ES2255083T3 - Determinacion electroquimica de la fructosamina. - Google Patents

Determinacion electroquimica de la fructosamina.

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ES2255083T3 ES96936479T ES96936479T ES2255083T3 ES 2255083 T3 ES2255083 T3 ES 2255083T3 ES 96936479 T ES96936479 T ES 96936479T ES 96936479 T ES96936479 T ES 96936479T ES 2255083 T3 ES2255083 T3 ES 2255083T3
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Abstract

Un método para determinar electroquímicamente la concentración de una fructosamina en una muestra de fluido corporal de un paciente que comprende las etapas de: a. poner en contacto dicha muestra de fluido corporal con un agente de tamponado y un biosensor, comprendiendo dicho biosensor un ánodo y un cátodo; b. aplicar un voltaje al ánodo; c. medir la corriente eléctrica que pasa entre el ánodo y el cátodo; y d. comparar la cantidad de corriente medida a una curva normal de corriente frente a la concentración de fructosamina, tal como se determina para dicho fluido corporal, ajustando dicho agente de tamponado el pH de la muestra de fluido corporal a entre aproximadamente 10 y aproximadamente 12, 5, y pudiendo estar dicho agente de tamponado sobre el biosensor o, si no, añadido a la muestra antes de medir la corriente.

Description

Determinación electroquímica de la fructosamina.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a un sistema de ensayo para determinar el estado glucémico de un individuo diabético. Más específicamente, se refiere a la medida electroquímica de la concentración de fructosamina en una muestra de fluido corporal del paciente.
Información sobre los antecedentes
Los individuos que padecen diabetes melitus tienen un nivel de azúcar en la sangre anormalmente alto generalmente porque el páncreas no secreta cantidades suficientes de la hormona activa insulina en la corriente sanguínea como para regular el metabolismo de los hidratos de carbono. Si se deja que continúe un nivel de azúcar en sangre anormalmente alto, lo que se conoce como un estado hiperglucémico, durante períodos prolongados, el individuo sufrirá complicaciones crónicas de la diabetes, incluyendo retinopatía, nefropatía, neuropatía y enfermedad cardiovascular. Los estudos indican que los pacientes diabéticos que son capaces de mantener un control glucémico cercano al normal reducen en gran medida la probabilidad de estas complicaciones extremas. Por lo tanto, se han desarrollado diferentes pruebas para medir y llevar un seguimiento del estado glucémico.
Una de las pruebas médicas más comunes para vigilar el estado glucémico consiste en que los propios diabéticos midan directamente los niveles de glucosa en la sangre. Dado que los niveles de glucosa en la sangre fluctúan significativamente a lo largo de un día determinado, en lo que influye la dieta, la actividad y el tratamiento, que depende de la naturaleza y gravedad de cada caso particular, algunos pacientes miden sus niveles de glucosa en sangre hasta siete veces al día. En función del patrón observado en los niveles de glucosa medidos, el paciente y el médico conjuntamente realizan ajustes en la dieta, el ejercicio y el consumo de insulina para tratar mejor la enfermedad. Claramente, esta información deberá ser asequible al paciente de manera inmediata.
No obstante, dado la frecuente fluctuación de los niveles de glucosa en un día determinado, se han desarrollado también pruebas que no dependen de la dieta, actividad y/o tratamiento del paciente y que proporcionan indicaciones más a largo plazo de los niveles de glucosa en sangre. Estas pruebas incluyen la determinación de glucosa unida a proteínas.
Las proteínas, como por ejemplo las presentes en la sangre completa, el suero y otros fluidos biológicos, reaccionan con glucosa en condiciones no enzimáticas, para producir proteínas glicadas, también conocidas como fructosamina. El grado de reacción depende directamente de la concentración de glucosa en sangre. En consecuencia, los diabéticos tienen normalmente una elevada concentración de fructosamina en comparación con un individuo sano. Por consiguiente, la concentración de proteínas en suero glicadas ha sido utilizada como indicador de un estado hiperglucémico. En particular, la medida de los niveles de fructosamina es útil para llevar un seguimiento de control diabético, ya que la concentración de fructosamina refleja un promedio de los niveles de glucosa en el suero durante un período de tiempo, aproximadamente un período de medio mes.
