ES2264151T3

ES2264151T3 - Procedimiento para la determinacion instrumental de una magnitud de medida en funcion del tiempo.

Info

Publication number: ES2264151T3
Application number: ES97115223T
Authority: ES
Inventors: Jurgen Dr. Patzke
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1996-09-28
Filing date: 1997-09-03
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2017-09-03
Also published as: ATE329265T1; CA2216895C; EP0833153A3; EP0833153A2; CA2216895A1; JP4015726B2; DE59712670D1; US6044330A; EP0833153B1; JPH10111248A; DE19640121B4; DE19640121A1; US6317702B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR INSTRUMENTALMENTE UNA MAGNITUD DE MEDIDA L(T) A MODIFICAR PERIODICAMENTE, DEBIENDO OBTENERSE EL VALOR MAXIMO DE L(T) EN UN MARGEN CON UN CURSO DE REACCION LINEAL Y SIENDO VARIABLES EL MOMENTO, ASI COMO LA MAGNITUD DE LA VENTANA DEL TIEMPO DE REACCION CON EL MARGEN LINEAL Y DEPENDIENDO DEL TIPO DE REACCION Y DE LAS CONDICIONES DE REACCION. LA PRESENTE INVENCION TRATA ESPECIALMENTE DE DETERMINAR CONCENTRACIONES DE PROTEINAS CON LA AYUDA DE UNA DISPERSION DE LUZ PRODUCIDA POR UNOS ANTICUERPOS ESPECIFICOS EN SOLUCIONES HOMOGENEAS. LA INVENCION TRATA EN PARTICULAR DE REACCIONES QUE TRANSCURREN LENTAMENTE Y QUE DISCURREN EN SU MAYOR PARTE DE FORMA LINEAL DURANTE UN TIEMPO MAS LARGO, OBTENIENDOSE COMO MAGNITUD DE MEDIDA LA VELOCIDAD PARA FORMAR COMPLEJOS DE ANTIGENOS Y ANTICUERPOS EN LA PARTE DE LA REACCION (V SUB,MAXLIN) QUE DISCURRE LINEALMENTE.

Description

Procedimiento para la determinación instrumental de una magnitud de medida en función del tiempo.

El presente invento se refiere a un procedimiento para la determinación instrumental de la máxima velocidad de reacción a partir de una magnitud de medición L(t) que se modifica con la reacción en función del tiempo, en una zona con evolución lineal de la reacción, realizándose que el momento así como el tamaño de la ventana de tiempo de reacción son variables con la zona lineal y dependen del tipo de la reacción y de las condiciones de reacción. Especialmente, el presente invento se refiere a la determinación de concentraciones de proteínas con ayuda de una dispersión de luz generada con anticuerpos específicos en el seno de soluciones homogéneas. En particular, el invento se refiere a reacciones que transcurren lentamente, las cuales discurren de un modo ampliamente lineal durante un período de tiempo prolongado, determinándose como magnitud de medición la velocidad de la formación de complejos de antígenos y anticuerpos en el tramo de la reacción que discurre de un modo lineal.

El fenómeno de la dispersión de luz junto a partículas, que se encuentran en un medio homogéneo, es usado, tanto a través de la medición de la intensidad de luz dispersa (nefelometría) como también a través de la medición de la pérdida de intensidad del rayo de luz que pasa a través del medio (turbidimetría), para la determinación de la concentración.

La reacción inmunoquímica entre un antígeno soluble y un anticuerpo bi- o poli-valente conduce a agregados de moléculas de gran tamaño y que dispersan fuertemente la luz. La evolución en el tiempo de tales reacciones corresponde con mucha frecuencia a la evolución cinética general de reacciones consecutivas de 1^{er} orden y muestran un punto de inflexión, y por consiguiente la máxima velocidad de reacción aparece tan sólo en el transcurso de la reacción (véanse p.ej. las Figuras 1a-1c). A partir de las curvas de señal y tiempo de las Figuras 1a-1c se puede obtener de diferentes maneras una señal de medición dependiente de la concentración.

La intensidad de la modificación de una señal se puede amplificar mediante el recurso de que un partícipe en la reacción es fijado a partículas, p.ej. en el "ensayo amplificado por partículas", de por sí conocido para un experto en la especialidad.

En el procedimiento del punto final, la señal de medición es determinada en un momento tan tardío en el que, de acuerdo con la experiencia, ya no se modifica, pero no tiene lugar ninguna precipitación. En el procedimiento de "tiempo fijo" (del inglés "fixed time"), el procedimiento de medición propiamente dicho se basa en la diferencia de dos señales que se determinan en momentos diferentes, pero establecidos previamente de un modo fijo.

En el procedimiento cinético "método de la velocidad máxima" (del inglés "peak rate method") se determina la velocidad máxima (de pico) de reacción (V_{Max}), es decir la modificación máxima (\delta) de la señal (S) por unidad de tiempo (\delta t),

a): mediante mediciones de \delta S en intervalos de tiempo (\delta t) suficientemente cortos y determinación del mayor cociente \delta S/\delta t,

b): diferenciación electrónica \delta S/\delta t y determinación del máximo,

c): construcción de la tangente a la curva de señal / tiempo y determinación de la máxima pendiente, S = señal, t = tiempo.

