ES2259822T3 - Procedimiento de separacion molecular por interaccion de ligandos en solucion libre. - Google Patents

Procedimiento de separacion molecular por interaccion de ligandos en solucion libre.

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ES2259822T3 ES98963036T ES98963036T ES2259822T3 ES 2259822 T3 ES2259822 T3 ES 2259822T3 ES 98963036 T ES98963036 T ES 98963036T ES 98963036 T ES98963036 T ES 98963036T ES 2259822 T3 ES2259822 T3 ES 2259822T3
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Abstract

Procedimiento para separar una primera especie de interés de una segunda especie de interés en una mezcla en disolución libre que comprende dicha primera y segunda especie de interés, teniendo dichas primera y segunda especie aproximadamente el mismo volumen hidrodinámico, comprendiendo dicho método: poner en contacto dicha mezcla en disolución libre con un ligando soluble en dicha mezcla en disolución libre, en la que dicho ligando interacciona con dicha primera especie, en la que el peso molecular de dicho ligando es menor que el peso molecular de dicha primera especie y en la que dicha interacción forma un complejo primera especie/ligando que tiene un mayor volumen hidrodinámico que el de dicha segunda especie en la disolución libre; y separar dicho complejo primera especie/ligando de dicha segunda especie mediante cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de membrana; proporcionar una composición que básicamente carezca de la segunda especie; y en la que dicha primera especie se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un polipéptido y un anticuerpo.

Description

Procedimiento de separación molecular por interacción de ligandos en solución libre.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos de purificación y separación de especies, en particular aquéllas de interés biológico, de disoluciones libres en las que los procedimientos emplean ligandos solubles y de bajo peso molecular que pueden interaccionar de un modo específico con las especies de interés.
Antecedentes de la invención
El éxito de muchos proyectos de investigación en biotecnología depende por completo de la disponibilidad de técnicas que permiten la separación y purificación de una o más moléculas de interés de mezclas complejas que comprenden tales moléculas de interés. Con respecto a esto, actualmente se dispone de varias técnicas para separar y purificar moléculas de interés biológico, tales como proteínas, de mezclas complejas de las mismas. Entre estas técnicas se incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico (IEC), la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), distintas variedades de filtración de membrana, tales como la ultrafiltración, la microfiltración, la ósmosis inversa y similares. No obstante, aunque se ha demostrado la utilidad de estas técnicas de separación en una variedad de aplicaciones, con frecuencia son muchas más las aplicaciones en las cuales su utilidad es limitada.
En un esfuerzo por aumentar la capacidad de separación de estas técnicas, los investigadores han elaborado numerosas técnicas de separación molecular parecidas pero que se basan, por lo menos en parte, en la capacidad de una molécula con afinidad para unirse a una entidad de interés y que, por lo tanto, permiten que esta entidad de interés pueda separarse de los otros componentes de una mezcla fluida. Tal técnica de separación basada en la molécula con afinidad es la cromatografía de afinidad, que separa moléculas biológicas en función de su capacidad para unirse de un modo específico y selectivo a una matriz o gel de afinidad. Los geles de afinidad suelen constar de una parte de unión a un ligando inmovilizada sobre un soporte de gel. Por ejemplo, en la patente del Reino Unido GB 2.178.742 se utilizó la cromatografía de afinidad para purificar hemoglobina y sus derivados modificados químicamente basándose en el hecho de que la (oxi)hemoglobina nativa se une de un modo específico con funcionalidades polianiónicas de determinados geles de afinidad. En este proceso, la hemoglobina no modificada es retenida por el gel de afinidad mientras se eluye la hemoglobina modificada, que no puede unirse al gel porque su sitio de unión polianiónico está ocupado covalentemente por un agente modificadora.
No obstante, aunque se ha demostrado la utilidad de la cromatografía de afinidad en una variedad de aplicaciones, existen limitaciones inherentes a esta técnica. Por ejemplo, puesto que la cromatografía de afinidad depende de la unión de un ligando a una matriz en fase sólida (tal como una perla de polímero u otro tipo de matriz polimérica), existen considerables limitaciones conformacionales en la molécula ligando a la que se une, así como en la proteína que se une a la molécula ligando unida a la matriz. Además, la matriz en fase sólida proporciona un posible sitio para la unión no específica de varios de los componentes de la mezcla de reacción, por lo que a menudo el resultado es inferior a una separación completamente eficaz. Además, la capacidad global de un sistema de cromatografía de afinidad se halla limitada por el área de superficie disponible de la fase sólida y por la densidad a la cual el área de la superficie puede sustituirse por un ligando.
Otra técnica de separación conocida y basada en moléculas con afinidad es la ultrafiltración de afinidad, técnica que combina la unión por afinidad con la ultrafiltración de membrana. Más específicamente, en la ultrafiltración por afinidad se emplea un gran ligando con afinidad polimérica al cual puede unirse una proteína de interés seguido de la separación basada en la ultrafiltración del ligando con afinidad polimérica complejado del resto de elementos de una mezcla. (Véase, por ejemplo, Mattiasson y otros, Journal of Chromatography 283:323-330 (1984); Luong y otros, Biotechnology and Bioengineering 31:516-520 (1988), y Male y otros, Biotechnology and Bioengineering 35:87-93 (1990)). Sin embargo, puesto que se emplean grandes ligandos con afinidad polimérica como molécula con afinidad de unión, existen considerables limitaciones en cuanto a la capacidad de separación debida a la insolubilidad inherente de tales ligandos con afinidad. Además, con frecuencia no es fácil disponer de ligandos con afinidad polimérica y éstos proporcionan rendimientos y/o factores de purificación relativamente bajos.
Van Eijndhoven y otros, Biotechnology and Bioengineering 48:406-414 (1995), han demostrado que las alteraciones en la fuerza iónica de una disolución que contiene proteínas pueden servir para alterar el tamaño aparente de una proteína de esta disolución. Más específicamente, van Eijndhoven y otros han demostrado que la interacción entre iones monovalentes (tal como Cl^{-}) y una proteína, tal como la albúmina sérica bovina, puede servir para alterar el volumen hidrodinámico de la proteína. No obstante, actualmente se desconoce si la unión a proteínas de pequeños iones monovalentes modifica lo suficiente el volumen hidrodinámico de la proteína como para que pueda separarse de otras proteínas de tamaño parecido en una mezcla compleja de los mismos mediante técnicas de separación
conocidas.
