ES2351924T3

ES2351924T3 - Péptidos miméticos y su utilización como inhibidores del proteasoma 20s, del proteasoma 26s y del inmunoproteasoma.

Info

Publication number: ES2351924T3
Application number: ES06723211T
Authority: ES
Inventors: Peter-Michael Kloetzel; Boris Schmidt; Sumaira c/o Frau Brigitte Herdler UMBREEN; Hannes Braun; Ulrike Kuckelkorn
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Technische Universitaet Darmstadt
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Technische Universitaet Darmstadt
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2011-02-14
Anticipated expiration: 2026-03-03
Also published as: CA2599864A1; EP1858913A2; DK1858913T3; PL1858913T3; EP1858913B1; ATE479701T1; DE102005009784A1; US8835392B2; WO2006092326A3; DE502006007775D1; US20090012007A1; WO2006092326A2; DE102005009784B4

Abstract

Compuesto de fórmula **(Ver fórmula)**en el que R1es Boc, Z, Ac o H, 10 L es Leu, X es Asp(OR4), 15 R2 es CH2-CH(CH3)2, R3 es CH2-OH, CH=O, CH(OH)-C≡C-fenilo, CH(OH)-C(O)-NH-R5 o C(O)-C(O)-NHR5, R4es t-butilo, bencilo o H, R5 es bencilo, 3-picolilo o fenilo, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos peptidomiméticos, a la síntesis y utilización de los mismos para la inhibición de los proteasomas y la inducción de la apoptosis en células tumorales. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos y a la utilización de dichos compuestos para el tratamiento de enfermedades, particularmente cáncer y enfermedades neurodegenerativas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El equilibrio entre los procesos de síntesis y de degradación de las proteínas resulta esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular. Las células presentan dos rutas metabólicas principales de degradación proteínica. Un número elevado de proteínas es digerido por enzimas proteolíticas en los lisosomas o a través del sistema ubiquitino-proteasómico. Un desequilibrio entre los procesos de síntesis y de degradación de las proteínas conduce a una serie de procesos patológicos (1).

Los proteasomas 26S son complejos de proteasa compuestos por múltiples subunidades, y llevan a cabo la degradación dependiente de ATP de las proteínas poliubiquitiniladas. Son responsables de la mayoría de las proteólisis no lisosómicas en las células eucariotas. Están constituidos por las partículas proteolíticas del núcleo del proteasoma 20S y presentan una tapa en uno de sus extremos, o en ambos, formada por las partículas de tapa reguladoras de 19S (2, 3). La partícula de núcleo 20S es un conjunto cilíndrico de 28 subunidades dispuestas en 4 anillos heptámeros amontonados. 2 anillos están formados por 7 subunidades de tipo α y 2 anillos por 7 subunidades de tipo β (4, 5). Los dos anillos interiores de tipo β forman la zona central del cilindro y contienen los centros proteolíticos. A diferencia de los proteasomas 20S procariotas, que consisten en 14 subunidades alfa y 14 subunidades idénticas proteolíticamente activas de tipo β, los proteasomas 20S eucariotas presentan únicamente tres subunidades proteolíticamente activas por anillo de tipo β. Los proteasomas pertenecen a la familia de las hidrolasas nucleofílicas N-terminales (6, 7). La estimulación de las células de mamífero con interferón γ provoca el intercambio de tres subunidades β activas β1, β2y β5 por las homólogas inmunes β1i, β2i y β5i, lo que conduce a la formación de las inmunoproteasomas, que generan un patrón de escisión modificado de los sustratos peptídicos. Se puso de manifiesto que la integridad funcional del proteasoma es esencial para multitud de funciones celulares, tales como, por ejemplo, la adaptación metabólica, la diferenciación celular, el control del ciclo celular, la respuesta a la tensión, la degradación de las proteínas anómalas y la generación de epítopes presentados a través de receptores MHC de clase I (para una revisión, véase (8, 9)). Los proteasomas son productores importantes, aunque no exclusivos, de péptidos antigénicos (10, 11).

La desregulación de la ruta metabólica de la degradación proteínica ubiquitinoproteasómica provoca diversas enfermedades en el humano, tales como, por ejemplo, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunes y enfermedades metabólicas. La inhibición de los proteasomas afecta a la estabilidad de muchas proteínas, tales como las implicadas en la regulación del ciclo celular. Por consiguiente, los inhibidores selectivos de las subunidades proteasómicas multicatalíticas son objetivos atractivos en el desarrollo de fármacos (12).

La mayoría de células tratadas con inhibidores proteasómicos están sensibilizadas para la apoptosis (13, 14). Habitualmente, lo que constituye una característica interesante, las células tumorales son más sensibles a la inhibición proteasómica que las células normales. Las células sanas sufren una detención del ciclo celular cuando se tratan con inhibidores proteasómicos, pero sin embargo, a diferencia de las células tumorales, tienen menos tendencia a sufrir apoptosis (15, 16).

Hasta el presente, se han caracterizado diferentes inhibidores proteasómicos (véase figura 1). Se hace una distinción entre inhibidores selectivos (4, lactacistina; 5, TMC-95A; 6, epoxomicina) e inhibidores no selectivos (1, dicloroviniléster; 3, MG132) (17).

El inhibidor proteasómico más importante es el compuesto 2, también designado Bortezomib® o VELCADE™ (véase figura 1). El Bortezomib® ha sido registrado por la

U.S. Food and Drug Administration (FDA) como fármaco disponible únicamente bajo receta para el tratamiento del mieloma múltiple (18-20).

Otro inhibidor proteasómico importante es el MG132 (compuesto 3 de la figura 1). Una desventaja decisiva del MG132 es su nula o baja selectividad en la inhibición de los proteasomas (1, 17, 22, 38).

El documento WO 95/24914 describe numerosos aldehídos peptídicos similares a los de la presente invención, pero no idénticos. La mejora del efecto de los compuestos presentes es debida al grupo/sustituyente Asp(OR4). Este hecho da lugar a una inhibición selectiva. Esta importante unidad estructural no está incluida en la definición de sustituyente R2 (en la página 13).

El documento Sorg y otros (2005), J. Peptide Science (11): 142-153, describe la síntesis de aldehídos tripeptídicos y tetrapeptídicos sobre un soporte sólido. Sin embargo, los compuestos más activos según la presente invención no se pueden sintetizar mediante este procedimiento, dado que este éster es inestable en las condiciones de reacción. Por consiguiente, no se describen aldehídos tripeptídicos o tetrapeptídicos con ácido glutárico

o ácido aspártico en la posición 2. Solo se describe un efecto biológico de las sustancias para las caspasas.

El documento Iqbal y otros (1977), Bioorganic & Medicinal Chemistry letter 7:539544, describe la inhibición de calpaína I mediante aldehídos dipeptídicos y tripeptídicos, particularmente con P2 = Leu, Phe, Ser, Thr, Trp. Ninguno de los péptidos mencionados presenta los aminoácidos polares Glu, Asp, Asn, Gln o derivados en P2.

En el documento Saito y otros (1992), Biochem. Biophys. Res. Comm. (184):419126, se describe una inhibición de proteasas indefinida mediante aldehídos dipéptidos de fórmula general Ac-Leu-Leu-X-CHO y Z-Leu-Leu-X-CHO de proteasas desconocidas. Se intentó llevar a cabo una identificación de la proteasa activa por cromatografía de afinidad, sin éxito. Únicamente se puso de manifiesto la inhibición de la catepsina L. No se mencionan los proteasomas 20S ó 26S. El proteasoma también es una proteasa no secretada.

Además, el documento WO 96/13266 describe compuestos peptídicos de ácido y 5 éster borónico adecuados como inhibidores de la función proteasómica.

La hidrólisis amídica proteasómica difiere de la hidrólisis amídica de todas las

demás clases de proteasas. Para ello, las características particulares son las treoninas N-

terminales. El mecanismo se representa en la figura 2. Al analizar la estructura cristalina

10 del proteasoma 20S, se puso de manifiesto que la Thr10γ funciona como nucleófilo y el grupo amino N-terminal como portador de acilo (6). Los inhibidores covalentes se pueden enlazar en el centro activo, particularmente a través del grupo hidroxilo de la Thr10γ o simultáneamente a través del terminal N libre y la Thr10γ (para una revisión, véase 17).

15 De este modo, los inhibidores in vivo eficaces del proteasoma 20S requieren una selectividad elevada y, al mismo tiempo, una buena capacidad de penetrar en las membranas celulares. Además, se pueden caracterizar por el hecho de que se enlazan covalentemente a la treonina N-terminal.