El documento de patente de los EE.UU. US 4.972.505 divulga un procedimiento de acuerdo con el concepto preliminar de las reivindicaciones 1 y 2

El procedimiento conforme al invento se puede aplicar en principio a todas las determinaciones de la máxima velocidad de reacción a partir de una magnitud de medición que se modifica con la reacción en función del tiempo, cuando la modificación del tamaño de la señal es lineal solamente en una zona parcial y se debe aprovechar para la valoración de la parte lineal.

Un gran número de analitos se pueden cuantificar hoy en día de acuerdo con los procedimientos expuestos, con medición directa o indirecta de la luz dispersa. Si se considera la dependencia de una apropiada señal de medición con respecto de la concentración de un partícipe en la reacción, p.ej. del antígeno, mientras que el otro partícipe en la reacción se emplea con una concentración constante, entonces se puede observar, por ejemplo en el caso de reacciones inmunoquímicas, que la misma señal de medición se puede atribuir a una concentración tanto baja como también alta del analito. Esto conduce a una ambigüedad de la relación entre la señal y la concentración, que es conocida para un experto en la especialidad como un fenómeno de exceso de antígeno "gancho de alta dosis" (en inglés "high-dose hook") o curva de Heidelberg. Esta ambigüedad es observable en principio en todos los sitios donde son posibles complejos con diversa estequiometría, dependiendo del exceso de uno u otro de los partícipes en la reacción, y estos complejos no se diferencian en su propiedad de señales, por ejemplo de luz dispersa.

Tales procedimientos inmunoquímicos de determinación son de por sí conocidos para un experto en la especialidad, p.ej. a partir del documento de patente europea EP 0.252.127.

Junto a la posible ambigüedad de la relación entre la señal y la concentración, otro problema es la determinación de concentraciones bajas, o bien la valoración de reacciones que transcurren lentamente. El transcurso de la reacción de la fijación de un antígeno y un anticuerpo muestra en principio una fase de retraso (del inglés "lag") al comienzo, una zona de máxima velocidad de reacción y una zona de saturación (Figuras 1a-1c). La agudización de estas tres fases es muy fuerte dependiendo de la concentración del antígeno, del anticuerpo y, además, de muchos otros factores, tales como p.ej. la temperatura y el medio de dilución, que sin embargo se mantienen lo más constantes que es posible en un sistema de ensayo.

El presente invento se basó por consiguiente en el problema técnico de proporcionar un procedimiento inmunoquímico de determinación con ayuda de una dispersión de luz generada por anticuerpos específicos, que permita tanto la medición de concentraciones muy bajas así como también ofrezca una alta seguridad contra el efecto de "gancho de alta dosis".

La resolución de este problema técnico se efectúa mediante la puesta a disposición de las formas de realización que se definen en las reivindicaciones.

Un componente esencial del procedimiento conforme al invento consiste en que, mediante pasos técnicos apropiados, la ventana de tiempo de medición de la respectiva cinética de reacción es adaptada de tal manera que la evaluación se efectúa de una manera confiable en la zona lineal, y en la zona de la máxima velocidad de reacción, de la reacción dependiente del tiempo. El resultado de tal evaluación es la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin}, ocasionalmente también designada como X_{Lin}.

El procedimiento conforme al invento se puede garantizar mediante diferentes formas de realización técnica.

Son analitos en el sentido del invento proteínas plasmáticas, tales como p.ej. ferritina, PSA, IgA, IgG y también proteínas, que se han de contar dentro del sector de la coagulación, tal como p.ej. el dímero D y factores de coagulación, en particular variantes genéticas de factores de coagulación y además haptenos, tales como p.ej. hormonas y péptidos mensajeros.

Es ventajosa también la aplicación del procedimiento conforme al invento a la determinación de la capacidad funcional del sistema de coagulación, tal como p.ej. el ensayo de Quick y el aPTT.

Así, sorprendentemente, se comprobó que el procedimiento de determinación que se describe a continuación permite tanto la medición de bajas concentraciones como garantiza también una seguridad elevada contra el efecto de "gancho de alta dosis".

La realización del procedimiento conforme al invento se efectúa en dos etapas, en las que se mide una muestra y se utiliza la cinética almacenada de reacción. En la primera etapa, mediante una ventana de tiempo relativamente corta, se determina la velocidad de reacción máxima provisional. La longitud de la ventana de tiempo t_{Test} se ajusta preferiblemente de tal manera que, en promedio a través de varias mediciones y de varias cargas, ella corresponde a la longitud del tramo lineal de la reacción en la cinética de reacción de muestras, cuyas concentraciones están situadas en el extremo superior de la zona de medición. A partir de esto se pone de manifiesto también claramente que el tamaño de la ventana de reacción de marcha previa es un parámetro específico del ensayo que, entre otras cosas, es dependiente del analito, pero también del sistema de ensayo (en inglés test), o bien del sistema de detección, que se utiliza. A partir de la V_{MaxPre} así determinada, se determina la óptima ventana de tiempo de reacción. La dependencia entre V_{MaxPre} y la óptima ventana de tiempo de reacción se debe determinar en experimentos previos de un modo específico para el ensayo (Figura 2). Es importante en este caso el hecho de que para cada V_{MaxPre} se determina una ventana de reacción, que, por una parte, incluye el mayor número posible de puntos de medición, pero, por otra parte, toma en consideración solamente unos puntos que están situados en el tramo lineal de la
reacción.

