ES2241057T3 - Inhibicion de proteasomas 26s y 20s por medio de indanonas. - Google Patents
Inhibicion de proteasomas 26s y 20s por medio de indanonas.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA INHIBICION DE LA PROLIFERACION CELULAR MEDIANTE INDANONAS.
Description
Inhibición de proteasomas 26S y 20S por medio de
indanonas.
La presente invención se refiere a una clase de
compuestos de indanona nunca antes considerados para la inhibición
de la proliferación celular. Como inhibidores de proliferación
celular, los compuestos son útiles para el tratamiento del cáncer,
enfermedad cardiovascular, p. ej., restenosis, rechazo del
trasplante en el anfitrión, gota y otros trastornos proliferantes
además de ser terapéuticos potenciales para las enfermedades
autoinmunitarias, tales como la artritis reumatoide, lupus,
diabetes de tipo I, esclerosis múltiple y trastornos y enfermedades
similares.
La proteinasa multicatalítica o proteasoma es una
estructura celular muy conservada que es responsable de la
proteolisis dependiente del ATP de la mayoría de las proteínas
celulares. El proteasoma 20S (700 kDa) contiene por lo menos cinco
actividades proteolíticas distintas que presentan un nuevo tipo de
mecanismo que implica un resto de treonina en el punto activo (Coux,
O., Tanaka, K. y Goldberg, A. 1996 Ann. Rev. Biochem.
65:801-47).
El proteosoma 20S ha sido cristalizada a partir
de la arquebacteria Thermoplasma acidophilum (Lowe, J.,
Stock, D., Jap, B., Zwickl, P., Baumeister, W., y Huber, R. 1995
Science 268:533-539). El proteasoma 20S
arquebacteriano contiene catorce copias de dos tipos distintos de
subunidades, \alpha y \beta, que forman una estructura
cilíndrica constituida por cuatro anillos agrupados. Los anillos de
la parte superior y de la parte inferior contienen siete
subunidades \alpha cada uno mientras que los anillos internos
contienen siete subunidades \beta. Un poro se extiende a través
de la estructura que contiene los puntos proteolíticos activos y las
proteínas se destinan al paso de la degradación a través de este
canal. El proteosoma 20S eucariótico es más complejo que el de la
arquebacteria porque numerosas subunidades distintas han aumentado
durante la evolución, sin embargo, las subunidades se pueden
clasificar todavía según la nomenclatura \alpha y \beta de la
arquebacteria de acuerdo con su homología. Por tanto, la
estructura cuaternaria del complejo eucariótico es similar a la de
la arquebacteria que comprende dos anillos \alpha y dos \beta.
Sin embargo, independientemente del proteosoma arquebacteriano que
presenta principalmente actividad proteolítica similar a la
quimiotripsina (Dahlmann, B., Kopp, F., Kuehn, L., Niedel, B.,
Pfeifer, G., Hejerl, R. y Baumeister, W., 1989 FEBS Lett.
251:125-131, Seemuller, E., Lupas, A., Zuhl, F.,
Zwickl, P. and Baumeister, W. 1995 FEBBS Lett.
359-173-178; y Lowe, J., Stock, D.,
Jap, B., Zwickl, P., Baumeister, W. y Huber, R. 1995 Science
268:533-539). El proteosoma eucariótico contiene
por lo menos cinco actividades de proteasa identificables. Existen
péptidos denominados de tipo quimiotripsina, de tipo tripsina y de
peptidilglutamina hidrolizables. Se han descrito además otras dos
actividades, una que presenta una preferencia para le escisión de
los enlaces péptido en la parte del carboxilo de los aminoácidos de
cadena ramificada y la otra hacia los enlaces entre pequeños
aminoácidos neutros. (Orlowski, M. 1990 Biochemistry 29:
10289-10297).
Aunque el proteasoma 20S contiene el núcleo
proteolítico, no puede degradar las proteínas in vivo a menos
que esté acomplejado con un casquete de 19S en ambos extremos de su
estructura, que contienen múltiples actividades de ATPasa. Esta
estructura mayor es conocida como proteasoma 26S y degrada
rápidamente las proteínas que han sido dirigidas para su
degradación mediante la adición de múltiples moléculas del
polipéptido, ubiquitina, de 8,5 kDa.
La primera etapa para la ubiquitinación de una
proteína procede por activación de una molécula de ubiquitina en su
terminal carboxilo del resto de glicina mediante la adición de ATP
que crea un producto intermedio tioéster de alta energía. Esta
etapa está catalizada por la enzima activadora de ubiquitina, E1.
La ubiquitina se transfiere a continuación a un resto activo de
cisteína de una enzima conjugadora de ubiquitina, E2. Las enzimas
E2 atacan la ubiquitina en los grupos
\varepsilon-amino de los restos de lisina en la
proteína sustrato que está destinada a ser degradada. Este proceso,
en algunos casos requiere también una ubiquitina ligasa, E3. La
conjugación repetida de ubiquitina con restos de lisina de los
grupos de ubiquitina unidos anteriormente conduce a la formación de
cadenas de multi-ubiquitina y crea un soporte de
ubiquitina alrededor de la proteína sustrato. Las proteínas
sustrato multi-ubiquitinadas son reconocidas por el
proteasoma 26S y son degradadas y las cadenas de
multi-ubiquitina se liberan del complejo y se
recicla la ubiquitina.
Está todavía bajo investigación qué es lo que
origina que una proteína se llegue a ubiquitinar y, por lo tanto, a
degradar. Obviamente esto debe ser una serie muy regulada de
sucesos ya que la duración crítica de la degradación específica de
la proteína es crucial para muchas funciones del ciclo celular. Se
han propuesto varias señales que se centran mayormente en las
secuencias de la estructura interna dentro del propio sustrato. Una
de dichas propuestas es la "regla del N final" en la que el
resto del terminal amino de una proteína determina su vida media.