20 Por consiguiente, el objetivo de la presente invención consiste en desarrollar inhibidores mejorados del proteasoma caracterizados particularmente por su selectividad con respecto al mismo, así como por su irreversibilidad, y que pueden penetrar en las membranas celulares.

25 Según la presente invención, este objetivo se alcanza proporcionando compuestos de fórmula

imagen1

30 en los que R1 a R5 y X se seleccionan independientemente los unos de los otros, y en los que R1 es Boc, Z, Ac o H, 35 Les Leu, X es Leu o Asp(OR4), R2 es CH2-CH(CH3)2, 40 R3 es CH2-OH, CH═O, CH(OH)-C≡C-fenilo, CH(OH)-C(O)-NH-R5 o C(O)-C(O)-NH-R5,

R4 es t-butilo, bencilo o H, R5 es bencilo, 3-picolilo o fenilo. Se excluye un compuesto en el que, si R1 es Z y X es Leu, R3 es CH═O y sales

farmacéuticamente aceptables del mismo. En una forma de realización preferida de la presente invención, la misma

comprende compuestos en los que

R1 es Boc o Z,

L es Leu,

X es Asp(OR4),

R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3 es CH2-OH,

R4 es t-butilo.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, la misma

comprende compuestos en los que

R1 es Boc, Z o Ac,

L es Leu,

X es Asp(OR4),

R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3 es CH═O,

R4 es t-butilo o bencilo.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, la misma

comprende compuestos en los que

R1es Z,

L es Leu,

X es Leu,

R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3 es C(O)-C(O)-NH-R5,

R5 es bencilo, 3-picolilo o fenilo. En otra forma de realización preferida de la presente invención, la misma

comprende compuestos en los que

R1 es Z,

L es Leu,

X es Leu,

R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3 es CH(OH)-C(O)-NH-R5,

R5 es fenilo.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, la misma

comprende compuestos en los que

R1 es Z,

L es Leu,

X es Leu,

R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3 es CH(OH)-C≡C-fenilo.

Además, la presente invención da a conocer procedimientos para preparar un compuesto según la presente invención. Uno de dichos procedimientos comprende preferentemente una etapa de oxidación o reducción. Preferentemente, dicho procedimiento se caracteriza porque la oxidación se lleva a cabo utilizando reactivos de yodo hipervalente.

Así, el procedimiento según la presente invención comprende preferentemente la conversión de aminoalcoholes en peptidomiméticos (7-12) con una oxidación posterior para obtener aldehídos peptídicos (13-18), por ejemplo mediante reactivos de yodo hipervalente. También es posible llevar a cabo la síntesis mediante la reducción de ésteres de aminoácido derivatizados para obtener los respectivos aldehídos peptídicos.

La síntesis de los compuestos 7-18 según la presente invención empezando por el compuesto 3 (MG132) como estructura principal se llevó a cabo sobre la base de las preferencias de sustrato establecidas de la β-secretasa (23) mediante procedimientos estándares. Dicha síntesis se representa en el esquema I (véase también ejemplo 1). La condensación de dipéptidos protegidos comercializados y aminoácidos con aminoalcoholes comercializados fue seguida de la oxidación para obtener los aldehídos por IBX en DMSO (esquema I).

imagen1

5

Se evaluó la capacidad para inhibir la enzima de los productos intermedios, es decir, los derivados alcohólicos 7-12, y de los aldehídos tripeptídicos 13-18. La inhibición de la β-secretasa fue bastante pronunciada (IC50 > 200 µM, resultados no representados). Aún así, diversos compuestos se mostraron como potentes inhibidores del proteasoma

10 20S.

En general, los aldehídos peptídicos no mostraron ninguna selectividad en la

inhibición de enzimas. Así, se evaluó la capacidad para inhibir las treonina proteasas en

diferentes grupos.

15 El dicloroviniléster 1 no selectivo (véase figura 1), que reacciona fácilmente con todos los nucleófilos posibles, tales como, por ejemplo, cisteína, serina y finalmente también treonina, actuó como estructura principal adicional para la síntesis de compuestos según la presente invención. Además, se planteó el objetivo que consiste en reducir la

20 sobreactivación inherente de este compuesto. La “eliminación” del grupo acilo de 1 pudo reducir la hidrólisis no específica a través de nucleófilos ubicuos, y da lugar a dicloroviniléteres (28) bastante estables. Los éteres resultantes, los compuestos según la presente invención 19-20 (para la síntesis, véase esquema II y ejemplo 1), toleran un entorno ácido pero se hidrolizan fácilmente a pH11y se convierten en α-cloroacetatos, que

25 a su vez reaccionan con los nucleófilos. Esta reactividad dual que se da en una reacción de tipo cascada corresponde a los requisitos específicos para un inhibidor de treonina proteasa N-terminal.

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Se puede observar una reactividad dual análoga en las propargil-cetonas. Se

sintetizó un compuesto parecido, pero desafortunadamente el alcohol 21 (esquema III)

resistió la oxidación para obtener la cetona deseada.

Esquema III (adición de fenilacetileno al aldehído 3 (MG132))

imagen1

10 De este modo, se dirigió la atención a los miméticos de estados de transición e inhibidores. Las estructuras principales, tales como las estatinas (38), las α-cetoamidas y las clorometil cetonas, son bien conocidas en la inhibición de las proteasas. La combinación de dichas estructuras con un tripéptido β-selectivo conduce a los compuestos 22-28 según la presente invención (estructuras de 22-28, véase figura 3). El compuesto 22

15 se preparó a partir de Z-Leu-Leu y clorometil leucina comerciales (esquema IV y ejemplo 1).

imagen1

Los compuestos 23-25 según la presente invención se obtuvieron a través de una

reacción de Passerini de MG132 (3) con tres isonitrilos. La oxidación posterior a través de

IBX en DMSO dio lugar a las α-cetoamidas 26-28 (esquema V y ejemplo 1).

imagen1

Los proteasomas están involucrados en una serie de diferentes procesos celulares.

10 Son importantes para el control del ciclo celular y protegen a las células contra la apoptosis manteniendo el equilibrio de proteínas antiapoptóticas y proapoptóticas (9, 31, 32). El interés en inhibidores potentes y específicos que se puedan utilizar como agentes potenciales contra el cáncer o el crecimiento neoplásico es muy elevado.

15 La presente invención da a conocer la síntesis de inhibidores basados en el inhibidor peptídico proteasómico MG132, que es un inhibidor potente pero no específico. Las modificaciones de cadena lateral de dicho tripéptido deben conducir a una inhibición de mayor potencia, selectividad y especificidad de posición del proteasoma 20S. Esta asunción se basa en una serie de inhibidores peptídicos conocidos y potentes (17, 33, 34,

20 35).

Se evaluó la capacidad inhibidora de todos los compuestos según la presente

invención en lisados celulares. Así, durante los ensayos con los miméticos sintetizados,

las proteasas de serina, cisteína y metales se bloquearon con el cóctel inhibidor de

25 proteasas Complete (Roche). La proteólisis del sustrato hidrofóbico Suc-LLVY-AMC se redujo en 10 de los compuestos según la presente invención examinados (véase también ejemplo 5, figura 4).

La inhibición específica de un lugar catalítico individual tiene un interés específico para el desarrollo de fármacos. Así, se analizó la inhibición de las diferentes actividades proteasómicas del proteasoma (véase también el ejemplo 6). Las diferentes preferencias de escisión del proteasoma se determinaron mediante el sustrato específico para las actividades hidrofóbicas (tipo quimiotripsina), tipo tripsina y tipo caspasa de los proteasomas aislados. 12 de 22 derivados según la presente invención inhibieron las actividades proteasómicas con valores de IC50 inferiores a 10 µM (véase tabla 1). Los derivados peptídicos 13 y 15 inhibieron todas las actividades proteasómicas hidrolíticas, mientras que cuatro compuestos (18, 25, 26 y 27) inhibieron los lugares tipo quimiotripsina y tipo caspasa.

Sin embargo, un objetivo adicional de este análisis era la identificación de inhibidores completamente selectivos de la actividad proteasómica. El alcohol tripeptídico 7 (y el compuesto 8 con una potencia inferior) redujo específicamente la actividad de tipo tripsina, y los compuestos 16, 21, 22 y 28 dieron lugar a una reducción exclusiva de la actividad de tipo quimiotripsina. Cabe destacar que los más potentes de los nuevos inhibidores presentan valores de IC50 inferiores a 100 nM (7, 15, 28). Estos se encuentran en el ámbito de los nuevos inhibidores proteasómicos que se encuentran actualmente en fase clínica (33).