Para la determinación de esta dependencia específica para un ensayo, se pueden emplear diferentes procedimientos. Es importante en este contexto el hecho de que la dependencia entre V_{MaxPre} y el tamaño de la ventana de tiempo de reacción se establezca de tal manera que sean óptimas la precisión y la exactitud. Para el establecimiento de esta dependencia se pueden llevar a cabo p.ej. mediciones en una agrupación (en inglés pool) de muestras de sueros con concentraciones diferentes del analito, o patrones de suero en diluciones diferentes. Las concentraciones se extienden en este caso ventajosamente a lo largo de toda la zona deseada de medición. En un primer paso se miden todas las muestras, se almacenan las cinéticas y se determinan los valores de V_{MaxPre}. Para cada medición de una muestra, se obtienen entonces, mediante modificaciones escalonadas de la ventana de reacción, diferentes coeficientes de correlación. El tamaño de la ventana con el óptimo coeficiente de correlación toma en consideración también de una manera óptima el tramo lineal de la reacción. Asimismo como medida de la linealidad, es apropiada la distancia media de los puntos de medición desde la recta de regresión. Así, en primer lugar, para cada muestra con una determinada V_{MaxPre} se obtiene la ventana de tiempo de reacción que es óptima para la linealidad. Como resultado para todas las muestras con diferentes V_{MaxPre} se establece una relación entre V_{MaxPre} y el tamaño de la ventana de reacción de marcha principal t_{Lin} para la óptima linealidad en la ventana de reacción. La Figura 2 muestra a modo de ejemplo la relación entre el tamaño de la ventana de reacción de marcha principal t_{Lin} y V_{MaxPre} en el caso del óptimo coeficiente de
correlación.

Esta relación se usa con el fin de trazar una curva de referencia con etapas de dilución de un suero patrón con una concentración conocida (V_{MaxPre} \rightarrow tamaño de la ventana de reacción de marcha principal \rightarrow V_{Max} de marcha principal).

Puesto que no está garantizado que el criterio de linealidad proporcione también los óptimos resultados en el caso de mediciones de precisión y en el caso de hallazgos de testigos, se efectúa entonces un ajuste fino de la relación entre la ventana de reacción de marcha principal y la V_{MaxPre}. En este caso, la curva de referencia arriba establecida no se modifica, con el fin de no hacer variar al mismo tiempo demasiados parámetros.

Para diferentes etapas de concentraciones de muestras, patrones y testigos, se llevan a cabo mediciones de precisión inter- e intra-ensayos (intra-ensayos = ensayos en serie, inter-ensayos = ensayos en diferentes días), llevándose a cabo las determinaciones de V_{Max} en marcha principal con ventanas de reacción de diferentes tamaños. Como resultado, se obtiene para cada medición, y por consiguiente para cada V_{MaxPre}, un tamaño de ventana de reacción de marcha principal, que proporciona la óptima precisión. La recopilación de todas las mediciones proporciona una dependencia similar a como en el caso de la linealidad. Una evolución dada a modo de ejemplo se indica en la Figura 2.

El mismo modo de proceder en principio en el caso de la medición de un material testigo, proporciona la óptima exactitud (Figura 2).

Entonces, se puede decidir para una asignación del tamaño de una ventana de reacción de marcha principal t_{Lin} a unos valores de V_{MaxPre} que garanticen tanto buenas precisiones como también un buen hallazgo de valores nominales testigos. El resultado para la ferritina se representa en la Tabla 1.

Después de haber establecido esta relación entre t_{Lin} y V_{MaxPre}, se debe repetir el cálculo de la curva de referencia con los nuevos criterios. Entonces, se puede efectuar una total caracterización del nuevo método, tal como se recopila en la Tabla 1 en el ejemplo de la ferritina.

TABLA 1 El procedimiento de V_{MaxLin} en el ejemplo de la ferritina

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Parámetro V_{MaxLin} para ferritina:
Ventana de reacción mínima:	40 segundos
Ventana de reacción de marcha preliminar:	80 segundos

V_{MaxPre}		t_{Lin}

> 25 bit/s	\rightarrow	80 segundos
20 - 25 bit/s	\rightarrow	240 - 160 segundos
10 - 20 bit/s	\rightarrow	360 - 240 segundos
< 10 bit/s	\rightarrow	360 segundos

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a) Muestra de baja concentración con un mínimo (Figura 3)

El mínimo se encuentra en: 38 segundos
V_{MaxPre}: 0,270 bit/s (38 - 118 segundos)
t_{Lin}:	360 segundos
V_{MaxLin}: 0,123 bit/s (38 - 360 segundos)

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b) Muestra de concentración normal sin ningún mínimo (Figura 3)

El mínimo se encuentra en: 0 segundos
V_{MaxPre}: 24,02 bit/s (0 - 80 segundos)
t_{Lin}:	175 segundos
V_{MaxLin}: 23,64 bit/s (23 - 198 segundos)

Hay que hacer resaltar que los parámetros determinados de esta manera son muy específicos para el sistema de ensayo. A un sistema de ensayo pertenecen el aparato analizador, las prescripciones de medición y los reactivos para la determinación de un determinado analito, cuando sea necesario con diferencias específicas para las cargas, y naturalmente el material de muestra.