Otras proteínas tales como las ciclinas contienen una secuencia
corta de aminoácidos muy conservados denominada la "caja de
destrucción" que son aparentemente necesarios para la
degradación. Además las secuencias "PEST", que están
constituidas por regiones ricas en prolina, aspartato, glutamato,
serina y treonina también parece que actúan como señales de
degradación. Se cree que dichas secuencias internas actúan como
elementos de reconocimiento entre el sustrato de proteína y su
sistema de ubiquitinación específico.
Se han descrito dos tipos de inhibidores que
inhiben la actividad proteolítica del proteasoma. Se ha publicado
que determinados aldehídos de péptidos inhiben la actividad de tipo
quimiotripsina relacionada con el proteasoma (Vinitsky, A.,
Michaud, C., Powers, J. y Orlowski, M. 1992 Biochemistry
31:9421-9428; Tsubuki, S., Kawasaki, H., Saito, Y.,
Miyashita, N., Inomata, M. y Kawashima, S., 1993 Biochem.
Biophys. Res. Commun. 196:1195-1201; Rock, K.L.,
Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K., Stein, R., Dick, L., Hwang, D.
y Goldberg, A.L. 1994 Cell 78:761-771).
Éstos son
N-acetil-L-leucinil-L-leucinal-L-norleucinal
(ALLN) y un compuesto estrechamente relacionado,
N-acetil-L-leucinil-L-leucinil-metional
(LLM) con unas K_{i} de 0,14 \muM. El inhibidor más potente de
este tipo es un compuesto estructuralmente relacionado,
N-carbobenzoxil-L-leucinil-L-leucinil-L-norvalinal
(MG 115) que inhibe una K_{i} de 0,021 \muM. Aunque estos
aldehídos de péptido son más eficaces contra la actividad
proteolítica de tipo quimiotripsina de los proteasomas, estudios
meticulosos han demostrado que son inhibidores de proteasa no
específicos. Informes más recientes han descrito series de potentes
inhibidores de dipéptido que tienen valores de IC_{50} en el
intervalo entre 10 y 100 nM in vitro (Iqbal, M., Chatterjee,
S., Kauer, J.C., Das, M., Messina, P. A., Freed, B., Biazzo, W. y
Siman, R. 1995 J. Med. Chem. 38:2276-2277) y
una serie de inhibidores igualmente potentes in vitro de
dipéptidos derivados de \alpha-cetocarbonilo y del
éster bórico (Iqbal, M., Chatterjee, S., Kauer, J.C., Mallamo, J.P.,
Messina, P.A., Reiboldt, A. y Siman, R. 1996 Bioorg. Med. Chem.
Lett. 6:287-290).
Otro informe describe una clase de compuestos que
presentan especificidad en la inhibición de la actividad del
proteasoma (Fenteany, G., Standaert, R.F., Lane, W.S., Choi, S.,
Corey, E.J. y Schreiber, S.L. 1995 Science
268:726-731). La lactacistina es un metabolito de
Streptomyces que inhibe específicamente la actividad
proteolítica del complejo de proteasoma. Esta molécula se descubrió
al principio por su capacidad para producir excrecencia de la
neurita en una línea de células de neuroblastoma (Omura et
al., 1991 J. Antibiot. 44:113) después se demostró que
inhibe la proliferación de varios tipos de células (Fenteany et
al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3358).
Utilizando lactacistina radiomarcada, los estudios de enlace
(Fenteany et al., 1995 Science
268:726-731) han identificado el punto de unión y el
mecanismo de acción. Estos estudios han demostrado que la
lactacistina se une de forma irreversible a un resto de treonina
situado en el terminal amino de la subunidad \beta de los
proteasomas. Una serie de análogos basados en la estructura de la
lactacistina se han investigado también (Fenteany et al.,
1995 Science 268:726-731). Estos estudios
indicaron que la estructura de la \beta-lactona
era esencial para su actividad inhibidora.
Ahora está muy demostrado que el proteasoma es el
principal sistema proteolítico extralisosómico que está implicado en
las trayectorias degradadoras que producen numerosas y diversas
funciones celulares tales como la división celular, el tratamiento
del antígeno y la degradación de proteínas reguladoras de vida corta
tales como los factores de transcripción, los productos del oncogén
y las ciclinas (estudiados en Ciechanover, A. 1994 Cell
79:13-21). La función principal del proteasoma
consiste en catalizar la proteolisis de proteínas en pequeños
péptidos. Sin embargo se ha demostrado también que la trayectoria
ubiquitina-proteasoma puede catalizar el tratamiento
proteolítico regulado de un gran precursor inactivo en una proteína
activa. El caso mejor documentado de esto implica la activación del
factor de transcripción NF-\kappaB (Palombella,
V.J., Rando, O.J., Goldberg, A.L. y Maniatis, T. 1994 Cell
78:773-785). La forma activa de
NF-\kappaB es un heterodímero constituido por una
subunidad p65 y una p50. Esta última está presente en el citosol de
la célula en forma de precursor inactivo, a saber p105, precursor
de p50 polipéptido de 105 kDa. El tratamiento proteolítico de p105
para generar p50 tiene lugar mediante la trayectoria
ubiquitina-proteasoma. Además, el p50 y el p65
procesados se mantienen en el citosol como un complejo inactivo con
la proteína inhibidora I\kappaB. Las señales inflamatorias
activan NF-\kappaB iniciando el curso de la
señalización para la degradación completa de I\kappaB, y también
estimulan el tratamiento de p105 en p50. De este modo dos sucesos
proteolíticos, ambos gobernados por la trayectoria
ubiquitina-proteasoma se necesitan para la
activación inducida de la señal de NF-\kappaB. No
se conoce qué origina la terminación de la proteolisis de p105 tras
la generación de p50 pero se ha propuesto que la conformación de p50
puede hacerlo resistente a un tratamiento posterior y dar lugar a
que se disocie en el complejo 26S.