La patente EP-A-0 104 356 describe la separación del factor VIIIC de otros factores de coagulación mediante la interacción con, por ejemplo, PEG o sulfato de amonio, para reducir el radio de Stokes de FVIIIC.
Por lo tanto, es necesario elaborar nuevos métodos para separar y purificar especies de interés de mezclas complejas en disolución libre que no estén sujetos a las limitaciones inherentes de otros procedimientos de separación conocidos basados en moléculas con afinidad. Específicamente, se requieren técnicas basadas en moléculas con afinidad que no estén sujetas a limitaciones conformacionales y a problemas de unión inespecífica asociados con la cromatografía de afinidad. Además, también son necesarias nuevas técnicas basadas en moléculas con afinidad que no estén sujetas a las limitaciones comentadas anteriormente del proceso de ultrafiltración por afinidad. La presente invención proporciona una solución a muchos de estos problemas.
Descripción resumida de la invención
La presente invención está dirigida a nuevos métodos para separar especies de interés de otras especies distintas presentes en una mezcla en disolución libre de dichas especies la cual aprovecha la afinidad y otras interacciones que tienen lugar entre ligandos solubles de bajo peso molecular y una especie de interés. Específicamente, la presente invención está dirigida a un método para separar una primera especie de interés de una segunda especie de interés de una mezcla en disolución libre que comprende dichas primera y segunda especies de interés, siendo la primera y la segunda especies de interés distintas. El procedimiento descrito en la presente comprende la etapa de poner en contacto la mezcla en disolución libre con un ligando soluble de bajo peso molecular que interacciona en la disolución libre con la primera especie de interés pero sólo en cierta medida con la segunda especie de interés, formando de este modo un complejo primera especie de interés/ligando que pueda separarse de la segunda especie de interés mediante una variedad de técnicas de separación molecular distintas que incluyen, por ejemplo, la cromatografía de exclusión por tamaño y la filtración de membrana. El ligando de bajo peso molecular tiene un peso molecular inferior al de la primera especie de interés con la que interacciona.
En realizaciones particulares, la primera especie de interés puede ser, por ejemplo, una proteína o un polipéptido (obtenido de forma natural o por recombinación), un aminoácido, un coloide, una endotoxina, un virus, un ácido nucleico y similares. Los ligandos de bajo peso molecular que se utilizan en la presente invención son solubles en sistemas de disoluciones libres e incluyen, por ejemplo, proteínas, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, aminoácidos, moléculas orgánicas e inorgánicas, moléculas multiiónicas similares. Habitualmente, la interacción entre la primera especie de interés y el ligando tiene lugar a través de interacciones de afinidad, hidrofóbicas y/o
iónicas.
En varias realizaciones de la presente invención, la primera y la segunda especies de interés pueden tener aproximadamente un mismo volumen hidrodinámico, peso molecular y/o punto isoeléctrico, haciendo que sean difíciles de separar con técnicas de separación convencionales. No obstante, una o más de estas propiedades pueden cambiar tras la interacción del ligando con la primera especie de interés. En los casos en que el volumen hidrodinámico del complejo primera especie de interés/ligando y el de la segunda especie de interés es aproximadamente el mismo, a menudo puede alterarse el pH o la fuerza iónica del sistema para aumentar de un modo eficaz la diferencia entre el volumen hidrodinámico del complejo primera especie de interés/ligando y el de la segunda especie de interés, aumentando de este modo la capacidad de separarlas mediante técnicas de separación convencionales.
En aún otras realizaciones de la presente invención, la primera especie de interés y los componentes del ligando pueden disociarse y separarse del complejo que inicialmente se separó de la segunda especie de interés, proporcionando de este modo una preparación relativamente pura de la primera especie de interés. Los procedimientos para inducir esta disociación incluyen generalmente alterar el pH del sistema, alterar uno o más de los componentes solubles del sistema, y similares.
Tras la lectura de la presente invención, aún otras realizaciones de la presente invención quedarán claras para un experto en la materia.
Breve descripción de las figuras
Figura 1
Elución de una IgG humanizada recombinante (rhuIgG) desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200
La figura 1 muestra el perfil de elución de rhuIgG desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. La proteína rhuIgG se cargó en la columna a una concentración de 8 mg/ml con un tampón de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,04%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 2
Elución de albúmina sérica bovina (BSA) modificada con sulfhidrilo desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200
La figura 2 muestra el perfil de elución de BSA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. La proteína BSA se cargó en la columna a una concentración de 0,3 mg/ml con un tampón de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 3
Elución de una mezcla de IgG humanizada recombinante (rhuIgG) y albúmina sérica bovina (BSA) modificada con sulfhidrilo desde de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200
La figura 3 muestra el perfil de elución de una mezcla de rhuIgG y BSA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. Las proteínas rhuIgG y BSA se cargaron en la columna a una concentración de 0,8 mg/ml y 0,3 mg/ml, respectivamente, con un tampón de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 4
Elución de un complejo IgG humanizada recombinante (rhuIgG)/proteína recombinante A (rPrA) desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200
La figura 4 muestra el perfil de elución de un complejo rhuIgG/rPrA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. Las proteínas rhuIgG y rPrA se cargaron en la columna a una concentración de 0,8 mg/ml y 0,2 mg/ml, respectivamente, con un tampón de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 5
Elución de una proteína recombinante A (rPrA) desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200
La figura 5 muestra el perfil de elución de una proteína rPrA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. La proteína rPrA se cargó en la columna a una concentración de 2 mg/ml con un tampón de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 6
Elución de una mezcla de un complejo IgG humanizada recombinante (rhuIgG)/proteína recombinante A (rPrA) y albúmina sérica bovina (BSA) modificada con sulfhidrilo desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200
La figura 6 muestra el perfil de elución de una mezcla de complejo rhuIgG/rPrA y BSA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200. Las proteínas rhuIgG, rPrA y BSA se cargaron en la columna a una concentración de 0,8 mg/ml, 0,2 mg/ml y 0,3 mg/ml, respectivamente, con un tampón de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 7
Elución de IgG humanizada y recombinante (rhuIgG) desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6
La figura 7 muestra el perfil de elución de rhuIgG desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6. La proteína ruhIgG se cargó en la columna a una concentración de 0,8 mg/ml con un tampón de ácido acético 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 3,5 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Figura 8
Elución de proteína A recombinante (rPrA) desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6
La figura 8 muestra el perfil de elución de rPrA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6. La proteína rPrA se cargó en la columna a una concentración de 0,2 mg/ml con un tampón de ácido acético 0,1 M y NaCl 0,15 M, pH 3,5 \pm 0,1 y con un volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
\newpage
Figura 9
Elución de un complejo IgG humanizada recombinante (rhuIgG)/proteína recombinante A (rPrA) desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6
La figura 9 muestra el perfil de elución del complejo rhuIgG/rPrA desde una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superose 6. Las proteínas rhuIgG y rPrA se cargaron en la columna a una concentración de 0,8 mg/ml y 0,2 mg/ml, respectivamente, con un tampón de ácido acético 0,1 M y NaCl 0,15 M, pH 3,5 \pm 0,1 y con volumen de carga del 0,2%. Los datos aparecen representados como unidades de absorbancia de UV (mAU) frente al tiempo en minutos (min).