Debe apreciarse que el inhibidor tetrapeptídico PSI (Z-Ile-Glu(OtBu)Ala-Leu-CHO)

(36) está relacionado estructuralmente con el compuesto según la presente invención 15 (Z-Leu-Asp(OtBu)Leu-CHO), que pertenece a los inhibidores más potentes (IC50 inferior a 60 nM).

Además, 15 exhibió una toxicidad baja y fue capaz de penetrar en las membranas celulares.

La comparación de los inhibidores según la presente invención puso de manifiesto que las cadenas laterales de los ligandos proporcionan las contribuciones principales a las interacciones específicas y fijas con los diferentes centros catalíticos proteolíticos (figura 8 y ejemplo 10). Se realizaron observaciones parecidas para los derivados alcohólicos, de los que el compuesto 7 es más eficaz que los otros seis. Además, se identificaron inhibidores muy potentes en forma de clorometil cetona (compuesto 22) y compuestos 25

28.

A menudo, las células tumorales, con su crecimiento neoplásico acelerado, son más sensibles a los inhibidores proteasómicos en comparación con las células normales. El inhibidor proteasómico ensayado clínicamente Bortezomib® dio lugar a la detención del crecimiento y a la apoptosis de las células tumorales sensibles, mientras que las células "normales" toleraron un nivel mayor de células inhibidoras (37). La restricción a los tumores de tipo mieloma podría superarse mediante inhibidores más específicos, tales como PSI, que bloqueó la angiogénesis y de este modo moduló el crecimiento de los tumores sólidos (36). Las diferencias en las propiedades celulares y los mecanismos de resistencia predecibles hacen necesario el desarrollo continuo de nuevos inhibidores proteasómicos. Una permeación celular eficiente, la estabilidad en sistemas acuosos y la potente inducción de acontecimientos celulares son características obligatorias para usos clínicos.

De este modo, se evaluó la capacidad de permeación de los compuestos según la presente invención y la influencia in vivo sobre los proteasomas, observándose una acumulación de proteínas poliubiquitiniladas en células cultivadas. Se observó una reducción de más del 50% de la actividad proteasómica intracelular para 5 de los inhibidores (15, 22, 25, 26, 28) tras solo 20 horas de incubación. Cabe destacar que la actividad proteasómica se redujo en un 10% en presencia de 15, 26 y 28. Los inhibidores débiles tienen una influencia menor sobre la función celular. Los resultados de la presente invención muestran potencia, permeación de membrana y una estabilidad suficiente durante los períodos de incubación para los inhibidores 15, 22, 25, 26 y 28. La actividad proteasómica celular se reduce inequívocamente y está acompañada de una fuerte inducción de la apoptosis tras un tratamiento de 20 horas con 1 µM de los inhibidores (15, 26, 28). La mayor sensibilidad conocida de las células tumorales a la inhibición proteasómica fue confirmada para los inhibidores 15 y 28. Sorprendentemente, se observó una fuerte inducción de la apoptosis en las células que se preincubaron con el compuesto 7, que inhibió la actividad de tipo tripsina de un modo exclusivo. Estos resultados indican que la actividad de tipo tripsina es particularmente importante para los procesos antiapoptóticos.

Según la presente invención, los compuestos se pueden utilizar para la inducción de la apoptosis en las células.

Además, los compuestos según la presente invención se pueden utilizar para la inhibición de la actividad proteolítica del proteasoma 20S, el proteasoma 26S y/o el inmunoproteasoma. En este caso, se utilizan para la inhibición in vitro, in vivo y/o intracelular.

Preferentemente, la actividad de tipo tripsina del proteasoma 20S y del proteasoma 26S y/o del inmunoproteasoma se inhibe de forma específica.

Además, preferentemente, se inhibe específicamente la actividad de tipo quimiotripsina del proteasoma 20S y del proteasoma 26S y/o del inmunoproteasoma.

Sin embargo, preferentemente, también se pueden inhibir simultáneamente las actividades de tipo quimiotripsina, de tipo tripsina y de tipo caspasa del proteasoma 20S y del proteasoma 26S y/o del inmunoproteasoma.

Además, resulta preferido según la presente invención utilizar los compuestos para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo para el tratamiento en los siguientes ámbitos terapéuticos:

Neurología

Las inhibiciones o disfunciones de los proteasomas se asocian al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Pick. Los proteasomas intervienen en la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), en enfermedades de las neuronas motoras, la enfermedad de la poliglutamina y en distrofias musculares.

Enfermedades tumorales

Los proteasomas tienen un papel en la transformación maligna, la regulación del ciclo celular, la inhibición o ejecución de la apoptosis, respectivamente, la degradación de diversos productos supresores tumorales (APC, p53, Rb), la degradación de protooncogenes (Raf, Myc, Myb, Rel, Src, etc.) y las disfunciones de la regulación del ciclo celular. Los proteasomas son responsables de la degradación de ciclinas, CDK e inhibidores de los mismos; en muchos casos, la inhibición de los proteasomas provoca la detención del ciclo.

Enfermedades víricas

La presentación de antígenos virales requiere su generación mediante proteasomas: por ejemplo, HCMV, hepatitis (HCV y HBV), herpes (HVP) y otros. Además, en el caso de virus de Coxsackie (CVB) y HCMV, es probable que los proteasomas tengan un papel en la replicación viral (39, 40).

Endocrinología

Los glucocorticoides regulan al alza, por ejemplo, una subunidad alfa proteasómica. La degradación de las proteínas durante la formación de tiroxina tiene lugar a través de proteasomas.

Inmunología

Existe una participación de los proteasomas en las reacciones inflamatorias (ligandos de MHC de clase I, inducción de inmunoproteasomas a través de citoquinas). Además, existe una posible participación en la generación y el progreso de enfermedades autoinmunes. Es posible llevar a cabo una determinación de anticuerpos de proteasoma en suero de los pacientes de SLE, síndrome de Sjögren y polimiositis, y es parcialmente posible la detección de proteasoma circulante liberado en el suero de estos pacientes (41).

Además, la presente invención da a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos según la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, junto con portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichos portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la materia.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se caracterizan porque el compuesto o compuestos están presentes en una cantidad tal que se alcanza una concentración comprendida preferentemente entre 0,001 y 100 µM, más preferentemente entre 0,01 y 10 µM, en el tratamiento in vivo.

Además, se caracterizan porque el compuesto o compuestos están presentes en una cantidad que inhibe eficazmente la función del proteasoma en una célula o un mamífero.

Además, la presente invención da a conocer un procedimiento para la inhibición del crecimiento de una célula cancerosa, que comprende poner en contacto una célula con un compuesto según la presente invención, o con una composición farmacéutica según la presente invención.

A continuación, la presente invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes, no limitativos, haciendo referencia a las figuras adjuntas.

FIGURAS

En las figuras:

la figura 1 representa inhibidores conocidos de serina proteasas y treonina proteasas;

la figura 2 representa mecanismos de la hidrólisis por parte de treonina proteasas;

la figura 3 representa fórmulas de los compuestos 7-28.

Los compuestos 7-18 representan los peptidomiméticos según la presente invención, que se pueden utilizar como inhibidores del proteasoma 20S.

La figura 4 muestra la inhibición de la proteólisis en lisados celulares mediante la adición de los compuestos 7-28 y MG132. Se añadieron 10 µM de los compuestos 7-28 o MG132 a lisados clarificados y se preincubaron durante 30 min antes de llevar a cabo el ensayo de proteólisis. Paralelamente, el lisado se preincubó durante 30 min con la mezcla inhibidora comercial Complete (Roche), que inhibió la mayor parte de las serina proteasas y aspartato proteasas citosólicas, pero no los proteasomas. Esta inactivación parcial fue seguida de la incubación con los compuestos 7-28 y MG132. Se determinó la actividad proteolítica en 10 µl de los lisados mediante la adición de LLVY-AMC (100 µl, 50 µM en 20 mM de Tris, pH 7,2, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT). El AMC que se liberó en el lisado no inhibido se ajustó al 100%. MG132 sirvió como control de la inhibición.

Figura 5: viabilidad de células HeLa tras incubación con los compuestos 7-28.

A, se determinó la viabilidad de células HeLa incubadas con los compuestos 7-28 y MG132 (1 µM), utilizando tinción con violeta cristal tras 20 h.

B, la viabilidad de las células HeLa depende de la concentración del inhibidor. Las células HeLa se cultivaron durante 20 horas en presencia de concentraciones crecientes (de 10 a 10.000 nM) de los compuestos (7, 13, 15, 18, 20-22, 24-28) y MG 132. La supervivencia de las células se determinó mediante tinción con violeta cristal.

Figura 6: inhibición de los proteasomas en las células.

