ES2263671T3

ES2263671T3 - Sensor optico para la medida in situ de analitos.

Info

Publication number: ES2263671T3
Application number: ES01982427T
Authority: ES
Inventors: Bo Petersson; Anders Weber
Original assignee: Precisense AS
Current assignee: Precisense AS
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2021-10-12
Also published as: DE60119556T2; NZ525567A; ATE325575T1; GB0025147D0; US6671527B2; JP2004510527A; AU2002214016B2; AU1401602A; EP1324691A1; CY1105129T1; NO20031685L; WO2002030275A1; PT1324691E; NO20031685D0; CA2425337A1; US20020058863A1; JP3873023B2; CA2425337C; DK1324691T3; NO334509B1

Abstract

Un aparato de análisis por implantación, que comprende un sensor para la medición in vivo de un analito y medios para implantar dicho sensor dentro de una capa superior de la piel, de la cual se expulsa naturalmente con el tiempo por el crecimiento de la piel y la renovación progresiva de la capa externa de la piel, en el que dichos medios de implantación comprenden al menos una aguja de inyección que tiene una longitud penetrable en la piel de no más de 200 ìm.

Description

Sensor óptico para la medida in situ de analitos.

La presente invención se refiere a un sensor destinado a usarse en la medición o control de analitos en el fluido cutáneo usando técnicas ópticas y a un sistema de control de analitos que usa este sensor. El sensor es adecuado en particular para usarse en situaciones en las que deben monitorizarse con precisión los niveles de analito, por ejemplo con fármacos que deben mantenerse dentro de un estrecho margen terapéutico o cuando deben realizarse mediciones del analito repetidamente, tal como en el tratamiento de la diabetes.

En el tratamiento de la diabetes es esencial la medición regular de la glucosa de la sangre para asegurarse de que la dosificación de insulina es correcta. Además, se ha demostrado que, en el tratamiento a largo plazo del paciente diabético, mejorando el control de los niveles de glucosa en sangre se puede retrasar, si no evitar, la aparición de retinopatía, problemas circulatorios y otras enfermedades degenerativas asociadas frecuentemente con la diabetes. Por lo tanto, es necesario que los pacientes diabéticos puedan monitorizar sus niveles de glucosa en sangre de manera fiable y segura.

Actualmente los pacientes diabéticos monitorizan su nivel de glucosa en sangre utilizando tiras colorimétricas de análisis o biosensores electroquímicos (por ejemplo, electrodos que incorporan una enzima), disponibles comercialmente, que requieren el uso regular de un instrumento, de tipo lanceta, para extraer una cantidad adecuada de sangre cada vez que se hace una medición. La mayoría de los pacientes diabéticos usa tales instrumentos dos veces al día, por término medio, para hacer una medición de la glucosa en sangre. No obstante, el Instituto Nacional de Sanidad de los Estados Unidos ha recomendado recientemente que la verificación de la glucosa en sangre debiera efectuarse al menos cuatro veces al día, recomendación que ha refrendado la Asociación Norteamericana de la Diabetes. Este aumento de la frecuencia de verificación de la glucosa en sangre supone una carga considerable para el paciente diabético, tanto en términos financieros como en términos de dolores y molestias, particularmente en el diabético a largo plazo que debe hacer uso regular de una lanceta para sacarse sangre de las yemas de los dedos. Por tanto, resulta evidente la necesidad de disponer de un mejor sistema de control a largo plazo de la glucosa, que no implique sacar sangre del paciente.

Ha habido varias propuestas recientes sobre técnicas de medición de la glucosa que no requieren que se extraiga sangre del paciente. Se han realizado diversos intentos de construir dispositivos en los que se coloca un biosensor enzimático de electrodo en el extremo de una aguja, o de un catéter, que se inserta dentro de un vaso sanguíneo (Wilkins E. and Atanasov P., Med. Eng. Phys. (1996) 18: 273-288). Aunque el propio dispositivo sensor se sitúa dentro de un vaso sanguíneo, la aguja o el catéter mantienen una conexión con el medio ambiente externo. En la práctica, tales dispositivos no son adecuados para su uso en pacientes, en primer lugar porque la inserción de una aguja o un catéter en el interior de un vaso sanguíneo implica un riesgo de infección y además porque es incómodo para el paciente y por lo tanto no es adecuado para un uso continuo. En segundo lugar, los dispositivos de este tipo no han conseguido la aprobación de uso en los pacientes porque se ha sugerido que el propio dispositivo, situado en el extremo de una aguja o un catéter, puede ser el responsable de la formación de trombosis en el sistema circulatorio del paciente. Es obvio que esto supone un riesgo muy grave para la salud del paciente.

Mansouri and Schultz (Biotechnology 1984), Meadows and Schultz (Anal. Chim. Acta (1993) 280: pp. 21-30) y la patente norteamericana n.º 4.344.438 describen dispositivos destinados a la supervisión in situ por medios ópticos de compuestos de bajo peso molecular existentes en la sangre. Estos dispositivos están diseñados de modo que se inserten en el interior de un vaso sanguíneo o se coloquen subcutáneamente, pero requieren una conexión de fibra óptica con una fuente luminosa externa y un detector externo. De nuevo, la colocación de estos dispositivos en un vaso sanguíneo supone el riesgo asociado de fomentar la trombosis y, además, en una realización es impracticable su uso a largo plazo e implica un riesgo de infección por la necesidad de mantener una conexión de fibra óptica con el medio ambiente externo.