El hecho de que el proteasoma desempeña un suceso
crítico en la activación del NF-\kappaB podría
explotarse clínicamente mediante la utilización de inhibidores
dirigidos hacia la proteolisis del proteasoma. En determinadas
enfermedades la función normal del NF-\kappaB
activo puede ser perjudicial para la salud humana como se observa
en las respuestas inflamatorias tras la infección bacteriana,
micótica o vírica. Por lo tanto los inhibidores de la activación de
NF-\kappaB, debido a su capacidad para impedir la
secreción de citocinas, pueden tener utilidad potencial en el
tratamiento del ARDS (síndrome disneico agudo) y del SIDA. Como la
activación del NF-\kappaB es también esencial
para la angiogénesis, los inhibidores de proteasoma pueden tener
utilidad en el tratamiento de aquellas enfermedades relacionadas con
la neovascularización anómala.
Al principio p53 se describió como una
oncoproteína pero desde entonces se ha demostrado que está implicado
en muchos procesos celulares (estudiados por Ko, L.J. y Prives, C.
1996 Genes Dev. 10, 1054-1072). Se ha
demostrado que p53 produce apoptosis en varias líneas celulares
hematopoyéticas (Oren, M., 1994 Semin. Cancer Biol. 5,
221-227) mediante la acción de muchos estímulos
diferentes que incluyen la alteración del ADN, la infección viral y
la eliminación de los factores de crecimiento. Sin embargo, es
importante observar que la apoptosis puede producirse de manera
independiente de p53, por ejemplo, mediante la acción de
glucocorticoides. La producción de p53 conduce a la interrupción
del crecimiento celular en la fase G1 del ciclo celular así como a
la muerte celular por apoptosis. Ambas funciones permiten a p53
controlar la alteración del ADN reduciendo de este modo la
propagación de las mutaciones del ADN cuando se dividen las
células. p53 detiene las células en G1 produciendo el inhibidor de
cinasa dependiente de ciclina, p21, que a su vez produce una
acumulación de la forma hipofosforilada del producto del gen el
retinoblastoma. Se cree que p53 actúa como un punto de comprobación
en la célula tras la alteración del ADN, ello da lugar en primer
lugar a una interrupción de la división celular y a la apoptosis.
Es conocido que la degradación de p53 procede a través de la
trayectoria ubiquitina-proteosoma y la destrucción
de la degradación de p53 es un modo posible de producir apoptosis.
Otra utilidad potencial de los inhibidores de proteasoma puede
consistir en el tratamiento de enfermedades que proceden de la
proliferación celular anómala.
Está muy documentado que el curso
ubiquitina-proteasoma es crítico para la destrucción
regulada de las ciclinas que regulan la salida de la mitosis y
permiten a las células evolucionar a la fase siguiente del ciclo
celular. Por lo tanto la inhibición de la degradación de las
ciclinas utilizando inhibidores de proteasoma produce la
interrupción del crecimiento. Por consiguiente otra utilidad
potencial de los inhibidores de proteasoma consiste en su
utilización en el tratamiento de enfermedades que proceden de una
división celular acelerada. Éstas incluyen el cáncer, las
enfermedades cardiovasculares tales como miocarditis, restenosis
tras la angioplasia, nefropatías tales como lupus, poliquistosis
renal, infecciones micóticas, enfermedades dermatológicas tales
como psoriasis, cicatrización anormal de las heridas, queloides,
enfermedades inmunológicas tales como la autoinmunidad, asma y
alergia, hipersensibilidad aguda y retardada, enfermedad injerto
frente a huésped, rechazo del trasplante y enfermedades
neuroinmunológicas tales como la esclerosis múltiple y la
encefalomielitis aguda diseminada.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar compuestos útiles para la inhibición de la
proliferación celular en mamíferos.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar compuestos útiles para el tratamiento eficaz de las
enfermedades que proceden de la división celular acelerada.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar compuestos útiles para el tratamiento de
enfermedades proliferantes inhibiendo la degradación de los
inhibidores del proteasoma.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en utilizar una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos
para inhibir los trastornos proliferantes de las células en el
hombre.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona compuestos que son útiles para la inhibición
de la proliferación celular en mamíferos y que tienen la fórmula
general:
en la que R_{1}, R_{2},
R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} cada uno es
hidrógeno y R_{3} es -OCH_{3}; y X
es
en la que D_{1} y D_{2} son
cada uno restos de aminoácidos; y E se selecciona de entre el grupo
constituido por un resto de aminoácido y -NRR', en el que R y R' se
seleccionan indistintamente de entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, alquilo
C_{1-10} sustituido, arilo y arilo
sustituido.
Los compuestos son útiles, cuando se administran
en cantidades terapéuticas, para el tratamiento de mamíferos, y
preferentemente para el tratamiento de seres humanos que padecen
trastornos proliferantes de las células, enfermedades infecciosas y
enfermedades inmunológicas.