También es posible valorar para cada medición la linealidad de la curva de medición de acuerdo con criterios matemáticos de linealidad y evaluar solamente la parte de la curva que corresponde a estos criterios previamente establecidos. Entonces se establecen sin embargo malas precisiones precisamente en el caso de bajas concentraciones de los analitos.

Una posibilidad adicional para la determinación de V_{Max} consistiría en adaptar un polinomio a la curva de medición de una muestra arbitraria y seguidamente formar la primera derivada del polinomio. El máximo de la primera derivada proporciona la máxima velocidad de reacción, pero se ha mostrado, no obstante, que, en particular en el caso de reacciones con elevada dispersión, hay poca confianza en una V_{Max} determinada de esta manera, tal como se puede observar p.ej. a partir de la Tabla 2 (polinomio).

TABLA 2 Determinación de V_{Max} directamente a partir del polinomio de 3^{er} grado

Dilución 1:	Concentración	Polinomio	Integral
	[\mug/l]	MW [bit/s]	VK [%]	MW [bit/s]	VK [%]
2,5	137,60	25,50	2,00	25,24	2,0
5	68,80	18,09	3,4	17,65	3,4
10	34,40	9,61	4,8	9,44	4,9
20	17,20	4,91	3,3	4,61	3,0
40	8,60	2,45	7,8	2,11	2,2
80	4,30	1,19	7,6	0,98	4,8
160	2,15	0,58	16,3	0,46	3,5
320	1,08	0,34	38,6	0,22	9,7
640	0,54	0,17	48,6	0,09	15,0
MW = valor de medición \hskip1cm VK = coeficiente de variación

Sorprendentemente, se pudo mostrar que mediante adaptación de una superficie integral por debajo de la primera derivada del polinomio, que es específica para el ensayo (véase la Figura 5), se puede determinar un período de tiempo de medición t_{Lin}, en el que la curva de medición se puede valorar a través de una regresión lineal y conduce a un resultado que, en lo que se refiere (= "in puncto") a la linealidad, la precisión y la exactitud, es equivalente al procedimiento antes descrito. El tamaño de la superficie integral es específico para un ensayo, es decir se determina empíricamente de manera preferida para cada procedimiento de ensayo y para cada analito y eventualmente también para determinados aparatos de ensayo.

Así, se mostró que en el caso de una superficie integral de 100 para diferentes ensayos amplificados con látex, se pueden conseguir en un aparato (BN II, de Behringwerke AG, Marburg) óptimos resultados, p.ej. para ferritina (FRT) y un antígeno específico para la próstata (PSA) (Figuras 4 a y b). En el mismo aparato, la óptima superficie integral para ensayos no amplificados por látex es 10 (Figuras 4 d y e). En otro aparato (BCS, de Behringwerke AG, Marburg) la óptima superficie para el ensayo amplificado por látex en el caso de una medición fotométrica es 20 (Figura 4 c).

La determinación empírica de la óptima superficie integral se efectúa en una marcha por separado tal como el establecimiento de V_{MaxPre} y t_{Lin}, pero para esta variante la superficie integral determinada es una constante, que es válida para todas las concentraciones. En los Ejemplos de la Figura 4 se indican en cada caso una concentración muy alta y una concentración muy baja. Así, p.ej. en el caso de la determinación de la precisión de los diferentes ensayos amplificados por látex en el nefelómetro de Behring (de Behringwerke AG, Marburg) se llevan a cabo mediciones de la precisión en serie para cada punto de referencia. La linealidad se estableció en cada una de las mediciones mediante los coeficientes de correlación de la regresión lineal. La exactitud se determinó por medio de la medición de sueros testigos y de la convolución junto a una curva de referencia, asimismo evaluada de acuerdo con el método de la integral.

La superficie integral así determinada es adaptada para cada medición por debajo de la primera derivada, de tal manera que hacia arriba la primera derivada del polinomio es limitadora de la superficie y hacia abajo indica el punto de intersección de las rectas inferiores de delimitación con la curva en el eje de las X, donde están situados el comienzo y el final del período de tiempo de medición.

El polinomio se calcula de acuerdo con el principio de los mínimos cuadrados a partir de los pares de valores de la cinética de reacción. El sistema de ecuaciones normales se resuelve de acuerdo con el algoritmo de Gauss, que es un procedimiento que un experto en la especialidad conoce de por sí para la resolución de regresiones no lineales. Ventajosamente, el polinomio adaptado es de 3^{er} grado, pero también se pueden utilizar polinomios de mayor grado.

Los siguientes Ejemplos explican el invento:

Ejemplo comparativo

a) Método de la velocidad máxima

El sistema TurbiTime de la Behringwerke es un buen ejemplo de un procedimiento cinético de evaluación (documento de patente alemana DE 33.47.162). Éste posee una cámara de medición, en la que la reacción transcurre en cada caso en una cubeta individual. Las mediciones de la densidad óptica se efectúan hasta tanto que se haya alcanzado la máxima velocidad de reacción V_{Max}, es decir el resultado de la medición, y luego se interrumpen.