En la búsqueda de una técnica menos traumática de control de la glucosa, también se ha concentrado parte de la atención en el uso de la espectroscopia por rayos infrarrojos, para medir directamente en los vasos sanguíneos la concentración de glucosa en sangre, en tejidos tales como el lóbulo de la oreja o la yema del dedo, que son relativamente "transparentes a la luz" y tienen vasos sanguíneos situados cerca de la superficie de la piel (Jaremko J. and Rorstad O., Diabetes Care 1998 21: 444-450, y Fogt E.J., Clin. Chem. (1990) 36, 1573-80). Obviamente este procedimiento es mínimamente traumático, pero se ha demostrado que tiene poco valor práctico por el hecho de que el espectro infrarrojo de la glucosa en sangre es tan similar al del tejido circundante que, en términos prácticos, es casi imposible separar los dos espectros.

Se ha observado que la concentración de analitos en el fluido subcutáneo está en correlación con la concentración de dichos analitos en la sangre, en consecuencia ha habido varios informes acerca del uso de dispositivos de control de la glucosa que se colocan en una posición subcutánea. En particular, Atanasov et al. (Med. Eng. Phys. (1996) 18: pp. 632-640) describen el uso de un dispositivo implantable sensor de glucosa (dimensiones 5,0 x 7,0 x 1,5 cm) para monitorizar la glucosa existente en el fluido subcutáneo de un perro. El dispositivo consiste en un sensor amperométrico de glucosa, un potenciostato en miniatura, un transmisor de señales de FM y una fuente de energía, y puede ser interrogado de modo remoto, mediante una antena y un receptor conectados a un sistema de adquisición de datos basado en ordenador, sin necesidad de conexión con el medio ambiente externo. No obstante, las grandes dimensiones de este dispositivo lo hacen obviamente impracticable para su uso en un paciente.

Ryan J. Russell et al., Analytical Chemistry, Vol. 71, Number 15, 3126-3132, describen un hidrogel implantable basado en polietilenglicol que contiene dextrano isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate dextran - dextrano-FITC) y concavalina A isotiocianato de tetrametilrodamina (tetramethylrhodamine isothiocyanate concavalin A) conjugados químicamente en la red del hidrogel para su implantación dérmica. Las esferas del hidrogel implantado son interrogadas de modo transdérmico.

R. Ballerstadt et al., Analytica Chemica Acta, 345 (1997), 203-212, describen un sistema de análisis en el que dos moléculas de polímero (dextrano) se marcan con un primer y un segundo fluoróforos, respectivamente, y se enlazan entre sí mediante moléculas multivalentes de lectina, produciendo la extinción. La glucosa satura los sitios de enlace de la lectina, provocando la disociación de los dos polímeros y proporcionando un aumento de fluorescencia.

Joseph R. Lakowicz et al., Analytica Chimica Acta, 271 (1993), 155-164, describen el uso de fluorimetría por modulación de fase. Esto sustituye las mediciones de fluorescencia basadas en la intensidad, enseñadas en la técnica descrita anteriormente, por mediciones de fluorescencia basadas en el tiempo de vida.

El tiempo de vida de la fluorescencia puede medirse con una técnica de modulación de fase, excitando la fluorescencia usando luz que esté modulada en intensidad de 1 a 200 MHz y midiendo el desplazamiento de fase de la emisión respecto a la luz incidente y la modulación de la emisión.

En la patente WO91/09312 se describe un método y dispositivo subcutáneo que emplea un análisis de afinidad de la glucosa que se interroga de modo remoto por medios ópticos. En la patente WO97/19188 se describe un ejemplo más de un sistema implantable de análisis de glucosa que produce una señal óptica que puede leerse de modo remoto. Los dispositivos descritos en las patentes WO91/09312 y WO97/19188 permanecerán en el cuerpo durante períodos prolongados de tiempo después de que la muestra química del análisis haya dejado de funcionar correctamente, lo cual constituye el principal inconveniente para su aplicación habitual. La extracción de los dispositivos requerirá un proceso quirúrgico.

La patente WO00/02048 trata este problema usando un material biodegradable que contiene los reactivos del análisis. No obstante, esto requiere un diseño meticuloso de los sistemas biodegradables de confinamiento a fin de conseguir resultados óptimos.

La patente WO98/55869 describe un método basado en la fluorescencia para la medición cutánea de la glucosa. Los reactivos, contenidos en un soporte material, pueden colocarse en el interior, encima o debajo de la piel, o dentro de un órgano o de un vaso.

Ballerstadt Ralph et al., Analytical Chemistry, Vol. 72, n.º 17, páginas 4185-4192 (2000), describen un sensor de fibra hueca basado en la fluorescencia (diámetro 0,5 mm; longitud 0,5 cm) para la supervisión continua de la glucosa de modo transdérmico. Se requiere que el sensor se coloque dentro de los 0,5 mm de la superficie de la piel para que la luz pueda penetrar fácilmente.

De todo ello se sigue la necesidad evidente de técnicas sensibles y precisas del control de la glucosa en sangre, que no requieran la extracción regular de sangre del paciente, que no supongan un riesgo de infección, ni acarreen molestias, y que no adolezcan de los inconvenientes prácticos de los dispositivos implantables descritos anteriormente.

En consecuencia, en un primer aspecto la presente invención proporciona un aparato de análisis por implantación según se define en la reivindicación 1, que comprende un sensor para la medición in vivo de un analito y medios para implantar dicho sensor dentro de una capa superior de la piel, de la cual se expulsa naturalmente con el tiempo por el crecimiento de la piel y la renovación progresiva de la capa externa de la piel.