Descripción detallada de la invención A. Definiciones
Tal y como se emplean aquí, las expresiones "especie" o "especie de interés" generalmente se refieren a una partícula/as o molécula/as que ha de separarse de una disolución libre o mezcla fluida, por ejemplo, un líquido. Las especies se separan de la mezcla en disolución libre y, en la mayor parte de los casos, de otras partículas, moléculas o especies presentes en la mezcla. Preferiblemente, las especies de interés son entidades biológicas de origen natural, biológico o bioquímico o producidas por procesos biológicos o bioquímicos. Entre los ejemplos preferidos de especies de interés se incluyen, sin ser limitantes de la invención, moléculas, tales como, por ejemplo, polipéptidos, tanto si se producen de forma natural como recombinante, proteínas, tanto si se producen de forma natural como recombinante; elementos celulares; ácidos nucleicos, como el ADN y el ARN, coloides; micoplasma, endotoxinas, virus, bacterias, carbohidratos, y otras diversas moléculas biológicas o de interés, independientemente de que estén glucosiladas o no. Una o más especies de interés pueden constituir una "impureza", lo que significa que se trata de un componente no deseable de una mezcla y que tiene que separarse de la misma. Las especies de interés también pueden ser proteínas de fusión en las que por lo menos una parte de la proteína de fusión es un polipéptido para el que se dispone fácilmente de un ligando de bajo peso molecular. Por ejemplo, la primera especie de interés puede ser una proteína que comprende un polipéptido derivado de una inmunoglobulina para el cual el ligando de la proteína A tiene una afinidad de unión específica.
Tal y como se emplea aquí, el término "mezcla" de especies hace referencia a una disolución libre (por ejemplo, un líquido) o suspensión que contiene dos o más especies distintas. Los tipos de especies presentes en cualquier mezcla y su abundancia en la misma pueden variar enormemente, ya que una mezcla puede contener, por ejemplo, varios polipéptidos, tampones, sales, células y componentes celulares distintos, y similares. Las mezclas pueden ser complejas, en las que están representadas un gran número de especies distintas, o relativamente simples, en las que sólo está representado un número reducido de especies distintas.
Tal y como se emplea aquí, el término "ligando" hace referencia a una molécula que es soluble en una disolución libre (es decir, con cierto grado de solubilidad en la disolución) y que puede interaccionar con una especie de interés para alterar por lo menos una de las propiedades físicas de la especie con la que el ligando interacciona. Los ligandos que se utilizan aquí son tales que uno, o más, puede interaccionar con una sola molécula de la especie de interés. El término "interaccionar" con una especie de interés significa que el ligando (o múltiples ligandos) puede unirse físicamente, tanto de un modo reversible como irreversible, a la especie de interés o bien alterar una o más de las propiedades físicas de la especie como, por ejemplo, el volumen hidrodinámico, el peso molecular, el punto isoeléctrico y otras propiedades parecidas. A menudo, la interacción entre la primera especie de interés y el ligando es "específica", lo que significa que el ligando "interacciona preferentemente con" o "se une preferentemente a" la primera especie de interés en comparación con cualquier otra entidad presente en la mezcla. La expresión interacción o unión "preferente" significa que el ligando interacciona o se une en mayor grado con la primera especie de interés que con cualquier otra especie presente en la disolución libre. En general, un ligando que se une "preferentemente" interacciona con una especie de interés con por lo menos el doble de eficacia que con otras especies presentes en la disolución, "preferiblemente" con una eficacia por lo menos cinco veces mayor y "más preferiblemente" con una eficacia por lo menos diez veces mayor en términos de afinidad de unión y/o tiempo de residencia. En algunos casos el ligando puede interaccionar con otros componentes de la mezcla en disolución libre, no obstante, interacciona en mayor grado con la especie de interés (por ejemplo, más moléculas ligando por moléculas de la especie), por lo que se consigue alterar tal como se pretendía el peso molecular, el volumen hidrodinámico y/o el punto isoeléctrico.
Los ligandos que se utilizan en la presente invención son ligandos de "bajo peso molecular", lo que significa que su peso molecular es inferior al de la primera especie de interés con la que interaccionan. Con respecto a esto, el término "inferior" quiere decir que el peso molecular del ligando oscila aproximadamente entre el 0,5 y el 99,5% del peso molecular de la especie con la que interacciona, preferiblemente entre un 5 y un 90%, más preferiblemente entre un 10 y un 80% y normalmente entre un 20 y un 75%. Los ligandos que se utilizan en la presente invención pueden interaccionar con la primera especie de interés por afinidad, a través de interacciones hidrofóbicas y/o iónicas y son, por ejemplo: proteínas, como los anticuerpos, péptidos, ácidos nucleicos, sacáridos, aminoácidos, moléculas orgánicas y moléculas inorgánicas, moléculas multiiónicas (es decir, moléculas con más de un grupo iónico) y similares. El término "ligando" tal como se define aquí no pretende abarcar especies iónicas monovalentes, como los protones, los iones metálicos y similares.
Es posible que los ligandos que se utilizan en la presente invención sean conocidos y se hallen disponibles para el experto o que puedan identificarse fácilmente mediante técnicas sistemáticas de cribado. Por ejemplo, pueden cribarse bibliotecas combinatorias de oligopéptidos u oligonucleótidos para identificar elementos de una biblioteca que puedan interaccionar con la primera especie de interés y que, por lo tanto, permitan identificar los ligandos que pueden ser útiles en la presente invención. A continuación, hay la opción de cribar estos elementos de las bibliotecas que interaccionan con la primera especie de interés dado que no pueden interaccionar con la segunda especie de interés. Con respecto a esto, cabe señalar que las técnicas para preparar y cribar bibliotecas combinatorias en busca de elementos que puedan interaccionar con una molécula diana son muy conocidas en el estado de la técnica.
