなっていることが考えられる。
【００５１】
NTPの過剰産生がＡＤおよび関連疾患の神経変性疾患病理に寄与しているのであれば、HARLILモデルに基づいた治療剤を用いれば、NTPタンパク質の産生もしくは折りたたみが阻害される、および/または、NTPの他のコンポーネントとの重合もしくは相互作用が妨害されることとなろう。例えば、1種以上のHarlilペプチドもしくはHarlil模倣体の投与によって、NTPの凝集、または折りたたみもしくはアセンブリーが阻害されれば、NTPのプロテアーゼによる分解の増大が期待されよう。従って、1種以上のHarlilペプチドもしくはHarlil模倣体の投与によって、過剰なNTPの除去を行いうる可能性がある。あるいはまた、HarlilペプチドまたはHarlil模倣体の治療剤はNTPモノマーまたは凝集体の神経変性カスケードの他のコンポーネントとの相互作用を制御するのに有用でありうる。
【００５２】
自己アセンブルまたは重合する多数のタンパク質が反復配列を有している。最もよく知られているものはコラーゲンで、1本の鎖あたりgly X Yという短い反復配列が6回も現れる(Lacyら、「FLRT1、FLRT2、およびFLRT3の同定：膜貫通ロイシンリッチリピートタンパク質の新規のファミリー(Identification of FLRT1, FLRT2 and FLRT3: a novel family of transmembrane leucine rich repeat proteins)」, Genomics, 62(3):417-26(1999))。その他の研究では特定の反復配列が結合の核形成に関与していることが示されている(Snellmanら、「XIII型コラーゲンの三量体化にはN末端領域のある短い配列が必要であり、それは他のコラーゲン性膜貫通タンパク質でも保存されている(A short sequence in the N-terminal region is required for the trimerization of type XIII collagen and is conserved in other collagenous transmembrane proteins)」, EMBO J., 19(19);5051-59(2000))。さらに、コラーゲンペプチドPro Pro Gly(自己アセンブリーに決定的に重要なものである)は、プロコラーゲンのシャペロンHSP7との相互作用にも決定的に重要なものであることを示す研究がある(Koideら、「コラーゲン性ペプチドのシャペロンタンパク質HSP47による認識のためのコンフォメーション条件(Conformational requirements of collagenous peptides for recognition by the chaperone protein HSP47)」, Biol. Chem., 275(36):27957-27963(2000))。ラミニン中の自己認識の特異性が研究されている(Schittny, J. C., 「アフィニティー・リターディション・クロマトグラフィー：方法の特徴付けとその適用(Affinity Retardation Chromatography: Charaterization of the Method and Its Application)」, Anal. Biochem., 222:140-148(1994))。
【００５３】
このように、重合または線維状(fibrilar)構造を形成するタンパク質は、通常は、自己についての(自己認識)タンパク質認識の特定のドメイン上の特定のドメインを介する自己アセンブリーによってそれを行うことは明らかである。さらに、これらのタンパク質はこれらの同じ認識部位を他のタンパク質との相互作用のために用いることができる。プロテインAとFcとの相互作用の場合と同様に(Deisenhofer, J., 「ヒトFcフラグメントと、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインAのフラグメントBとの複合体の結晶学的精製と2.9Aおよび2.8Aの分解能での原子モデル(Crystallographic Refinement and Atomic Models of a Human Fc Fragment and Its complex with Fragment B of Protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8- A Resolution)」, Biochem., 20(9):2361-2370(1981))、Harlil配列の相互作用と同様、これらの相互作用は疎水性およびイオン性相互作用を介するものであると思われる。
【００５４】
NTPの場合にはHarlilドメイン(おそらく自己アセンブリーで機能するのであろう)は、高度に相同で、ほぼ完全に保存されているものと思われる。「ロイシンジッパー」は自己認識を用いており、その中ではロイシンに富むストレッチ(stretches)がお互いに結合している。しかしロイシンジッパーはHarlil配列ほどユニークではない。Harlil配列は自己アセンブリーおよびNTPの他の脳のコンポーネントとの相互作用に決定的に重要な役割を果たしていると考えられている。
【００５５】
酵母中での、プリオンおよびプリオンエレメントでの実験で、タンパク質が自己凝集するコンフォメーションを取りうることの証拠が提供されている(Serioら、「プリオン決定基による核のあるコンフォメーションの変換およびコンフォメーション情報の複製(Nucleated Conformational Conversion and the Replication of Conformational Information by a Prion Determinant)」, Science, 289:1317-21(2000)；およびSparrer, H. E., 「プリオン仮説に対する証拠；in vitroで変換させたSup35タンパク質による、酵母(PSI＋)因子の誘導(Evidence for the Prion Hypothesis: Induction of the Yeast(PSI+) Factor by in vitro-Converted Sup35 protein)」, Science, 289(5479):595-599(2000))。
【００５６】
LiとLindquistは、ペプチド配列22-69を含んでいるSUPタンパク質の部分を遺伝学的に融合させることによって無関係のタンパク質上にSUPプリオン活性を与えることができることを示した。このように、彼らはSUP35タンパク質の特性を与えるプリオンがSUP 22-69ペプチドにあることを示した。類似して、本発明は凝集を起こす自己同定性ペプチドに向けられたものである。該配列をあるタンパク質上にグラフト(grafting)(コンジュゲーションによって)することによって、自己凝集性をそのタンパク質上に与えることができる：その結果、生理学的pHでのHarlilタンパク質コンジュゲートの95%までの沈殿が直ちに起こることが観察される。
【００５７】
下記の実施例は本発明を説明するためのものである。しかし、本発明がこれらの実施例中に説明した特定の条件や詳細事項に限定されるべきものではないことは理解されるべきである。本明細書全体を通じて、米国特許を含む、公的に利用可能な文書に対するいずれのおよび全ての参考文献は参照により特別に組み入れる。
【００５８】
実施例１
この実施例の目的は神経糸状タンパク質(Ｎeural Thread Ｐrotein)の数個のHarlil配列を同定し、それらのNTPとの反応性を調べることであった。
【００５９】
下記のHarlil配列を合成し(Synpep, Dublin CA)、それを、マレイミド活性化ウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove PA)とコンジュゲートさせ、それらのNTP免疫反応性を評価した。リンカーとして、NTPの90-96にあたるHHARLCL配列の前または後ろに存在するタンパク質配列の反復部分を、付加した。
【００６０】
*メチルアセトアミド(C3H6NO)によるブロック
【００６１】
担体タンパク質とのコンジュゲーションはシステインを介するものであった。ペプチドNTP-1およびNTP-2は混合コンジュゲート生成物を産生したが、それはシステイン残基が2個以上あるからである。従って、ペプチドNTP-5およびNTP-6については第２システインをメチルアセトアミドでブロックした。
【００６２】
NTP配列中の同定された配列の位置は図１に示している。Harlil類似体の全てがある程度の反応性を示したが、NTP-3はシステイン残基を1個しか有していないことにより取り扱いやすい一方で反応性は良好であったので、大部分の研究についてNTP-3が選択された。
【００６３】
上述のとおり、Harlilペプチドの相同体および変異体も本発明の範囲内に包含される。この実施例の相同体ペプチドの構築のために類似アミノ酸を用いた。ここで用いた置換の判断基準は電荷および/またはサイズである。NTPペプチド３中のシステインの代わりにメチオニンで置換するという選択は、これら2種のアミノ酸間の全体としての類似性、および、この重要な一続きのアミノ酸配列から反応性のシステインを除去するという要望に基づいたものである。システインをプロリンで置換するという選択は、それが前記タンパク質中にありそのシステインがジスルフィド結合を形成している場合にそれがそのペプチドの立体構造形態を模倣するのかどうかを確かめることを意図するものである。
【００６４】
アフィニティー相互作用に影響を与えるかまたはそれを調べるための当業者には公知のその他の変更としては、限定はされないが、例えば、ロイシンを他の疎水性アミノ酸、例えばイソロイシン、バリン、アラニン、またはグリシンと交換すること；酸性アミノ酸同士または塩基性アミノ酸同士を交換すること；ヒスチジンをフェニルアラニンと交換して電荷 対 空間の効果を調べること；アスパラギンをアスパラギン酸と、またはグルタミンをグルタミン酸と交換して電荷 対 空間の効果を評価すること；ならびにセリンをトレオニンと、トレオニンをシステインと、アスパラギン酸をグルタミン酸と、アルギニンをリジンまたはヒスチジンと、およびチロシンをトリプトファンまたはフェニルアラニンと交換することが挙げられる。
【００６５】
Harlilペプチド配列のみが活性を有するので、スペーサーとして以外にはNTPの隣接配列が必要であるとする理由はないものと考えられる。隣接配列に導入した変更は、ペプチドの塩基性または疎水性をより低くするように行った。
【００６６】
実施例２
この実施例の目的は、NTPのアフィニティー精製のためのアフィニティーリガンドとしてのNTP-3の使用を実証することであった。このプロセスでは、NTPはＡＤ患者から得られた尿サンプルから、アフィニティーカラムで精製した。
【００６７】
NTP を含有する試験用尿サンプルの調製：用いたNTPの生物学的供給源はＡＤと診断された患者(BOU1)の尿である。カラム材料にアプライする前に、その生物学的サンプルをＡＤ試験用の尿処理のための下記プロトコールに従って処理した。
【００６８】
1. 尿はAmes MultistixTM(Bayer, Indiana)で試験した。サンプルが次のようなものである場合には廃棄した。(a) 細菌の混入について陽性であるもの；(b) 以下について病的に高レベルであることがみとめられるもの：腎疾患と関連するタンパク質などのタンパク質(病的なレベルのタンパク質は含んでいないがNTPが陽性のサンプルは、この試験では排除しない)、ケトン、血液、ウロビリノーゲン(urobilogen)、亜硝酸塩、白血球；(c) pHが7.5を超えるかもしくは4.5未満のもの；または(d) 比重が1.025を超えるもの。
2. 尿を3000×gで15分間遠心して細胞片を除去した。
3.注射器を用いて尿を0.22μmの酢酸セルロースフィルターを通してろ過し、ろ液にアジドを0.05%となるように添加した。
4. この結果得られたアリコートを、Amicon Centricon(登録商標) YM-10 Milliporeの上部リザーバー中に入れ、3000×gで１時間遠心した。
5. 元の液量の約25%となったサンプルを遠心機から取り出し、1.5mLのTris緩衝生理食塩水(TBS)を加えて元の液量に戻した。
6. ステップ4および5を繰り返し、それらのステップではサンプルを再度3000×gで30分間遠心し、遠心機からサンプルを取り出して1.5mLのTBSをサンプルに添加した。
7. 次いでサンプルを3000×gで30分間遠心し、その後遠心機からサンプルを取り出した。その時点でサンプルは元の液量の4分の1であった。
8. 次いでサンプルをホウケイ酸ガラス製のバイアル瓶に移し、−20℃で凍結保存した。
【００６９】
カラムの調製：NTP-3を、臭化シアン活性化アガロース(Sigma, St.Louis, MO)に、製造者の使用説明書に従ってコンジュゲートさせた。調製後はそのカラム材料を、0.01%のアジドを添加したpH7の25mM Tris緩衝生理食塩水(TBS)中で保存した。
【００７０】
クロマトグラフィー：アフィニティーカラム材料11mLを25mLの尿サンプル(上述のとおり処理してTBS(pH7)中に4倍濃縮されたサンプル)および25mLの0.025M グリシンバッファー(pH3.5)と共に１時間インキュベートした。吸着されなかった物質(通過したもの)を集めた。次いでそのカラムを5倍量の1×TBS(pH 7)で洗浄し、11mLの0.1M グリシン(pH 2)中に溶出させた。溶出後すぐに、溶出物をNaOHでpH 7に調整し、実施例１と同様にAmicon Centricon(登録商標) YM-10 (Millipore, Beverly, MA)を用いて1mLに濃縮した。
【００７１】
アフィニティーカラム溶出液中に存在する NTP 活性の分析：アフィニティーアッセイによる活性は、尿中の神経糸状タンパク質を試験するための7C GoldTM Strip(Nymox Pharmaceutical Corp., Maywood NJ)を用いてアッセイした。例えば、Fitzpatrickら、Alzheimer's Reports, 3(3):155-159(2000)を参照されたい。7C GoldTM Stripでアッセイした活性は全てpH 2の溶出画分中にみとめられた。
【００７２】
タンパク質濃度：クーマシーブルー染色(BioRad, Hercules, CA)で測定すると、溶出液中のタンパク質濃度は108μgであった。これは出発時のタンパク質濃度の約3%である。Bicinchoninic Acid Kit(カタログNo.23223, BioRad)で測定すると、タンパク質濃度は145μgであった。バッファーに対して補正した280nmでの吸光度は390であり、これは390μgのタンパク質を示している。吸光度測定で決定されたタンパク質の量がより多かったのはNTP中に芳香族アミノ酸が多量に存在することによるものと考えられ、そのことによりこの測定法を用いた場合にタンパク質の過剰な見積り量がもたらされる。