Según la invención, el sensor se inyecta de modo que quede situado en el espesor de la piel, suficientemente cerca de la superficie, para que tras un período de tiempo el sensor se aproxime a la superficie y eventualmente se desprenda. La piel comprende varias capas distintas. El estrato córneo es una capa de células muertas cuyo espesor es de 10 a 25 \mum aproximadamente. Debajo de ella está la epidermis. Las células de la parte superior de la epidermis mueren progresivamente y forman la base del estrato córneo. En la parte inferior de la epidermis se añaden nuevas células. Las células superiores del estrato córneo se erosionan continuamente. Por consiguiente, una partícula implantada en la epidermis ascenderá gradualmente a través del espesor de la epidermis (igual que sus células epidérmicas vecinas) hasta llegar al estrato córneo y eventualmente se caerá. Por otra parte, las partículas inyectadas en la dermis, a través de la epidermis, quedarán retenidas permanentemente, como en un tatuaje convencional. En la presente invención, la implantación del sensor completamente dentro de la epidermis, evitará que permanezca en el cuerpo el material sensor agotado. El espesor de la epidermis varía a lo largo del cuerpo. Puede ser de sólo 50 \mum, en los párpados, y llegar a 800 \mum en las palmas de las manos o en las plantas de los pies.

Los medios de implantación pueden adaptarse de modo que implanten el sensor a una profundidad menor de
200 \mum, más preferentemente no mayor de 100 \mum, aún más preferentemente no mayor de 50 \mum.

Las partículas pueden inyectarse en la epidermis mediante el uso de una aguja hipodérmica corta, por ejemplo una aguja que tenga una longitud apropiada para la acción de implante a las profundidades indicadas arriba.

Con esta finalidad puede emplearse, preferentemente, una matriz de microagujas según se describe en la patente WO-A-99/64580. Tales matrices pueden micromecanizarse de silicio mediante un proceso de ataque químico, tal como un ataque químico iónico reactivo, de modo que se produzca, por ejemplo, una matriz de 10 nm cuadrados con 400 agujas de 1 \mum de diámetro. Estas agujas pueden cargarse en su exterior con las partículas o los materiales sensores requeridos o pueden dotarse de orificios individuales para el paso interior de una suspensión de las partículas sensoras o de los materiales sensores. En lugar de orificios pasantes convencionales, las microagujas pueden tener la propiedad de porosidad que permita la inyección a su través de materiales sensores.

En la presente invención puede usarse cualquiera de estos sistemas conocidos de inyección cutánea, combinado con las partículas sensoras.

El sensor de la invención incorpora medios de análisis para detectar un analito o para medir la cantidad de un analito, siendo la lectura de salida del análisis una señal óptica. Dado que el sensor está situado dentro de la piel, una señal óptica generada en el sensor puede detectarse de modo transcutáneo (es decir, a través de la capa o capas superiores de la piel), lo cual hace innecesaria cualquier conexión directa entre el sensor y el medio ambiente externo. Una vez que el sensor está en su lugar, en una posición cutánea, pueden tomarse las mediciones del analito con la frecuencia que sea necesario, sin ningún efecto adverso. Esto representa una ventaja particular respecto al tratamiento a largo plazo de los pacientes diabéticos, porque si las mediciones de glucosa se toman más frecuentemente puede mantenerse un control más preciso del nivel de glucosa existente en la sangre y se reducirá el riego de desarrollar condiciones relacionadas con una cantidad de glucosa en sangre mal regulada, tal como retinopatía, artritis y mala circulación.

Dado que el sensor de la invención no contiene en sí ninguno de los componentes ópticos requeridos para emitir los impulsos de la lectura de salida del análisis (disponiéndose estos componentes separadamente y estando situados fuera del cuerpo), el sensor puede adoptar perfectamente una forma que sea inyectable, con molestias mínimas para el paciente. En una realización preferida los componentes del análisis se incorporan en un material matricial que es permeable al fluido cutáneo, permitiendo de este modo que los analitos, tales como la glucosa, penetren por difusión en el sensor e interactúen con los componentes del análisis. El material matricial puede ser una formulación inyectable que forme un gel en el punto de inyección del interior de la piel del paciente. Alternativamente, el sensor puede formarse a partir de un material matricial polimérico sólido que incorpore los componentes del análisis, que se inyecte a su vez de modo cutáneo, teniendo el material polimérico típicamente un tamaño adecuado para su inyección a través de una aguja de calibre fino para minimizar las molestias del paciente. Cuando está colocado de modo epidérmico, el material polimérico sólido absorbe agua y se dilata hasta formar un gel, hidratándose de este modo los componentes del análisis.

El dispositivo de la presente invención puede ser biodegradable o hidrolizable in vivo, pero esto no es necesario porque los procesos naturales de crecimiento y renovación de la piel se lo llevarán con la muda de la epidermis en la que el sensor esté implantado, cayéndose con ella eventualmente. Una vez que el sensor haya dejado de ser funcionalmente eficaz para la supervisión de analitos, simplemente puede inyectarse o implantarse un sensor nuevo y no hay necesidad de que el sensor usado sea extraído quirúrgicamente.