En las Figuras, la Figura 1 es un análisis de
inmunorreactividad por transferencia Western que utiliza un
anticuerpo anti-I\kappaB\alpha de un extracto
de células RAW que ha sido tratado con los compuestos 173 y 187 que
se describen en la Tabla 1;
la Figura 2 es un análisis de inmunorreactividad
por transferencia Western para un anticuerpo
anti-P50 de extractos de células RAW que han sido
tratadas con el compuesto 187 que se describe en la Tabla 1 antes de
la exposición a su LPS; y
la Figura 3 es un análisis de desplazamiento por
movilidad del gel utilizando un extracto nuclear preparado a partir
de células RAW que habían sido pretratadas con el compuesto 187 que
se describe en la Tabla 1 antes de la exposición a LPS.
La presente invención proporciona compuestos que
son útiles para la inhibición de trastornos de proliferación
celular, enfermedades infecciosas y enfermedades inmunológicas en
mamíferos y especialmente en el hombre que tienen la fórmula
general:
en la que R_{1}, R_{2},
R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} cada uno es
hidrógeno y R_{3} es -OCH_{3}; y X
es
en la que D_{1} y D_{2} son
cada uno restos de aminoácidos; y E se selecciona de entre el grupo
constituido por un resto de aminoácido y -NRR', en el que R y R' se
seleccionan indistintamente de entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, alquilo
C_{1-10} sustituido, arilo y arilo
sustituido.
Los términos siguientes se utilizan para
describir varios constituyentes de los compuestos de la presente
invención. Los términos se definen de la forma siguiente:
El término "halógeno" se refiere a los
átomos de flúor, bromo, cloro y yodo.
El término "hidroxilo" se refiere al grupo
-OH.
El término "oxo" se refiere al grupo =O.
El término "tiol" o "mercapto" se
refiere al grupo -SH y
-S(O)_{0-2}.
La expresión "alquilo inferior" se refiere a
un grupo alquilo cíclico, con cadena lineal o ramificada de uno a
diez átomos de carbono. Esta expresión está ejemplificada además
por grupos tales como metilo, etilo, n-propilo,
i-propilo, n-butilo,
t-butilo, i-butilo (ó
2-metilpropilo), ciclopropilmetilo,
i-amilo, n-amilo, hexilo y
similares.
La expresión "alquilo inferior sustituido"
se refiere al alquilo inferior recién descrito incluyendo uno o más
grupos tales como hidroxilo, tiol, alquiltiol, halógeno, alcoxi,
amino, amido, carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido,
heterociclo, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido,
acilo, arilo, arilo sustituido, ariloxi, hetarilo, hetarilo
sustituido, aralquilo, heteroaralquilo, alquil alquenilo, alquil
alquinilo, alquil cicloalquilo, alquil cicloheteroalquilo y ciano.
Estos grupos pueden estar unidos a cualquier átomo de carbono del
grupo alquilo inferior.
El término "alquenilo" se refiere a un grupo
-CR'=CR''R''', en el que R', R'', R''' se selecciona cada uno de
entre hidrógeno, halógeno, alquilo inferior, alquilo inferior
sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, heteroarilo,
heteroarilo sustituido o similares tal como se definió.
El término "alquinilo" se refiere a un grupo
-C\equivCR'; en el que R' se selecciona de entre hidrógeno,
halógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo,
arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido o
similares tal como se definió.
El término "alquil alquenilo" se refiere a
un grupo -R-CR'=CR'''R'''', en el que R es alquilo
inferior o alquilo inferior sustituido, R', R''', R'''' se
selecciona cada uno independientemente de entre hidrógeno, halógeno,
alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, acilo, arilo, arilo
sustituido, hetarilo o hetarilo sustituido tal como se
definió
anteriormente.
anteriormente.
El término "alquil alquinilo" se refiere a
un grupo -RC\equivCR' en el que R es alquilo inferior o alquilo
inferior sustituido, R' es hidrógeno, alquilo inferior, alquilo
inferior sustituido, acilo, arilo, arilo sustituido, hetarilo o
hetarilo sustituido tal como se definió anteriormente.
El término "alcoxi" significa el grupo -OR,
en el que R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido,
acilo, arilo, arilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido,
heteroarilo, heteroarilalquilo, cicloalquilo, cicloalquilo
sustituido, cicloheteroalquilo o cicloheteroalquilo sustituido tal
como se definió anteriormente.
El término "alquiltio" significa el grupo
-SR,
-S(O)_{n=1-2}-R, en
el que R es alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo,
arilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido tal como se
definió anteriormente.
El término "acilo" significa grupos
-C(O)R, en el que R es hidrógeno, alquilo inferior,
alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido y similares tal
como se definió anteriormente.
El término "ariloxi" significa grupos -OAr,
en el que Ar es un grupo arilo, arilo sustituido, heteroarilo o
heteroarilo sustituido tal como se definió anteriormente.
El término "amino" significa el grupo NRR',
en el que R y R' pueden ser independientemente hidrógeno, alquilo
inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido,
hetarilo, cicloalquilo o hetarilo sustituido tal como se definió
anteriormente o acilo.
El término "amido" significa el grupo
-C(O)NRR', en el que R y R' pueden ser
independientemente hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior
sustituido, arilo, arilo sustituido, hetarilo, o hetarilo
sustituido tal como se definió anteriormente.
El término "carboxilo" significa el grupo
-C(O)OR, en el que R puede ser independientemente
hidrógeno, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo,
arilo sustituido, hetarilo y hetarilo y similares tal como se
definió.
Los términos "arilo" o "Ar" se refieren
a un grupo carbocíclico aromático que tiene por lo menos un anillo
aromático (p. ej., fenilo o bifenilo) o múltiples anillos
condensados y que por lo menos un anillo es aromático (p. ej.,
1,2,3,4-tetrahidronaftilo, naftilo, antrilo o
fenantrilo).