Los reactivos para el sistema están ajustados de tal manera que hacen posible una rápida reacción, y en el caso ideal se puede interrumpir la medición ya después de algunos segundos. Además, se valora el momento en el que se alcanza la V_{Max}. De esta manera se puede tomar una decisión acerca del lado en el que se encuentra la curva de Heidelberg y casi se puede excluir un resultado falso, demasiado bajo.

b) Método del tiempo fijo

Los nefelómetros de la Behringwerke (BN, BN100, BNII) miden el aumento del enturbiamiento como dispersión de la luz. El método de evaluación es denominado "de tiempo fijo" a causa de los tiempos de reacción fijos. Como resultado de la medición, se determina la diferencia de enturbiamientos entre un valor inicial y un valor final. Los nefelómetros son sistemas totalmente automáticos, en los cuales las tandas se incuban simultáneamente en muchas cubetas, con el fin de hacer posible una elevada velocidad de realización del ensayo. Las cubetas se hacen avanzar con un rotor a intervalos regulares para el registro del valor de medición en el sistema óptico de medición. Por lo tanto, se obtiene una cinética de reacción con puntos de medición a intervalos de tiempo relativamente grandes, p.ej. de 16 segundos en el BN II.

Ejemplo 1 El nuevo procedimiento de V_{MaxLin} con evaluación en 2 etapas

El procedimiento es de dos etapas (Figura 3, Tabla 1):

1. Determinación de la longitud óptima de la ventana de reacción de marcha principal (t_{Lin})

En una primera pasada se busca con una pequeña ventana de reacción de marcha preliminar, a través de la evolución de la cinética global, la máxima velocidad de reacción V_{MaxPre}. El tamaño de la ventana es específico para el respectivo ensayo y es establecido de tal manera que, incluso en el caso de altas concentraciones de un antígeno, se encuentre todavía dentro de la zona lineal de la reacción. La velocidad de reacción determinada de esta manera es todavía relativamente inexacta.

Ésta se utiliza con el fin de establecer el tamaño ideal de la ventana de reacción de marcha principal (t_{Lin}) para esta concentración de un antígeno. El concepto "ideal" quiere decir aquí que aproximadamente la parte total de la reacción, que transcurre de un modo lineal, se aprovecha para el establecimiento de la velocidad de reacción. La Tabla demostrativa acerca de la asociación de la velocidad de reacción y del tamaño de la ventana de reacción de marcha principal se determina empíricamente, asimismo de un modo específico para el ensayo (Figura 2, Tabla 1).

2. Determinación de la máxima velocidad de reacción (V_{MaxLin}) a) Reconocimiento de un mínimo

Al comienzo de una cinética se puede llegar a una disminución del enturbiamiento antes de que comience la reacción propiamente dicha. De esta manera, en el caso de un gran valor de t_{Lin} (p.ej. 360 segundos), se determinaría una V_{MaxLin} falsa, demasiado baja. Esto impide el reconocimiento de un mínimo.

Para el establecimiento del momento de comienzo de la reacción, se utiliza una ventana muy corta de reacción. En el ejemplo de la Figura 3 y de la Tabla 1 ésta abarca un período de tiempo de 40 segundos. La ventana de reacción comienza en el momento 0 y se mueve adicionalmente hasta tanto que la pendiente sea negativa. Tan pronto como ésta alcanza el primer valor positivo, el primer punto de medición de la ventana de reacción es también el 1^{er} valor que se puede considerar en el cálculo de V_{MaxLin}.

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b) Búsqueda de V_{MaxLin}

Con la ventana de reacción de marcha principal (t_{Lin}), determinada en la marcha preliminar se busca a lo largo de toda la evolución la máxima velocidad de reacción. Si (t_{Lin}) es mayor que la duración real de la reacción, la velocidad es promediada a lo largo de toda la reacción (desde el mínimo hasta el final del tiempo de reacción).

Con la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin} así determinada, se establecen las curvas de referencia, y respectivamente con ayuda de la curva de referencia se calculan concentraciones.

Ejemplo 2 Procedimiento de V_{MaxLin} con evaluación de la integral en el ensayo de la ferritina

El Ejemplo usa los mismos pares de valores de medición de ferritina que el Ejemplo 1.

a) Reconocimiento de un mínimo

El reconocimiento de un mínimo se lleva a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 en el apartado 2a). En el caso de la muestra de baja concentración (Tabla 1) un mínimo se encuentra por lo tanto de nuevo en 38 segundos y en el caso de la muestra de alta concentración éste se encuentra en 0 segundos. Todos los puntos de medición antes del mínimo ya no se toman en consideración entonces.

b) Adaptación de un polinomio

A la curva situada detrás del mínimo se adapta un polinomio de 3^{er} grado y a partir de éste se forma la 1ª derivada (véase también la Figura 5). El máximo de la 1ª derivada está situado, en el caso de la muestra de baja concentración, en 153 segundos y, en el caso de las muestras de alta concentración, en 87 segundos.

c) Hallazgo de la zona de evaluación

Por debajo del máximo de la 1ª derivada se aumenta iterativamente un superficie integral, hasta que se haya alcanzado el valor límite, en este Ejemplo 100 (véase también la Figura 5). En este caso la superficie situada a la izquierda y a la derecha del momento del máximo de la 1ª derivada se aumenta por separado, hasta que se haya alcanzado la superficie nominal. De esta manera, se establece la ventana de tiempo de reacción. Si la superficie nominal no se alcanza en el lado derecho hasta el último punto de medición, se va hasta el último punto de medición de la zona derecha de evaluación. Si la superficie nominal no se alcanza en el lado izquierdo hasta llegar al mínimo, allí la ventana de tiempo de reacción va hasta el mínimo.