Los materiales adecuados para la construcción de un sensor de esta clase incluyen copolímeros de bloque biodegradables, tales como los descritos por Jeong et al., Nature 388: pp. 860-862. Las soluciones acuosas de estos materiales son termosensibles, presentando transiciones reversibles gel-sol dependientes de la temperatura. El material de polímero puede cargarse, con los componentes del análisis, a una temperatura elevada en la que el material forme un sol. En esta forma el material es inyectable y tras una inyección cutánea y el posterior enfriamiento rápido, debido a la temperatura corporal, el material forma una matriz de gel. Los componentes del análisis quedan suspendidos dentro de esta matriz de gel, constituyéndose de este modo un sensor adecuado para detectar o medir analitos existentes en el fluido cutáneo. Los analitos de bajo peso molecular, tales como la glucosa, pueden difundirse libremente hacia el interior de la matriz de gel desde el fluido cutáneo circundante. La inyección cutánea del material en fase sol no provoca dolor significativo, ni deterioro del tejido.

Como alternativa al sensor basado en gel descrito anteriormente, el sensor puede construirse a partir de un material matricial biodegradable, polimérico, sólido o similar a un gel, dentro del cual sean distribuidos los componentes del análisis. Cuando se inyecta o implanta cutáneamente, este sensor polimérico sólido se hidrata y se esponja y el analito penetra a través de su estructura para encontrarse con los componentes del análisis.

Tanto los sensores poliméricos sólidos, como los sensores de cámara hueca, pueden introducirse en un lugar cutáneo por inyección, como se describe más abajo.

Los materiales biodegradables adecuados para usarse en la construcción de los sensores poliméricos, sólidos y de cámara hueca, incluyen proteínas reticuladas, tales como la albúmina humana, geles de fibrina, polisacáridos tales como almidón o agarosa, polímero poli(D,L-láctico) y polímero poli(D,L-glicólico), polianhídridos, mezclas de colesterol/ácido graso que formen derivados semisólidos, hialuronatos y cristales líquidos de monoleína y agua. Asimismo pueden usarse materiales no biodegradables.

En otra realización más, el sensor puede estar formado por una suspensión de micropartículas de un diámetro preferido menor de 100 \mum, más preferentemente de 10 a 100 \mum, por ejemplo de 10 a 50 \mum. No obstante, las partículas pueden ser menores de 10 \mum. Cada una de las partículas puede contener los componentes del análisis, ya sea encapsulados dentro de una micropartícula hueca, ya sea dispersados dentro del material de una micropartícula sólida. Una suspensión de micropartículas de esta clase se inyecta cutáneamente con facilidad. Opcionalmente las micropartículas se forman a partir de un material que sea biodegradable o hidrolizable in vivo. Alternativamente pueden usarse liposomas que contengan los componentes del análisis. Se ha demostrado que las liposomas de diámetro comprendido entre 0,3 y 2,0 \mum permanecen en el lugar de inyección (Jackson A.J., Drug Metab. Dispos. 1981 9, 535-540), por lo que serían adecuadas para usarse en el sensor. En una realización adicional el sensor comprende una pluralidad de eritrocitos vacíos que han sido cargados con los componentes del análisis y después se inyectan epidérmicamente. Los eritrocitos vacíos, conocidos también como eritrocitos fantasmas, pueden prepararse exponiendo eritrocitos intactos en una solución hipotónica, de modo que se esponjen y revienten para que suelten su contenido citoplasmático. Los eritrocitos vacíos pueden cargarse después con los componentes del análisis, antes de dejar que vuelvan a cerrarse las membranas plasmáticas.

En las realizaciones preferidas del sensor (es decir de gel, polímero sólido, micropartículas huecas o sólidas) es ventajoso que los componentes del análisis experimenten una difusión restringida a fin de minimizar su pérdida o desaparición del sensor. Esto puede conseguirse asegurándose de que el gel, o el material de confinamiento, tenga un tamaño de poro que permita la difusión de analitos de bajo peso molecular, pero no la de los propios componentes del análisis. Éstos se perderían sólo a medida que el material o gel se degradase con el tiempo. Los componentes del análisis preferentemente son de elevado peso molecular, tal como proteínas o polímeros, con objeto de restringir su desaparición del sensor.

Los análisis adecuados para usarse en el sensor incluyen reacciones, tales como hidrólisis y oxidación, que tengan como resultado un cambio óptico detectable, es decir, una excitación o una extinción de fluorescencia, que pueda observarse transcutáneamente. Un análisis preferido para usarse en el sensor de la invención es un análisis de enlace, cuya lectura de salida es una señal óptica detectable o medible que puede ser interrogada transcutáneamente usando medios ópticos. El análisis de enlace que genera la señal óptica preferentemente debería ser reversible, de modo que pueda efectuarse una supervisión continua de los niveles fluctuantes del analito. Esta reversibilidad es una ventaja particular del uso de una configuración del análisis de enlace en la que los componentes del análisis no se consumen. Los análisis de enlace también son preferidos para usarse en el sensor de la invención por razones de seguridad, dado que no pueden generar ningún producto indeseado como los que pueden generarse con reacciones enzimáticas o electroquímicas.