Las fructosaminas se forman del siguiente modo. Se glican in vivo las proteínas de la sangre, como por ejemplo albúmina de suero a través de una reacción de condensaión no enzimática entre la glucosa y los grupos amino disponibles de las proteínas de la sangre, principalmente los grupos \varepsilon-amina de radicales lisina y los grupos \alpha-amino del terminal amino ácido de la proteína. La glucosa se une a un grupo amino de la proteína para formar una base de Schiff, es decir, una glucosilamina o aldimina. La glucosilamina experimenta un reordenamiento molecular, específicamente un reordenamiento de Amadori, para formar una cetoamina estable, denominada "fructosamina". Esta secuencia de reacción se ilustra en la figura 1a. Una vez formada, la estructura de cetoamina estable permanece con la proteína a lo largo de toda su
vida.
Una propiedad particularmente útil de la fructosamina es que, en condiciones básicas, está en equilibrio con su tautómero eneaminol, también denominado tautómero eneaminol de fructosamina. Esta conversión de equilibrio se expone en la figura 1b. El tautómero de eneaminol es un agente reductor. Véase, por ejemplo Burd y cols., patente estadounidense Nº 5.470.752, 28 de noviembre de 1995, e Ismail, patente estadounidense Nº 4.956.301, 11 de septiembre de 1990. Son las propiedades de reducción de la fructosamina y su tautómero lo que se presta para uno de los aspectos de la presente invención y la determinación electroquímica de fructosamina. La oxidación del tautómero de eneaminol produce glucosona y proteína sin glicar, tal como se expone con más detalle en la figura 1c.
Se conocen ya varios métodos para medir fructosamina a través de otros métodos distintos a la determinación electroquímica. Por ejemplo, Baker, en las patentes EE.UU. Nº 4.642.295 y 4.645.742, describe métodos para determinar los niveles de fructosamina en un ensayo en solución. Estos tipos de ensayos presentan varias limitaciones prácticas, tales como la inconveniencia asociada a los ensayos en solución y la necesidad de volúmenes relativamente grandes de muestra líquida. Dichos métodos han sido adaptados a química en fase deshidratada, por ejemplo por Ismail, tal como se describe en la patente EE.UU. 4.956.301. Sin embargo, el ensayo en fase deshidratada de Ismail consiste en un dispositivo de tira de ensayo, que requiere el uso de un compuesto acelerador de reacción. Los compuestos aceleradores descritos son incapaces de rendir con determinados reactivos que son específicamente útiles en los ensayos de fructosamina, en concreto azul nitro - cloruro de tetrazolio (NBT) y tampón de carbonato. Los dispositivos de ensayo de varias capas para determinar la concentración de fructosamina también son conocidos dentro de la especialidad. Por ejemplo, Sakamoto, en la publicación de patente europea publicada Nº 0.473.189, describe un elemento de análisis de varias capas para ensayar fructosamina. Staniford y cols., en la publicación de solicitud de patente europea Nº 526.150, explica un método enzimático que comprende el pretratamiento de una muestra que contiene fructosamina con una proteasa, a continuación, la reacción de la muestra con cetoamina oxidasa, y la medida de los resultados colorimétricamente. Modrovich y cols. en la solicitud de patente europea Nº 573.942, detecta fructosamina colorimétricamente con una sal de tetrazolio, utilizando un método de sustracción en el que se emplea una reacción adicional en la que se trata la muestra con ácido bórico para bloquear la oxidación de fructosamina.
Hill y cols., patente EE.UU. Nº 4.820.636, describe la determinación electroquímica de un compuesto de tipo fructosamina, hemoglobina glucosilada (HbAlc), utilizando glucosa oxidasa y un ácido borónico de metaloceno como mediador. Cuando está presente HbAlc, reacciona con el ácido borónico de metaloceno para prevenir la reacción entre este mediador de metaloceno y glucosa oxidasa reducida. Ishikawa y cols., patente EE.UU. Nº 5.387.109 y la solicitud de patente europea Nº 576.838 describen principalmente la determinación colorimétrica de fructosamina utilizando la enzima fructosilamina deglicasa. Ishikawa y cols., menciona brevemente la detección de los productos de reacción H_{2}O_{2}/O_{2} de la reacción catalizada por enzima con electrodos H_{2}O_{2} y O_{2} especializados, respectivamente, pero dichos electrodos presentan bastantes más inconvenientes en su uso que los biosensores de la presente invención que detectan fructosamina, enzimas y mediadores.