Para la baja concentración resulta la misma ventana de tiempo de reacción que en el caso del procedimiento de V_{MaxLin} con 2 etapas de evaluación de 38 - 360 segundos, para la alta concentración, la ventana de tiempo de reacción va de 0 a 196 segundos.

d) Determinación del valor en bruto

Mediante regresión lineal dentro de la ventana de tiempo de reacción se obtiene el valor en bruto. Éste, en el caso de la concentración baja, es de 0,123 bit/segundo, y en el caso de la concentración alta, es de 23,46 bit/segundo, frente a 23,64 bit/segundo en el Ejemplo 1.

Este valor o bien entra en una curva de referencia o es usado para la determinación de una concentración con una curva de referencia existente.

La ventaja elemental del procedimiento de V_{MaxLin} con respecto al estado de la técnica consiste en la ideal adaptación de la ventana de reacción a la respectiva cinética de reacción mediante el procedimiento en dos etapas o el procedimiento de la integral, que utiliza parámetros específicos para un ensayo, establecidos empíricamente. En caso necesario, éstos se pueden establecer incluso de una manera específica para cada carga.

Mediante la adaptación muy específica se garantiza que se haga uso para la evaluación en cada caso de un número máximo de puntos de medición. Esta ventaja se muestra especialmente cuando es grande la relación entre señal y ruido, tal como se da el caso en el caso de ensayos amplificados por látex en el BNII, y allí precisamente en el caso de bajas concentraciones del analito. En comparación con el método de tiempo fijo, que utiliza solamente la diferencia entre valores de comienzo y final, se muestra entonces una mejor precisión de las señales (Figura 6).

El método de la velocidad máxima está adaptado a unas cinéticas que en su evolución tienen una separación entre la fase de RETRASO, la máxima velocidad de reacción y la zona de saturación (patente de los EE.UU. US 4.157.871). En los casos de las evoluciones de las reacciones de los ensayos con látex en el BNII (p.ej. N látex ferritina) con frecuencia apenas son reconocibles la fase de RETRASO y la fase de saturación (Figuras 1a-1c). Al comienzo de la reacción se capta demasiado tarde el primer valor de medición y la frecuencia del registro del valor de medición es también demasiado pequeña como para registrar todavía la fase de RETRASO. La zona de saturación no se ha alcanzado todavía ni con mucho después de 6 minutos.

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Cuando las tres fases no están separadas con nitidez y adicionalmente la frecuencia del registro de los valores de medición es relativamente pequeña, existe el peligro de que los métodos de la velocidad máxima capten falsamente unas velocidades máximas demasiado altas. Especialmente en el caso de muestras de baja concentración, tal como p.ej. en las Figuras 1a-1c, la determinación de una velocidad máxima no es conveniente manifiestamente, puesto que la velocidad de reacción es constante a un bajo nivel. Esto lo muestra también la comparación de las precisiones con una pequeña ventana de reacción de 80 segundos, con la que todavía se captan velocidades máximas, y una ventana de reacción de 360 segundos (Figura 7).

Con el fin de valorar de una manera comparativa el nuevo procedimiento de evaluación, se hizo uso de una serie de criterios (Tabla 3). En todas las investigaciones se valoraron las mismas cinéticas en cada caso de acuerdo con el habitual procedimiento de tiempo fijo y de acuerdo con el nuevo procedimiento. En tal caso, para V_{MaxLin} el tiempo de ensayo se había acortado a 6 minutos, frente a 12 minutos con anterioridad, y se había ampliado la curva de referencia. En lugar de 5-350 \mug/l se estableció de esta manera un intervalo de medición de 2,5-700 \mug/l (dilución previa de la muestra 1:5, Figura 11).

Tabla 3

Propiedades de ensayo de ferritina en comparación con el procedimiento de evaluación en tiempo fijo y de V_{MaxLin}

En ambos procedimientos se utilizó en la curva de referencia la función LogitLog. Cada resultado constituye el valor medio de 10 mediciones. Otras explicaciones más se pueden tomar a partir del texto.

TABLA 3

	Tiempo fijo	V_{MaxLin}

Tiempo de ensayo	12 minutos	6 minutos

Límite inferior del intervalo de medición	5 \mug/l	2,5 \mug/l
Límite superior del intervalo de medición	350 \mug/l	700 \mug/l

Seguridad con exceso de antígeno hasta	25.000 \mug/l	50.000 \mug/l

Autenticidad de dilución de muestra
Hallazgo a 1:20 por 1:5

300-340 \mug/l	+16,0%	+6,6%
553-665 \mug/l	- *	+6,7%

* Fuera del intervalo de medición

Precisión intra ensayos

Patrón
1:2,5	1,8%	1,8%
1:5	2,8%	3,6%
1:10	4,9%	5,0%
1:20	2,8%	2,7%
1:40	2,4%	2,1%
1:80	4,0%	4,5%
1:160	4,8%	3,4%
1:320	14,8%	9,6%
1:640	31,9%	15,3%