Las configuraciones preferidas de los análisis de enlace para usarse en el sensor de la invención incluyen un análisis de enlace competitivo, reversible, limitadamente reactivo, cuyos componentes incluyen un analito análogo y un agente de enlace de los analitos que puede enlazarse de modo reversible tanto al analito de interés como al analito análogo. El analito de interés y el analito análogo compiten para enlazarse al mismo sitio de enlace del agente de enlace de los analitos. Tales configuraciones de los análisis de enlace competitivo son muy conocidas en la técnica de diagnósticos clínicos y están descritas, a modo de ejemplo, en el Manual de Inmunoanálisis: The Immunoassay Handbook, ed. David Wild, Macmillan Press 1994. Los agentes adecuados de enlace de los analitos para usarse en el análisis incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que conserven un sitio de enlace de los analitos (por ejemplo, fragmentos Fab - fragments antigen-binding o fragmentos con enlace de antígeno), lectinas (por ejemplo concanavalina A), receptores hormonales, receptores de fármacos, aptómeros y polímeros marcados molecularmente. Preferentemente, el analito análogo debería ser una sustancia de mayor peso molecular que el del analito para que no pueda difundirse libremente hacia el exterior del sensor. Por ejemplo, un análisis de glucosa podría emplear como analito análogo un polímero de glucosa de elevado peso molecular, tal como dextrano.

Las señales ópticas adecuadas que pueden usarse como lectura de salida del análisis, según la invención, incluyen cualquier señal óptica que pueda generarse por medio de un análisis de proximidad, tales como las generadas mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, polarización por fluorescencia, extinción de fluorescencia, técnica de fosforescencia, excitación de luminiscencia, extinción de luminiscencia, resonancia de difracción o de plasmón, todas las cuales son conocidas per se en la técnica.

La realización más preferida del sensor de la invención incorpora un análisis de enlace competitivo, limitadamente reactivo, que genera una lectura óptica usando la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. En esta configuración del análisis el analito análogo se marca con un primer cromóforo y el agente de enlace de los analitos se marca con un segundo cromóforo. Uno de los cromóforos primero y segundo actúa como cromóforo donante y el otro actúa como cromóforo aceptor. Una característica esencial del análisis es que el espectro de emisión de fluorescencia del cromóforo donante se solapa con el espectro de absorción del cromóforo aceptor, de modo que cuando el agente de enlace hace que los cromóforos donante y aceptor se sitúen muy próximos, una porción de la energía que normalmente produciría fluorescencia emitida por el cromóforo donante (después de la irradiación con radiación incidente de una longitud de onda absorbida por el cromóforo donante) no será transferida por radiación al cromóforo aceptor adyacente, cuyo proceso es conocido en la técnica como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, con el resultado de que se extingue una porción de la señal fluorescente emitida por el cromóforo donante y, en algunos casos, de que el cromóforo aceptor emite fluorescencia. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia sólo tendrá lugar cuando los cromóforos donante y aceptor estén situados muy próximos por el enlace del analito análogo al agente de enlace de los analitos. Por consiguiente, en presencia de analito, que compite con el analito análogo para enlazarse al agente de enlace de los analitos, se reduce la magnitud de la extinción (produciéndose un aumento medible de la intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo donante o un descenso en la intensidad de la señal emitida por el cromóforo aceptor) puesto que el analito análogo marcado es desplazado del enlace al agente de enlace de los analitos. Por lo tanto, la intensidad o el tiempo de vida de la señal fluorescente emitida por el cromóforo donante está en correlación con la concentración de analito existente en el fluido subcutáneo que baña el sensor.

Una característica ventajosa adicional de la configuración del análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia reside en el hecho de que cualquier señal fluorescente emitida por el cromóforo aceptor, después de su excitación con un haz de radiación incidente con longitud de onda dentro del espectro de absorción del cromóforo aceptor, no resulta afectada por el proceso de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Por lo tanto, es posible usar la intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo aceptor como señal de referencia interna, por ejemplo en la calibración continua del sensor o para monitorizar el grado de degradación del sensor e indicar en consecuencia la necesidad de implantar o inyectar un sensor nuevo. A medida que se degrade el sensor, disminuirá la cantidad de cromóforo aceptor presente en el sensor y, por tanto, también disminuirá la intensidad de la señal fluorescente detectada tras la excitación del cromóforo aceptor. El descenso de esta señal por debajo de un nivel aceptable de referencia indicaría la necesidad de implantar o inyectar un sensor nuevo. Los análisis de enlace competitivo que usan la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, y que pueden adaptarse para usarlos en el sensor de la invención, son conocidos en la técnica. La patente norteamericana n.º 3.996.345 describe inmunoanálisis que emplean anticuerpos y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre un par cromofórico excitador-extintor de fluorescencia. Meadows and Schultz (Anal. Chim. Acta, 1993 280: pp. 21-30) describen un método de análisis homogéneo para la medición de glucosa basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre una glucosa análoga marcada (dextrano marcado con FITC) y un agente de enlace de la glucosa marcado (concavalina A marcada con rodamina). En todas estas configuraciones, los cromóforos/extintores donante y aceptor pueden enlazarse al agente de enlace o al analito análogo.

Pueden usarse los diversos procesos químicos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET - fluorescence resonance energy transfer) descritos en los antecedentes de la técnica citados en la introducción de este documento.

Pueden hacerse mediciones del tiempo de vida de la fluorescencia o de la intensidad de la fluorescencia. Como describen Lakowitz et al., el tiempo de vida de la fluorescencia puede medirse con técnicas de modulación de fase.

Una alternativa a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia es la técnica de extinción de fluorescencia. En este caso se usa un compuesto con capacidad de extinción de la fluorescencia, en lugar del cromóforo aceptor específico, y la señal óptica de un análisis de enlace competitivo aumentará con el aumento del analito. Un ejemplo de un extintor de fluorescencia, potente e inespecífico, lo proporciona Tyagi et al., Nature Biotechnology (1998) 18: p. 49.