Con la expresión "complejo especie de interés/ligando" o con sus equivalentes gramaticales se hace referencia al complejo que se forma cuando uno o más ligandos de bajo peso molecular interaccionan con una especie de interés y, por lo tanto, se alteran el peso molecular, el volumen hidrodinámico y/o el punto isoeléctrico de la especie de interés que, al mismo tiempo, se modifica para que pueda separarse de otras especies presentes en una mezcla en disolución libre. Con expresiones como "capaz de separarse" o sus equivalentes gramaticales se hace referencia a que las técnicas de separación molecular que actualmente son conocidas o que se desarrollarán en el futuro pueden separar el complejo primera especie de interés/ligando de la segunda especie de interés para dar una composición que básicamente carezca de la segunda especie de interés. La expresión "básicamente libre" significa que la segunda especie de interés es ausente en la composición o que su presencia es tal que no interfiere con ninguna función deseada de la primera especie de interés purificada. A menudo, los distintos componentes de un complejo especie de interés/ligando pueden disociarse, lo que permite la separación y purificación de cada uno de los componentes una vez que el complejo se ha separado de otros componentes presentes en una mezcla fluida.
Con respecto a las especies de interés y los ligandos, el término "separar" significa que se purifica un componente o componentes, librándolo de otros componentes presentes en una mezcla fluida. En el estado de la técnica se conocen varias técnicas de separación molecular que se utilizarán aquí, como técnicas de "filtración de membrana" y cromatografía.
Tal como se utiliza aquí, la expresión "filtración de membrana" hace referencia a todos los tipos de procesos de filtración en los que se emplea una membrana o membranas porosas para separar moléculas de tamaños relativos distintos. En el estado de la técnica se conocen distintos tipos de procesos de filtración de membrana y entre éstos se incluyen, por ejemplo, la filtración de flujo tangencial de alto rendimiento, la ultrafiltración, la ósmosis inversa y la microfiltración.
Tal como se utilizan aquí, las expresiones "filtración de flujo tangencial" o "TFF" hacen referencia a procesos en los que se hace recircular la mezcla en disolución libre, que contiene los componentes que hay que separar por filtración de membrana, tangencialmente al plano de la membrana de filtración para aumentar el coeficiente de transferencia de masa para la retrodifusión. En tales filtraciones de membrana se aplica una presión diferencial en toda la longitud de la membrana de filtración para que la disolución y los solutos filtrables fluyan a través de la membrana. Esta filtración de membrana es idónea como proceso por lotes, así como proceso de flujo continuo. Por ejemplo, puede pasarse la disolución repetidas veces por encima de la membrana de filtración mientras se arrastra continuamente el fluido que pasa a través de la membrana hacia otra unidad o se pasa una vez la disolución por la membrana de filtración y el fluido que pasa a través de la membrana se procesa de forma continua hacia abajo.
Tal como se utiliza aquí, las expresiones filtración de flujo tangencial de alto rendimiento o "HPTFF" hacen referencia al proceso de filtración de membrana descrito en las patentes norteamericanas 5.256.294 y 5.490.937, las cuales se han incorporado por completo y de forma expresa como referencia.
Tal como se utilizan aquí, los términos "ultrafiltración" o "UF" hacen referencia a procesos de filtración de membrana en los que se emplean membranas de filtración calibradas para retener solutos que tengan un peso molecular entre 1 kD y 1.000 kD.
Tal como se utilizan aquí, las expresiones "ósmosis inversa" o "RO" hacen referencia a los procesos de filtración de membrana en los que se emplean membranas que pueden retener solutos de un peso molecular inferior a 1 kD, como sales y otros solutos de bajo peso molecular.
Tal como se utilizan aquí, los términos "microfiltración" o "MF" hacen referencia a procesos de filtración de membrana en los que se emplean membranas con un poro de tamaño entre 0,1 y 10 micras.
Tal como se utiliza aquí, la expresión "cromatografía de exclusión por tamaño" se refiere a un proceso bien conocido mediante el cual se emplean técnicas de cromatografía para separar al menos una molécula de al menos otra molécula en función del tamaño. En el caso de los métodos reivindicados aquí, la cromatografía de exclusión por tamaño suele realizarse a fuerzas iónicas bajas, por ejemplo, menos de unos 150 mM, preferiblemente menos de 100 mM y más preferiblemente menos de unos 75 mM, normalmente menos de unos 50 mM.
B. Modos de llevar a la práctica la invención
En su aspecto más amplio, la presente invención se ocupa de procedimientos para separar una primera especie de interés de una segunda especie de interés de una mezcla en disolución libre que comprende ambas especies. El procedimiento comprende poner en contacto la mezcla en disolución libre con un ligando de bajo peso molecular que sea soluble en la disolución libre y que pueda interaccionar con la primera especie de interés para formar un complejo primera especie de interés/ligando en la disolución libre, y así alterar por lo menos una de las propiedades físicas de la primera especie de interés. Preferiblemente, por medio de la interacción con la primera especie de interés, el ligando sirve para aumentar el volumen hidrodinámico, el peso molecular y/o cambiar el punto isoeléctrico de la primera especie de interés, permitiendo por lo tanto que se separe de la segunda especie de interés mediante técnicas de separación muy conocidas. La presente invención es en particular útil en situaciones en las que inicialmente la primera y la segunda especies de interés pueden separarse porque, por ejemplo, tienen un volumen hidrodinámico, un peso molecular y/o un punto isoeléctrico parecidos. En estos casos, la primera especie de interés puede interaccionar con el ligando y aumentar el volumen hidrodinámico del mismo, permitiendo que pueda separarse (como complejo) de la segunda especie de interés. Entonces, la primera especie de interés puede disociarse y separarse del ligando y proporcionar una reserva de la primera especie de interés en estado puro que básicamente carece del ligando y de la segunda especie de interés.
El ligando puede introducirse en el sistema por distintos medios, ninguno de los cuales será perjudicial para la presente invención. Preferiblemente, el ligando se introducirá directamente en una mezcla en disolución libre que comprenda ambas especies de interés. En tales situaciones, el ligando interaccionará preferentemente con la primera especie de interés en comparación con la segunda. El ligando puede introducirse en la mezcla en disolución libre de una sola vez o bien añadirse en distintas etapas durante un período de tiempo prolongado.