【００７３】
アフィニティーカラムの溶出液から得た NTP タンパク質のゲル電気泳動による分析：1μgの溶出液(約110〜145ng)を12.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ミニゲル(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)にて泳動して、銀染色した。バンドは29kD、33kD、40〜45kD、および60kDに観察された。そのゲルを20〜35kD、35〜45kD、および45〜65kDのバンドについて切片化し、それを100μLのTBS中に入れて、TBSに対して一晩透析した。バンドの溶出液を実施例1と同様にAmicon Centricon(登録商標) YM-10を用いて濃縮し、7C GoldTM Assayを用いて活性を評価した。
【００７４】
NTP反応性は35〜45kDのバンドについて観察され、それはほぼ41kDのものであった。他のバンドについては活性は観察されなかった。NTPは分子量が41kDと報告されている。従って、このデータはアフィニティーカラムに結合したNTP-3が、ＡＤ患者の尿サンプル中に存在するNTPタンパク質を選択的に結合したことを示している。
【００７５】
この実施例はHarlilペプチドNTP-3のNTPへの特異的結合、およびNTP-3などのHarlilペプチドの、NTPのアフィニティー精製のためのアフィニティーリガンドとしての使用を実証したものである。
【００７６】
実施例３
この実施例の目的は、Harlilペプチドの自己凝集能を示すことであった。HarlilペプチドNTP-3は(システイン残基により)ジスルフィド結合を形成し、中性pHで二量体化する。二量体化したペプチドは2個の免疫グロブリンを結合できるので、沈殿を生成する。Harlilペプチドのこの性質をウサギ免疫グロブリンを用いて実証した。
【００７７】
1mgのHarlilペプチドNTP-3を含む1mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に、3.4mgのウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)をpH 7で添加した。その混合液を一晩透析し、翌朝には真っ白な沈殿が観察された。沈殿を遠心分離によって除去し、その上清のタンパク質濃度をPerkin Elmer分光光度計Lambda 3B型を用いて測定される280nmでの吸光度から決定した。結果は表1に示している。免疫グロブリンの沈殿は、低いpH、例えばpH3.5または3.5未満では妨げられる。
【００７８】
【表１】
この実施例は、Harlilペプチドを免疫グロブリンの単離および/または精製に用いることができることを示したものである。
【００７９】
実施例４
この実施例は、NTPの存在の検出および定量におけるHarlilペプチドの有用性を示すものであった。
【００８０】
メンブレンに基づくアッセイ：7C GoldTM アッセイは、5mm×45mmのストリップと、そのストリップ上に配置した2つのトラップおよびサンプル収容区域とからなる。トラップ1および2はサンプル収容区域からそれぞれ16mmと24mm離れている。各トラップは約4cmの深さがある。
【００８１】
【００８２】
標識金粒子はトラップ1または2に移動する。トラップ1およびトラップ2中の標識された金の比率はサンプル中に含まれるNTPの量と相関する。Fitzpatrickらの米国特許第6,121,008号を参照せよ。
【００８３】
NTP-3 コンジュゲートの調製：3.5mg/mLの濃度のマレイミド活性化ウサギ免疫グロブリン(RGG)(Pierce, Rockford, IL)を1Mのクエン酸を用いてpH3.5とした。30倍モル過剰としたHarlilペプチドNTP-3を含むDMSOを、そのRGGに添加した。そのNTP-3/RGGコンジュゲートのpHをモニターし、室温で緩徐に撹拌しながら一晩反応させた。次いでそのコンジュゲートを0.5mM, pH3.5のクエン酸リン酸バッファーに対して十分に透析した。
【００８４】
7C Gold TM Strip アッセイの調製：RGGにコンジュゲートしたNTP-3を透析したものを、0.5mM, pH3.5のクエン酸リン酸バッファー中に1mg/mLに希釈した。一晩静置した後、6μL/cmのそのコンジュゲートを、XY3000TM Biodot(Irvine, CA)を用いて、トラップ1におけるメンブレン(Loprodyne 3, Pall, East Hills, NY)にコートした。次いで、0.5mg/mLのヤギ抗マウス免疫グロブリン(DAKO #20109, Denmark)を、トラップ2における、メンブレン上のNTP-3/RGGコンジュゲートから1cm上の位置にコートした(NTP-3/RGGのコーティングと同じパラメーターを用いた)。そのメンブレン、すなわち7C GoldTM Stripを加熱した空気で30分間乾燥させ、5mmのストリップに切断し、乾燥剤と共に保存した。このトラップはNTPが存在しなければ抗NTP抗体をコートした金を結合する。7C GoldTM アッセイは抗NTP抗体N314を用いる(de la Monteら、J. of Neuropath. Exp. Neurol., 55:1038-50(1996))。このアッセイの基礎となっているのは、NTPが金粒子上のN314抗NTP抗体によって隔離され、NTP-3トラップに輸送され、そこでそのNTPがN314と離れてトラップ1に結合することである。そうすることでそのNTPは金粒子上の抗体のトラップ1への結合をブロックし、その結果、金粒子はトラップ2に移動する。このようにしてNTPが存在すればより多量の金がトラップ2へ移動する。
【００８５】
金コロイド：金コロイドの調製は「金コロイド（Colloidal Gold）」 M. A. Hayat編(Academic Press Limited, London(1991))に報告されているとおり行い、20μg/mLの濃度の精製N314抗NTP抗体でコートした。次いで抗体でコートした金コロイドを凍結保存用バッファー(Serex Inc., Maywood, NJ)中に希釈し凍結乾燥した。1枚のストリップに十分な量を2mLのホウケイ酸製バイアル(Wheaton #223683; Millville, NJ)中で、Virtus(Gardiner, NY) Model 600SL & 12SL 凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。
【００８６】
患者のサンプル：107例の患者のサンプルを実施例2に記載したとおり処理し濃縮した。
【００８７】
7C Gold TM アッセイ：処理し濃縮した患者サンプルの各々の50μLをNTP抗体でコートした凍結乾燥金に添加した。この混合物を室温で15分間インキュベートし、その後、7C GoldTM Stripをバイアル瓶中に入れ、そのストリップの上部に緑色の線が現れてアッセイの完了が示されるまでそのままにした。そのストリップを取り出し乾燥させた。
【００８８】
結果のまとめ：NTPが存在しない場合にはNTP抗体でコートした金の大多数はHarlilペプチドNTP-3トラップに結合する。NTP Harlilペプチド固相マイクロタイタープレートはマウス抗体を非常に低いアフィニティーで結合するが、N314モノクローナル抗体はそれが金粒子上で凝集した状態ではトラップと結合する。バンド1および2の色強度はデンシトメーター(Gretag D19C, Switzerland)を用いて読みとった。比率値（トラップ1の反射率をトラップ1の反射率とトラップ2の反射率の加算値で除算した値に等しい）を計算し、サンプルの比率値を指標サンプルまたはカットオフサンプルの比率値で割った。この値を指数値と称した。図３にグラフで示したアッセイの結果は、正常なサンプルとＡＤのサンプルとが良好に分離されていることを示している。
【００８９】
実施例５
この実施例の目的は、HarlilペプチドでコートしたマイクロタイタープレートへのNTPの結合が、コンジュゲートされていないHarlilペプチドによって阻害されうることを示すことであった。
【００９０】
マイクロタイタープレートの調製：30:1の比率として実施例4に記載のとおり調製したHarlilペプチド/免疫グロブリン複合体NTP-3-RGGを、Immulon 4マイクロタイタープレート(Dynex, Chantilly, VA)上に0.5μg/ウエルの濃度でコートした。
【００９１】
標準物：0.01%アジド(Nymox Pharm. Corp., Lot 4-7-98)を加えた組換えNTPを含むTBS(de la Monteら、J. of Neuropath. Exp. Neurol., 55:1038-1050(1996)に記載)をTBS中に連続希釈した。各希釈液の100μLをpH3.5で1時間インキュベートした。次いでその希釈液を、0.1%アルブミンおよび0.05% Tween80を含むTBS中で15分間洗った。その後、0.05% Tween80を含むTBS中で3回洗った。
【００９２】
マイクロタイタープレートアッセイ：次いで、ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)の1:8000希釈液を100μL添加し、30分間反応させた。そのマイクロタイタープレートを0.05%のTween80を含むTBSで2回洗い、その後150μLのテトラメチルベンゼン(TMB)(Serex Inc., Maywood, NJ)を添加した。次に、その混合液を10分間インキュベートし、50μLの2N HClで反応を停止させた。吸光度をSLT 340 ATTC分光光度計で読みとった。
【００９３】
このシステムを用いると、モノマーのNTP-3がコンジュゲートのプレートへの結合を阻害することが示される。図2を参照せよ。
【００９４】
実施例６
この実施例の目的は、抗体が、Harlilペプチドでコートしたマイクロタイタープレートに特異的に結合することを実証すること、およびその抗体のどの部分(FcまたはFab)がHarlilでコートしたプレートと結合しているのかを調べることであった。
【００９５】
試験した抗体：下記の抗体をJackson Immunoresearch(West Grove,PA)から入手した：(a)アルカリホスファターゼ(AP)標識し、アフィニティー精製したウサギIgG抗マウス抗体；(2)AP標識し、アフィニティー精製したウサギIgG抗マウス抗体(Fab2)；および(3)AP標識し、アフィニティー精製したウサギIgG抗ニワトリ抗体。
【００９６】
ウサギIgG抗ニワトリ(抗体(3))は、ウサギ抗マウス(抗体(2))がNTP-3/RGGコンジュゲート中のRGGを認識している可能性を排除するために用いた。抗体(2)は、抗体(2)にIgGのFc部分が欠けていることを除いては抗体(1)と同一である。
【００９７】
このアッセイフォーマットは実施例５に記載のとおりとした。免疫精製していないウサギ、ニワトリ、およびマウスIgGを1mg/mLまで添加した(図4参照)。対照としては、1mg/mLの、BSA(ウシ血清アルブミン)、α糖タンパク質、ＡＤ陽性および陰性対照尿、ならびに80、40、20、10、および5単位の組換えNTPを用いた。ウサギIgGとニワトリIgGは共に用量依存的様式でAPコンジュゲートから離れた。図4を参照せよ。Fab2はプレートと結合しなかった。
【００９８】
結果のまとめ：分子全体を用いた場合には、ウサギ抗マウスおよびウサギ抗ニワトリはどちらもNTP-3/ウサギIgGでコートしたマイクロタイタープレートと結合した。Fab標識抗体は結合を示さなかった(結果は示していない)。これらの結果は、Harlilペプチド抗体結合は、抗体のFc領域の認識を介して影響を及ぼすことを示している。
【００９９】
様々な生物種のIgGに対するHarlilペプチドのアフィニティーは異なる。例えば、マウスモノクローナル抗体はNTP-3コンジュゲートに対してウサギIgGよりもはるかに低いアフィニティーを示す。図4を参照せよ。
【０１００】
実施例７
この実施例の目的は、抗体のFc部分を認識するプロテインG中の配列をNTPが認識するかどうかを調べることであった。
【０１０１】
プロテインGはFc領域を介して抗体と結合する。この実施例の結果はまた、Harlilペプチドが免疫グロブリンのFc部分と結合し、Fab部分とは結合しないことを示唆したものであるため、NTPが抗体のFc部分を認識するプロテインG中の配列を認識するか否かを調べた。具体的には、HarlilペプチドがHarlilペプチドを認識し、Harlilペプチドが抗体のFc領域を認識し、プロテインGが抗体のFc領域を認識することから、この実験によってプロテインGがNTPを認識するか否かが判明した。
【０１０２】
NTP陽性およびNTP陰性のサンプルの双方ともがプロテインGカラムを通過した。NTPは有意には減少しなかった。これらの結果は、プロテインGがNTPに結合しないとの結論を支持するものである。
【０１０３】
Fc領域を介する結合は、Fc領域が免疫系において受容体を認識するために用いられているので、治療的な効果を有する可能性がある。
【０１０４】
実施例８
この実施例の目的は、Harlilペプチドを用いた、マイクロタイタープレートアッセイフォーマットでの競合的アフィニティーアッセイを実証することである。
【０１０５】
マイクロタイタープレートの調製：30:1の比率として実施例4に記載のとおり調製したHarlilペプチド/免疫グロブリン複合体NTP-3-RGGは、Immulon IIマイクロタイタープレート(Dynex, Chantilly, VA)上に20μg/ウエルの濃度でコートした。
【０１０６】
サンプルの調製：30検体の尿サンプルを試験用に実施例2に述べたようにして調製した。Fc抗体がアッセイに干渉しうるので、サンプルを100K Amicon Centricon(Millipore Inc., Beverly, MA)中でスピンして抗体を除去した後に、ろ液を試験した。(診断用試験での偽陽性を防止するために、Harlilペプチドが非NTP抗体と結合できないようにする。例えば、免疫グロブリンレベルが100μg/mLを超えるようなサンプルでは、アッセイにかける前に免疫グロブリンレベルを100μg/mL未満に減らしておかなければならない。）
対照：いかなる神経変性性疾患とも診断されていない被験者の尿から調製した尿のプールをアフィニティーカラムに通過させ、実施例2に記載のとおり調製した。この結果得られた尿のプールは「除去した」尿と呼ぶ。
【０１０７】
次いで「除去した」尿を用いて、高レベルのプールを適切に希釈することによって中等度の対照物を調製した。その高レベルのプールは、NTPについてのアッセイで陽性と判定されＡＤと診断された患者から得たサンプルを集めて調製したものである(実施例4を参照せよ)。
【０１０８】