El sensor de la invención puede adaptarse para la detección o la medición cuantitativa de cualquier analito que esté presente en el fluido subcutáneo. Los analitos preferidos incluyen glucosa (en relación con la supervisión a largo plazo de diabéticos), urea (en relación con la enfermedad o disfunción del riñón), lactato (en relación con la evaluación del rendimiento muscular en la medicina deportiva), iones tales como sodio, calcio o potasio, y fármacos terapéuticos cuya concentración en sangre deba monitorizarse con precisión, tales como, por ejemplo, digoxina, teofilina o fármacos inmunosupresores. Los analitos anteriores se enumeran sólo a modo de ejemplo y ha de entenderse que la naturaleza precisa del analito a medir no es objeto de la invención.

El sensor es interrogado transcutáneamente usando medios ópticos, es decir, no se requiere ninguna conexión física entre el sensor y los medios ópticos. Cuando el sensor incorpora un análisis de enlace competitivo, limitadamente reactivo, empleando la técnica de transferencia de energía fluorescente, los medios ópticos deberían suministrar un primer haz de radiación incidente con una longitud de onda dentro del espectro de absorción del cromóforo donante y preferentemente un segundo haz de radiación incidente con una longitud de onda dentro del espectro de adsorción del cromóforo aceptor. Además, los medios ópticos deberían poder medir señales ópticas generadas en el sensor con dos longitudes de onda diferentes; la longitud de onda 1 dentro del espectro de emisión del cromóforo donante (la señal generada en relación con la medición del analito) y la longitud de onda 2 en el espectro de emisión del cromóforo aceptor (que podría ser la señal del analito o la señal de referencia interna o calibración).

Los medios ópticos adecuados para usarse en la interrogación remota del dispositivo de la invención incluyen un fluorímetro simple de gran capacidad, que comprende una fuente luminosa de excitación, tal como, por ejemplo, un diodo electroluminiscente (azul, verde o rojo > 1000 mCa), un filtro luminoso de excitación (filtro dicroico o de color) y un detector de luz fluorescente (configuración de diodo PIN). Un fluorímetro con estas características puede presentar una sensibilidad de picomolar a femtomolar respecto a la concentración del fluoróforo.

En la figura 1 aneja y en los Ejemplos incluidos en la presente memoria se muestra y describe, respectivamente, la disposición de un fluorímetro adecuado. El fluorímetro mide por separado los siguientes parámetros:

Con la longitud de onda 1 (cromóforo donante)

: Intensidad luminosa de excitación, I(1,0)

: Intensidad luminosa ambiente, I(1,1)

: Intensidad de la luz fluorescente y la luz ambiente combinadas, I(1,2)

Con la longitud de onda 2 (cromóforo aceptor)

: Intensidad luminosa de excitación, I(2,0)

: Intensidad luminosa ambiente, I(2,1)

: Intensidad de la luz fluorescente y la luz ambiente combinadas, I(2,2)

Las mediciones se toman manteniendo el fluorímetro cerca de la piel y en alineación con el sensor. Cuando se hacen mediciones transcutáneas de las señales fluorescentes generadas en el sensor, es necesario tener en cuenta la absorción de la señal por la piel; se encuentra de modo experimental que el menor poder absorbente de la piel humana está en el intervalo de 400 nm a 900 nm. La salida final proporcionada es la relación normalizada de la intensidad fluorescente de los dos fluoróforos definida por la siguiente relación (Ecuación 1):

(1)Salida \ final \ = (I(1,2) - (I(1,1)) * I(2,0) / (I(2,2) - I(2,1)) * I(1,0)

La salida final de los medios ópticos (por ejemplo el fluorímetro), dada por la Ecuación 1 anterior, se convierte a concentración de analito, preferentemente mediante un ordenador, usando datos de calibración que pueden obtenerse basándose en los principios que se exponen a continuación.

Midiendo la respuesta versus la concentración de analito, para un intervalo fisiológicamente relevante de concentraciones de analito, puede establecerse empíricamente una curva de calibración. Preferentemente, esto se realiza in vitro como parte de la producción del dispositivo sensor. El procedimiento de calibración puede simplificarse considerablemente usando la relación matemática existente entre la respuesta y la concentración de analito en un sensor de afinidad competitiva, la cual se deduce como sigue:

la respuesta de un sensor de afinidad competitiva está gobernada por las reacciones:

RC \leftrightarrow R + C

RL \leftrightarrow R + L

que indican la disociación de los complejos RC y RL formados por la combinación del agente de enlace de los analitos (R) con el analito (L) o el analito análogo (C).

Las constantes de equilibrio de la disociación correspondiente son:

K_{1} = \frac{C_{r} C_{c}}{C_{RC}}

y

K_{2} = \frac{C_{r} C_{c}}{C_{RL}}

donde C indica el número de moles de las especies existentes en el sensor dividido por el volumen del sensor. Usando esta medición de la concentración tanto las especies inmovilizadas como las especies en solución se tratan igual.

Las ecuaciones de balance másico son:

T_{C} = C_{C} + C_{RC}

para la concentración total del analito análogo, y

T_{R} = C_{R} + C_{RC} + C_{RL}

para la concentración total del agente de enlace de los analitos.