Davis y cols., patente EE.UU. Nº 4.758.323, describe un sistema de detección de multi-enzima de una enzima o de su sustrato específico, que comprende un cofactor que une la enzima (E1)/parte mediadora del sistema con la enzima (E2)/parte de sustrato del mismo sistema.
La mayoría de los métodos que se han indicado emplean métodos de detección colorimétricos. Con la determinación colorimétrica existe frecuentemente la interferencia del color natural de la muestra o el precipitado. Por ejemplo, los glóbulos rojos de la sangre de la muestra de sangre del paciente pueden interferir en la determinación colorimétrica. Por otra parte, el volumen de la muestra que se requiere frecuentemente con los ensayos que se han descrito para conseguir una determinación apropiada constituye típicamente una cantidad significativa. Existe la necesidad de contar con un ensayo de fructosamina que no presente ninguna interferencia del color o el precipitado y que se pueda utilizar con volúmenes de muestra relativamente reducidos. Asimismo, existe la necesidad de contar con un ensayo rápido y cómodo para medir fructosamina en muchos tipos de muestras de fluido corporal. Finalmente, es deseable, contar con un ensayo que implique una instrumentación relativamente simple y que, preferiblemente, se pueda miniaturizar. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona las ventajas asociadas
también.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método para determinar electroquímicamente la concentración de una fructosamina en una muestra de fluido corporal de un paciente. Esto se averigua poniendo en contacto dicha muestra de fluido corporal con un agente de tamponado y un biosensor, que consiste en un ánodo y un cátodo. Se aplica un voltaje entre el ánodo y se mide la corriente eléctrica que pasa entre el  ánodo y el cátodo. Se compara la cantidad de corriente medida con una curva patrón de la corriente frente a la concentración de fructosamina, tal como se determina para dicho fluido corporal. El agente de tamponado ajusta el pH de la muestra de fluido corporal a entre aproximadamente 10 y aproximadamente 12,5. El agente de tamponado puede estar en el biosensor o puede añadirse si no a la muestra antes de medir la corriente.
Breve descripción de los gráficos
La figura 1a es un diagrama de la condensación de una proteína y glucosa para formar una glucosilamina y el subsiguiente reordenamiento de Amadori a una fructosamina.
La figura 1b es un diagrama del equilibrio alcalino entre una fructosamina y su tautómero de eneaminol.
La figura 1c es un diagrama de un tipo de reacción de oxidación de una fructosamina o eneaminol, con el resultado de glucosona y una proteína libre.
La figura 2 representa esquemáticamente la oxidación de fructosamina ("F") o el tautómero eneaminol en el ánodo (zona sombreada).
La figura 3 representa los resultados obtenidos en el ejemplo I más adelante. Los tres puntos de datos son para las soluciones 0,5, 1,0 y 1,5 mM de albúmina de suero humano glicada denominados "fructosamina" en el eje de abscisas del gráfico.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la determinación del nivel de glucosa en sangre de mamífero midiendo electroquímicamente la cantidad de fructosamina (también denominada "cetoaminas") (Fig. 1a), o su tautómero de alta alcalinidad, denominado "eneaminol" (fig. 1b), presente en la muestra del paciente. La invención permite en uno de sus aspectos la comodidad de medir directamente, a un pH alcalino, la concentración de enaminol presente.
Más específicamente, la técnica electroquímica utilizada en la presente invención bioanalítica es conocida como amperometría. Dicha técnica implica la medida de la corriente que pasa a un voltaje fijo. El voltaje se fija en este caso mediante el voltaje de oxidación de fructosamina y su tautómero eneaminol, que son fuertes agentes de reducción.