標準物：組換えNTP(Nymox Pharmaceutical Corp, Montreal, Canada)をTBS中に希釈して標準物とした。標準物はその単位値を40、20、10、および0と定めた。尿中のNTPが部分的に分解している可能性があるとの証拠があるので、NTPの量は重量ではなく組換えNTP単位数で表現した。図5は、マイクロタイターフォーマット競合NTPアッセイにおける尿対照サンプルと組換えNTPの線形性を比較したものである。
【０１０９】
アッセイ：患者のサンプルは下記のアッセイで試験した：1:5000に希釈したペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)の50μLと、50μLのサンプルまたは標準物をプレートのウエルに添加した。そのプレートを室温で1時間インキュベートし、0.1% アルブミンおよび0.05% Tween 80を含むTBSで3回洗った。各ウエルに100μLのPNPP(パラニトロフェニルホスフェート)(Moss, Pasadena, MD)を添加した。405nmでのODを、BioRad Readerで、30分後およびその後15分間隔で、TBS標準物のODが2〜2.5の間になるまで測定した。図6に示しているその結果から、NTPは全てのサンプル中に認められるがＡＤ陽性患者ではその量が増加していることが示される。この量の増加は、年令が一致する対照を用いて容易に調べることができる。生物学的サンプル中のNTPの量を測定する診断用試験はＡＤまたはその他の神経変性性疾患の高精度の診断に有用である。
【０１１０】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の方法と組成物に種々の改変および変更を加えることができることは当業者であれば明らかであろう。従って、本発明の改変および変更が添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある限りは、本発明はそれらの変更および変更を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は完全なNTPの配列、およびその完全なNTPの配列中のHarlil配列の位置を示している(de la Monteら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-1050(1996))；
【図２】 図２はウサギ抗マウス免疫グロブリンコンジュゲートのHarlilペプチド(NTP-3)をコートしたマイクロタイタープレートとの結合の阻害をNTP-3/RGG濃度(x軸)の関数として示したものである(データは実施例5に記載している)；
【図３】 図３はHarlilペプチドをベースとしたメンブレンアッセイを用いた生物学的サンプル107検体のアッセイ結果を示したものである(データは実施例4に示している)；
【図４】 図４はNTPがそれに対して結合する抗体の部分を決定するアッセイ結果を示したものである(データは実施例6に示している)；
【図５】 図５はELISAフォーマットの競合NTPアッセイでの尿対照サンプルと組換えNTPの直線性を比較したものである(データは実施例8に示している)；
【図６】 図６はHarlilペプチドを用いたELISAフォーマットでＡＤと診断されたサンプルを、年令をマッチさせた正常サンプルと区別するための競合アフィニティーアッセイの結果を示しており、そのアッセイではＡＤ陽性の患者では閾値量が存在していることを示したものである(データは実施例8に記載している)。
発明の分野
本発明は、例えば、結合アッセイ、タンパク質と抗体の精製、治療用剤および診断用剤に有用な神経糸タンパク質（Neural Thread Protein）の好ましいセグメントに関する。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病(ＡＤ)は現在のところ、治癒不可能な神経変性性疾患であり、全世界で少なくとも1200万人が罹患している。ＡＤの患者は高齢者が圧倒的に多く、65才では約1%の発生率で、85才では推定40%に上昇する。医学の進歩、余命の延長、およびベビーブーム世代の高齢化による人口構成の全体としての高齢化につれて、ＡＤの総合的発生率は上昇するものと考えられ、ヘルスケアシステムに対して、および患者とその患者をケアする人々およびその患者の家族に対して、より大きな負荷となるものと考えられる。
【０００３】
現在ＡＤの有効な治療法はない。現在利用できる治療法、例えばAricept(登録商標)(塩酸ドネペジル；Pfizer Corp.)、Exelon(登録商標)(酒石酸リバスチグミン；Novaltis Pharmaceuticals Corp.)、およびCognex(登録商標)(タクリン；Warner Lambert Corp.)は、軽度から中等度のＡＤの患者の症状の軽減のための方策を提供することを意図したもので、この疾患の原因に作用させることは考えられていない。
【０００４】
ＡＤの臨床診断も不完全なものである；正確性は一般の開業医での約50〜60%から患者照会センター(referral center)でのアルツハイマー病のスペシャリストでの80〜90%まで様々である(Molsaら、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48(11):1085-90(1985)；Roccaら、Ann. Neurol., 19:415-424(1986)；Burnsら、BMJ, 301(6759):1026(1990)；Risseら、Am. J. Psychiatry, 147(2):168-72(1990)；Gilleardら、Acta Psychiatr. Scand., 85(4):264-9(1992)；Mendezら、Alzheimer Dis. Assoc. Disord., 6:35-43(1992)；Flemingら、Mayo Clin. Proc., 7:1093-1107(1995)；Corey-Bloomら、Neurology, 45:211-218(1995)；およびBowlerら、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 64(1):18-24(1998))。症状の初発からＡＤの診断が下されるまで平均してほぼ3年間の遅れがある(Jorstら、J. Am. Geriatr. Soc., 43(11):1248-55(1995))。
【０００５】
信頼できるバイオマーカーがあればＡＤの正確で早期の診断に大いに助けとなると考えられてきた(Growdonら、Neurobiol. Aging, 19:109-116(1998))。生化学的および遺伝的マーカーがいくつか現在用いられているが、日常的に臨床使用するには臨床-病理相関性が通常は低すぎる。例えば、アポリポプロテインE ε4アレルは遺伝的危険因子であるがＡＤ症例の50%に見出されるにすぎず(Myersら、Neurology, 46(3):673-7(1996))、脳脊髄液中のタウおよびβ-アミロイドタンパク質の測定および血清AβはＡＤと非ＡＤが著しくオーバーラップしており、そのため有用性は限定される(Pirttilaら、J. Neurol. Sci., 127(1):90-5(1994)；Araiら、Ann. Neurol., 38:649-652(1995)；Jensenら、Neurosci. Lett., 186(2-3):189-91(1995);Motterら、Ann. Neurol., 38(4):643-8(1995)；Munroeら、Ann. Clin. Lab. Sci., 25(3):207-17(1995)；Tataら、J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr., 59:280-283(1995)；Vigo-Pelfreyら、Neurology, 45(4):788-93(1995)；Iwatsubo, T., Neurobiol. Aging, 19:161-163(1998)；Nitschら、Ann. Neurol., 37(4):512-8(1995)；van Goolら、Ann. Neurol., 37(2):277-9(1995)；Tamaokaら、J. Neurol. Sci., 151(1-2):65-8(1996)；およびPirtillaら、Arch. Neurol., 53(2):189-93(1996))。その他の提案されているマーカー、例えばトロポカミドに対する瞳孔応答(Scintoら、Science, 266:1051-1054(1994)；およびGrowdonら、Arch. Neurol., 54(7):841-4(1997))およびp-97などの血清因子(Kennardら、Nat. Med., 2(11):1230-5(1996))は、対照をおいた臨床試験の反復による検証がまだなされていない。提案されているＡＤマーカーの主な欠点はそれらがＡＤの病理に伴う脳に特異的な分子というわけではないことであり、末梢の体液中で高信頼度で測定し得ないことである。
【０００６】
神経糸タンパク質(NTP)は最近その特徴が明らかとなった脳タンパク質の新規のファミリーである。NTPは〜41kDの膜関連リンタンパク質で、神経発芽および細胞死に関連する機能を有している(de la Monteら、J. Clin. Invest., 100;3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep.,2:327-332(1999))。NTPとＡＤとを結びつける確かな証拠はある。NTP mRNAはＡＤの脳中では対照と比べてアップレギュレートされている；脳中およびCSF中のNTPタンパク質レベルはＡＤでは対照よりも高い；また、ＡＤおよびダウン症候群の脳の老人斑中、神経原線維変化(NFT)中、変性ニューロン、神経網スレッド、および栄養障害性神経突起発芽(dystrophic neuritic sprouts)中ではNTPに対する免疫反応性が明確に認められる(Ozturkら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423(1989)；de la Monteら、J. Clin. Invest., 86(3):1004-13(1990)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 113(2):152-64(1992)；de la Monteら、Ann. Neurol., 32(6):733-42(1992)；de la Monteら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 135(2):118-25(1996)；de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。ニューロン中へのNTPの蓄積はＡＤでの神経変性の初期(NFT形成以前)に起こる。NTPはまた、ダウン症候群の脳組織でも同定されている(Wandsら、International Patent publication WO 90/06993；de la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。ダウン症候群の患者の大多数は、中年以後のＡＤの神経病理学的所見と類似の所見を示し、晩年のＡＤと類似の多数の認知の欠損を発症する。
【０００７】
ＡＤ患者と対照の脳脊髄液(CSF)中のNTPレベルを比較すると、ＡＤでは一貫して上昇していることが示されている(Chongら、J. Clin. Lab. Anal., 6(6):379-83(1992)；de la Monteら、Ann. Neurol., 32(6):733-742(1992)；de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；Ghanbariら、J. Clin. Lab. Anal., 12(4):223-6(1998)；Ghanbariら、J. Contemp. Neurol., 1998:2-8(1998)； Kahleら、Neurology, 54(7):1498-504(2000))。ＡＤ患者でのNTP上昇の特異性はＡＤ以外の神経疾患を対照として比較することによって示され、NTPの上昇は痴呆の程度と正の相関が認められた(de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999)；ならびにKahleら、Neurology, 54(7):1498-504(2000))。ある大規模な研究では、早期ＡＤの患者の89%がCSF中のNTPレベルが2ng/mLを超え、非ＡＤの対照患者の89%ではCSF中で2ng/mL未満であった(de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997))。
【０００８】
その後、NTPタンパク質が、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、およびELISAによって尿中で同定された(Ghanbariら、J. Clin. Lab. Anal., 12(4):285-288(1998)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。尿中NTPレベルはＡＤ患者と対照でのCSF中のレベルと相関していることが示され、ＡＤ患者では非ＡＤの患者と比較すると著しく上昇していた((Ghanbariら、J. Clin. Lab. Anal., 12(4):285-288(1998))。尿サンプルの分析用に液相中にモノクローナル抗NTPを結合させた金粒子を用いたアッセイ法が開発され、ＡＤに対して特異的でかつ高感度であることが示された(Fitzpatrickら、Alzheimer's Reports, 3(3):155-159(2000))。
【０００９】
NTPの既存のアッセイ法を改良する必要があり、そのような改良には一般的な臨床検査室やドクターのオフィスで行いうる、ケアを行う場所でのNTPアッセイ法の開発の必要性も含まれる。尿から天然の状態のNTPを安価に日常的に精製しうる方法や、容易に製造しうるNTPの類似体の開発などの技術的進歩もそれらのアッセイ法を改良することとなろう。
【００１０】
NTPがＡＤの病因に直接的な役割を果たしていることを示す証拠があり、そのことによってNTPはＡＤ治療用薬剤開発の標的の１つとされている。NTPは神経突起の発芽に伴って見出される；ＡＤには異常な神経突起発芽が伴う。NTPの過剰発現はリン-タウの細胞内の蓄積を生じさせ、その蓄積が今度は、ＡＤでの痴呆と神経解剖学的に見て重要な相関性のあるNFTの形成に先行する(de la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999)。さらに、NTPの過剰発現は酸化ストレスに関連するアポトーシス性の細胞死の増加を起こしうる(de la Monte, 1999)。NTPの発現または生化学的作用を阻害することはＡＤの有効な治療法への１つの有望な道筋である。
【００１１】