A, las células HeLa se cultivaron durante 24 horas en presencia del inhibidor. La concentración de proteína se determinó de acuerdo con la lisis celular según Bradford a efectos de normalizar las actividades proteasómicas a las diferentes cantidades de células. A continuación, se añadió Complete (Roche) a todos los lisados y se determinó la actividad proteasómica mediante la hidrólisis de SucLLVY-AMC.

B, las células HeLa se incubaron con 1 µM de compuesto 15 durante 2, 4, 6 y 24 horas. Las células se lisaron y las proteínas se separaron por SDS-PAGE en un gel al 10% y se absorbieron en una membrana de PVDF. La acumulación de proteínas poliubiquitiniladas se detectó en un análisis Western blot mediante un anticuerpo antiubiquitina (DAKO).

C, las células HeLa se trataron con concentraciones crecientes del inhibidor 15, 25, 26, 27, y 28 durante 24 horas (pista 1: sin inhibidor; pista 2: 10 nM; pista 3: 100 nM y pista 4: 1 µM del inhibidor dado). Las células se lisaron, se separaron las proteínas sobre geles al 15% y la acumulación de las proteínas poliubiquitiniladas se controló mediante Western blot.

Figura 7: la inhibición del proteasoma mediante los compuestos 7, 15, 26 y 28 conduce a la inducción de apoptosis.

Las células HeLa que se cultivaron durante 20 horas en presencia del inhibidor dado se incubaron a continuación durante 2 horas con sustrato de caspasa (Apo-One; Promega). La activación de las caspasas 3/7 se midió a 538 nm (excitación a 485 nm). El tratamiento de las células con TNFα o con MG132 sirvió como control.

Figura 8: las células de melanoma humano mostraron una sensibilidad elevada al compuesto 15 y los experimentos mostraron la detención del ciclo celular mediante dicho compuesto.

A, se trataron células de melanoma humano (MeWo) con concentraciones crecientes de los compuestos 15 ó 3 (MG132) durante 72 horas. Se detectó la viabilidad de las células tras el tratamiento con el compuesto 15 (-♦-) y MG132 (-□-) mediante tinción de violeta cristal. B y C, las células MeWo se cocultivaron con los compuestos 15 y 3 (MG132) durante 24 horas. A continuación, las células se fijaron en etanol al 70% y se trataron con ARNasa. El ADN se tiñó con yoduro de propidio (5 µg/ml) y se analizó mediante FACS (citómetro de flujo FACS Calibur; Beckton Dickinson). La significancia estadística se detectó mediante el ensayo de chi al cuadrado. La distribución relativa de las células que estaban presentes en la fase G1 (negro), la fase S (blanco) o la fase G2 (rayado) del ciclo celular se muestra para los dos compuestos examinados (15 en B y MG132 en C).

Figura 9: estructura cristalina del compuesto 15 con un proteasoma 20S.

Estereoscopia de sectores de 30 Å de la estructura cristalina de los centros activos de las subunidades β1 (a), β2 (b) y β5 (c) del proteasoma 20S a partir de levadura en complejo con el compuesto 15. El aldehído 15 se representa para cada subunidad en su densidad electrónica no modificada. El Thr1 en el centro activo se resalta en negro. Se representa el enlace covalente entre 15 y Thr1Oγ . Los residuos particularmente responsables del carácter del lugar S1 se representan en gris.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Síntesis de los compuestos

A) Consideraciones generales

Se registraron los espectros de RMN de 1H y 13C en un espectrómetro Bruker AC 300 a 300 MHz (75 MHz). Los desplazamientos químicos se indicaron en ppm corriente abajo del campo de Me4Si (TMS). La espectrometría de masas se llevó a cabo en un espectrómetro de masas Bruker-Franzen Esquire LC. La cromatografía en columna rápida se llevó a cabo utilizando gel de sílice Merck Silicagel 60 (40-63 y 15-40 µm) y60G (5-40 µm). La cromatografía de capa fina (TLC) se llevó a cabo utilizando placas de aluminio recubiertas con gel de sílice Silicagel 60 F254 (0,2 mm; E. Merck). Los puntos cromatográficos se visualizaron mediante UV y/o pulverización con una solución etanólica ácida de p-anisaldehído o una solución etanólica de ninhidrina con calentamiento posterior. Para la cromatografía de capa fina preparativa, las placas se recubrieron con gel de sílice Silicagel 60 F254 (2,0 mm; E. Merck). Los derivados aminoácidos se obtuvieron a través de Fluka Chemie (Suiza), NovaBiochem (Suiza) o Bachem (Suiza). El THF se secó y se destiló con sodio y benzofenona. El DMF se almacenó sobre un tamiz molecular de 3 Å. Todas las demás sustancias químicas comerciales se utilizaron sin purificación adicional.

B) Compuesto 7 (BSc 2114).

Se añadieron hidrocloruro de etil-3-(3′-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC, 191 mg, 1,0 mmol) y N-hidroxibenzotriazola hidrato (HOBt, 183 mg, 1,2 mmol) a una solución de Z-Asp(OtBu)-OH (29, 323 mg, 1,0 mmol) disuelta en CH2Cl2 (10 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 min, y a continuación se trató durante 24 h con Z-leucinol (117 mg, 1,0 mmol) y trietilamina (151 mg, 1,5 mmoles). Se añadió CH2Cl2 (20 ml) y la solución se lavó con HCl (0,1 N, 5 x 30 ml), NaOH (0,1 N, 3 x 30 ml), solución de NaCl saturada (1 x 30 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró, obteniéndose el producto 31 (350 mg, 83%). Una solución de 31 (422 mg, 0,8 mmoles) en etanol (10 ml, abs.) se trató con catalizador de Pd/C (10% de carbono, 100 mg) bajo atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente. La suspensión se filtró al cabo de 3 h y el disolvente se eliminó en vacío, obteniéndose el compuesto 33 (228 mg, 100%). Se añadieron EDAC (157 mg, 0,82 mmoles) y HOBt (132 mg, 0,98 mmol) a la solución de Boc-Leu-OH (189 mg, 0,82 mmoles) en CH2Cl2 (10 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 min, y a continuación se trató durante 24 h con compuesto 33 (228 mg, 0,82 mmoles) y trietilamina (124 mg, 1,23 mmoles). Se añadió DCM (20 ml) y la solución se lavó con HCl (0,1 N, 5 x 30 ml), NaOH (0,1 N, 3 x 30 ml) y solución saturada de NaCl (1 x 30 ml). Tras el secado (Na2SO4), el disolvente se eliminó en vacío, obteniéndose el compuesto 7 (BSc2114) (400 mg, 97%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,65 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 6,8 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 5,03 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 4,55-4,45 (m, 1H), 3,99-3,89 (m, 2H), 3,57 (dd, 1H, 3J = 3,3 Hz, 2J = 11,0 Hz), 3,47 (dd, 1H, 3J = 3,3 Hz, 2J = 11,0 Hz), 2,99 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 2,58 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 2,48 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 2,15-2,14 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,34 (s, 9H), 0,90-0,87 (m, 6H), 0,80-0,75 (m, 6H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 173,0, 171,5, 170,5, 156,3, 81,9, 81,0, 65,6, 54,3, 50,6, 50,5, 40,8, 39,7, 35,9, 28,4, 28,0, 24,9, 23,2, 22,2, 21,6, 21,1 ppm.

MS (EI): m/z = 501 (M+).

C) Compuesto 13 (BSc2115).

El compuesto 7 (BSc2114) (400 mg, 0,8 mmoles) se oxidó con IBX (ácido 2yodoxibenzoico, 268 mg, 0,95 mmoles) en DMSO (5 ml) durante 6 h a temperatura ambiente. Se añadió CH2Cl2 (30 ml) y la solución se lavó con agua (3 x 30 ml), solución de NaHCO3 (3 x 30 ml, saturada) y solución saturada de NaCl (1 x 30 ml). Tras el secado (Na2SO4), el disolvente se eliminó en vacío, obteniéndose el compuesto 13 (BSc2115) (390 mg, 98%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 9,4 (s, 1H), 7,54 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 7,27 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 4,89 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 4,66-4,56 (m, 2H), 4,22-4,15 (m, 2H), 3,99 (dd, 1H, 3J = 3,3 Hz, 2J = 11,0 Hz), 2,99 (dd, 1H, 3J = 3,3 Hz, 2J = 11,0 Hz), 2,90 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 2,58 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 2,48 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 1,66-1,55 (m, 1H), 1,47-1,45 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,34 (s, 9H), 0,9-0,86 (m, 6H, ), 0,80-0,76 (m, 6H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 200,1, 172,6, 171,6, 170,9, 156,2, 82,0, 80,8, 54,3, 50,6, 50,5, 40,8, 39,7, 35,9, 28,4, 28,0, 24,9, 23,2, 22,2, 21,6, 21,1 ppm.