\newpage

Usando las expresiones anteriores se deduce la relación existente entre la respuesta y la concentración de analito:

(2)\frac{T_{C} - C_{C}}{C_{C}} \ K_{1} = \frac{T_{R} - (T_{C} - C_{C})}{1 + (C_{L} / K_{2})}

Usando esta relación, la cantidad de datos necesaria para la calibración puede reducirse a dos parámetros clave: la concentración total del agente de enlace de los analitos y la concentración total del analito análogo. La curva de calibración se determina de este modo mediante dos puntos de la curva.

La presente invención se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, junto con las figuras anejas, en las que:

la figura 1 es un diagrama esquemático de la parte óptica del fluorímetro de fibra óptica; y

la figura 2 es un diagrama esquemático de un circuito excitador/amplificador usado junto con la parte óptica del fluorímetro de fibra óptica.

La figura 3, tomada de la patente WO 99/64580, muestra según una vista de alzado lateral un inyector multiaguja que es adecuado para usarse en la invención.

Como puede verse en la figura 3, una forma adecuada y conocida de inyector 1 comprende un sustrato de silicio 11 en una de cuyas caras se ha formado una matriz de microagujas 12 sobre un área rectangular, mediante fotolitografía y ataque químico iónico reactivo o un proceso similar. Convenientemente, las agujas tienen una longitud comprendida entre 1 y 800 \mum, por ejemplo 50 \mum, y pueden ser sólidas, como se muestra, o huecas con un orificio pasante para el paso del material sensor.

Como muestra esquemáticamente la figura 3, cada microaguja se oprime en la piel de un sujeto, atravesando el estrato córneo 14 y llegando al interior de la epidermis 16, pero deteniéndose cerca de la dermis 18.

Ejemplo 1

Un análisis de glucosa según Meadows and Schultz (Atlanta, 35, 145-150, 1988) fue desarrollado usando concavalina A-rodamina y dextrano-FITC (ambos de Molecular Probes Inc., Oregon, USA). El principio del análisis es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre los dos fluoróforos cuando están situados muy próximos; en la presencia de glucosa se inhibe la transferencia de energía por resonancia y aumenta la señal fluorescente procedente del FITC (fluoresceína). Por tanto, la excitación de la fluorescencia está en correlación con el aumento de la glucosa. Se encontró que el análisis de glucosa responde a la glucosa, según ha informado Schultz, con aproximadamente el 50 por ciento de recuperación de la señal de fluorescencia de la fluoresceína con 20 mg/dl de glucosa. La fluorescencia se midió en un fluorímetro Perkin Elmer adaptado para la medición de flujo a su través usando un dispositivo de detección por lavado.

Ejemplo 2

Los componentes del análisis de glucosa del Ejemplo 1 fueron añadidos a soluciones agitadas (1 ml) de 1%, 1,5% y 2% p/v de una agarosa de baja temperatura de fusión (Tipo IX, Sigma, St. Louis, USA) a 45°C. Después de la dispersión se redujo la temperatura a 20°C y se detuvo la agitación. Cuando se hubo formado el gel (después de 3 horas aproximadamente) se le puso en un mortero cerámico y se machacó hasta obtener un tamaño de partícula de 50 a 100 \mum, mediante referencia visual respecto a una preparación de microesferas de poliestireno con el mismo diámetro medio de las microesferas. Con la preparación de partículas se hizo una suspensión salina de 0,9% p/v y se filtró a través de un tamiz de nilón para separar las partículas más grandes. Las partículas que pasaron por el tamiz se centrifugaron después a 500g en una máquina centrífuga de sobremesa y se desechó el material sobrenadante que contenía las partículas más finas. Durante el proceso las partículas retuvieron su fluorescencia, por inspección visual y por medición de la fluorescencia de la rodamina en el fluorímetro Perkin Elmer. Añadiendo glucosa de 20 mg/dl a una muestra de partículas en suspensión se produjo un aumento en la señal de fluorescencia de la fluoresceína durante un período de 30 minutos. Por tanto, los componentes del análisis contenidos en el gel de agarosa fueron sensibles a la glucosa.

Ejemplo 3

Se preparó un fluorímetro de fibra óptica como sigue.

La parte óptica de un fluorímetro de fibra óptica se hizo con componentes estándar en una pequeña mesa de trabajo. La disposición, que comprende un LED rojo como fuente luminosa, lentes, un divisor dicroico del haz y filtros y diodos detectores, fue como se muestra en la figura 1. Brevemente, el fluorímetro comprende un diodo electroluminiscente (1) que proporciona un haz luminoso de excitación, el cual atraviesa una lente condensadora (2) que contiene un filtro de excitación (3) e incide sobre un divisor de haz (4). Parte del haz excitador se desvía de este modo hacia el interior de la óptica de emisión (5) y entra en la fibra óptica (6). Cuando el fluorímetro está en uso en la interrogación de un sensor situado cutáneamente al final de la piel, en alineación con el sensor cutáneo, de modo que el haz de la luz excitadora incida sobre el sensor, una porción de la señal óptica emitida por el sensor, tras la excitación, entra en la fibra óptica (6) y se dirige de este modo hacia el fluorímetro donde pasa por un diodo de bloqueo (7). El fluorímetro también contiene un diodo detector de referencia (9) que proporciona una medición de referencia de la luz excitadora emitida por el LED (1). Los extremos de una fibra óptica Ensign Beckford, de 1 m de longitud y 0,5 mm de diámetro y abertura numérica de 0,65, se pusieron en un acabado especular usando pasta de diamante sobre pasta de vidrio. Un extremo de la fibra se montó en un soporte de tres ejes XYZ situado frente a un objetivo de microscopio de 20 aumentos. Los diodos (LED (1) y diodos detectores (7) y (9)) se conectaron a un circuito excitador/amplificador hecho ex profeso, como se muestra en la figura 2. El circuito comprende un emisor (10), amplificadores de corriente (11) y (12), multiplexores (13) y (14), integradores (15) y (16) y un divisor analógico (17). El circuito excitador se ajustó de modo que excitase el LED (1) a 238 Hz y las señales procedentes de los diodos detectores (7) y (9) se conmutaron entre tierra y los condensadores de almacenamiento (integrador con una constante de tiempo de 1 segundo) sincronizadas con la señal excitadora. Las dos señales integradas corresponden a la señal fluorescente, con la corrección de ambiente, y al nivel luminoso de excitación con la corrección de ambiente (intensidad del LED). La primera dividida por la segunda fue proporcionada por un divisor analógico, como se muestra en la figura 2. A efectos del análisis, el extremo distal de la fibra (6) se sumergió en soluciones diluidas de rodamina y las ópticas se ajustaron de modo que se maximizara la señal procedente del divisor analógico.