Uno de los aspectos de la presente invención se refiere a la detección electroquímica directa de fructosamina, y más en particular, su forma tautómero eneaminol alcalina (figura 2). Según esto, se pone en contacto la muestra de fluido corporal con un agente de tamponado sólido (en la superficie del biosensor) o una solución de tampón (que se añade a la muestra de fluido corporal) con el fin de llevar el pH de la solución resultante a entre aproximadamente 10 y aproximadamente 12,5, y preferiblemente entre aproximadamente 10,3 y aproximadamente 11,5. El agente de tamponado utilizado no deberá contener grupos oxidables. Entre los agentes de tamponado útiles se incluyen CAPS ácido (3-ciclohexilamina)-1-propano sulfúrico, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri); hidrogen fosfato sódico/hidróxido sódico; sales de guanadinio como carbonato de guanadinio y fosfato de guanadinio; cloruro potásico/hidróxido sódico; hidrogen fosfato potásico; hidróxido sódico metanólico; hidróxido de tetrametilamonio; carbonato sódico/bicarbonato sódico; determinados aminoácidos; y otros tampones adecuados tal como se conoce en la especialidad; o una combinación de ellos. El agente de tamponado puede secarse sobre una malla porosa que rodea al ánodo (o las mallas que rodean otros electrodos) con el fin de que el agente se pueda disolver en la muestra de fluido corporal en contacto.
Una variación de la detección directa de fructosamina entraña poner en marcha una célula de control en la que se bloquea la electroreactividad de la fructosamina en la muestra de fluido corporal utilizando ácido bórico o uno o más derivados de ácido borónico, como los antes indicados.
Los fluidos corporales contienen frecuentemente sustancias que se pueden oxidar a un pH y voltaje similar a la fructosamina. Entre dichas sustancias se incluyen ácido úrico y ácido ascórbico. En la situación en la que surge dicha interferencia, se puede llevar a cabo una oxidación adicional en una porción de la muestra de fluido corporal utilizando agentes de unión a fructosamina conocidos en la especialidad por bloquear la oxidación de fructosamina. Por ejemplo, se puede añadir ácido bórico a una porción de la propia muestra en conjunción con el uso de una malla porosa sobre un biosensor. En una semi-célula de ánodo idéntica, se mide la corriente que pasa de la misma manera que en el anolito o muestra sin tratar. El valor de corriente de la muestra o anolito tratado se sustrae del valor de corriente del que no está tratado para medir la concentración de fructosamina. La precisión de este método se asegura porque la fructosamina que está presente en la sangre completa y los fluidos corporales relacionados está presente normalmente en la concentración más alta de cualquier compuesto de unión a ácido borónico o ácido bórico sujeto a una reducción a pH de 10 a 12,5. El uso de ácido bórico en análisis no electroquímicos se describe en I.E. Modrovich, publicación de solicitud de patente europea Nº 573.942, publicada el 15 de diciembre de 1993.
Alternativamente, en Hill y cols., patente EE.UU. Nº 4.820.636, publicada el 11 de abril de 1989 se describen ácidos borónicos de metaloceno, u otros derivados de ácido borónico alternativos, que se pueden utilizar de la misma manera que ácido bórico con el fin de proporcionar un método de control adecuado.
Alternativamente, los agentes de unión de fructosamina pueden ser anticuerpos contra epítopos de fructosamina, que pueden aumentar la precisión de la presente invención. Dichos anticuerpos se ilustran en la patente EE.UU. Nº 4.478.744 para Mezer, patente EE.UU. Nº 4.806.468 para Wagner y cols., patente EE.UU. Nº 5.183.739, para Cohen y la patente EE.UU. Nº 5.206.144 para Zeuthen y cols.
La concentración de fructosamina o el tautómero eneaminol puede medirse indirectamente, es decir, midiendo la concentración de una sustancia que acepta electrones de fructosamina o del eneaminol que a su vez se oxida en el ánodo. Estas sustancias pueden proporcionar una reducción del voltaje o el pH del ensayo, entre otras ventajas.