El término "arilo sustituido" se refiere a
un arilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos funcionales,
p. ej., halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltío
inferior, trifluormetilo, amino, amido, carboxilo, hidroxilo,
arilo, ariloxi, heterociclo, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro,
ciano, alquiltío, tiol, sulfamido y similares.
El término "heterociclo" se refiere a un
grupo carbocíclico saturado, insaturado o aromático con un solo
anillo (p. ej., morfolino, piridilo o furilo) o múltiples anillos
condensados (p. ej., naftpiridilo, quinoxalilo, quinolinilo,
indolizinilo o benzo[b]tienilo) y que tiene por lo
menos un heteroátomo, tal como N, O o S, en el anillo, que puede
estar opcionalmente insustituido con p. ej., halógeno, alquilo
inferior, alcoxi inferior, alquiltío inferior, trifluormetilo,
amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo,
hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, alquiltío, tiol,
sulfamido y similares.
Los términos "heteroarilo" o "hetarilo"
se refiere a un heterociclo en el que por lo menos un anillo
heterocíclico es aromático.
El término "heteroarilo sustituido" se
refiere a un heterociclo opcionalmente mono o polisustituido con
uno o más grupos funcionales, p. ej., halógeno, alquilo inferior,
alcoxi inferior, alquiltío, trifluormetilo, amino, amido,
carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, hetarilo,
hetarilo sustituido, nitro, ciano, alquiltío, tiol, sulfamido y
similares.
El término "aralquilo" se refiere al grupo
-R-Ar, en el que Ar es un grupo arilo y R es un
grupo alquilo inferior o alquilo inferior sustituido. Los grupos
arilo pueden estar opcionalmente insustituidos o sustituidos con,
p. ej., halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltío,
trifluormetilo, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi,
heterociclo, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano,
alquiltío, tiol, sulfamido y similares.
El término "heteroalquilo" se refiere al
grupo -R-Het, en el que Het es un grupo heterociclo
y R es un grupo alquilo inferior. Los grupos heteroalquilo pueden
estar opcionalmente insustituidos o sustituidos, p. ej., con
halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltío,
trifluormetilo, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi,
heterociclo, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano,
alquiltío, tiol, sulfamido y similares.
El término "heteroarilalquilo" se refiere al
grupo -R-HetAr en el que HetAr es un grupo
heteroarilo y R es alquilo inferior o alquilo inferior sustituido.
Los grupos heteroarilalquilo pueden estar opcionalmente
insustituidos o sustituidos, p. ej., con halógeno, alquilo
inferior, alquilo inferior sustituido, alcoxi, alquiltío, arilo,
ariloxi, heterociclo, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano,
alquiltío, tiol, sulfamido y similares.
El término "cicloalquilo" se refiere a un
grupo alquilo cíclico o policíclico divalente que contiene 3 a 15
átomos de carbono. Para los grupos policíclicos, éstos pueden ser
anillos múltiples condensados en los que uno de los anillos
distales puede ser aromático (p. ej., indanilo, tetrahidronaftaleno,
etc.).
El término "cicloalquilo sustituido" se
refiere a un grupo cicloalquilo que comprende uno o más
sustituyentes, p. ej., halógeno, alquilo inferior, alquilo inferior
sustituido, alcoxi, alquiltío, arilo, ariloxi, heterociclo,
hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, alquiltío, tiol,
sulfamido y similares.
El término "cicloheteroalquilo" se refiere a
un grupo cicloalquilo, en el que uno o más de los átomos de carbono
del anillo está sustituido con un heteroátomo (p. ej., N, O, S o
P).
El término "cicloheteroalquilo sustituido"
se refiere a un grupo cicloheteroalquilo tal como el definido en la
presente memoria que contiene uno o más sustituyentes, tales como
halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltío inferior,
trifluormetilo, amino, amido, carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi,
heterociclo, hetarilo, hetarilo sustituido, nitro, ciano, alquiltío,
tiol, sulfamido y similares.
El término "alquil cicloalquilo" se refiere
al grupo -R-cicloalquilo, en el que cicloalquilo es
un grupo cicloalquilo y R es alquilo inferior o alquilo inferior
sustituido. Los grupos cicloalquilo puede estar opcionalmente
insustituidos o sustituidos, p. ej., con halógeno, alquilo
inferior, alcoxi inferior, alquiltío, trifluormetilo, amino, amido,
carboxilo, hidroxilo, arilo, ariloxi, heterociclo, hetarilo,
hetarilo sustituido, nitro, ciano, alquiltío, tiol, sulfamido y
similares.
El término "aminoácido" se refiere al
isómero D- o L- de alfa aminoácidos naturales y sintéticos,
preferentemente los aminoácidos naturales son alanina, arginina,
asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico,
glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o
valina.
Normalmente, E puede ser un aminoácido. Con
frecuencia se prefieren aminoácidos lipófilos. En general, las
abreviaturas de los aminoácidos siguen la Comisión Conjunta de la
IUPAC-IUB sobre nomenclatura bioquímica tal como se
describe en Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984).
Se prefiere que -D_{1} sea leucina y -D_{2}
sea leucina y E sea NR'R''. Es más preferible que -D_{1} sea
l-leucina y -D_{2} sea d-leucina y
que E se seleccione de entre el grupo de compuestos constituidos
por bencilamina, l-indanilamina,
N,N'-dibencilamina,
2,6-difluorobencilamina,
4-metoxibencilamina, piperonilamina, NH_{2} y
glucinamida.