Tal como se ha explicado antes, la primera y la segunda especies de interés pueden ser cualquiera de numerosas o distintas entidades biológicas o de otro tipo y a veces incluyen moléculas como, por ejemplo, polipéptidos, tanto producidos de forma natural como por recombinación; proteínas, tanto producidas de forma natural como recombinante, como las proteínas de fusión; componentes celulares, ácidos nucleicos, como el ADN y el ARN; coloides; micoplasma; endotoxinas; virus; bacterias; carbohidratos y otras varias moléculas biológicas o de interés, independientemente de si están o no glucosiladas. Preferiblemente, la primera especie de interés es una proteína producida por recombinación.
Los ligandos que se utilizan en la presente invención tendrán que ser solubles en la disolución libre (lo que significa que deberán contar con cierto grado de solubilidad en el sistema) y tener un peso molecular inferior al de la primera especie de interés, razón por la cual pueden interaccionar. En su mayor parte, la entidad del ligando podrá unirse de forma no covalente con la primera especie de interés y en general se tratará de una proteína, como puede ser un anticuerpo, un péptido, un ácido nucleico, un sacárido, un aminoácido, una molécula orgánica o inorgánica, una molécula multiiónica y similares, excluyéndose de un modo específico entidades monovalentes como los protones y los iones metálicos. Los ligandos que se utilizan en la presente invención son fácilmente obtenibles comercialmente o bien pueden sintetizarse e identificarse fácilmente de un modo sistemático, a través de la preparación y el cribado de bibliotecas combinatorias. En los casos en los que el ligando de elección sea una proteína, ésta se hallará disponible en el comercio como proteína A o podrá prepararse fácilmente mediante técnicas de expresión recombinante
de ADN.
Cuando el ligando sea un anticuerpo capaz de unirse de forma específica a la primera especie de interés, tales anticuerpos podrán prepararse y cribarse para la especificidad de unión deseada mediante tecnología sistemática. Por ejemplo, alguien que conozca bien la técnica es capaz de obtener con rapidez, facilidad y de forma sistemática un preparado de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigido contra cualquier proteína de interés. Los anticuerpos policlonales de la proteína normalmente se hacen crecer en animales a los que se somete a múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de la proteína combinada con un adyuvante. Puede ser útil conjugar la proteína o fragmento de interés con una proteína que sea inmunogénica en la especie que hay que inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o un inhibidor de la tripsina de la soja utilizando una sustancia bifuncional o de derivación, como por ejemplo el éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R'N=C=NR, dónde R y R' son distintos grupos alquilo.
Los animales huésped pueden inmunizarse contra conjugados o derivados inmunogénicos combinando el conjugado con un adyuvante apropiado e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Al cabo de un mes, puede darse a los animales una dosis de refuerzo, que contenga de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado junto con un adyuvante apropiado, que se inyecta por vía subcutánea en múltiples sitios. Al cabo de 7 a 14 días, puede extraerse sangre a los animales y analizarse el suero para valorar la presencia de anticuerpos antiproteína de interés. A continuación pueden darse dosis de refuerzo hasta alcanzar mesetas de valoración. Asimismo, pueden añadirse sustancias como el aluminio para aumentar la respuesta inmunitaria. A continuación se purifican los anticuerpos policlonales del suero inmunitario mediante técnicas convencionales.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína de interés a partir de una población de anticuerpos básicamente homogéneos, es decir, todos los anticuerpos de la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren de forma natural y cuya presencia es reducida. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína de interés pueden elaborarse mediante Procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975) o con métodos de ADN recombinante (Cabilly y otros, U.S. Pat. No. 4.816.567).
En Procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster, para obtener linfocitos que produzcan o puedan producir anticuerpos, que se unan de un modo específico con la proteína utilizada para la inmunización. Por otro lado, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. A continuación pueden fusionarse los linfocitos con las células del mieloma mediante una sustancia de fusión adecuada, como el glicol polietileno, para formar una célula del hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células del hibridoma preparadas así pueden sembrarse y dejarse crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células paternas no fusionadas del mieloma. Por ejemplo, si las células del mieloma paterno carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas suele contener hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células con insuficiencia de HGPRT.
Las células preferidas del mieloma son aquellas que se fusionan de un modo eficaz, sostienen una expresión estable y elevada de un anticuerpo, mediante células seleccionadas que producen anticuerpos, y son sensibles a un medio como el HAT. Entre ellas, las cepas celulares preferidas del mieloma son cepas murinas, como las que proceden de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. También se ha descrito el uso de cepas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-ratón para producir anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984) y Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
A continuación se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células del hibridoma para ver si produce anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína de interés. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células del hibridoma se determina preferiblemente por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como un radioinmunoanálisis (RIA) o un inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de la unión de los anticuerpos monoclonales puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).
Los ligandos que son oligonucleótidos pueden sintetizarse químicamente mediante procedimientos conocidos como el de la química del fosfotriéster, del fosfito o de la fosfoaramidita, con técnicas de fase sólida como las que se describen en la EP 266.032, publicada el 4 de mayo de 1988, o vía intermediarios desoxinucleósidos del H-fosfonato tal como explicaron Froehler y otros, Nucl. Acids Res. 14:5399 (1986). Tras la síntesis, pueden purificarse las sondas de oligonucleótidos sobre geles de poliacrilamidas. Los ligandos que son péptidos pueden sintetizarse con los procedimientos sintéticos habituales de fase sólida de Merrifield, manualmente o con un sintetizador de péptidos automatizado, con la química de protección habitual (por ejemplo, química t-Boc o Fmoc) y con resinas (por ejemplo, resina 4-metil benzidril amina o resina Rink amida). Las sucesivas tandas de desprotección del grupo amino terminal y el acoplamiento de monómeros de aminoácidos, seguido de la desprotección y escisión de péptidos procedentes de resinas, llevan a la síntesis de oligopéptidos de la secuencia y longitud deseadas. Además, la síntesis de péptidos en fase líquida es muy conocida en el estado de la técnica y también puede emplearse. Pueden prepararse bibliotecas combinatorias de oligonucleótidos y oligopéptidos recurriendo a una tecnología combinatoria convencional y a las bibliotecas cribadas para identificar elementos de la biblioteca que puedan servir como ligandos de bajo peso molecular según los procedimientos aquí descritos, cuya metodología es muy conocida en el estado actual de la técnica.