El aparato utilizado en la presente invención puede consistir en una célula electroquímica convencional o una forma más reducida de una célula electroquímica denominada comúnmente "biosensor". El término "biosensor" significa lo mismo que el término utilizado en la especialidad, es decir, un dispositivo en el que al menos un ánodo y un cátodo están contenidos en un soporte aislante, de manera que algo tan reducido como una gota (es decir, no más de aproximadamente 10 microlitros) de muestra del paciente, hará contacto tanto con el ánodo como con el cátodo. La diferencia entre un biosensor y una célula electroquímica convencional consiste principalmente en el tamaño físico del ánodo y el cátodo, el tamaño, o la completa ausencia de un anolito o catolito, respectivamente, así como la cantidad de la muestra de fluido que se va a medir. Independientemente del tipo de aparato utilizado, los electrodos deben ir conectados tanto a un suministro de energía eléctrica como a un dispositivo para medir tanto el voltaje aplicado entre los electrodos como la cantidad de corriente generada de la oxidación de fructosamina y su tautómero en el ánodo. Dado que es la oxidación de fructosamina o el tautómero lo que se mide directa o indirectamente, el ánodo es el electrodo activo para la presente invención. Puede utilizarse opcionalmente un tercer electrodo, también denominado electrodo de referencia, para ayudar a llevar un seguimiento del progreso de otras reacciones en el ánodo.
Finalmente, una opción más consiste en utilizar un cuarto electrodo, o electrodo auxiliar, que es un segundo ánodo, ajustado a un voltaje diferente, normalmente más bajo, que el electrodo activo. El electrodo auxiliar se puede utilizar para oxidar sustancias de interferencia (como por ejemplo ácido úrico).
La presente invención se lleva a cabo mediante células electroquímicas y biosensores en los que se conocen, dentro de la especialidad de electroquímica y bioanalítica, la composición y la forma de los electrodes y, si son aplicables, los separadores de célula de electrolito y las mallas porosas que rodean a los electrodos. En particular, entre los libros de texto útiles se incluyen Organic Electrochemistry, M.M. Baizer, editor Marcel Dekler, Inc. Nueva York (1973) y Biosensor Fundamentals and Applications, Turner, Karube and Wilson, editores, OUP (1987). Por otra parte, se puede encontrar más información sobre células y biosensores adecuados para la presente invención en McAleer y cols., patente EE.UU. Nº 5.264.106, publicada el 23 de noviembre de 1993; Green y cols., patente EE.UU: Nº 4.876.205, publicada del 24 de octubre de 1989; Higgins y cols., patente EE.UU. Nº 4.545.382, publicada el 8 de octubre de 1985; Foulds y cols., patente EE.UU. Nº 5.124.253, publicada el 23 de junio de 1992; Hill y cols., patente EE.UU. Nº 4.820.636, publicada el 11 de abril de 1989; Kuhn y cols., patente EE.UU. Nº 5.385.846, publicada el 31 de enero de 1995; y N. G. Carter y cols., solicitud de patente europea Nº 593.096, publicada el 20 de abril de 1994.
Los ánodos que se pueden emplear en la presente invención están hechos por ejemplo de carbón vítreo, pasta de carbono, fieltro de carbón, grafito, fieltro de grafito, grafito pirolítico, mercurio, cobre, plomo, zinc, platino, plata, oro, titanio o cadmio o un material carbonáceo revestido con una capa catalítica de metal de transición. Preferiblemente, el ánodo está hecho de un metal de transición o una forma de carbono, y más preferiblemente, oro, platino o carbón vítreo. El material de ánodo deberá estar más bien altamente purificado, tal como ocurre normalmente en la especialidad.
El cátodo puede estar hecho de cualquier material purificado que no sea atacado por el lado reductor de la oxidación de fructosamina. Los cátodos para la presente invención están hechos normalmente de metales nobles, especialmente platino u otro material de electrodo comúnmente utilizado, como carbono. Un electrodo de platino es el cátodo preferible.
El electrodo de referencia, cuando se utiliza, es generalmente de un voltaje normal conocido. Dicho electrodo puede consistir en un electrodo de mercurio/cloruro de mercurio (calomel saturado, o SCE) o de plata/ cloruro de plata, prefiriéndose éste último.