En una forma de realización preferida, D_{1} es
leucina, D_{2} es leucina y E es bencilamina. En otra forma de
realización preferida, D_{1} es leucina, D_{2} es leucina y E
es 1-indanilamina. En otra forma de realización
preferida todavía, D_{1} es leucina, D_{2} es leucina y E es
N,N-dibencilamina. En otra forma de realización
preferida, D_{1} es leucina, D_{2} es leucina y E es
2,6-difluorbencilamina.
En estas formas de realización preferidas, se
prefiere más que D_{1} sea L-leucina y D_{2}
sea D-leucina.
Está dentro del conocimiento de un experto en la
materia que los estereoisómeros de los compuestos descritos en la
presente memoria así como los isómeros y estereoisómeros de los
componentes que comprenden los compuestos identificados en la
presente memoria están todos comprendidos dentro del alcance de los
compuestos de la presente invención.
Si los compuestos de la presente invención
contienen un grupo básico, se pueden preparar sales de adición de
ácido. Las sales de adición de ácido de los compuestos se preparan
de la manera habitual en un disolvente adecuado a partir del
compuesto precursor y un exceso de ácido, tal como, pero sin
limitarse a, clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico,
acético, maleico, succínico o metansulfónico. Si el compuesto final
contiene un grupo ácido, se pueden preparar sales catiónicas.
Normalmente el compuesto precursor se trata con un exceso de un
reactivo alcalino, tal como hidróxido, carbonato o alcóxido, que
contiene el catión apropiado. Cationes tales como, Na^{+},
K^{+}, Ca^{2+} y NH_{4}^{+} son ejemplos de cationes
presentes en las sales farmacéuticamente aceptables. Determinados
compuestos forman sales internas o iones bipolares que pueden ser
también aceptables.
Los compuestos descritos anteriormente son útiles
para el tratamiento de los trastornos de proliferación celular,
enfermedades infecciosas y enfermedades inmunológicas en mamíferos,
y particularmente, en pacientes humanos que necesitan dicho
tratamiento. Los trastornos proliferantes de las células que se
pueden tratar utilizando los compuestos descritos anteriormente
incluyen el cáncer, la enfermedad cardiovascular tales como la
miocarditis y la restenosis tras la angioplasia, enfermedades
renales tales como lupus y poliquistosis renal, rechazo del
trasplante en el anfitrión, gota y otros trastornos proliferantes.
Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar con los
compuestos descritos anteriormente incluyen la artritis reumatoide,
lupus, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple y trastornos y
enfermedades similares. Las enfermedades infecciosas que se pueden
tratar utilizando los compuestos descritos anteriormente incluyen
IBD, enfermedad de Crohn, SIDA, ARDS y trastornos similares. Los
compuestos dados a conocer anteriormente se pueden utilizar para
tratar infecciones micóticas, enfermedades dermatológicas tales
como psoriasis, cicatrización anormal de las heridas, queloides,
enfermedades inmunológicas tales como la autoinmunidad, asma,
alergia, hipersensibilidad aguda y retardada, enfermedad injerto
contra huésped, rechazo del trasplante y enfermedad
neuroinmunológica tales como la esclerosis múltiple y la
encefalomielitis aguda diseminada.
El compuesto seleccionado o las combinaciones del
mismo se pueden administrar por vía parenteral u oral en una
cantidad eficaz, preferentemente dispersado en un portador
farmacéutico. Las unidades de dosificación del ingrediente activo se
seleccionan generalmente de entre el intervalo de 0,01 a 100 mg/kg,
pero serán determinadas fácilmente por un experto en la materia
dependiendo de la vía de administración, de la edad y de la
enfermedad del paciente. Las unidades de dosificación se pueden
administrar desde una a diez veces al día o más para la enfermedad
aguda o crónica. No se esperan efectos toxicológicos inaceptables
cuando los compuestos de la invención se administran según la
presente invención.
Las composiciones farmacéuticas de los compuestos
de la presente invención o de los derivados de los mismos, se pueden
formular como soluciones o polvos liofilizados para administración
parenteral. Los polvos se pueden redisolver mediante la adición de
un diluyente adecuado o de otro portador farmacéuticamente
aceptable antes de su utilización. La formulación líquida
generalmente es una solución acuosa, tamponada e isotónica. Ejemplos
de diluyentes adecuados son la solución salina isotónica normal,
dextrosa 5% estándar en agua o solución tamponada de acetato de
sodio o de amonio. Dicha formulación es especialmente adecuada para
administración parenteral, pero se pueden también utilizar para
administración oral. Puede ser deseable añadir excipientes tales
como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxicelulosa, acacia,
polietilenglicol, manitol, cloruro de sodio o citrato de sodio.
Como alternativa, estos compuestos pueden estar encapsulados, en
comprimidos o preparados en una emulsión o jarabe para
administración oral. Se pueden añadir portadores sólidos o líquidos
farmacéuticamente aceptables para potenciar o estabilizar la
composición o para facilitar la preparación de la composición. Los
portadores líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de
oliva, glicerina, solución salina, alcoholes y agua. Los portadores
sólidos incluyen, pero no se limitan a, almidón, lactosa, sulfato
de calcio, dihidrato, terra alba, estearato de magnesio o ácido
esteárico, talco, pectina, acacia, agar-agar o
gelatina. El portador puede incluir además un material de
liberación lenta tal como monoestearato de glicerilo o diestearato
de glicerilo, solo o con una cera. La cantidad de portador sólido
varía pero, preferentemente, estará comprendido aproximadamente
entre 20 mg y aproximadamente 1 g por unidad de dosificación. Las
preparaciones farmacéuticas se preparan siguiendo técnicas
convencionales de farmacia que implican molienda, mezclado,
granulación y compresión, cuando sea necesario, para las formas en
comprimido; o molienda, mezclado y rellenado para las formas en
cápsulas de gelatina dura. Cuando se utiliza un portador líquido,
la preparación estará en forma de jarabe, elixir, emulsión o de una
suspensión acuosa o no acuosa. Dicha formulación líquida se puede
administrar directamente por vía oral (p.o) o rellenar en una
cápsula de gelatina blanda.