MS (EI): m/z = 499 (M+).

D) Compuesto 14 (BSc2128).

Se añadió TFA (1 ml) a una solución agitada del compuesto 7 (BSc2114, 390 mg, 0,78 mmol) en CH2Cl2 (4 ml). El disolvente se evaporó tras 3 h, obteniéndose el compuesto 14 (BSc2128) (260 mg, 97%).

1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 9,37 (s, 1H), 8,85 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 8,19 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 4,67-4,56 (m, 1H), 4,05-3,89 (m, 2H), 3,77-3,65 (m, 2H), 3,70-3,67 (m, 1H), 2,89 (dd, 1H, 3J = 4,1 Hz, 2J = 16,0 Hz), 2,78 (d, 1H, 2J = 4,1 Hz, 2J = 16,0 Hz), 2,58 (d, 1H, 3J = 4,1 Hz), 2,48 (d, 1H, , 3J = 4,1 Hz), 1,60-1,58 (m, 1H), 1,46-1,44 (m, 1H), 0,800,76 (m, 6H), 0,70-0,66 (m, 6H) ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 200,1, 171,1, 171,0, 169,9, 55,2, 53,8, 50,4, 40,8, 39,7, 35,9, 23,2, 22,2, 21,6, 21,1 ppm.

MS (ESI): m/z = 343,4 (M+).

E) Los compuestos 16 (BSc2129), 9 (BSc2207), 17 (BSc2208), 18 (BSc2197), y 12 (BSc2194) se prepararon por procedimientos análogos.

F) Compuesto 8 (BSc2117).

El compuesto 8 se preparó a partir del compuesto 33 siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 80%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,51 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 7,29-7,19 (m, 5H), 6,70 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 5,35 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 5,50 (s, 2H), 4,60-4,58 (m, 1H), 4,10-4,75 (m, 1H), 3,95-3,87 (m, 1H), 3,58 (dd, 1H, 3J = 3,3 Hz, 2J = 11,0 Hz), 3,45 (dd, 1H, 3J = 3,3 Hz, 2J = 11,0 Hz), 2,89 (dd, 1H, 3J = 4,1 Hz, 2J = 16,0 Hz), 2,80 (d, 1H, 3J = 4,1 Hz, 2J = 16,0 Hz), 2,59 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz, ), 2,50 (d, 1H, 3J = 4,3 Hz), 2,0-1,96 (m, 2H), 1,55-1,53 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,25-1,23 (m, 1H), 0,89 (dd, 6H, 3J = 4,3 Hz, 3J = 7,0 Hz), 0,80 (dd, 6H, 3J = 4,3 Hz, 3J = 7,0 Hz) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 167,0, 166,2, 165,1, 151,4, 130,4, 123,3, 123,1, 123,1, 122,8, 77,1, 62,2, 60,2, 49,0, 45,8, 45,2, 35,6, 34,4, 31,1, 22,7, 22,7, 22,7, 21,6, 21,1, 19,5, 17,8 ppm.

MS (EI): m/z = 535(M+).

G) Compuesto 15 (BSc2118).

El compuesto 15 se preparó a partir del compuesto 8 (BSc2117) siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 94%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 9,49 (s, 1H), 7,48 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 7,35-7,33 (m, 5H), 7,25 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 5,23-5,22 (m, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,80-4,79 (m, 1H), 4,384,37 (m, 1H), 4,15-4,14 (m, 1H), 3,00 (d, 1H, 3J = 3,3 Hz), 2,98 (d, 1H, 3J = 3,3 Hz), 2,60 (d, 1H, 3J = 6,3 Hz), 2,55 (d, 1H, 3J = 6,3 Hz), 2,30-2,28 (m, 1H), 2,23-2,22 (m, 1H), 2,051,99 (m, 2H), 1,77-1,76 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,35-1,34 (m, 1H), 0,89-0,86 (m, 6H), 0,800,78 (m, 6H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 200, 172,1, 171,6, 170,8, 67,4, 156,6, 135,9, 128,7, 128,4, 128,1, 122,8, 82,1, 57,5, 54,5, 49,8, 45,8, 45,2, 41,1, 37,4, 36,5, 28,0, 28,0, 28,0, 24,5, 23,3, 23,0, 21,7 ppm.

MS (ESI): m/z = 533 (M+).

H) Compuesto 16 (BSc2129).

El compuesto 16 se preparó a partir del compuesto 15 (BSc2118) siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 84%.

1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 9,8 (s, 1H), 9,37 (s, 1H), 8,30 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 8,24 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 7,36-7,34 (m, 5H), 5,22-5,21 (m, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,80-4,79 (m, 1H), 4,5-4,45 (m, 1H), 4,15-4,10 (m, 1H), 3,30-3,29 (m, 1H), 2,98-2,97 (m, 1H), 2,602,59 (m, 1H), 2,55-2,54 (m, 1H), 2,30-2,29 (m, 1H), 2,23-2,22 (m, 1H), 2,05-1,99 (m, 2H), 1,77-1,76 (m, 1H), 1,35-1,34 (m, 1H), 0,89-0,88 (m, 6H), 0,80-0,79 (m, 6H) ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 200, 172,1, 171,6, 170,8, 67,4, 156,6, 135,9, 128,7, 128,4, 128,1, 122,8, 82,1, 57,5, 54,5, 49,8, 45,8, 45,2, 41,1, 37,4, 36,5, 24,5, 23,3, 23,0, 21,7 ppm.

MS (ESI): m/z = 476 (M+).

I) Compuesto 9 (BSc2207).

El compuesto 9 se preparó a partir del compuesto 33 siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 93%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,67 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 7,4 (d, 1H, 3J = 9,2 Hz), 7,26 (d, 1H, 3J = 8,4 Hz), 4,7-4,63 (m, 2H), 4,43-4,33 (m, 2H), 4,04-3,94 (m, 2H), 3,59-3,54 (m, 1H), 3,53-3,43 (m, 1H), 3,30 (dd, 1H, 3J = 4,5 Hz, 2J = 17,0 Hz), 2,8 (dd, 1H, 3J = 4,8 Hz, 2J = 17,0 Hz), 2,65-2,55 (m, 1H), 2,54-2,45 (m, 1H), 2,15-2,05 (m, 2H), 2,0 (d, 3H, 3J = 15,0 Hz), 1,44 (s, 9H), 0,9-0,87 (m, 6H), 0,80-0,78 (m, 6H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 172,5, 172,3, 171,6, 169,9, 82,0, 66,6, 53,4, 50,4, 49,5, 40,8, 39,7, 35,9, 28,4, 25,0, 24,7, 22,9, 23,2, 22,1 ppm.

MS (EI): m/z = 443 (M+).

J) Compuesto 10 (BSc2195).

El compuesto 10 se preparó a partir del compuesto 34 siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 88%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 8,26 (d, 1H, 3J = 7,2 Hz), 7,59 (m, 5H, ArH), 6,70 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 6,35 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,20 (s, 2H), 4,62-4,48 (m, 1H), 4,44-4,42 (m, 1H), 4,01-4,00 (m, 1H), 3,98-3,97 (m, 1H), 3,91-3,90 (m, 1H), 2,89-2,88 (dm, 1H), 2,80-2,78 (m, 1H), 2,59-2,58 (m, 1H), 2,50-2,49 (m, 1H), 2,0-1,99 (m, 2H), 1,55-1,54 (m, 1H), 1,34 (s, 3H), 1,25-1,24 (m, 1H), 0,89 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,7 Hz), 0,80 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,7 Hz) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 175,5, 173,7, 173,0, 169,7, 128,8, 128,3, 68,5, 66,5, 41,4, 40,8, 40,2, 35,6, 34,4, 31,1, 23,5, 22,1, 23,9, 23,6, 22,9 ppm.

MS (EI): m/z = 477 (M+).

K) Compuesto 17 (BSc2208).

El compuesto 17 se preparó a partir del compuesto 10 (BSc2195) siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 74%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 9,40 (s, 1H), 8,26 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 7,28-7,19 (m, 5H), 6,70 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,65 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,30 (s, 2H), 4,82-4,81 (m, 1H), 4,35-4,33 (m, 1H), 3,96-3,95 (m, 1H), 2,80-2,79 (m, 1H), 2,75-2,74 (m, 1H), 2,49-2,48 (m, 1H), 2,45-2,44 (m, 1H), 2,0-1,98 (m, 2H), 1,51-1,50 (m, 1H), 1,30 (s, 3H), 1,25-1,24 (m, 1H), 0,89 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz), 0,80 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz) ppm.