Las formas de los electrodos utilizadas en la presente invención no son críticas; pueden ser iguales o diferentes y pueden presentarse en forma de lámina sólida, bastón, película, gasa metálica o tela metálica, impermeable o de micropartículas porosas, o como un lecho fluidizado de partículas, con resultados igualmente buenos.
Es eficaz sobre todo disponer los electrodos de manera que la distancia entre el ánodo y el cátodo, y los demás electrodos, cuando están presentes, sea lo más pequeños posible, sin que interfieran las semi-reacciones que tienen lugar en cada electrodo con la correspondiente semi-reacción en los otros electrodos. En una configuración de biosensor, es deseable espaciar el ánodo del cátodo sin fluido adicional, de manera que sólo sea necesario el uso de únicamente una gota o dos de muestra de fluido corporal (v.g., sangre, plasma, suero, saliva u orina). En general, es deseable una íntima proximidad física para reducir al mínimo el flujo de corriente y reducir al mínimo la elevación de temperatura causada por la resistencia de la muestra líquida corporal al flujo de corriente.
El voltaje entre el cátodo y el ánodo se puede controlar de diversas maneras. La manera más eficaz y precisa de controlar el voltaje es mediante el uso de un electrodo de referencia. El voltaje deseado para el proceso se determina a partir del examen de un voltamografo del sistema, y se ajusta el voltaje entre el cátodo y el ánodo a partir para dar el voltaje constante deseado entre el electrodo de referencia y el cátodo. Este método de control es mucho más efectivo que el control a través del voltaje global entre el cátodo y el ánodo, ya que dicho voltaje depende del estado de la membrana separadora, la concentración del catolito, así como la concentración del compuesto de fructosamina que ha de detectarse. Se puede llevar un seguimiento de los cambios de corriente a un voltaje fijo, preferiblemente, midiendo el tiempo de corriente (I-t) transitorio a un voltaje adecuado frente a un electrodo de cátodo. Un intervalo de voltaje adecuado es de aproximadamente 200 a aproximadamente 1100 milivoltios, prefiriéndose 1000 a 1100 milivoltios, frente a un cátodo de referencia de plata/cloruro de plata, para los métodos directos que se exponen a continuación, y de aproximadamente 100 mV a 1000 mV para los métodos asistidos.
El sensor eelectroquímico para su uso en la presente invención puede consistir en un sensor que implique detección amperométrica, y que utilice un elemento de tira, especialmente, una tira seca desechable. En consecuencia, los electrodos de sensor pueden comprender áreas de electrodo formadas por ejemplo por impresión de pantalla, pulverizado u otra técnica de depósito adecuada.
El sensor de tira seca puede comprender un sustrato de aislamiento eléctrico alargado que tenga un par de pistas conductoras de la electricidad, sustancialmente paralelas, longitudinales encima, estando provista cada una de las pistas en el mismo extremo con un mecanismo de conexión eléctrica con un mecanismo de lectura, así como un ánodo y un cátodo, pudiendo estar presentes electrodos adicionales tal como se ha explicado ya.
Más especialmente, dicho sensor se configura adecuadamente en forma de una tira de soporte de material eléctricamente aislante como, por ejemplo, un polímero sintético (por ejemplo pvc) que lleva en un punto localizado entre sus dos extremos los dos electrodos soportados en pistas impresas conductoras de la electricidad. Por ejemplo, los electrodos pueden adoptar la forma de dos áreas rectangulares una junto a otra sobre la tira. Dichas áreas pueden configurarse como un área objetivo que se va a recubrir con una sola gota de la muestra de fluido corporal, para su ensayo para determinar la concentración de fructosamina. Si se desea, se pueden emplear áreas de electrodo no rectangulares, por ejemplo, en forma de diamante, semicirculares, o triangulares, para proporcionar el área objetivo para un contacto optimizado mediante una muestra líquida.