Los compuestos de la presente invención se
preparan por procedimientos convencionales de química orgánica. Los
reactivos de acoplamiento son bien conocidos en la técnica, tales
como DCC y otras carbodiimidas, EDC, BOP y PPA, y se pueden
utilizar opcionalmente con otros reactivos, tales como HOBT, NMM y
DMAP, que pueden facilitar la reacción. La preparación de los
compuestos de fórmula (1) en los que E es un aminoácido es bien
conocida en la técnica utilizando técnicas en fase de solución o
fase sólida convencional tal como las descritas en Bodanszky,
"The Practice of Peptide Synthesis",
Springer-Verlag, primera edición, 1984. Los grupos
protectores adecuados para el grupo amino son los dados a conocer
por Greene et al., "Protective Groups in Organic
Synthesis", segunda edición, John Wiley and Sons, Nueva York,
1991. Los grupos benciloxicarbonilo,
t-butoxicarbonilo y fluorenilmetoxicarbonilo son
grupos protectores amino particularmente útiles.
La síntesis de péptidos en fase sólida se llevó a
cabo de la forma siguiente. Se coloca resina de amida de Rink en un
filtro fritado adaptado con jeringuilla. La resina se desprotege
utilizando piperidina al 20% en DMF. Después de 20 minutos, se lavó
la resina cinco veces con DMF, cinco veces con metanol, a
continuación cinco veces con DMF. Se extrajo en la jeringuilla una
solución de aminoácidos (E), carbodiimida y HOBT en DMF y la mezcla
de reacción se dejó mezclar durante 4 a 20 horas. Se tiró la
solución de reacción y se lavó la mezcla cinco veces con DMF, cinco
veces con metanol, a continuación cinco veces con DMF. Se repitió
este ciclo hasta que se acopló la secuencia deseada. El acoplamiento
final utilizó ácido
5-metoxi-1-indanona-3-acético,
carbodiimida y HOBT. Tras los lavados finales de la resina, se
escindió el fragmento de péptido de la resina utilizando 95% de
TFA/5% de agua. La concentración de la mezcla de escisión dio un
sólido blanco.
Los compuestos de la presente invención
preparados según el procedimiento del Ejemplo 1 se probaron de la
forma siguiente. La subunidad catalítica 20S del proteasoma
(conocida también como complejo multicatalítico de proteinasa) se
purificó hasta homogeneidad en el cerebro bovino según los
procedimientos publicados (Wilk S. y Orlowski, M., J.
Neurochem 40:842-849). Se mide la actividad
quimiotríptica del complejo aumentando la fluorescencia seguido de
la escisión del péptido substrato
succinil-leucina-leucina-valina-tirosina-7-amino-4-metilcumarina.
El ensayo normal in vitro está constituido por 2 \mug de
proteasoma 20S, 0,1 a 100 \mug/ml de inhibidor de proteasoma en
200 \mul de HEPES 50 mM, que contiene dodecilsulfato de sodio al
0,1%, pH 7,5. La reacción proteolítica se inicia mediante la
adición de sustrato de péptido fluorógeno 50 \muM y permitió
evolucionar durante 15 minutos a 37ºC. La reacción se termina
mediante la adición de 100 \mul de tampón de acetato 100 mM, pH
4,0. La velocidad de la proteolisis es directamente proporcional a
la cantidad de aminometilcumarina liberada que se mide por
espectroscopía fluorescente (EX 370 nm, EM 430 nm). Las estructuras
de los compuestos ensayados así como los resultados de la prueba se
describen en la Tabla 1, a continuación. Los compuestos, que no
están comprendidos por las reivindicaciones de la presente
invención, se exponen únicamente a título comparativo.
Los compuestos preparados según el procedimiento
del Ejemplo 1 se analizaron frente a varias líneas celulares
diferentes. Se cultivaron monocapas de células en presencia del
compuesto de ensayo durante 18 horas para evaluar su capacidad para
inhibir la proliferación celular. Se determinó la proliferación
celular por colorimetría utilizando el análisis de proliferación
celular no radioactivo acuoso Celltiter 96 (Promega) en el que la
proliferación celular es directamente proporcional a la absorbancia
a 490 nm. Los resultados se expresan como IC_{50} en \mug/ml
para la inhibición de la proliferación celular en varios tipos de
células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la inhibición de LPS producida por
la síntesis de TNF en los compuestos preparados según el
procedimiento del Ejemplo 1. Se pretrataron células RAW con
diferentes concentraciones del compuesto de ensayo durante 1 hora
antes de la administración de lipopolisacárido (100 ng/ml). Se
recogieron los sobrenadantes del cultivo celular tras 1 hora y se
analizó la concentración de TNF por ELISA (Biosource).
\newpage
| Compuesto | IC_{50} (\mug/ml) |
| 173 | 5 |
| 187 | 5 |
| 194 | 3 |
| 196 | 3 |
| 197 | 3 |
Este Ejemplo examina la capacidad del compuesto
173 y particularmente del compuesto 187 descrito anteriormente en la
Tabla 1 para inhibir la actividad del proteasoma como se indica, en
parte, por la presencia de I\kappaB y/o de p105 en las células
inhibidas. Con el fin de trasladar NF-\kappaB al
núcleo en respuesta de un estímulo tal como el lipopolisacárido
(LPS) y activar la transcripción se necesita que ocurran dos
sucesos proteolíticos, a saber la degradación de la proteína
I\kappaB inhibidora y la transformación de p105 a p50. Estos
sucesos proteolíticos sirven para desenmascarar la señal de
localización nuclear de NF-\kappaB.