NTPの遺伝子およびそれから予言されるタンパク質の配列は既に同定され、報告されている(de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997))。神経糸状タンパク質(Neural thread protein)が最初に報告され特許請求されたのは、米国特許第5,948,634号、第5,948,888号、および第5,830,670号で、それらは全て「アルツハイマー病の神経糸タンパク質遺伝子発現と検出」と題されている。
【００１２】
神経糸タンパク質の別の種類のもの(〜26kD、〜21kD、〜17kD、および〜15kD)も同定されており、それらは神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、および膠芽腫、ならびに低酸素症、虚血、もしくは脳梗塞に伴って出現する(de la Monteら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35(1996)；de la Monteら、J. Neurol. Sci., 135(2):118-25(1996)；de la Monteら、J. Clin. Invest.,100:3093-3104(1997)；およびde la Monteら、Alz. Rep., 2:327-332(1999))。
【００１３】
当業界ではNTP組成物を改善し、ＡＤとダウン症候群に関する治療と診断に有用なNTP組成物を改善したもの、ならびに神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、および膠芽腫、ならびに低酸素症、虚血、もしくは脳梗塞の治療と診断に有用な神経糸状タンパク質(Neural Thread Protein)のその他の種類のものに関する組成物が必要とされている。本発明はこれらの必要を満たす。
【００１４】
発明の要約
本発明はNTPの反復配列の新規のもののファミリーに向けられたものであって、それらは"HARLIL"というコンセンサス配列を有するもの、およびそれらの類似体である。本発明で包含されるHarlilペプチドとしては、限定はされないが、"HARLIL"、"HARLCL"、"HHARLCL"、"HARL"、"MFARLIL"、ARLIL"、"HARLIF"、"HHARLCL"、ならびにそれらの類似体および結合相手を含む。この群のNTPペプチドおよび類似のペプチドをまとめて「Harlilペプチド」と呼ぶ。
【００１５】
本発明はHarlilペプチドが次のような独特の結合性を持つという予期せぬ発見から生じたものである。
【００１６】
・HarlilペプチドはNTPに結合するアフィニティーを有しており、それによって、尿、CSF、または血液などの体液からのNTPの精製においてNTPを捕捉するための結合相手として、ならびに尿、CSF、または血液などの体液中のNTPの検出および測定に、ＡＤとダウン症候群のための薬剤開発に、また、下記に開示している事項に有用である；
・Harlilペプチドは多数の免疫グロブリンと結合するアフィニティーを有しており、それによって免疫グロブリンの精製、そのような免疫グロブリンの検出と測定に有用となる。
【００１７】
・Harlilペプチドはそれら同士を結合させるアフィニティーを有しており、それによってHarlilペプチドにコンジュゲートされたタンパク質の分離、アッセイ、および/または精製に、アッセイでのNTP類似体として、また、下記に開示するその他の事項にも有用となる；ならびに、
・Harlilペプチドはセルフアセンブリーおよび/またはNTPとの相互作用において、他のタンパク質と共に機能して治療のための標的として有用なものとなると考えられる。
【００１８】
本発明はまた、Harlilペプチド配列に対する抗体、およびそのような抗体の機能を有するフラグメントをも包含する。該抗体はモノクローナルまたはポリクローナルの抗体とすることができる。
【００１９】
本発明の別の1態様はNTPタンパク質上のHarlil配列の結合相手についてのものである。そのような結合相手としては、限定はされないが、相同のペプチド、有機ペプチド類似体、抗体および抗体の部分、ならびにパラログ(paralogue)が含まれる。
【００２０】
本発明は、Harlilペプチドに対応する核酸、少なくとも1個のHarlilペプチドをコードする少なくとも1個の核酸を含有するベクター、およびそのようなベクターを増殖させるための宿主細胞、例えば大腸菌(E.coli)もしくはその他の有用な細菌、または酵母などを包含する。そのようなベクターは例えば、治療用に、またはHarlilペプチドを作成する方法で用いることができる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のHarlilペプチド、抗体、および核酸を当業界で既知の従来の技法を用いて作成する方法を開示している。
【００２２】
本発明の別の1態様は、1種以上のHarlilペプチド、Harlilペプチド模倣体、および/またはそれらへの結合相手を含んでなる医薬組成物、ならびに1種以上のHarlilペプチドをコードする1種以上の核酸を含んでなる医薬組成物に向けられたものである。該医薬組成物は例えばＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の治療に有用なものとなろう。
【００２３】
本発明はHarlilペプチド、それに対応する核酸、またはHarlil模倣体のＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患での使用を包含する。1種以上のHarlilペプチドを用いる診断試験法は、NTPに対する抗体またはHarlilペプチド配列に対する抗体の存在、それらはNTPの存在を示すものであるが、そのような抗体を試験するために有用であり得る。NTPは全ての人に見出されるが、ＡＤであるとの医学的診断を受けた患者(すなわち、DSM4患者)ではその量は増加している。あるいはまた、診断試験法を、1種以上のHarlilペプチド配列に対する1種以上の抗体を用いて行うことができ、それはNTPの存在の検出に有用なものである。NTPの量は、ＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の存在と相関している。最後に、診断試験法は、1種以上のHarlilペプチドをコードする1種以上の核酸を用いて行うことができる。生物学的サンプル中でのそのような核酸と核酸の間のハイブリダイゼーションによってNTPの存在が示される。ここでもNTPの量は、ＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の存在と相関している。本発明のHarlilペプチド、Harlil模倣体、抗体、および核酸はそのような診断試験法において標識して用いることができる。
【００２４】
本発明のまた別の1態様は、本発明の診断方法を実施するための診断試験法キットに向けられている。そのような試験キットは1種以上のHarlilペプチド、Harlil模倣体、抗体、Harlilの結合相手、および/または核酸、ならびに適切な試薬を含んでなる。
【００２５】
本発明はまた、HarlilペプチドまたはHarlil模倣体を用いて溶液中からNTPを精製する方法をも包含する。そのような方法に適用するキットは本発明に包含される。そのようなキットは少なくとも1種のHarlilペプチド、Harlil模倣体、またはそれらの混合物、ならびに適切な試薬を含んでなる。
【００２６】
本発明にはまた、本発明のHarlilペプチドを用いた抗体の精製のための方法とキットも包含される。そのようなキットは本発明のHarlilペプチドと適切な試薬を含んでなる。
【００２７】
本発明はさらにＡＤ、神経外胚葉腫瘍、神経膠星状細胞腫、膠芽腫、およびその他の神経変性性疾患の治療方法に関し、その方法は本発明のHarlilペプチド、Harlil模倣体(Harlilペプチド模倣体に限定はされない)、および/または核酸の1種以上の治療上有効な量を、治療を必要とする哺乳類に投与することを含んでなる。
【００２８】
上述の一般的説明および下記の詳細な説明は、どちらも例示および説明のためのものであり、特許請求の範囲に記載されている本特許についてさらに説明を提供することを意図したものである。その他の目的、利点、および新規性の特徴については、当業者であれば、本発明に関する下記の詳細な説明から容易に判るであろう。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、「Harlil配列」と呼ばれるNTPの新規の反復配列を含んでなる組成物に向けられたものである。その配列はNTPのアミノ酸配列中で4回出現する：
(a) 45-51 THARLIL
(b) 90-96 HHARLCL
(c) 263-269 MFARLIL
(d) 292-296 HHARLIF
図１を参照せよ。
【００３０】
本発明は、領域(a)、(b)、(c)、(d)のいずれかの配列またはこれらの相同体(「HARLML」を含むがそれに限定されない)を有するペプチドを包含する。該Harlilペプチドはまた、リンカーペプチド上でHarlil配列の前または後ろに追加のアミノ酸残基を持つものとすることもできる。その追加のアミノ酸残基またはリンカーペプチドは、NTP配列中でHarlil配列の前または後ろに見出されるものとすることができる。例えば、アミノ酸残基GITGMCTはNTP配列中で第46番目の残基の前に出現し、アミノ酸残基YFFLVはNTP配列中で第50番目のアミノ酸の後ろに出現する。従って、本発明に包含されるHarlilペプチドは、NTPペプチドGITGMCTHARLILYFFLVを含む。(b)、(c)、および(d)に示したHarlilペプチドについては、追加のアミノ酸残基はNTP配列中のHarlil配列に隣接するものである。しかし、それらの隣接配列がリンカー以外の作用があるとの証拠はない。好ましくは、追加のアミノ酸残基を有するHarlilペプチドはその長さがアミノ酸残基数の総計で25個を超えないものである。
【００３１】
Harlilペプチドの相同体および変異体も本発明の範囲に包含される。1個のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することによってペプチド配列を変えることは一般的に行われている。アミノ酸を変える目的に応じて、そのアミノ酸を類似のもしくは相同のアミノ酸と、または類似していないアミノ酸と置換することができる。アミノ酸を類似または相同であるとランク付けをすることのできる、多数の尺度がある(Gunnar von Heijne, 「分子生物学における配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」, p123-39(Academic Press, New York, NY 1987)。
【００３２】
該Harlil反復配列は下記のユニークな特徴を有している：(1)この配列はNTPに結合することができる；(2)この配列は多数の免疫グロブリンに結合することができる；および(3)この配列はそれ自体と結合することができる。これらのユニークな特徴によって、下記に示すとおりの、種々の診断および治療的適用が可能となり、それらを行いうることが示唆される。
【００３３】
A. 組成物
本発明は、NTPのHarlilペプチド、NTPのアッセイもしくは精製のためのNTPのアフィニティー結合パートナーとしてのそのようなペプチド、ペプチド模倣体(mimetic)、結合パートナーおよび/または相同体の使用、Harlilペプチド、ペプチド模倣体、およびそれらの相同体のNTP上のHarlilペプチド部位をブロックするための使用、または、Harlil配列を介してNTPと相互作用する物質の使用に向けられたものである。本発明はまた、そのようなHarlilペプチド配列に向けられた抗体、および該Harlilペプチドおよびその相同体に対応する核酸をも包含する。
【００３４】
Harlilペプチドおよびその相同体は従来のペプチド合成技法を用いて作製することができる。Harlilペプチドの模倣体はコンビナトリアル化学技法を用いて開発することができる。
【００３５】
Harlilペプチド配列に対するモノクローナル抗体は、例えば、KohlerとMilstein, Nature, 256:495(1975)によってはじめて報告されたハイブリドーマ法、または組換えDNA法(例えば米国特許第4,816,567号参照)によって作製することができる。ポリクローナル抗体(すなわち抗血清)は、例えば、ウサギまたはヒツジなどの宿主動物にHarlilペプチドを免疫原として免疫することによって作製することができる。そのような免疫には典型的には、その免疫原による反復接種が含まれ、典型的には少なくとも2回を約1週間間隔で行う。そのような接種によって免疫原に対する免疫応答が生じ、接種された宿主の免疫系がその免疫原に対する抗体を産生するようになる。その免疫された宿主由来の血清は通常は最終ブースターの約3日〜10日後に採取されるだろう。その血清から、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、またはその他の従来の分離および精製技法によって免疫グロブリンを分離することができる。
【００３６】
Harlilペプチドに対応する核酸は、例えば、(a)標準的な組換え法、(b)合成技法、または(c)それらの組み合わせを用いて作製することができる。
【００３７】
B. Harlil ペプチドの性質
１ . NTP への結合
Harlil配列はNTPに対して結合特異性を示す。Harlilペプチドまたはその類似体を固定化すると、それを溶液からのNTPの精製に用いることができる。アフィニティーアッセイの一部としてNTPの捕捉に用いられる場合には、NTPへの結合は非常に特異的であり、pH 3.5からpH 8までの間ではpHの影響を受けない。このアフィニティーアッセイの感度は少なくともイムノアッセイと同程度に高い。例えば、ELISAによって約0.5ng/mLのNTPを含んでいるとされた陽性の尿のプールをほぼ4倍に希釈しても、このアフィニティーアッセイでは依然として陰性のプールと区別することができる(このことは下記の実施例6でより詳細に述べられている)。さらに、アッセイ感度はより高感度な検出手段、例えば蛍光もしくは化学発光物質、または放射性標識アッセイなどを用いることによって改善することができる。
【００３８】
本発明のHarlilペプチドはNTPと特異的に結合するので、Harlilペプチドを生物学的サンプル中のNTPまたはNTPに対する抗体の存在を検出するための診断アッセイに用いることができる。体液中のNTPが正常レベルを上回っていることが、ＡＤ、ダウン症候群、またはその他の変性性脳疾患の存在を示すものであることが示されている。
【００３９】
２ . 免疫グロブリンへの結合
Harlilペプチドは多数の免疫グロブリンと結合する。そのペプチドの結合は抗体のFab部分を介してではなくFc部分を介して行われているものと考えられる。免疫グロブリンとの結合は生理学的pHで起こるが、いくつかの免疫グロブリンではより低いpHでも結合する。より低いpHでの結合はHarlilペプチドとある特定の抗体との間の強いアフィニティーを示し、この結合がアフィニティーではなく電荷/電荷相互作用によるものであるという可能性を排除するものである。