Por otra parte, puede estar presente un tercer electrodo similar al electrodo de ánodo sobre la tira de soporte. Dicho electrodo auxiliar puede conducir a un resultado más fiable, ya que si se aplica un voltaje más bajo en el electrodo auxiliar, se puede sustraer la corriente que pasa entre éste último electrodo y el cátodo de la corriente que pasa en el ánodo, entonces la corriente resultante se debe a la oxidación de fructosamina.
En un procedimiento de fabricación típico de un biosensor, se puede aplicar por impresión de pantalla o de otra forma un adhesivo alrededor del área objetivo de muestra de cada biosensor de tira seguido de la colocación y adherencia sobre este área de un papel revestido con un mediador, co-factor y/o enzima, cuando está presente. Se puede colocar una malla porosa protectora revestida con un tampón sobre la capa objetivo de muestra y mantenerse en su sitio mediante una impresión de aislamiento aplicada generalmente sobre el elemento de ensayo con el fin de dejar descubierta tanto el área objetivo de muestra como los extremos terminales que se van a insertar en el dispositivo de lectura. La malla puede consistir en un polímero, como por ejemplo, nilón o poliéster. El tampón impregnado enzima es como ya se ha explicado.
El ejemplo que se expone a continuación sirve para ilustrar sin limitar por ello la invención.
Ejemplo I Determinación directa de fructosamina
Se disolvió albúmina de suero humano glicada (gHSA) en carbonato de guanidinio 1M (pH 11,5) para dar soluciones 0,5, 1,0 y 1,5 mM. Se exploró el voltaje de estas soluciones linealmente de -100 mV a +1200 mV, punto en el cual se invirtió la dirección, retornando la exploración a -100 mV. Se utilizaron un electrodo activo de carbón vítreo de 3 mm junto con un electrodo de referencia de Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de platino. La oxidación del gHSA tuvo lugar a +1040 mV y se midió la corriente correspondiente tal como se representa para la curva dosis-respuesta de la figura 3.

Claims (8)

1. Un método para determinar electroquímicamente la concentración de una fructosamina en una muestra de fluido corporal de un paciente que comprende las etapas de:
a. poner en contacto dicha muestra de fluido corporal con un agente de tamponado y un biosensor, comprendiendo dicho biosensor un ánodo y un cátodo;
b. aplicar un voltaje al ánodo;
c. medir la corriente eléctrica que pasa entre el ánodo y el cátodo; y
d. comparar la cantidad de corriente medida a una curva normal de corriente frente a la concentración de fructosamina, tal como se determina para dicho fluido corporal,
ajustando dicho agente de tamponado el pH de la muestra de fluido corporal a entre aproximadamente 10 y aproximadamente 12,5, y pudiendo estar dicho agente de tamponado sobre el biosensor o, si no, añadido a la muestra antes de medir la corriente.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que el ánodo comprende un metal de transición o una forma de carbono.
3. Un método según la reivindicación 2, en el que el ánodo consiste en carbón vítreo, platino u oro.
4. Un método según la reivindicación 1, en el que el pH del anolito se ajusta un pH de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5.
5. Un método según la reivindicación 1, que comprende además el contacto de un electrodo de referencia simultáneamente con una muestra de fluido corporal y la medida del voltaje entre el electrodo de referencia y el ánodo.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que el electrodo de referencia es un electrodo de plata/cloruro de plata.
7. Un método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:
a. poner en contacto la muestra de fluido corporal con un segundo biosensor, utilizando dicho biosensor el mismo agente de tamponado, ánodo y cátodo y dicho biosensor;
b. poner en contacto dicha muestra de fluido corporal con un agente de unión de fructosamina;
c. aplicar el voltaje idéntico al segundo ánodo;
d. medir adicionalmente la corriente entre el ánodo y el cátodo del segundo biosensor;
e. sustraer la corriente medida mediante el segundo biosensor de la medida para el otro biosensor; y
f. comparar la diferencia de los dos valores para dicha curva normal;
pudiendo estar dicho agente de unión a fructosamina sobre el biosensor o añadido a dicha muestra antes de medir la corriente.
8. Un método según la reivindicación 7, en el que el agente de unión a fructosamina es ácido bórico, uno o más derivados de ácido borónico, o uno o más anticuerpos anti-(fructosamina).
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