Muestras
Valor medio (10)	4,7%	3,4%

Testigos
Alto (153 \mug/l)	2,9%	3,2%
Bajo (20,2 \mug/l)	6,1%	4,6%

TABLA 3 (continuación)

Precisión inter ensayos

Muestras
Valor medio (5)	2,0%	1,8%

Testigos
Alto (153 \mug/l)	4,0%	2,6%
Bajo (20,2 \mug/l)	4,6%	2,9%

Hallazgo de testigo

Alto (153 \mug/l)	+2,2%	+3,6%
Bajo (20,2 \mug/l)	+2,4%	+3,8%

\hskip1,7cm Correlación (50 muestras):	V_{maxLin} = 0,951* tiempo fijo -0,2785
	R^{2} = 0,999

La precisión es igual de buena tanto en la serie (intra ensayos) como también entre los días (inter ensayos) en el caso de concentraciones altas e intermedias de analito. En el caso de bajas concentraciones del analito, la precisión en el caso de V_{MaxLin} es manifiestamente mejor que en el procedimiento habitual (Tabla 3).

La autenticidad de dilución es manifiestamente mejor en el caso de V_{MaxLin} (Tabla 3, Figura 9). Especialmente en el caso de muestras, cuya concentración está situada en el extremo superior del intervalo de medición, una medición posterior con la dilución de muestra más alta en segundo lugar (1:20) conduce a unos valores que están situados más altos en promedio en un 16%. El mismo experimento con una concentración situada en un nivel doble de alto en la zona de medición ampliada, conduce con V_{MaxLin} a unas concentraciones más altas solamente en un 7%. También la Figura 9 muestra la autenticidad mejorada de dilución.

El hallazgo de testigo es similarmente bueno en el caso de ambos procedimientos de evaluación (Tabla 3). En tal caso hay que considerar que la determinación de valores nominales se efectuó con el procedimiento de tiempo fijo, por lo que un reajuste permite esperar aquí un hallazgo todavía mejor.

La correlación de los resultados de ambos procedimientos es muy buena (Figura 10).

La seguridad con un exceso de antígeno se presenta en el caso de tiempo fijo hasta aproximadamente 25.000 g/l y en el caso de V_{MaxLin} hasta aproximadamente 50.000 g/l (Figura 11).

Como otro ejemplo adicional puede servir el ensayo para PSA (de Prostata spezifisches Antigen = antígeno específico de la próstata). Tal como puede observarse a partir de la Figura 8, por medio del procedimiento de V_{MaxLin} pueden establecerse curvas de referencia igual de buenas, que prometen una ampliación hacia arriba de la zona de medición. En tal caso, el tiempo de medición con V_{MaxLin} es solamente de 6 minutos, frente a 18 minutos con el método del tiempo fijo.

En la Tabla 4 se contrastan la precisión intra ensayo (VK,%) de mediciones décuples (en 10 veces) del patrón con evaluación en tiempo fijo, con integral y en 2 etapas en diferentes ensayos amplificados por látex.

Las dos variantes del procedimiento de V_{MaxLin} son casi equivalentes y en el caso de bajas concentraciones proporcionan unas precisiones manifiestamente mejores que el método de tiempo fijo.

TABLA 4

Para el método de la integral se utiliza una superficie nominal de 100
n.d.	-	el valor no se determinó
*	-	valor medio sin nivel cero.

Tiempos de medición:
\hskip0,3cm FRT 6 minutos (integral y 2 etapas) y 12 minutos (tiempo fijo)
\hskip0,3cm PSA 12 minutos (integral y 2 etapas) y 18 minutos (tiempo fijo)
\hskip0,3cm BR 9 minutos (integral y 2 etapas) y 12 minutos (tiempo fijo)
\hskip0,3cm RF 6 minutos (integral y 2 etapas) y 6 minutos (tiempo fijo)

1

Ejemplo 3

(Figura 12)

Procedimiento de V_{MaxLin} con evaluación de la integral en un ensayo de aPTT

La evaluación se efectúa en el ensayo original de Behring determinando el momento en el que se sobrepasa un determinado umbral de la absorción de luz (valoración de la absorbencia fija). Se pudo mostrar que, de igual manera, se puede utilizar también el procedimiento de V_{MaxLin} con una evaluación de la integral. La diferencia de señales entre el patrón y el patrón diluido a 1:3 (125,7 mE/segundo frente a 28,2 mE/segundo) es más alta que en el caso de la evaluación de la absorbencia fija (33,9 segundos, frente a 81,4 segundos). Es ventajoso el hecho de que en el caso de la evaluación de V_{MaxLin} no se tiene que sobrepasar ningún umbral (sistema: BCS, reactivo de Behring OQGS, número de ensayo de Behring: 28, superficie nominal: 10, grado del polinomio: 5, zona de evaluación: 30-100 segundos (patrón sin diluir), 70-150 segundos (patrón a 1:3), Figura 12).

Para la evaluación de V_{MaxLin} de ensayos con una larga fase de retraso, se debe mantener variable el momento del comienzo de la evaluación. Para esto se busca un algoritmo análogo a la búsqueda del mínimo después de una pendiente límite positiva, cuyo valor debe ser definible y depende del sistema de ensayo. Si se alcanza la pendiente límite, el comienzo de la ventana de tiempo de búsqueda proporciona el punto de tiempo de comienzo para la evaluación de V_{MaxLin}.