Cuando se encuentran en una mezcla fluida, la primera y la segunda especies de interés pueden separarse de forma eficaz poniendo en contacto la mezcla fluida con un ligando de bajo peso molecular que pueda interaccionar con la primera especie de interés pero no con la segunda (o si lo hace que sea en menor grado). El procedimiento es particularmente útil en situaciones en las que la primera y la segunda especies de interés tienen aproximadamente el mismo tamaño, volumen hidrodinámico y/o punto isoeléctrico, lo que dificulta su separación con técnicas de separación convencionales. No obstante, al interaccionar con la primera especie de interés, el ligando aumenta el peso molecular y/o el volumen hidrodinámico de la primera especie de interés (y/o altera el punto isoeléctrico de la primera especie de interés), permitiendo que pueda separarse mediante técnicas convencionales de separación molecular.
Por lo general, el volumen hidrodinámico de una especie de interés se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño, técnica que es muy conocida. Con un volumen hidrodinámico que sea "aproximadamente el mismo" que el de otra especie de interés distinta, las dos especies de interés tienen volúmenes hidrodinámicos que difieren entre sí aproximadamente en un 10%.
El punto isoeléctrico de una especie de interés es el pH al cual la especie es eléctricamente neutra. El punto isoeléctrico de una especie de interés puede determinarse mediante técnicas convencionales que someten a la especie a un gradiente de pH y a un campo eléctrico y que establecen a qué pH la especie es eléctricamente neutra, es decir a qué pH la especie no migra hacia una u otra dirección en un campo eléctrico. Si se dispone de un punto isoeléctrico que sea "aproximadamente el mismo" que el de otra especie de interés, los puntos isoeléctricos de las dos especies difieren entre sí unos 0,5 puntos en el pH.
En algunas realizaciones de la presente invención se puede llevar más allá la capacidad de separar la primera y segunda especies de interés alterando el pH o la fuerza iónica de la mezcla fluida. Esta etapa es particularmente útil en situaciones en las que el complejo primera especie de interés/ligando tiene un volumen hidrodinámico que es aproximadamente el mismo que el de la segunda especie de interés. Alterando el pH y/o la fuerza iónica del sistema, puede alterarse el tamaño aparente (en términos de volumen hidrodinámico o de peso molecular) de una proteína o complejo proteínico en un factor de hasta unas 10 veces (véase Pujar y Zydney, "Analysis of Electrostatic Interactions on Protein Sieving: Experimental and Theoretical Investigations", North America Membrane Society Meeting, Ottawa, Canadá, 1996. Al aumentar la diferencia entre el volumen hidrodinámico del complejo primera especie de interés/ligando y la segunda especie de interés (o entre la primera y la segunda especies de interés) por medio de la alteración del pH y/o de la fuerza iónica de la mezcla fluida pueden separarse de un modo más eficaz la primera y segunda especies de interés con técnicas convencionales de separación molecular.
A partir del momento en que se permite que el ligando de bajo peso molecular interaccione con la primera especie de interés en la mezcla fluida, es posible separar el complejo primera especie de interés/ligando de la segunda especie de interés mediante técnicas convencionales de separación molecular. Por ejemplo, la etapa de separación de los componentes puede comprender la utilización de técnicas convencionales de filtración de membrana, tales como la filtración de flujo tangencial, la filtración de flujo tangencial de alto rendimiento, la ultrafiltración, la microfiltración y la ósmosis inversa. El complejo primera especie de interés/ligando y la segunda especie de interés también pueden separarse mediante técnicas convencionales de cromatografía como, por ejemplo, SEC, HPLC y similares. Una vez separado el complejo primera especie de interés/ligando de la segunda especie de interés, pueden separarse y disociarse los componentes del complejo utilizando una de las mismas técnicas descritas anteriormente para separar el complejo de la segunda especie de interés. El complejo puede disociarse con cualquier tratamiento que altere la interacción entre las dos moléculas, por ejemplo disminuyendo el pH del sistema en el que se hallan o añadiendo al sistema cualquier componente que sirva para disociar la primera especie de interés del ligando.
El procedimiento descrito aquí es en teoría útil para cualquier aplicación que requiera separar una entidad de una mezcla de otra entidad presente en la mezcla. Entre las aplicaciones preferidas se incluyen, por ejemplo, la separación y purificación de una o más proteínas de una mezcla compleja formada por distintas proteínas, en especial durante la producción a gran escala de proteínas recombinantes. Los procedimientos de la presente invención son aplicables a la separación y purificación de una amplia serie de moléculas biológicas, por ejemplo, productos proteínicos de fermentación de microorganismos naturales o producidos mediante ingeniería genética, polipéptidos, anticuerpos, secreciones celulares, coloides, micoplasma, endotoxinas, virus, bacterias, aminoácidos, ADN, ARN, carbohidratos y similares.
La presente invención tiene numerosas ventajas respecto de la técnica anterior. Por ejemplo, el procedimiento que se describe aquí tiene la ventaja frente a los procedimientos habituales de cromatografía de afinidad sobre matriz sólida que utiliza ligandos de bajo peso molecular que son solubles en una disolución libre. Así pues, mientras que en la cromatografía de afinidad existen limitaciones conformacionales, que dependen tanto del ligando como de la especie a la que se une, no es este el caso con los procedimientos que se describen aquí. Además, la capacidad de separación de un sistema de cromatografía de afinidad se halla limitada por el área de la superficie de la matriz sólida utilizada y por la densidad a la que el área de la superficie es sustituida con ligando. Al contrario, la capacidad de separación de los procedimientos descritos aquí sólo se ve limitada por la solubilidad del ligando en la mezcla fluida. Además, la presencia de matriz sólida en un sistema de cromatografía de afinidad hace posible que las proteínas de la matriz interaccionen de forma inespecífica, motivo por el cual la separación molecular es menos
eficaz.