13C-RMN (CDl 3 , 75 MHz): δ = 200, 174,5, 173,5, 173,0, 166,7, 128,6, 128,3, 68,5, 41,4, 40,8, 40,2, 35,6, 34,4, 31,1, 23,5, 22,1, 23,9, 23,6, 22,9.

MS (EI): m/z = 475 (M+).

L) Compuesto 11 (BSc2196).

El compuesto 11 se preparó a partir del compuesto 34 siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 77%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,29-7,19 (m, 10H), 6,65 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 6,33 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,35 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,28-5,17 (m, 4H), 4,22-4,21 (m, 1H), 4,03,99 (m, 1H), 3,74-3,73 (m, 1H), 3,66-3,65 (m, 1H), 3,22-3,21 (m, 1H), 2,99-2,98 (m, 1H), 2,92-2,91 (m, 1H), 2,62-2,60 (d, 1H), 2,50-2,51 (d, 1H, ), 2,4-2,3 (m, 2H), 1,57-1,56 (m, 1H), 1,24-1,23 (m, 1H), 0,87 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz), 0,80 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 172,4, 172,0, 170,2, 156,8, 142,8, 135,8, 128,7, 68,5, 67,2, 62,2, 52,0, 49,8, 49,2, 41,6, 40,4, 33,1, 22,4, 22,1, 21,6, 21,1, 19,5, 18,3 ppm.

MS (EI): m/z = 569 (M+).

M) Compuesto 18 (BSc2197).

El compuesto 18 se preparó a partir del compuesto 11 (BSc2196) siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 74%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 9,33 (s, 1H), 7,26-7,19 (m, 10H), 7,03 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 6,41 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,66 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,23-4,95 (m, 4H), 4,26-4,13 (m, 1H), 4,12-4,03 (m, 1H), 3,57-3,54 (m, 1H), 2,94 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 2,72 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz ), 2,02 (d, 1H, 3J = 10,0 Hz), 1,99 (d, 1H, 3J = 10,0 Hz), 1,57-1,44 (m, 2H), 1,451,42 (m, 1H), 1,24-1,99 (m, 1H), 0,87 (dd, 6H, 3 = 3,8 Hz, 6,4 Hz ), 0,80 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 200, 173,4, 172,6, 171,2, 156,8, 142,8, 138,8, 128,7, 128,7, 66,5, 65,2, 52,0, 49,7, 48,2, 41,7, 40,6, 33,5, 22,6, 22,3, 21,9, 21,5, 19,4, 18,0 ppm.

MS (ESI): m/z = 567 (M+).

N) Compuesto 12 (BSc2194).

El compuesto 12 se preparó a partir del compuesto 34 siguiendo el mismo procedimiento, y se obtuvo con un rendimiento del 90%.

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,32-7,28 (m, 5H), 7,01 (d, 1H, 3J = 1,0 Hz), 6,33 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 5,32 (s, 2H), 4,91 (d, 1H, 3J = 7,0 Hz), 4,25-4,22 (m, 1H), 4,08-4,06 (m, 1H), 3,98-3,97 (m, 1H), 3,68-3,65 (dd, 2H), 2,99-2,97 (m, 1H), 2,92 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 2,59 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 2,50 (d, 1H, 3J = 7,3 Hz), 1,97-1,87 (m, 2H), 1,55-1,54 (m, 1H), 1,34 (s, 9H), 1,24, 1,23 (m, 1H), 0,89 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz), 0,80 (dd, 6H, 3J = 3,8 Hz, 6,4 Hz) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 172,8, 172,4, 170,1, 155,8, 135,4, 128,6, 77,1, 76,6, 67,2, 62,2, 49,0, 45,8, 45,2, 35,6, 34,4, 33,1, 23,7, 22,4, 22,1, 21,6, 21,1, 19,5, 18,3 ppm.

MS (EI):m/z = 535 (M+).

O) Compuesto 19 (BSc2158) (ejemplo de referencia)

Se trató una suspension de NaH en aceite mineral (60%, 291 mg, 7,3 mmoles) en THF (2 ml, abs.) con S-(-)-fenilglicinol (500 mg, 3,6 mmoles) a -15ºC bajo atmósfera de argón, y se agitó durante 20 min. La mezcla se enfrió a -55ºC antes de añadir tricloroetileno (400 µl, 4,5 mmoles) en THF (2 ml). La mezcla se calentó a temperatura ambiente a lo largo de las siguientes 5 h, se añadió agua (40 ml), y a continuación se extrajo con Et2O (60 ml). La capa orgánica se extrajo, se lavó con solución saturada de NaCl (40 ml), se secó (Na2SO4) y se concentró. El producto se purificó por cromatografía de columna, obteniéndose el dicloroviniléter 35 (347 mg, 56%).

A una mezcla de Z-Leu-Leu-OH (378 mg, 1,0 mmol), EDAC (192 mg, 1,0 mmol) y HOBt (170 mg, 1,1 mmoles), se le añadió DMF (2 ml). La solución resultante se agitó enérgicamente durante 10 min y a continuación se añadieron el dicloroviniléter 35 (200 mg, 1,2 mmoles) y Et3N (0,28 ml, 2,0 mmoles). La solución se agitó durante 2 h. Se añadió DCM (40 ml) y se llevó a cabo el lavado con ácido clorhídrico (0,1 N, 3 x 30 ml), solución acuosa de NaHCO3 (saturada, 3 x 30 ml) y agua (3 x 30 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y el disolvente se eliminó en vacío, obteniéndose el compuesto 19 (BSc2158) (403 mg, 77%).

1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 8,52 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 8,33 (d, 1H, 3J = 8,3 Hz), 7,44 (d, 1H, 3J = 8,2 Hz, NH-Leu1), 7,40-7,28 (m, 10H), 6,07 (s, 1H), 5,19-5,12 (m, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,45-4,40 (m, 1H), 4,22-4,11 (m, 2H), 4,08-4,01 (m, 1H), 1,65-1,35 (m, 6H), 0,90-0,78 (m, 12H) ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 172,0, 171,5, 155,8, 142,2, 138,4, 136,9, 128,2, 127,7, 127,6, 127,4, 127,5, 126,9, 97,7, 73,0, 65,2, 53,0, 51,4, 50,8, 40,8, 40,6, 24,1, 24,0, 22,6, 21,9, 21,6, 21,3 ppm.

MS (EI): m/z = 480 (Z-Leu-Leu-C8H9+), 371 (C10-Leu-C10H10Cl2NO+).

P) Compuesto 20 (BSc2166) (ejemplo de referencia).

El dicloroviniléter 36 (178 mg, 25%) se sintetizó a partir de (S)-(-)-leucinol (400 mg, 3,4 mmol) de acuerdo con la síntesis del dicloroviniléter 35. La reacción se inició a -70ºC, se calentó durante una noche a temperatura ambiente y a continuación se agitó durante 60 h adicionales. El acoplamiento del compuesto 36 (100 mg, 0,47 mmoles) con Z-LeuLeu-OH (100 mg, 0,47 mmoles) proporcionó el producto 20 (BSc2166) (143 mg, 63%).

1H-MR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 7,92 (d, 1H, 3J = 5,1 Hz), 7,70 (d, 1H, 3J = 5,1 Hz), 7,48 (d, 1H, 3J = 4,2 Hz), 7,40-7,31 (m, 5H), 6,05 (s, 1H), 5,05 (s, 2H), 4,33-4,29 (m, 1H), 4,08-4,03 (m, 2H), 3,87-3,85 (m, 2H), 1,60-1,41 (m, 9H, ) 0,90-0,88 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 171,9, 171,5, 155,8, 142,9, 137,0, 128,2, 127,7, 127,5, 97,9, 73,3, 65,3, 53,1, 50,9, 45,7, 40,9, 40,0, 39,8, 24,11, 24,08, 23,85, 23,16, 22,92, 22,87, 21,80, 21,50, 21,5 ppm.

MS (EI): m/z = 460 (Z-Leu-Leu-C6H14N+), 295 (CO-Leu-C4H6Cl2NO+).

Q) Compuesto 21 (BSc2167) (ejemplo de referencia).