【００４０】
Harlilペプチドは免疫グロブリンと結合するので、Harlilペプチドは免疫グロブリン分子の精製に有用である。Harlilモノマーの免疫グロブリンに対するアフィニティーはきわめて低く、従ってHarlilコンジュゲートの結合活性はペプチドの密度を制御することによって制御することができる。Harlilペプチドの密度を増加させると、免疫グロブリンに対するアフィニティーが増大する。低アフィニティーから中程度のアフィニティーのカラムを用いることが望ましいが、それは高アフィニティーのカラムは厳しい溶出条件を必要とし、それがタンパク質および抗体を変性させ、幅広い希釈ピークで溶出されうるので、それは溶出産物が希釈されることとなるので望ましくない(Wikstromら、J. of Chromatography, 597:83-92(1992))。そのような希釈が起こると溶出されたタンパク質または抗体をさらに濃縮する必要があり、それによってタンパク質または抗体産物の損失および/または損傷が起こる。
【００４１】
これに対して低アフィニティークロマトグラフィー(例えばHarlilペプチドを用いて行いうるようなもの)では溶出ピークが鋭くなり厳しい条件が避けられるという利点がある(上述の文献)。このような精製方法は、製薬上のおよび診断適用に有用な精製タンパク質を提供することによって、治療用および診断用の抗体を精製するために価値のあるものである。
【００４２】
免疫グロブリンの精製に有用な既知のペプチド類似体はHarlilペプチドよりもはるかに長い配列を有しており、免疫グロブリンと相互作用するための二次的構造を必要としている、またはそのような構造を模倣しているものと思われる(Fassinaら、J. of Mol. Recognition, 9:564-569(1996)；Guerrierら、J. of Mol. Recognition, 11:107-109(1998)；Palomboら、J. of Mol. Recognition, 11:247-249(1998)；Braistedら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5688-5692(1996)；Fassinaら、J. of Mol. Recognition, 11:128-133(1998)；Palomboら、J. of Mol. Recognition, 11:243-246(1998)；Liら、Nat. Biotechnol., 16:190-195(1998)；ならびに米国特許第5,084,559号；米国特許第5,100,788号；米国特許第6,013,763号)。本発明のHarlilペプチドは比較的短く、生産と貯蔵がはるかに容易で費用効率が高い。
【００４３】
本発明のHarlilペプチドの別の1適用は、ELISAおよびイムノクロマトグラフィー用のストリップなどのフォーマットでの診断試験法での使用に関する。本発明のHarlilペプチドは免疫グロブリンと結合するので、イムノアッセイ系において、捕捉、分離、または固定のための抗抗体、ならびにプロテインAおよびGに代替する、費用効率が高いトラップ物質となる。ELISAおよびイムノクロマトグラフィー用のストリップで用いられている現行のトラップ物質、すなわち、抗抗体、ならびにプロテインAおよびGは作製し維持するために高い費用がかかる。これに対して本発明のHarlilペプチドでは作製が比較的単純であり、貯蔵が費用効率が高い。
【００４４】
３ . Harlil ペプチド自体への結合
本発明のHarlilペプチドと類似体はそれら自体と結合することができ、従ってタンパク質とコンジュゲートさせると、そのタンパク質は非常に低いpHまたは非常に低い希釈度に維持されていない限りは、自己凝集(self-aggregate)するだろう。その担体タンパク質は自己凝集し溶液から中性pHで沈殿させることができる。
【００４５】
さらに、そのユニークな自己結合特性によって、HarlilペプチドはアッセイにおいてNTP類似体として用いることができる。このことはHarlilペプチドがNTPの自己結合性を複製するからである。連続的または競合アッセイにおいては、NTPはHarlilペプチドコンジュゲートの固相と結合し、洗浄の間も固相上に留まり、そこで免疫グロブリン(ウサギIgGなど)の結合をブロックするだろう。Harlilペプチドはまたサンドイッチアッセイにおいて捕捉抗体の代替として用いることができる。本発明のHarlilペプチドはNTPタンパク質よりも高価でなく、費用効率が高いアッセイ材料である。
【００４６】
Harlilペプチドに自己凝集性があることにより治療に適用できる可能性がある。Harlil配列はそれらがコンジュゲートするタンパク質がお互いに結合するようにするが、そのことはこれらの配列を介してNTPが自己会合する、および/または他のタンパク質と会合することを示している。この会合は分子内、または分子間のものとすることができる。アフィニティーカラムおよびマイクロタイタープレートの遊離のNTPと結合する能力(下記の実施例に示すように)は、天然のNTPではHarlil配列がおそらくは表面にあって接近可能であることを示している。
【００４７】
NTPの毒性は、その全てまたは一部が、高度に相互作用性のHarlil配列によるものである可能性がある。従ってNTPの毒性は自己凝集によるものか、または反応性の高いHarlil配列の他の脳のコンポーネントとの相互作用によるものかもしれない。NTPのこの配列をブロックすることによって、この相互作用する能力をブロックすることができる。
【００４８】
NTPが神経変性カスケードに関与することは明らかである。NTPを標的とすることによる、そのカスケードを遮断する、または方向を変える能力は治療に役立つ可能性を提供する。例えば、HarlilペプチドのNTPの結合部位と相互作用する能力を用いてNTP上の潜在的な反応部位をブロックして治療的に介入することが可能であろう。あるいはまた、本発明のHarlilペプチドおよび模倣体は、Harlil配列を発現している細胞を薬剤が標的とするために有用であろう。
【００４９】
自己会合するペプチドは生物接着物質(bioadhesive)として生体材料中で用いられてきた。従ってそのようなペプチドの自己会合量または自己認識量を用いて、非会合性のタンパク質またはペプチドの会合を誘導すること、部分を表面に固定させること、または分子を標的部位に向かわせることができる。そのような細胞接着誘導ペプチドは合成組織および合成臓器のデザインに有用でありうると認識されている(Mayo, K. H., TIBTECH, 18:212-217(May, 2000))。またそのような材料はそれ自体がpHおよび結合に感受性のゲル系の構築に有用であることが示されている(上記の文献)。さらに、Harlilペプチド配列の重合および/または多数の反復によって、構造的特徴とより高い結合活性を有する組成物を提供しうる。
【００５０】
NTP配列中でHarlil配列が反復されていることは、Harlil配列がおそらくはNTPのアセンブリーまたは重合に役割を果たしていることを示している。例えば、コラーゲンでは、続いてピリジノリン結合を形成することとなる部位で自己会合する別々の鎖の領域が高い相同性をも示し、このことは、これらの自己同定性相同領域が構造的および機能的に主要な目的のために働いていることを示している。「HARLIL」部位が個々に、またはポリマーのアレイ中で他の脳タンパク質と相互作用しNTPの機能性に重要なものとなっていることが考えられる。
【００５１】
NTPの過剰産生がＡＤおよび関連疾患の神経変性疾患病理に寄与しているのであれば、HARLILモデルに基づいた治療剤を用いれば、NTPタンパク質の産生もしくは折りたたみが阻害される、および/または、NTPの他のコンポーネントとの重合もしくは相互作用が妨害されることとなろう。例えば、1種以上のHarlilペプチドもしくはHarlil模倣体の投与によって、NTPの凝集、または折りたたみもしくはアセンブリーが阻害されれば、NTPのプロテアーゼによる分解の増大が期待されよう。従って、1種以上のHarlilペプチドもしくはHarlil模倣体の投与によって、過剰なNTPの除去を行いうる可能性がある。あるいはまた、HarlilペプチドまたはHarlil模倣体の治療剤はNTPモノマーまたは凝集体の神経変性カスケードの他のコンポーネントとの相互作用を制御するのに有用でありうる。
【００５２】
自己アセンブルまたは重合する多数のタンパク質が反復配列を有している。最もよく知られているものはコラーゲンで、1本の鎖あたりgly X Yという短い反復配列が6回も現れる(Lacyら、「FLRT1、FLRT2、およびFLRT3の同定：膜貫通ロイシンリッチリピートタンパク質の新規のファミリー(Identification of FLRT1, FLRT2 and FLRT3: a novel family of transmembrane leucine rich repeat proteins)」, Genomics, 62(3):417-26(1999))。その他の研究では特定の反復配列が結合の核形成に関与していることが示されている(Snellmanら、「XIII型コラーゲンの三量体化にはN末端領域のある短い配列が必要であり、それは他のコラーゲン性膜貫通タンパク質でも保存されている(A short sequence in the N-terminal region is required for the trimerization of type XIII collagen and is conserved in other collagenous transmembrane proteins)」, EMBO J., 19(19);5051-59(2000))。さらに、コラーゲンペプチドPro Pro Gly(自己アセンブリーに決定的に重要なものである)は、プロコラーゲンのシャペロンHSP7との相互作用にも決定的に重要なものであることを示す研究がある(Koideら、「コラーゲン性ペプチドのシャペロンタンパク質HSP47による認識のためのコンフォメーション条件(Conformational requirements of collagenous peptides for recognition by the chaperone protein HSP47)」, Biol. Chem., 275(36):27957-27963(2000))。ラミニン中の自己認識の特異性が研究されている(Schittny, J. C., 「アフィニティー・リターディション・クロマトグラフィー：方法の特徴付けとその適用(Affinity Retardation Chromatography: Charaterization of the Method and Its Application)」, Anal. Biochem., 222:140-148(1994))。
【００５３】
このように、重合または線維状(fibrilar)構造を形成するタンパク質は、通常は、自己についての(自己認識)タンパク質認識の特定のドメイン上の特定のドメインを介する自己アセンブリーによってそれを行うことは明らかである。さらに、これらのタンパク質はこれらの同じ認識部位を他のタンパク質との相互作用のために用いることができる。プロテインAとFcとの相互作用の場合と同様に(Deisenhofer, J., 「ヒトFcフラグメントと、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のプロテインAのフラグメントBとの複合体の結晶学的精製と2.9Aおよび2.8Aの分解能での原子モデル(Crystallographic Refinement and Atomic Models of a Human Fc Fragment and Its complex with Fragment B of Protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8- A Resolution)」, Biochem., 20(9):2361-2370(1981))、Harlil配列の相互作用と同様、これらの相互作用は疎水性およびイオン性相互作用を介するものであると思われる。
【００５４】
NTPの場合にはHarlilドメイン(おそらく自己アセンブリーで機能するのであろう)は、高度に相同で、ほぼ完全に保存されているものと思われる。「ロイシンジッパー」は自己認識を用いており、その中ではロイシンに富むストレッチ(stretches)がお互いに結合している。しかしロイシンジッパーはHarlil配列ほどユニークではない。Harlil配列は自己アセンブリーおよびNTPの他の脳のコンポーネントとの相互作用に決定的に重要な役割を果たしていると考えられている。
【００５５】
酵母中での、プリオンおよびプリオンエレメントでの実験で、タンパク質が自己凝集するコンフォメーションを取りうることの証拠が提供されている(Serioら、「プリオン決定基による核のあるコンフォメーションの変換およびコンフォメーション情報の複製(Nucleated Conformational Conversion and the Replication of Conformational Information by a Prion Determinant)」, Science, 289:1317-21(2000)；およびSparrer, H. E., 「プリオン仮説に対する証拠；in vitroで変換させたSup35タンパク質による、酵母(PSI＋)因子の誘導(Evidence for the Prion Hypothesis: Induction of the Yeast(PSI+) Factor by in vitro-Converted Sup35 protein)」, Science, 289(5479):595-599(2000))。
【００５６】
LiとLindquistは、ペプチド配列22-69を含んでいるSUPタンパク質の部分を遺伝学的に融合させることによって無関係のタンパク質上にSUPプリオン活性を与えることができることを示した。このように、彼らはSUP35タンパク質の特性を与えるプリオンがSUP 22-69ペプチドにあることを示した。類似して、本発明は凝集を起こす自己同定性ペプチドに向けられたものである。該配列をあるタンパク質上にグラフト(grafting)(コンジュゲーションによって)することによって、自己凝集性をそのタンパク質上に与えることができる：その結果、生理学的pHでのHarlilタンパク質コンジュゲートの95%までの沈殿が直ちに起こることが観察される。
【００５７】
下記の実施例は本発明を説明するためのものである。しかし、本発明がこれらの実施例中に説明した特定の条件や詳細事項に限定されるべきものではないことは理解されるべきである。本明細書全体を通じて、米国特許を含む、公的に利用可能な文書に対するいずれのおよび全ての参考文献は参照により特別に組み入れる。
【００５８】
実施例１