Ejemplo 4

(Figura 12)

Procedimiento de V_{MaxLin} con evaluación de la integral en el caso de un ensayo de ATIII

También el ensayo de ATIII, en el que un substrato cromógeno es convertido por la trombina no inhibida por ATIII, se puede evaluar mediante la V_{MaxLin} (sistema: BCS, reactivo de Behring OWWR, número de ensayo de Behring: 28, zona de evaluación: 0-45 segundos, superficie nominal: 1, grado del polinomio: 5). En el caso de una medición décuple resultan unas precisiones casi igual de buenas en comparación con la evaluación habitual (pendiente de 15-45 segundos).

Ejemplo 5

(Figura 12)

Procedimiento de V_{MaxLin} con evaluación de la integral en el caso de un ensayo de agregación de plaquetas

En el caso de la agregación de plaquetas sanguíneas se pueden establecer muy diferentes cinéticas de reacción. En el curso de la agregación aumenta la transmisión de luz del plasma. En el Ejemplo de la Figura 12 se muestran las evoluciones de la agregación de células en una muestra a las 2 horas y las 10 horas después de una toma de sangre. En el caso de ambas evoluciones, la V_{MaxLin} encuentra muy bien el tramo lineal con una evaluación de la integral y determina una velocidad de agregación de 22,4 para la muestra recientemente obtenida y de 14,5 para la muestra antigua (sistema: BCT, tanda: 50 \mul de ADP (1,25 \mum) de Sigma, St. Louis, EE.UU., mezclados con 150 \mul de un plasma rico en plaquetas, intervalo de evaluación: 7-80 segundos, superficie nominal: 5, grado del polinomio: 5).

Ejemplo 6

(Figura 13)

Procedimiento de V_{MaxLin} con evaluación de la integral en el caso del ensayo de Von-Willebrand

El ensayo de Von-Willebrand de Behring determina la agregación de plaquetas, dependiente del factor de Von-Willebrand, con un reactivo, que contiene plaquetas fijadas y ristocetina. La evaluación se efectúa, en el caso del ensayo original de Behring, determinando el momento en el que se pasa por debajo de un determinado umbral (100 mE) de la absorción de luz (evaluación de la absorbencia fija). Los puntos de las curvas de referencia se pueden determinar, en el caso de la evaluación habitual de la absorbencia fija, solamente hasta una concentración de 20% del cofactor ristocetina (dilución patrón de plasma humano), puesto que debajo de ella ya no se puede pasar por debajo del umbral por causa de la reacción débil, y por consiguiente ya no se puede determinar incluso ningún resultado. Por el contrario, la V_{MaxLin} con evaluación de la integral hace posible, en el caso de las mismas mediciones, una curva de referencia hasta aproximadamente 5% (sistema: BCT, reactivo de Behring OUBD, número de ensayo de Behring 390, intervalo de evaluación: 7-80 segundos, superficie nominal: 5, grado de polinomio: 5).

Claims

1. Procedimiento para la determinación instrumental de la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin} a partir de una magnitud de medición L(t) que se modifica con la reacción en función del tiempo, realizándose que la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin} se determina mediante una ventana de tiempo de reacción de marcha principal en un tramo de reacción con la óptima linealidad, caracterizado porque

i): primeramente, mediante una ventana de tiempo de reacción de marcha preliminar, determinada previamente, que es específica para el ensayo, se determina la máxima velocidad de reacción provisional V_{MaxPre}, luego

ii): mediante una dependencia determinada previamente entre la ventana de tiempo de reacción óptima y la velocidad de reacción máxima V_{MaxPre} preliminar, que es específica para el ensayo, se determina la ventana de tiempo de reacción de marcha principal, y luego

iii): con ayuda de la ventana de tiempo de reacción de marcha principal se deduce la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin}.

2. Procedimiento para la determinación instrumental de la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin} a partir de una magnitud de medición L(t) que se modifica con la reacción en función del tiempo, realizándose que la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin} se determina mediante una ventana de tiempo de reacción t_{Lin} en un tramo de reacción con la óptima linealidad, caracterizado porque

i): a la función L(t) se adapta un polinomio,

ii): se forma la 1ª derivada del polinomio encontrado,

iii): por debajo de la 1ª derivada se adapta una superficie específica para el ensayo, realizándose que los puntos de contacto de la delimitación inferior de la superficie con la 1ª derivada del polinomio marcan los valores límites superior e inferior de la ventana óptima de tiempo de reacción, y

iv): para la ventana óptima de tiempo de reacción se deduce la velocidad máxima de reacción V_{MaxLin}.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2, realizándose que la máxima velocidad de reacción V_{MaxLin} se determina mediante una ventana de tiempo de reacción, que adicionalmente es óptima para la precisión y la exactitud.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, realizándose que la reacción de una muestra con reactivos conduce a una modificación dependiente del tiempo de la magnitud de medición L(t).

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el analito en la muestra y el reactivo son partícipes de un par específico de fijación.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el analito en la muestra y el reactivo son un antígeno y un anticuerpo.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la magnitud de medición es el enturbiamiento.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la magnitud de medición es la dispersión de la luz

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 8, en la que el analito en la muestra es una proteína plasmática.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 8, en la que el analito en la muestra es un hapteno.

11. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10 en un procedimiento de la analítica de coagulación.