Un matraz redondo secado en un horno se cargó con Zn(OTf)2 (168 mg, 0,45 mmoles) y (-)-efedrina (84 mg, 0,50 mmoles) bajo atmósfera de argón. Se añadió Et3N (51 mg, 70 µl, 0,50 mmol) en toluol seco (2 ml) y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadieron el compuesto 3 (MG132) (200 mg, 0,42 mmoles) y fenilacetileno (52 mg, 56 µl, 0,50 mmoles) al cabo de otros 15 min y se agitó durante 20 h a 60ºC. Se añadieron CH2Cl2 (40 ml) y una solución tampón acuosa de KH2PO4/Na2HPO4 (30 ml, pH 5,5), se separó la capa orgánica y la fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 x 30 ml). Las bases orgánicas unificadas se secaron (Na2SO4) y el disolvente se eliminó en vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna, obteniéndose el compuesto 21 (BSc2167) (260 mg, 54%).

1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 8,46-8,37 (m, 1H), 7,50-7,47 (m, 1H), 7,43-7,19 (m, 10H), 5,20-5,11 (m, 1H), 5,00-4,95 (m, 2H), 4,57-4,49 (m, 2H), 4,13-4,03 (m, 2H), 1,80-1,24 (m, 9H), 0,90-0,53 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 174,2, 174,7, 156,9, 139,5, 131,2, 127,9, 127,8, 127,6, 127,3, 126,5, 126,3, 98,1, 80,0, 63,1, 62,8, 54,5, 52,9, 46,8, 40,9, 40,3, 36,9, 24,7. 24,2, 24,0, 23,2, 23,1, 22,9, 21,4, 21,2, 20,7 ppm.

MS (El): m/z = 446 (Z-Leu-Leu-C5H11 +), 257 (CO-Leu-C6H13O+).

R) Compuesto 22 (BSc2160) (ejemplo de referencia).

Se acoplaron Z-Leu-Leu-OH (151 mg, 0,4 mmoles) y (S)-3-amino-1-cloro-5metilhexan-2-ona (80 mg, 0,4 mmoles) tal como se ha descrito para el compuesto 19 (BSc2158). El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna, obteniéndose el compuesto 22 (BSc2160) (32 mg, 16%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,35-7,19 (m, 5H), 6,81-6,73 (m, 1H), 6,41-6,32 (m, 1H), 5,16 (d, 1H, 3J = 5,1 Hz), 5,03 (s, 2H), 4,64-4,61 (m, 1H), 4,35-4,06 (m, 3H), 1,871,40 (m, 9H), 0,92-0,73 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 201,4, 172,7, 172,3, 156,6, 136,2, 128,6, 128,3, 128,0, 67,2, 55,0, 53,8, 51,8, 47,1, 41,4, 40,6, 39,6, 24,9, 24,8, 23,3, 22,9, 22,7, 22,6, 22,3, 22,2, 21,5 ppm.

MS (EI): m/z = 488 (Z-Leu-Leu-Leu-CH2+), 432 (OCO-Leu-Leu-Leu-CH2Cl+).

S) Compuesto 23 (BSc2159) (ejemplo de referencia).

Se disolvieron el compuesto 3 (MG132) (300 mg, 0,63 mmoles), bencilisonitrilo (116 µl, 0,95 mmol), y piridina (204 µl, 2,53 mmoles) en CH2Cl2 (2,0 ml), y la solución se enfrió a -10ºC. Se añadió ácido trifluoroacético (97 µl, 1,26 mmoles) gota a gota en atmósfera de argón durante más de 15 min (T < 0ºC). Se prosiguió el enfriamiento durante 2 h, tras las cuales siguieron otras 72 h a temperatura ambiente. Se añadió CH2Cl2 (50 ml) y se lavó con ácido clorhídrico (0,1 N, 3 x 30 ml), solución acuosa de NaHCO3 (saturada, 3 x 30 ml) y solución saturada de NaCl (3 x 40 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y el producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna, obteniéndose el compuesto 23 (BSc2159) (191 mg, 50%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,51-7,27 (s, 1H), 7,26-7,14 (m, 10H), 6,91-6,80 (m, 1H) 5,82-5,63 (m, 2H), 5,02-4,90 (m, 2H), 4,35 (d, 1H, 3J = 10,7 Hz), 4,30-4,01 (m, 5H), 1,55-1,31 (m, 9H), 0,81-0,73 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 173,3, 172,7, 172,6, 157,5, 138,0, 136,2. 128,9, 128,8, 128,6, 128,1, 127,9, 127,8, 73,5, 67,3, 53,9, 52,0, 51,7, 43,2, 42,4, 41,6, 25,0, 24,8, 23,3, 23,0, 22,1, 22,0, 21,6 ppm.

MS (EI): m/z = 610 (M+).

T) Compuesto 24 (BSc2185) (ejemplo de referencia).

Se convirtieron el compuesto 3 MG132 (145 mg, 0,3 mmol) y 3-picolilisonitrilo (52 mg, 0,45 mmoles) de acuerdo con la preparación del compuesto 23 (BSc2159) en la αhidroxilamida 24 (BSc2185). La purificación mediante cromatografía de columna dio lugar al compuesto 24 (BSc2185) (103 mg, 56%).

1HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 8,62-8,36 (m, 2H), 7,71-7,50 (m, 2H), 7,28-7,20 (m, 6H), 7,05-6,96 (m, 1H) 5,92-5,57 (m, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,72-4,56 (m, 1H), 4,46-4,10 (m, 5H), 1,79 (s, 1H), 1,62-1,18 (m, 9H), 0,92-0,73 (m, 18H)ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 172,4, 171,9, 171,2, 155,8, 148,9, 147,9, 137,0, 135,2, 135,0, 128,2, 127,7, 127,6. 123,2, 73,8, 65,2, 53,0, 51,0, 49,2, 42,8, 40,6, 37,1, 24,1, 23,7, 22,2, 23,0, 21,8, 21,7, 21,6, 21,1 ppm.

MS (El): m/z = 611 (M+).

U) Compuesto 25 (BSc2186) (ejemplo de referencia).

Se convirtieron el compuesto 3 MG132 (200 mg, 0,42 mmoles) y fenilisonitrilo (65 mg, 0,63 mmoles) de acuerdo con la preparación del compuesto 23 (BSc2159) en la αhidroxilamida 25 (BSc2186). El producto crudo se purificó mediante cromatografía de columna, obteniéndose el compuesto 25 (BSc2186) (70 mg, 28%).

1H-RMN (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 8,27 (s, 1H). 7,72-7,57 (m, 2H), 7,37-7,20 (m, 7H), 7,11-7,01 (m, 2H), 6,11-6,08 (m, 1H), 5,95-5,92 (m, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,30-4,24 (m, 2H), 4,07-3,99 (m, 2H), 1,57-1,32 (m, 9H), 0,88-0,61 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (DMSO-d6, 75 MHz): δ = 172,0, 171,1, 171,0, 155,7, 138,3, 137,0, 128,4, 128,2, 127,6, 127,5, 123,5, 119,5, 65,2, 52,7, 52,9, 49,2, 40,5, 40,3, 40,0, 24,1, 23,9, 23,8, 23,1, 23,0, 22,6, 22,0. 21,3, 21,2 ppm.

MS (El): m/z = 596 (M+).

V) Compuesto 26 (BSc2187) (ejemplo de referencia).

Se disolvieron la α-hidroxilamida 23 (BSc2159) (40 mg, 0,065 mmol) e IBX (36 mg, 0,13 mmol) en DMSO, y la disolución se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. Se añadieron DCM (40 ml) y agua (30 ml) antes de la filtración. Las capas orgánicas se separaron, se lavaron con agua (2 x 40 ml), solución acuosa de NaHCO3 (1 x 40 ml, 0,05 N) y agua (1 x 30 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y el disolvente se eliminó en vacío, obteniéndose el compuesto 26 (BSc 2187) (22 mg, 56%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 7,50-7,41 (m, 1H), 7,41-7,14 (m, 10H), 6,91-6,80 (m, 1H) 5,58-5,54 (m, 1H), 5,27-5,21 (m, 1H), 5,03-4,94 (m, 2H), 4,43-4,31 (m, 3H), 4,194,03 (m, 2H), 1,64-1,12 (m, 9H), 0,92-0,74 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 191,8, 172,6, 171,8, 161,4, 156,4, 136,9, 136,3, 128,9, 128,9, 128,6, 128,3, 128,1, 128,0, 67,2, 53,6, 53,3, 51,6, 43,4, 41,5, 40,86, 40,0, 25,3, 24,8, 23,8, 23,7, 23,3, 23,0, 22,8, 22,4, 22,1, 21,5 ppm.

MS (El): m/z = 474 (Z-Leu-Leu-C6H12NO+).

W) Compuesto 27 (BSc2188) (ejemplo de referencia).