この実施例の目的は神経糸状タンパク質(Ｎeural Thread Ｐrotein)の数個のHarlil配列を同定し、それらのNTPとの反応性を調べることであった。
【００５９】
下記のHarlil配列を合成し(Synpep, Dublin CA)、それを、マレイミド活性化ウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove PA)とコンジュゲートさせ、それらのNTP免疫反応性を評価した。リンカーとして、NTPの90-96にあたるHHARLCL配列の前または後ろに存在するタンパク質配列の反復部分を、付加した。
【００６０】
【００６１】
担体タンパク質とのコンジュゲーションはシステインを介するものであった。ペプチドNTP-1およびNTP-2は混合コンジュゲート生成物を産生したが、それはシステイン残基が2個以上あるからである。従って、ペプチドNTP-5およびNTP-6については第２システインをメチルアセトアミドでブロックした。
【００６２】
NTP配列中の同定された配列の位置は図１に示している。Harlil類似体の全てがある程度の反応性を示したが、NTP-3はシステイン残基を1個しか有していないことにより取り扱いやすい一方で反応性は良好であったので、大部分の研究についてNTP-3が選択された。
【００６３】
上述のとおり、Harlilペプチドの相同体および変異体も本発明の範囲内に包含される。この実施例の相同体ペプチドの構築のために類似アミノ酸を用いた。ここで用いた置換の判断基準は電荷および/またはサイズである。NTPペプチド３中のシステインの代わりにメチオニンで置換するという選択は、これら2種のアミノ酸間の全体としての類似性、および、この重要な一続きのアミノ酸配列から反応性のシステインを除去するという要望に基づいたものである。システインをプロリンで置換するという選択は、それが前記タンパク質中にありそのシステインがジスルフィド結合を形成している場合にそれがそのペプチドの立体構造形態を模倣するのかどうかを確かめることを意図するものである。
【００６４】
アフィニティー相互作用に影響を与えるかまたはそれを調べるための当業者には公知のその他の変更としては、限定はされないが、例えば、ロイシンを他の疎水性アミノ酸、例えばイソロイシン、バリン、アラニン、またはグリシンと交換すること；酸性アミノ酸同士または塩基性アミノ酸同士を交換すること；ヒスチジンをフェニルアラニンと交換して電荷 対 空間の効果を調べること；アスパラギンをアスパラギン酸と、またはグルタミンをグルタミン酸と交換して電荷 対 空間の効果を評価すること；ならびにセリンをトレオニンと、トレオニンをシステインと、アスパラギン酸をグルタミン酸と、アルギニンをリジンまたはヒスチジンと、およびチロシンをトリプトファンまたはフェニルアラニンと交換することが挙げられる。
【００６５】
Harlilペプチド配列のみが活性を有するので、スペーサーとして以外にはNTPの隣接配列が必要であるとする理由はないものと考えられる。隣接配列に導入した変更は、ペプチドの塩基性または疎水性をより低くするように行った。
【００６６】
実施例２
この実施例の目的は、NTPのアフィニティー精製のためのアフィニティーリガンドとしてのNTP-3の使用を実証することであった。このプロセスでは、NTPはＡＤ患者から得られた尿サンプルから、アフィニティーカラムで精製した。
【００６７】
NTP を含有する試験用尿サンプルの調製：用いたNTPの生物学的供給源はＡＤと診断された患者(BOU1)の尿である。カラム材料にアプライする前に、その生物学的サンプルをＡＤ試験用の尿処理のための下記プロトコールに従って処理した。
【００６８】
1. 尿はAmes MultistixTM(Bayer, Indiana)で試験した。サンプルが次のようなものである場合には廃棄した。(a) 細菌の混入について陽性であるもの；(b) 以下について病的に高レベルであることがみとめられるもの：腎疾患と関連するタンパク質などのタンパク質(病的なレベルのタンパク質は含んでいないがNTPが陽性のサンプルは、この試験では排除しない)、ケトン、血液、ウロビリノーゲン(urobilogen)、亜硝酸塩、白血球；(c) pHが7.5を超えるかもしくは4.5未満のもの；または(d) 比重が1.025を超えるもの。
2. 尿を3000×gで15分間遠心して細胞片を除去した。
3.注射器を用いて尿を0.22μmの酢酸セルロースフィルターを通してろ過し、ろ液にアジドを0.05%となるように添加した。
4. この結果得られたアリコートを、Amicon Centricon(登録商標) YM-10 Milliporeの上部リザーバー中に入れ、3000×gで１時間遠心した。
5. 元の液量の約25%となったサンプルを遠心機から取り出し、1.5mLのTris緩衝生理食塩水(TBS)を加えて元の液量に戻した。
6. ステップ4および5を繰り返し、それらのステップではサンプルを再度3000×gで30分間遠心し、遠心機からサンプルを取り出して1.5mLのTBSをサンプルに添加した。
7. 次いでサンプルを3000×gで30分間遠心し、その後遠心機からサンプルを取り出した。その時点でサンプルは元の液量の4分の1であった。
8. 次いでサンプルをホウケイ酸ガラス製のバイアル瓶に移し、−20℃で凍結保存した。
【００６９】
カラムの調製：NTP-3を、臭化シアン活性化アガロース(Sigma, St.Louis, MO)に、製造者の使用説明書に従ってコンジュゲートさせた。調製後はそのカラム材料を、0.01%のアジドを添加したpH7の25mM Tris緩衝生理食塩水(TBS)中で保存した。
【００７０】
クロマトグラフィー：アフィニティーカラム材料11mLを25mLの尿サンプル(上述のとおり処理してTBS(pH7)中に4倍濃縮されたサンプル)および25mLの0.025M グリシンバッファー(pH3.5)と共に１時間インキュベートした。吸着されなかった物質(通過したもの)を集めた。次いでそのカラムを5倍量の1×TBS(pH 7)で洗浄し、11mLの0.1M グリシン(pH 2)中に溶出させた。溶出後すぐに、溶出物をNaOHでpH 7に調整し、実施例１と同様にAmicon Centricon(登録商標) YM-10 (Millipore, Beverly, MA)を用いて1mLに濃縮した。
【００７１】
アフィニティーカラム溶出液中に存在する NTP 活性の分析：アフィニティーアッセイによる活性は、尿中の神経糸状タンパク質を試験するための7C GoldTM Strip(Nymox Pharmaceutical Corp., Maywood NJ)を用いてアッセイした。例えば、Fitzpatrickら、Alzheimer's Reports, 3(3):155-159(2000)を参照されたい。7C GoldTM Stripでアッセイした活性は全てpH 2の溶出画分中にみとめられた。
【００７２】
タンパク質濃度：クーマシーブルー染色(BioRad, Hercules, CA)で測定すると、溶出液中のタンパク質濃度は108μgであった。これは出発時のタンパク質濃度の約3%である。Bicinchoninic Acid Kit(カタログNo.23223, BioRad)で測定すると、タンパク質濃度は145μgであった。バッファーに対して補正した280nmでの吸光度は390であり、これは390μgのタンパク質を示している。吸光度測定で決定されたタンパク質の量がより多かったのはNTP中に芳香族アミノ酸が多量に存在することによるものと考えられ、そのことによりこの測定法を用いた場合にタンパク質の過剰な見積り量がもたらされる。
【００７３】
アフィニティーカラムの溶出液から得た NTP タンパク質のゲル電気泳動による分析：1μgの溶出液(約110〜145ng)を12.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ミニゲル(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)にて泳動して、銀染色した。バンドは29kD、33kD、40〜45kD、および60kDに観察された。そのゲルを20〜35kD、35〜45kD、および45〜65kDのバンドについて切片化し、それを100μLのTBS中に入れて、TBSに対して一晩透析した。バンドの溶出液を実施例1と同様にAmicon Centricon(登録商標) YM-10を用いて濃縮し、7C GoldTM Assayを用いて活性を評価した。
【００７４】
NTP反応性は35〜45kDのバンドについて観察され、それはほぼ41kDのものであった。他のバンドについては活性は観察されなかった。NTPは分子量が41kDと報告されている。従って、このデータはアフィニティーカラムに結合したNTP-3が、ＡＤ患者の尿サンプル中に存在するNTPタンパク質を選択的に結合したことを示している。
【００７５】
この実施例はHarlilペプチドNTP-3のNTPへの特異的結合、およびNTP-3などのHarlilペプチドの、NTPのアフィニティー精製のためのアフィニティーリガンドとしての使用を実証したものである。
【００７６】
実施例３
この実施例の目的は、Harlilペプチドの自己凝集能を示すことであった。HarlilペプチドNTP-3は(システイン残基により)ジスルフィド結合を形成し、中性pHで二量体化する。二量体化したペプチドは2個の免疫グロブリンを結合できるので、沈殿を生成する。Harlilペプチドのこの性質をウサギ免疫グロブリンを用いて実証した。
【００７７】
1mgのHarlilペプチドNTP-3を含む1mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に、3.4mgのウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)をpH 7で添加した。その混合液を一晩透析し、翌朝には真っ白な沈殿が観察された。沈殿を遠心分離によって除去し、その上清のタンパク質濃度をPerkin Elmer分光光度計Lambda 3B型を用いて測定される280nmでの吸光度から決定した。結果は表1に示している。免疫グロブリンの沈殿は、低いpH、例えばpH3.5または3.5未満では妨げられる。
【００７８】
【表１】
【００７９】
実施例４
この実施例は、NTPの存在の検出および定量におけるHarlilペプチドの有用性を示すものであった。
【００８０】
メンブレンに基づくアッセイ：7C GoldTM アッセイは、5mm×45mmのストリップと、そのストリップ上に配置した2つのトラップおよびサンプル収容区域とからなる。トラップ1および2はサンプル収容区域からそれぞれ16mmと24mm離れている。各トラップは約4cmの深さがある。
【００８１】
標識金粒子はトラップ1または2に移動する。トラップ1およびトラップ2中の標識された金の比率はサンプル中に含まれるNTPの量と相関する。Fitzpatrickらの米国特許第6,121,008号を参照せよ。
【００８３】
NTP-3 コンジュゲートの調製：3.5mg/mLの濃度のマレイミド活性化ウサギ免疫グロブリン(RGG)(Pierce, Rockford, IL)を1Mのクエン酸を用いてpH3.5とした。30倍モル過剰としたHarlilペプチドNTP-3を含むDMSOを、そのRGGに添加した。そのNTP-3/RGGコンジュゲートのpHをモニターし、室温で緩徐に撹拌しながら一晩反応させた。次いでそのコンジュゲートを0.5mM, pH3.5のクエン酸リン酸バッファーに対して十分に透析した。
【００８４】
7C Gold TM Strip アッセイの調製：RGGにコンジュゲートしたNTP-3を透析したものを、0.5mM, pH3.5のクエン酸リン酸バッファー中に1mg/mLに希釈した。一晩静置した後、6μL/cmのそのコンジュゲートを、XY3000TM Biodot(Irvine, CA)を用いて、トラップ1におけるメンブレン(Loprodyne 3, Pall, East Hills, NY)にコートした。次いで、0.5mg/mLのヤギ抗マウス免疫グロブリン(DAKO #20109, Denmark)を、トラップ2における、メンブレン上のNTP-3/RGGコンジュゲートから1cm上の位置にコートした(NTP-3/RGGのコーティングと同じパラメーターを用いた)。そのメンブレン、すなわち7C GoldTM Stripを加熱した空気で30分間乾燥させ、5mmのストリップに切断し、乾燥剤と共に保存した。このトラップはNTPが存在しなければ抗NTP抗体をコートした金を結合する。7C GoldTM アッセイは抗NTP抗体N314を用いる(de la Monteら、J. of Neuropath. Exp. Neurol., 55:1038-50(1996))。このアッセイの基礎となっているのは、NTPが金粒子上のN314抗NTP抗体によって隔離され、NTP-3トラップに輸送され、そこでそのNTPがN314と離れてトラップ1に結合することである。そうすることでそのNTPは金粒子上の抗体のトラップ1への結合をブロックし、その結果、金粒子はトラップ2に移動する。このようにしてNTPが存在すればより多量の金がトラップ2へ移動する。
【００８５】
金コロイド：金コロイドの調製は「金コロイド（Colloidal Gold）」 M. A. Hayat編(Academic Press Limited, London(1991))に報告されているとおり行い、20μg/mLの濃度の精製N314抗NTP抗体でコートした。次いで抗体でコートした金コロイドを凍結保存用バッファー(Serex Inc., Maywood, NJ)中に希釈し凍結乾燥した。1枚のストリップに十分な量を2mLのホウケイ酸製バイアル(Wheaton #223683; Millville, NJ)中で、Virtus(Gardiner, NY) Model 600SL & 12SL 凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。
【００８６】
患者のサンプル：107例の患者のサンプルを実施例2に記載したとおり処理し濃縮した。
【００８７】
7C Gold TM アッセイ：処理し濃縮した患者サンプルの各々の50μLをNTP抗体でコートした凍結乾燥金に添加した。この混合物を室温で15分間インキュベートし、その後、7C GoldTM Stripをバイアル瓶中に入れ、そのストリップの上部に緑色の線が現れてアッセイの完了が示されるまでそのままにした。そのストリップを取り出し乾燥させた。
【００８８】
結果のまとめ：NTPが存在しない場合にはNTP抗体でコートした金の大多数はHarlilペプチドNTP-3トラップに結合する。NTP Harlilペプチド固相マイクロタイタープレートはマウス抗体を非常に低いアフィニティーで結合するが、N314モノクローナル抗体はそれが金粒子上で凝集した状態ではトラップと結合する。バンド1および2の色強度はデンシトメーター(Gretag D19C, Switzerland)を用いて読みとった。比率値（トラップ1の反射率をトラップ1の反射率とトラップ2の反射率の加算値で除算した値に等しい）を計算し、サンプルの比率値を指標サンプルまたはカットオフサンプルの比率値で割った。この値を指数値と称した。図３にグラフで示したアッセイの結果は、正常なサンプルとＡＤのサンプルとが良好に分離されていることを示している。