El procedimiento descrito aquí también tiene ventajas sobre la ultrafiltración de afinidad, ya que los grandes ligandos poliméricos empleados en la ultrafiltración de afinidad a menudo no se encuentran disponibles o no pueden sintetizarse con facilidad, mientras que los ligandos solubles de bajo peso molecular empleados en la presente invención sí se hallan disponibles y/o pueden sintetizarse sistemáticamente. Además, la ultrafiltración de afinidad se limita a aplicaciones en las que se emplean procesos de ultrafiltración mientras que el presente procedimiento puede utilizarse en una variedad de técnicas distintas de separación molecular como, por ejemplo, muchos de los tipos de filtración de membrana, así como en procedimientos de cromatografía. Además, la ultrafiltración de afinidad a menudo proporciona relativamente pocos resultados y factores de purificación dada la escasa solubilidad en las disoluciones de muchos de los grandes ligandos poliméricos, problema que se resuelve utilizando ligandos solubles de bajo peso molecular como en la presente invención.
Se proporcionan más detalles de la invención en los siguientes ejemplos que no son los únicos.
C. Ejemplos Ejemplo 1 Separación molecular de IgG humanizada y recombinante de una impureza de albúmina sérica bovina mediante un ligando soluble de proteína A
El procedimiento de separación molecular de interacción con el ligando descrito aquí se utilizó para separar una proteína IgG humanizada y recombinante de una mezcla que también contenía la proteína albúmina sérica bovina modificada con sulfhidrilo como impureza. Se recurrió a la SEC mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para identificar cada una de las moléculas, así como para demostrar la formación de complejos, la disociación y la separación de proteínas del ligando. El sistema HPLC constaba de bomba cuaternaria, automuestreador e inyector, detector de absorbancia ultravioleta, un módulo interfaz, un ordenador y software de adquisición y procesado de datos de Hewlett Packard Chemstation (Modelo 1050 HPLC, Hewlett Packard, Inc., Palo Alto, California).
El complejo se formó utilizando IgG humanizada y recombinante (rhuIgG) como producto proteínico de interés y proteína A recombinante (rPrA) como ligando de bajo peso molecular con el que interacciona. Las disoluciones de reserva se preparaban en el tampón de fase móvil (NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1) a una concentración de 8 mg/ml y 5 mg/ml, respectivamente. Las disoluciones de reserva se combinaron y diluyeron en este tampón para formar un complejo que contuviera 0,8 mg/ml de rhuIgG y 0,2 mg/ml de rPrA.
El monómero de la albúmina sérica bovina (BSA) fue purificado de la BSA modificada con sulfhidrilo por la Miles Corporation mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Este monómero se utilizó como impureza. Se preparó una solución de reserva en el tampón de fase móvil (NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1) a una concentración final de 5 mg/ml.
Para formar el complejo en presencia de la impureza, se añadió rPrA a una disolución de rhuIgG y BSA en el tampón de fase móvil (NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,1) a una concentración final de 0,8 mg/ml de rhuIgG, 0,2 mg/ml de rPrA y 0,3 mg/ml de BSA. Como control, para demostrar la separación de la impureza del producto sin la presencia del complejo, se combinaron las disoluciones de reserva de rhuIgG y BSA y se diluyeron en el tampón de fase móvil hasta una concentración final de 0,8 mg/ml y 0,3 mg/ml, respectivamente.
Las muestras de cada una de las tres disoluciones de reserva, así como las muestras de las disoluciones formadas por complejo, complejo-impureza y proteínas-producto-impureza, se inyectaron en columnas de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) tal como se explica más abajo para determinar los tiempos de retención y la separación de las distintas especies.
Se analizaron cada una de las disoluciones de reserva explicadas más arriba y varias mezclas de las mismas mediante cromatografía de exclusión por tamaño tal como sigue. Las muestras se inyectaron en dos columnas Superdex 200 (diámetro interno = 10 mm, longitud = 300 mm por columna, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey) que se colocaron en serie. Como fase móvil se utilizó un tampón que contenía NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M y con un pH 7,1 \pm 0,1. Tras introducirlas en las columnas, las muestras se separaron en las columnas a un caudal volumétrico de 0,5 ml/minuto. El tiempo total transcurrido por muestra fue de 90 minutos. La elución de proteínas se determinó mediante absorbancia ultravioleta a 280 nm. Estos parámetros se resumen en la
tabla 1.
TABLA 1 Procedimiento HPLC-SEC: separación complejo-impureza
Columna: \begin{minipage}[t]{49mm} Superdex 200 10/30, dos en serie (60 cm) Intervalo de separación: de 10.000 a 600.000 Mr volumen total de la columna 48 ml\end{minipage}
Tampón introducido: Tris base 0,025 M
NaCl 0,025 M
EDTA pH 7,1 \pm 0,1 0,005 M
Caudal 0,5 ml/minuto
Tiempo transcurrido 90 minutos
Longitud de onda UV 280 nm
Bajo las condiciones de separación descritas más arriba, no pudo separarse la impureza de BSA del producto rhuIgG. Por ejemplo, tal como se muestra en las figuras 1 y 2, se constató que los tiempos de retención de cada una de las moléculas de BSA y rhuIgG eran muy parecidos: 55,9 minutos para la rhuIgG (figura 1) y 57,7 minutos para la BSA (figura 2). Cuando se preparó y analizó una mezcla de moléculas de rhuIgG y BSA mediante el procedimiento de separación SEC-HPLC explicado anteriormente, se observó un único máximo con un tiempo de retención de 56,7 minutos (figura 3), lo que prueba que el producto proteínico deseado (rhuIgG) no puede separarse de la impureza (BSA).
La formación del complejo rhuIgG/rPrA se demostró mediante el procedimiento HPLC-SEC descrito más arriba con la observación de un único pico de 43,7 minutos tras la inyección de la disolución que contenía un complejo formado por 0,8 mg/ml de rhuIgG y 0,2 mg/ml de rPrA (figura 4). Cuando se inyectaban por separado, los tiempos de retención de la rhuIgG y la rPrA eran de 55,9 minutos (figura 1) y 52,3 minutos (figura 4), respectivamente. La desviación a un único pico con un tiempo de retención menor que en el caso de cada una de las moléculas por separado indica la formación de un complejo con un mayor peso molecular y volumen hidrodinámico.
La formación del complejo entre la rhuIgG y la rPrA y, por lo tanto, la modificación del volumen hidrodinámico efectivo de la proteína ahora permitía separar la impureza de BSA del complejo rhuIgG/rPrA. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 6, el tiempo de retención del complejo era de 47,8 minutos mientras que el tiempo de retención de la impureza claramente diferenciada de BSA era de 56,9 minutos. Así, mediante la introducción de un ligando de bajo peso molecular capaz de interaccionar con una proteína producto que, por lo tanto, altera el peso molecular y el volumen hidrodinámico efectivos del producto proteínico, puede separarse de forma eficaz la proteína producto (en forma de complejo con un ligando) de una impureza que no es separable de la proteína producto cuando se combina por separado.