Se pretrataron células RAW con diferentes
concentraciones del compuesto de la prueba durante 1 hora antes de
la administración de lipopolisacárido (100 ng/ml). Se recogieron
todos los lisados celulares tras 1 hora, se separó 10 \mug de
proteína por SDS-PAGE, se transfirió a nitrocelulosa
y se analizó la inmunorreactividad con anticuerpo
anti-I\kappaBa. Se observaron las transferencias
Western (véase la Figura 1) utilizando el kit de detección
quimioluminiscente de Boehringer Mannheim. La transferencia
demuestra que I\kappaB está presente en las células tratadas con
una cantidad tan pequeña como 5 \mug/ml de los compuestos 173 y
187.
Se utilizó el compuesto 187 como se describe en
la Tabla 1 para pretratar las células RAW tal como se describió
anteriormente y se analizó la inmunorreactividad para con un
anticuerpo anti-p50 de todos los lisados celulares
preparados como se describió anteriormente. Estos resultados,
indicados en la Figura 2 indican que p50 y p150 están presentes en
las células tratadas con una cantidad tan pequeña como 5 \mug/ml
de compuesto 187, mientras que en las células sin tratar, la
mayoría de p105 se ha transformado en p50.
Se trataron células RAW durante 1 hora con el
compuesto 187 (20 \mug/ml) y a continuación se incubaron con
lipopolisacárido (100 ng/ml) durante una hora más. Se prepararon
fracciones nucleares según los procedimientos normalizados. Las
reacciones de unión para los ensayos de desplazamiento por movilidad
en el gel contenían 5 \mug de proteína de extracto nuclear,
50.000 cpm de oligonucleótido que se une por consenso a
NF-\kappaB marcado con ^{32}P en presencia y
ausencia de un exceso de cincuenta veces de oligonucleótido sin
marcar. El ensayo de desplazamiento por movilidad del gel, indicado
en la Figura 3 demuestra que el compuesto 187 es eficaz en la
inhibición de la acumulación de NF-\kappaB en el
núcleo de las células.
Claims (22)
1. Compuesto de fórmula:
en la que R_{1}, R_{2},
R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} cada uno es
hidrógeno y R_{3} es -OCH_{3}; y X
es
en la que D_{1} y D_{2} son
cada uno restos de aminoácidos; y E se selecciona de entre el grupo
constituido por un resto de aminoácido y -NRR', en el que R y R' se
seleccionan indistintamente de entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, alquilo
C_{1-10} sustituido, arilo y arilo
sustituido.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
el alquilo C_{1-10} sustituido es alquilo
C_{1-10} sustituido con arilo o arilo
sustituido.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el
que D_{1} y D_{2} se seleccionan cada uno de entre el grupo
constituido por -leucina y D-leucina.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el que
D_{1} es L-leucina y D_{2} es
D-leucina.
5. Compuesto según la reivindicación 4, en el que
E se selecciona de entre el grupo constituido por
gly-NH_{2}, bencilamina, dibencilamina y
2,6-fluorbencilamina.
6. Compuesto de fórmula:
en la que R_{1} es H y R_{2} se
selecciona de entre el grupo constituido por bencilo, hidroxietilo,
adamantilo, fenilo, fenetilo y ciclohexilmetilo o R_{1} es
bencilo y R_{2} metilo o
bencilo.
7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que
R_{1} es hidrógeno y R_{2} es bencilo.
8. Compuesto de fórmula:
en la que R se selecciona de entre
el grupo constituido por 1-indanilo, piperonilo,
2,6-difluorbencilo, bencilo,
4-metoxibencilo y
4-nitrobencilo.
9. Compuesto según la reivindicación 8, en el que
R es 2,6-difluorbencilo.
10. Utilización de una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al
tratamiento de una enfermedad seleccionada de entre el grupo
constituido por trastornos de proliferación celular, trastornos del
sistema inmunitario y enfermedades infecciosas en un mamífero.
11. Utilización según la reivindicación 10, en la
que el mamífero es un ser humano.
12. Utilización según la reivindicación 10 u 11,
en la que la cantidad terapéuticamente eficaz oscila entre 0,001 y
100 mg/kg del peso del mamífero.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en la que el trastorno de proliferación
celular se selecciona de entre el grupo constituido por artritis
reumatoide, lupus, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, cáncer,
restenosis, enfermedad injerto contra huésped y gota.
14. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el trastorno de proliferación celular es la restenosis.
15. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el trastorno de proliferación celular es el cáncer.
16. Utilización según la reivindicación 13, en la
que la composición farmacéutica produce apoptosis.
17. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el trastorno de proliferación celular es la poliquistosis
renal.
18. Utilización según las reivindicaciones 10 a
12, en la que la enfermedad es una enfermedad infecciosa.
19. Utilización según la reivindicación 18, en la
que la enfermedad infecciosa se selecciona de entre el grupo
constituido por IBD, enfermedad de Crohn, SIDA, ARDS y enfermedades
micóticas.
20. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en la que el trastorno del sistema
inmunitario se selecciona de entre el grupo constituido por
artritis reumatoide, enfermedades autoinmunitarias, rechazo del
trasplante y psoriasis.
21. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 20, en la que la composición farmacéutica está
en forma de solución.
22. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 20, en la que la composición farmacéutica está
en forma de comprimido.
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