【００８９】
実施例５
この実施例の目的は、HarlilペプチドでコートしたマイクロタイタープレートへのNTPの結合が、コンジュゲートされていないHarlilペプチドによって阻害されうることを示すことであった。
【００９０】
マイクロタイタープレートの調製：30:1の比率として実施例4に記載のとおり調製したHarlilペプチド/免疫グロブリン複合体NTP-3-RGGを、Immulon 4マイクロタイタープレート(Dynex, Chantilly, VA)上に0.5μg/ウエルの濃度でコートした。
【００９１】
標準物：0.01%アジド(Nymox Pharm. Corp., Lot 4-7-98)を加えた組換えNTPを含むTBS(de la Monteら、J. of Neuropath. Exp. Neurol., 55:1038-1050(1996)に記載)をTBS中に連続希釈した。各希釈液の100μLをpH3.5で1時間インキュベートした。次いでその希釈液を、0.1%アルブミンおよび0.05% Tween80を含むTBS中で15分間洗った。その後、0.05% Tween80を含むTBS中で3回洗った。
【００９２】
マイクロタイタープレートアッセイ：次いで、ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)の1:8000希釈液を100μL添加し、30分間反応させた。そのマイクロタイタープレートを0.05%のTween80を含むTBSで2回洗い、その後150μLのテトラメチルベンゼン(TMB)(Serex Inc., Maywood, NJ)を添加した。次に、その混合液を10分間インキュベートし、50μLの2N HClで反応を停止させた。吸光度をSLT 340 ATTC分光光度計で読みとった。
【００９３】
このシステムを用いると、モノマーのNTP-3がコンジュゲートのプレートへの結合を阻害することが示される。図2を参照せよ。
【００９４】
実施例６
この実施例の目的は、抗体が、Harlilペプチドでコートしたマイクロタイタープレートに特異的に結合することを実証すること、およびその抗体のどの部分(FcまたはFab)がHarlilでコートしたプレートと結合しているのかを調べることであった。
【００９５】
試験した抗体：下記の抗体をJackson Immunoresearch(West Grove,PA)から入手した：(a)アルカリホスファターゼ(AP)標識し、アフィニティー精製したウサギIgG抗マウス抗体；(2)AP標識し、アフィニティー精製したウサギIgG抗マウス抗体(Fab2)；および(3)AP標識し、アフィニティー精製したウサギIgG抗ニワトリ抗体。
【００９６】
ウサギIgG抗ニワトリ(抗体(3))は、ウサギ抗マウス(抗体(2))がNTP-3/RGGコンジュゲート中のRGGを認識している可能性を排除するために用いた。抗体(2)は、抗体(2)にIgGのFc部分が欠けていることを除いては抗体(1)と同一である。
【００９７】
このアッセイフォーマットは実施例５に記載のとおりとした。免疫精製していないウサギ、ニワトリ、およびマウスIgGを1mg/mLまで添加した(図4参照)。対照としては、1mg/mLの、BSA(ウシ血清アルブミン)、α糖タンパク質、ＡＤ陽性および陰性対照尿、ならびに80、40、20、10、および5単位の組換えNTPを用いた。ウサギIgGとニワトリIgGは共に用量依存的様式でAPコンジュゲートから離れた。図4を参照せよ。Fab2はプレートと結合しなかった。
【００９８】
結果のまとめ：分子全体を用いた場合には、ウサギ抗マウスおよびウサギ抗ニワトリはどちらもNTP-3/ウサギIgGでコートしたマイクロタイタープレートと結合した。Fab標識抗体は結合を示さなかった(結果は示していない)。これらの結果は、Harlilペプチド抗体結合は、抗体のFc領域の認識を介して影響を及ぼすことを示している。
【００９９】
様々な生物種のIgGに対するHarlilペプチドのアフィニティーは異なる。例えば、マウスモノクローナル抗体はNTP-3コンジュゲートに対してウサギIgGよりもはるかに低いアフィニティーを示す。図4を参照せよ。
【０１００】
実施例７
この実施例の目的は、抗体のFc部分を認識するプロテインG中の配列をNTPが認識するかどうかを調べることであった。
【０１０１】
プロテインGはFc領域を介して抗体と結合する。この実施例の結果はまた、Harlilペプチドが免疫グロブリンのFc部分と結合し、Fab部分とは結合しないことを示唆したものであるため、NTPが抗体のFc部分を認識するプロテインG中の配列を認識するか否かを調べた。具体的には、HarlilペプチドがHarlilペプチドを認識し、Harlilペプチドが抗体のFc領域を認識し、プロテインGが抗体のFc領域を認識することから、この実験によってプロテインGがNTPを認識するか否かが判明した。
【０１０２】
NTP陽性およびNTP陰性のサンプルの双方ともがプロテインGカラムを通過した。NTPは有意には減少しなかった。これらの結果は、プロテインGがNTPに結合しないとの結論を支持するものである。
【０１０３】
Fc領域を介する結合は、Fc領域が免疫系において受容体を認識するために用いられているので、治療的な効果を有する可能性がある。
【０１０４】
実施例８
この実施例の目的は、Harlilペプチドを用いた、マイクロタイタープレートアッセイフォーマットでの競合的アフィニティーアッセイを実証することである。
【０１０５】
マイクロタイタープレートの調製：30:1の比率として実施例4に記載のとおり調製したHarlilペプチド/免疫グロブリン複合体NTP-3-RGGは、Immulon IIマイクロタイタープレート(Dynex, Chantilly, VA)上に20μg/ウエルの濃度でコートした。
【０１０６】
サンプルの調製：30検体の尿サンプルを試験用に実施例2に述べたようにして調製した。Fc抗体がアッセイに干渉しうるので、サンプルを100K Amicon Centricon(Millipore Inc., Beverly, MA)中でスピンして抗体を除去した後に、ろ液を試験した。(診断用試験での偽陽性を防止するために、Harlilペプチドが非NTP抗体と結合できないようにする。例えば、免疫グロブリンレベルが100μg/mLを超えるようなサンプルでは、アッセイにかける前に免疫グロブリンレベルを100μg/mL未満に減らしておかなければならない。）
対照：いかなる神経変性性疾患とも診断されていない被験者の尿から調製した尿のプールをアフィニティーカラムに通過させ、実施例2に記載のとおり調製した。この結果得られた尿のプールは「除去した」尿と呼ぶ。
【０１０７】
次いで「除去した」尿を用いて、高レベルのプールを適切に希釈することによって中等度の対照物を調製した。その高レベルのプールは、NTPについてのアッセイで陽性と判定されＡＤと診断された患者から得たサンプルを集めて調製したものである(実施例4を参照せよ)。
【０１０８】
標準物：組換えNTP(Nymox Pharmaceutical Corp, Montreal, Canada)をTBS中に希釈して標準物とした。標準物はその単位値を40、20、10、および0と定めた。尿中のNTPが部分的に分解している可能性があるとの証拠があるので、NTPの量は重量ではなく組換えNTP単位数で表現した。図5は、マイクロタイターフォーマット競合NTPアッセイにおける尿対照サンプルと組換えNTPの線形性を比較したものである。
【０１０９】
アッセイ：患者のサンプルは下記のアッセイで試験した：1:5000に希釈したペルオキシダーゼ・コンジュゲート化ウサギIgG(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)の50μLと、50μLのサンプルまたは標準物をプレートのウエルに添加した。そのプレートを室温で1時間インキュベートし、0.1% アルブミンおよび0.05% Tween 80を含むTBSで3回洗った。各ウエルに100μLのPNPP(パラニトロフェニルホスフェート)(Moss, Pasadena, MD)を添加した。405nmでのODを、BioRad Readerで、30分後およびその後15分間隔で、TBS標準物のODが2〜2.5の間になるまで測定した。図6に示しているその結果から、NTPは全てのサンプル中に認められるがＡＤ陽性患者ではその量が増加していることが示される。この量の増加は、年令が一致する対照を用いて容易に調べることができる。生物学的サンプル中のNTPの量を測定する診断用試験はＡＤまたはその他の神経変性性疾患の高精度の診断に有用である。
【０１１０】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の方法と組成物に種々の改変および変更を加えることができることは当業者であれば明らかであろう。従って、本発明の改変および変更が添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある限りは、本発明はそれらの変更および変更を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は完全なNTPの配列、およびその完全なNTPの配列中のHarlil配列の位置を示している(de la Monteら、J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-1050(1996))；
【図２】 図２はウサギ抗マウス免疫グロブリンコンジュゲートのHarlilペプチド(NTP-3)をコートしたマイクロタイタープレートとの結合の阻害をNTP-3/RGG濃度(x軸)の関数として示したものである(データは実施例5に記載している)；
【図３】 図３はHarlilペプチドをベースとしたメンブレンアッセイを用いた生物学的サンプル107検体のアッセイ結果を示したものである(データは実施例4に示している)；
【図４】 図４はNTPがそれに対して結合する抗体の部分を決定するアッセイ結果を示したものである(データは実施例6に示している)；
【図５】 図５はELISAフォーマットの競合NTPアッセイでの尿対照サンプルと組換えNTPの直線性を比較したものである(データは実施例8に示している)；
【図６】 図６はHarlilペプチドを用いたELISAフォーマットでＡＤと診断されたサンプルを、年令をマッチさせた正常サンプルと区別するための競合アフィニティーアッセイの結果を示しており、そのアッセイではＡＤ陽性の患者では閾値量が存在していることを示したものである(データは実施例8に記載している)。
Claims (53)
- 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらの相同体。 - 請求項１に記載の1種以上のペプチドおよびそのペプチドのための担体を含んでなる組成物。
- 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体 - 請求項３に記載の1種以上のペプチドおよびそのペプチドのための担体を含んでなる組成物。
- A R L Iのアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるペプチド。
- H A R Lのアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるペプチド。
- F A R Lのアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるペプチド。
- A R Lのアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるペプチド。
- A R L Cのアミノ酸配列を有するペプチドであって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるペプチド。
- Harlilペプチド配列のポリマーであって、該ペプチドの少なくとも2つの反復を含んでなるポリマー。
- 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列をコードする核酸：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体。 - 請求項１１に記載の1種以上の核酸およびその核酸のための製薬上許容される担体を含んでなる組成物。
- 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列をコードする核酸：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体 - 請求項１３に記載の1種以上の核酸およびその核酸のための担体を含んでなる組成物。
- アミノ酸配列A R L Iをコードする核酸であって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸をコードする残基を含んでなる核酸。
- アミノ酸配列H A R Lをコードする核酸であって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸をコードする残基を含んでなる核酸。
- アミノ酸配列F A R Lをコードする核酸であって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸をコードする残基を含んでなる核酸。
- アミノ酸配列A R Lをコードする核酸であって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸をコードする残基を含んでなる核酸。
- アミノ酸配列A R L Cをコードする核酸であって、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸をコードする残基を含んでなる核酸。
- 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド配列を特異的に認識する抗体：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらの相同体。 - 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド配列を特異的に認識する抗体：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体 - 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチド配列を特異的に認識する抗体であって：
(a) A R L I；
(b) H A R L；
(c) F A R L；
(d) A R L；および
(e) A R L C、