Tras separar la impureza de BSA del complejo rhuIgG/rPrA tal como se ha explicado antes, se disoció el complejo en cada uno de sus componentes que, a su vez, se separaron para obtener un producto proteínico puro de rhuIgG que carezca de BSA y rPrA. Se observó disociación del complejo rhuIgG/rPrA en cada uno de los distintos componentes rhuIgG y rPrA por medio de la alteración del pH y la fuerza iónica de la disolución tal como se indica.
En concreto, se colocaron en serie dos columnas Superose 6 (diámetro interno = 10 mm, longitud = 300 mm por columna, Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey). Como fase móvil se empleó un tampón que contenía ácido acético 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 3,5 \pm 0,1, con un caudal volumétrico de 0,4 ml/min. La elución de proteínas se controló mediante absorbancia ultravioleta a 214 nm. El tiempo total transcurrido por muestra inyectada fue de 110 minutos. Estos parámetros se resumen más abajo en la tabla 2.
TABLA 2 Procedimiento HPLC-SEC: disociación del complejo y separación de los componentes
Columna \begin{minipage}[t]{49mm} Superose 6 10/30, dos en serie Intervalo de separación de 5.000 a 5.000.000 Mr volumen total de la columna 48 ml \end{minipage}
Tampón introducido Ácido acético 0,1 M
NaCl pH 3,5 \pm 0,1 0,15 M
Caudal 0,4 ml/minuto
Tiempo transcurrido 110 minutos
Longitud de onda UV 214 nm
Se inyectaron muestras de cada una de las disoluciones de reserva de rhuIgG y rPrA, así como la disolución compleja que contenía 0,8 mg/ml de rhuIgG y 0,2 mg/ml de rPrA, en la columna para determinar los tiempos de retención y separación de las distintas especies. Las muestras se prepararon con un tampón activo de NaCl 0,025 M, Tris base 0,025 M, EDTA 0,005 M, pH 7,1 \pm 0,01. Puesto que el volumen de la muestra inyectado era muy pequeño comparado con el volumen total de la columna (carga del 0,2%), los cálculos teóricos mostraron que las muestras se intercambiaban en la fase móvil de ácido acético 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 3,5 \pm 0,1 y en el primer centímetro de altura de la columna.
Bajo las nuevas condiciones más ácidas de los tampones, el análisis de cada una de las muestras de rhuIgG y rPrA puso en relieve tiempos de retención de 91,8 minutos para la rhuIgG (figura 7) y de 80,6 minutos para la rPrA
(figura 8).
El análisis de una inyección del complejo mostró una separación inicial de dos picos con tiempos de retención que se correspondían con los picos de cada uno de los componentes rhuIgG y rPrA (figura 9: 91,8 minutos y 80,4 minutos, respectivamente). Estos resultados indican que en estas condiciones el complejo se está separando en cada uno de los componentes rhuIgG y rPrA, de modo que puede obtenerse la reserva de rhuIgG como producto purificado.
Los resultados presentados arriba demuestran que la separación de una impureza de un producto proteínico es factible en una disolución libre si se añade un ligando de menor peso molecular que pueda interaccionar con el producto proteínico y, por lo tanto, se alteran el peso molecular y el volumen hidrodinámico del producto proteínico que pasa a ser separable de la impureza. Tal como se ha demostrado más arriba, la unión de afinidad permitió la formación del complejo proteína/ligando (rhuIgG/rPrA). Esta interacción alteró las propiedades de la proteína rhuIgG y por consiguiente se formó una molécula con un mayor volumen hidrodinámico. Estas nuevas propiedades permitieron separar la impureza de BSA de la proteína rhuIgG mediante HPLC-SEC. Después de separar el complejo de la impureza, éste se disoció satisfactoriamente en cada uno de sus componentes modificándose las condiciones de la disolución, el pH y la fuerza iónica. La purificación final del producto rhuIgG se consiguió separando cada una de las moléculas de proteína y de ligando mediante HPLC-SEC.
La anterior descripción explica con detalle procedimientos concretos que pueden emplearse para poner en práctica la presente invención. Después de haber explicado con detalle tales procedimientos, quienes sean expertos en la materia tendrán los conocimientos suficientes para planear procedimientos alternativos fiables para conseguir la misma información utilizando los frutos de la presente invención. De hecho, no obstante, por detallada que la anterior pueda aparecer en el texto, no debería interpretarse como limitante de la perspectiva global de esto; al contrario, el contexto de la presente invención sólo puede establecerse mediante la determinación legítima de las reivindicaciones incluidas.

Claims (11)

1. Procedimiento para separar una primera especie de interés de una segunda especie de interés en una mezcla en disolución libre que comprende dicha primera y segunda especie de interés, teniendo dichas primera y segunda especie aproximadamente el mismo volumen hidrodinámico, comprendiendo dicho método:
poner en contacto dicha mezcla en disolución libre con un ligando soluble en dicha mezcla en disolución libre, en la que dicho ligando interacciona con dicha primera especie, en la que el peso molecular de dicho ligando es menor que el peso molecular de dicha primera especie y en la que dicha interacción forma un complejo primera especie/ligando que tiene un mayor volumen hidrodinámico que el de dicha segunda especie en la disolución libre; y
separar dicho complejo primera especie/ligando de dicha segunda especie mediante cromatografía de exclusión por tamaño o filtración de membrana;
proporcionar una composición que básicamente carezca de la segunda especie; y
en la que dicha primera especie se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un polipéptido y un anticuerpo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la primera especie de interés comprende una inmunogammaglobulina y dicho ligando es proteína A.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha cromatografía de exclusión por tamaño se realiza a una fuerza iónica inferior a aproximadamente 100 mM.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de separación se lleva a cabo mediante filtración de membrana.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha filtración de membrana es filtración de flujo tangencial.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha filtración de flujo tangencial es filtración de flujo tangencial de alto rendimiento.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha filtración de membrana es la ultrafiltración, la ósmosis inversa o la microfiltración.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de disociar dicho complejo primera especie/ligando en cada uno de sus componentes, en el que la disociación se produce tras dicha etapa de separación.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que más de un ligando interacciona con dicha primera especie de interés.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ligando no interacciona con dicha segunda especie de interés.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha primera especie de interés es una impureza.
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