El fluorímetro se alimenta por baterías (consumo típico de energía 150 mA a 9 V) y por conveniencia puede construirse con la forma y dimensiones de una pluma estilográfica.

Ejemplo 4

Se lavaron varias veces partículas de agarosa de 1,5% p/v, de 50 \mum de diámetro aproximadamente, que contenían los componentes del análisis (como se ha descrito en el Ejemplo 2) centrifugándolas y volviéndolas a poner en suspensión en una solución salina de 0,9% p/v. Este procedimiento de lavado elimina el exceso de reactivos que no quedaron atrapados dentro de la estructura del gel. Las partículas permanecen sumamente fluorescentes durante este proceso. Después se cargó la suspensión de partículas en una pastilla micromecanizada de silicio, que tenía una matriz de 10 mm^{2} con 400 microagujas de 1 \mum de diámetro y una profundidad de penetración de 100 \mum desde la superficie de la piel, y se inyectaron, cutáneamente o intradérmicamente, debajo de la piel del dorso de la mano de una persona voluntaria. Se dirigió un fluorímetro de fibra óptica (véase el Ejemplo 3) hacia la piel y se obtuvo la señal de fluorescencia de la rodamina y se estableció su correlación con una medición convencional de la glucosa en sangre, indicando que pueden hacerse mediciones transdérmicas sobre sensores implantados. Las partículas sensoras se desprendieron de la piel tras un período de un mes.

Claims

1. Un aparato de análisis por implantación, que comprende un sensor para la medición in vivo de un analito y medios para implantar dicho sensor dentro de una capa superior de la piel, de la cual se expulsa naturalmente con el tiempo por el crecimiento de la piel y la renovación progresiva de la capa externa de la piel, en el que dichos medios de implantación comprenden al menos una aguja de inyección que tiene una longitud penetrable en la piel de no más de 200 \mum.

2. Aparato según la Reivindicación 1, en el que dicho sensor comprende una multitud de micropartículas, comprendiendo una muestra cada una de análisis de dicho analito, produciendo dicho análisis una lectura de salida tras cuya interrogación la lectura de salida es una señal óptica que es detectable o medible transcutáneamente con medios ópticos externos.

3. Aparato según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho análisis es un análisis de enlace, cuya lectura de salida es una señal óptica detectable o medible.

4. Aparato según la Reivindicación 3, en el que dicho análisis de enlace es un análisis de enlace competitivo cuyos componentes incluyen un analito análogo y un agente de enlace de los analitos.

5. Aparato según la Reivindicación 4, en el que dicho analito análogo se marca con un primer cromóforo y dicho agente de enlace de los analitos se marca con un segundo cromóforo, solapándose el espectro de emisión de dicho primer cromóforo con el espectro de absorción de dicho segundo cromóforo.

6. Aparato según la Reivindicación 3 o la Reivindicación 4, en el que el agente de enlace es un anticuerpo, un fragmento Fab, una lectina, un receptor hormonal, un receptor de fármacos, un aptómero o un polímero marcado molecularmente.

7. Aparato según cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha señal óptica, detectable o medible, se genera mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, polarización por fluorescencia, extinción de fluorescencia, fosforescencia, excitación de luminiscencia, extinción de luminiscencia, resonancia de difracción o de plasmón.

8. Aparato según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en el que el sensor comprende un material matricial, estando en suspensión en dicho material matricial los componentes de dicho análisis.

9. Aparato según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho sensor comprende micropartículas sólidas y los componentes de dicho análisis están dispersados uniformemente en dichas micropartículas sólidas.

10. Aparato según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho sensor comprende micropartículas huecas y los componentes de dicho análisis están encapsulados dentro de dichas micropartículas huecas.

11. Aparato según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho sensor comprende una pluralidad de liposomas, estando encapsulados dentro de dichas liposomas los componentes de dicho análisis.

12. Aparato según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho sensor comprende una pluralidad de eritrocitos vacíos que han sido cargados con los componentes de dicho análisis.

13. Un sistema analítico para la detección de mediciones cuantitativas de un analito en fluido cutáneo, cuyo sistema analítico comprende un aparato de análisis por implantación según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, junto con medios ópticos adecuados para la interrogación transcutánea de dicho sensor.