該ペプチドが該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなる、抗体。 - 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドの模倣体：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体。 - 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドの模倣体：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体 - 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドの模倣体であって：
(a) A R L I；
(b) H A R L；
(c) F A R L；
(d) A R L；および
(e) A R L C、
該NTPペプチドが該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなる、模倣体。 - 生物学的サンプルからNTPを精製する方法であって：
(1) 生物学的サンプルを、次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチドと接触させ：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそのようなアミノ酸配列の相同体；
(2) その結果得られるHarlilペプチド/NTPコンジュゲートを単離し；および
(3) 精製NTPを得るために1種以上のHarlilペプチドからNTPを分離する、
ことを含んでなる方法。 - 生物学的サンプルからNTPを精製する方法であって：
(1) 生物学的サンプルを、次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチドと接触させ：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体
(2) その結果得られるHarlilペプチド/NTPコンジュゲートを単離し；および
(3) 精製NTPを得るために1種以上のHarlilペプチドからNTPを分離する、
ことを含んでなる方法。 - 生物学的サンプルからNTPを精製する方法であって：
(1) 生物学的サンプルを、次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチドと接触させ：
(i) A R L I；
(ii) H A R L；
(iii) F A R L；
(iv) A R L；および
(v) A R L C、
ここで該ペプチドは、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるものであり；
(2) その結果得られるHarlilペプチド/NTPコンジュゲートを単離し；および
(3) 精製NTPを得るために1種以上のHarlilペプチドからNTPを分離する、
ことを含んでなる方法。 - アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を調べるための診断試験法であって：
(1) 生物学的サンプルを、次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチドと接触させ：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体；
(2) 該サンプル中に存在するNTPの量を測定し；および
(3) 該サンプル中に存在するNTPの量が、アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を示す閾値量を上回る量か否かを決定する、
ことを含んでなる診断試験法。 - アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を調べるための診断試験法であって：
(1) 生物学的サンプルを、次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチドと接触させ：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体；
(2) 該サンプル中に存在するNTPの量を測定し；および
(3) 該サンプル中に存在するNTPの量が、アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を示す閾値量を上回る量か否かを決定する、
ことを含んでなる診断試験法。 - アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を調べるための診断試験法であって：
(1) 生物学的サンプルを、次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチドと接触させ：
(i) A R L I；
(ii) H A R L；
(iii) F A R L；
(iv) A R L；および
(v) A R L C、
ここで該ペプチドは、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるものであり；
(2) 該サンプル中に存在するNTPの量を測定し；および
(3) 該サンプル中に存在するNTPの量が、アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を示す閾値量を上回る量か否かを決定する、
ことを含んでなる診断試験法。 - アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を調べるための診断用キットであって：
(1) 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチド：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体；ならびに
(2) 適切な試薬、
を含んでなる診断用キット。 - アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を調べるための診断用キットであって：
(1) 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチド：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体；ならびに
(2) 適切な試薬、
を含んでなる診断用キット。 - アルツハイマー病またはその他の神経変性性疾患の存在を調べるための診断用キットであって：
(1) 次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する1種以上のペプチド：
(i) A R L I；
(ii) H A R L；
(iii) F A R L；
(iv) A R L；および
(v) A R L C、
ここで該ペプチドは、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるものであり；ならびに(2) 適切な試薬、
を含んでなる診断用キット。 - 治療用または診断用のアッセイにおいてあるペプチドをNTPの類似体として用いる方法であって、そのようなアッセイにおいてNTPを該ペプチドと置き換えることを含んでなり、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである、方法：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体。 - 治療用または診断用のアッセイにおいてあるペプチドをNTPの類似体として用いる方法であって、そのようなアッセイにおいてNTPを該ペプチドと置き換えることを含んでなり、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである、方法：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体。 - 治療用または診断用のアッセイにおいてあるペプチドをNTPの類似体として用いる方法であって、そのようなアッセイにおいてNTPを該ペプチドと置き換えることを含んでなり、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドであり：
(a) A R L I；
(b) H A R L；
(c) F A R L；
(d) A R L；および
(e) A R L C、
ここで該ペプチドは、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるものである、方法。 - 治療用または診断用のアッセイにおいて、ペプチドをトラップ物質として用いる方法であって、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである、方法：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体。 - 治療用または診断用のアッセイにおいて、ペプチドをトラップ物質として用いる方法であって、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである、方法：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体。 - 治療用または診断用のアッセイにおいて、ペプチドをトラップ物質として用いる方法であって、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドであり：
(a) A R L I；
(b) H A R L；
(c) F A R L；
(d) A R L；および
(e) A R L C、
ここで該ペプチドは、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるものである、方法。 - サンプルからペプチドを用いて免疫グロブリンを単離する方法であって：
(1) 免疫グロブリンを含んでなるサンプルを少なくとも2種のペプチドと接触させて免疫グロブリン/ペプチド相互作用を起こさせ；および
(2) その結果得られるペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートを単離し、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである、方法：
(a) H H A R L；
(b) H A R L；
(c) H A R L I；
(d) H A R L I L；
(e) H H A R L C L；
(f) A R L I L；
(g) H H A R L I F；
(h) T H A T L I L；
(i) A R L I；
(j) A R L；
(k) H A R L C L；
(l) A R L C L；
(m) A R C L；
(n) M F A R L I L；
(o) F A R L I L；
(p) F A R L I；
(q) F A R L；
(r) H A R L I F；
(s) A R L I F；およびそれらのアミノ酸配列の相同体。 - 該NTPペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートが沈殿によって単離されるものである、請求項４１に記載の方法。
- 該NTPペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートがアフィニティーカラムで単離されるものである、請求項４１に記載の方法。
- 該免疫グロブリンがさらに精製されるものである、請求項４１に記載の方法。
- サンプルからペプチドを用いて免疫グロブリンを単離する方法であって：
(1) 免疫グロブリンを含んでなるサンプルを少なくとも2種のペプチドと接触させて免疫グロブリン/ペプチド相互作用を起こさせ；および
(2) その結果得られるペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートを単離し、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドである、方法：
(a) L H A R L C L A N F C G R N R V；
(b) L A R L C L A N F C G N N N V；
(c) C A R Y R T G H H A R L M；
(d) H H A R L P L A N F C G；
(e) R T G H H A R L C* L A N F C；
(f) C E S A R Y R T G H H A R L C*；
(g) D N T H H A R L I L；
(h) S H H A R L I L；およびそれらの相同体。 - 該ペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートが沈殿によって単離されるものである、請求項４５に記載の方法。
- 該ペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートがアフィニティーカラムで単離されるものである、請求項４５に記載の方法。
- 該免疫グロブリンがさらに精製されるものである、請求項４５に記載の方法。
- サンプルからペプチドを用いて免疫グロブリンを単離する方法であって：
(1) 免疫グロブリンを含んでなるサンプルを少なくとも2種のペプチドと接触させて免疫グロブリン/ペプチド相互作用を起こさせ；および
(2) その結果得られるペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートを単離し、ここで該ペプチドは次のものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するペプチドであり：
(a) A R L I；
(b) H A R L；
(c) F A R L；
(d) A R L；および
(e) A R L C、
ここで該ペプチドは、該ペプチドの3'末端または5'末端のいずれかに隣接して少なくとも1個から25個までの追加のアミノ酸を含んでなるものである、方法。 - 該ペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートが沈殿によって単離されるものである、請求項４９に記載の方法。
- 該ペプチド/免疫グロブリンコンジュゲートがアフィニティーカラムで単離されるものである、請求項４９に記載の方法。
- 該免疫グロブリンがさらに精製されるものである、請求項４９に記載の方法。
- NTPがHarlilドメインを介して相互作用することを防止するための方法であって、1種以上のHarlilペプチド、Harlilペプチド模倣体、そのようなドメインに対する抗体、またはそれらの組み合わせを用いて1つ以上のHarlilドメインをブロックすることを含んでなる方法。
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