El compuesto 24 (BSc2185) se oxidó de acuerdo con la síntesis del compuesto 26 (BSc2187). La purificación mediante cromatografía de columna dio lugar al compuesto 27 (BSc2188) (60 mg, 49%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 8,46-8,44 (m, 2H), 7,64-7,47 (m, 2H), 7,24-7,12 (m, 6H), 6,85-6,82 (m, 1H), 5,54-5,47 (m, 1H), 5,22-5,15 (m, 1H), 5,04-4,93 (m, 2H), 4,46-3,99 (m, 4H), 1,62-1,16 (m, 9H), 0,92-0,76 (m, 18H) ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 196,4, 172,6, 171,9, 159,8, 156,4, 149,3, 149,2, 136,2, 135,9, 133,0, 128,7, 128,3, 128,0, 123,8, 67,2, 53,7, 53,3, 51,5, 41,4, 40,8, 40,6, 39,9, 25,0, 24,8, 23,3, 23,0, 22,1, 22,0 ppm.

MS (EI): m/z = 609 (M+), 474 (Z-Leu-Leu-C6H12NO+).

X) Compuesto 28 (BSc2189) (ejemplo de referencia).

El compuesto 25 (BSc2185) (200 mg, 0,35 mmol) se oxidó de acuerdo con la síntesis del compuesto 26 (BSc2187). La purificación mediante cromatografía de columna dio lugar al compuesto 28 (BSc2189) (30 mg, 50%).

1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): δ = 8,58 (s, 1H), 7,56-7,54 (m, 2H), 7,29-7,19 (m, 7H), 7,11-7,00 (m, 1H), 6,75 (d, 1H, 3J = 9,0 Hz), 6,63 (d, 1H, 3J = 9,1 Hz), 5,36-5,28 (m, 2H), 5,07 (s, 2H), 4,51-4,41 (m, 1H), 4,19-4,11 (m, 1H), 1,97-1,41 (m, 9H), 0,93-0,77 (m, 18H)ppm.

13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): δ = 196,8, 172,5, 171,8, 157,2, 156,4, 136,3, 136,2, 129,3, 129,2, 128,7, 125,5, 120,0, 67,3, 53,7, 53,0, 51,6, 41,3, 40,6, 40,9, 25,4, 25,4, 24,8, 23,3, 23,0, 22,8, 22,2, 22,1, 21,5 ppm.

MS (EI): m/z = 474 (Z-Leu-Leu-C6H12NO+).

Ejemplo 2: Aislamiento de los proteasomas

Los proteasomas se aislaron de los glóbulos rojos. Las células se lisaron con DTT (1 mM), y el sobrenadante desprovisto de estromas se cargó en DEAE-Sepharose (Toyopearls). El proteasoma se eluyó con un gradiente de NaCl en TEAD (20 mM de TrisCl, pH 7,4, 1 mM de EDTA, 1 mM de azida, 1 mM de DTT) de 100 a 300 mM de NaCl. El proteasoma se concentró utilizando precipitación con sulfato de amonio (entre 40 y 70% de saturación) y se separó en un gradiente de sucrosa al 10-40% por centrifugación a

40.000 rpm durante 16 horas (SW40; L7, Beckman & Coulter). Finalmente, los proteasomas se purificaron en una columna MonoQ y se eluyeron con un gradiente de NaCl a aproximadamente 280 mM de NaCl. Las fracciones que contenían el proteasoma purificado se sometieron a diálisis frente a NaCl 50 mM en TEAD y se almacenaron en hielo. La pureza se determinó por SDS-PAGE.

Ejemplo 3: Ensayos de proteasa

Se utilizaron Suc-LLVY-AMC, Z-VGR-AMC y LLE-AMC (BACHEM, Calbiochem) para determinar las actividades tipo quimiotripsina, tipo tripsina o tipo caspasa postacídicas del proteasoma. El sustrato se incubó con proteasoma a 37ºC en tampón de ensayo (20 mM de Tris/Cl, pH 7,2, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT) durante una hora. Se preincubaron 100 ng de proteasoma con 0,01-10 µM del inhibidor durante 15 mm. La reacción se inició mediante la adición de sustrato (50 µM). El AMC liberado se detectó mediante emisión de fluorescencia a 460 nm (excitación a 390 nm) utilizando un fluorímetro TECAN. La actividad se calculó en unidades de florescencia. La inhibición se representa mediante valores de IC50.

Ejemplo 4: Cultivo celular

Se cultivaron células HeLa en RPMI complementado con 10% de FCS y penicilina/estreptomicina, con un 5% de CO2. Los seguidores se administraron a partir de soluciones estoc 100x (en DMSO) a las concentraciones finales indicadas, y se incubaron con las células, como mínimo, durante 20 horas.

Ejemplo 5: Inhibición intracelular de los proteasomas

Se evaluó la capacidad para inhibir el proteasoma 20S de todos los peptidomiméticos (7-28). Para ello, en primer lugar, se examinó la inhibición de las proteasas celulares solubles.

Se añadieron soluciones 10 µM de los compuestos 7 a 28 a la fracción citosólica de células HeLa y se incubaron durante 30 min sobre hielo. A continuación, el proceso proteolítico se prosiguió mediante la adición del sustrato peptídico Suc-LLVY-AMC. Paralelamente, la fracción citosólica se trató con el cóctel inhibidor de proteasa Complete (Roche), que tiene una amplia especificidad, antes de la adición del sustrato. Este cóctel inhibidor no afectó a la actividad proteasómica. 11 de los 22 compuestos examinados redujeron la proteólisis de la fracción citosólica, así como en el lisado pretratado con Complete (figura 4). Las relaciones de inhibición diferían enormemente. Algunos de los compuestos no mostraron ninguna inhibición, mientras que 5 de los compuestos analizados redujeron la hidrólisis de Suc-LLVY-AMC en más del 75%.

Las células cultivadas (HeLa) se recogieron lisadas y con un 0,1% de NP40 en TEAD en presencia de la mezcla inhibidora de proteasa comercialmente disponible Complete (Roche). La actividad proteasómica se midió en 10 µl del lisado utilizando SucLLVY-AMC como sustrato. El contenido proteínico se cuantificó mediante el procedimiento de Bradford (Protein assay; BioRad).

Ejemplo 6: Especificidad de los compuestos en la inhibición del proteasoma 20S

Con el fin de verificar que el efecto inhibidor observado en la fracción citosólica estaba causado por la inhibición del proteasoma, los inhibidores se añadieron en diferentes concentraciones a proteasomas 20S aislados. Los efectos se compararon con el del inhibidor proteasómico de uso habitual 3 (MG132). Las actividades de tipo quimiotripsina (Suc-LLVY-AMC), de tipo tripsina (Bz-VGR-AMC) y de tipo caspasa (Z-LLEAMC) de los proteasomas 20S se determinaron tras la incubación durante una hora a 37ºC. Los resultados se representan en la tabla 1.

Los efectos inhibidores más potentes se observaron para la actividad de tipo quimiotripsina. Seis de los inhibidores ensayados (compuestos 13, 15, 25, 26, 27, 28) mostraron valores de IC50 menores de 1 µM. La inhibición de la actividad de tipo tripsina fue menor de 1 µM para los inhibidores 7, 13 y 15. Únicamente los compuestos 7 y 8 mostraron una inhibición exclusiva de la actividad de tipo tripsina. La inhibición de la actividad de tipo caspasa fue incluso más débil (véase tabla 1).

Los proteasomas aislados a partir de las células HeLa incluyen principalmente proteasomas con subunidades constitutivas. De este modo, se repitieron los experimentos de inhibición con inmunoproteasomas aislados a partir de células T2.27 transfectadas de forma estable. Los inmunoproteasomas exhibieron una sensibilidad similar frente a compuestos de la presente invención (datos no represenados).

-25 TABLA 1: valores de IC50 calculados de los compuestos 7-28.

Compuesto: Nº de compuesto IC50 (µM)

β5 Tipo quimiotripsina (Y): β5 Tipo quim. (L) β2 Tipo tripsina (R) β1 Tipo caspasa (E)

7: BSc2114 > 10 - 0,053 > 10

8: BSc2117 > 10 - 5,481 > 10

9: BSc2207 > 10 - -

10: BSc2195 > 10 - -

11: BSc2196 > 10 - -

12: BSc2194 > 10 - -

13: BSc2115 0,382 0,102 0,495 0,098

14: BSc2128 > 10 > 10 > 10 > 10

15: BSc2118 0,058 0,031 0,155 1,791

16: BSc2129 7,26 - > 10 > 10

17: BSc2208 - - - -

18: BSc2197 1,731 - 3,122

19: BSc2158 - - - -

20: BSc2166 > 10 > 10 > 10

21: BSc2167 1,303 > 10 - -

22: BSc2160 2,196 - - -

23: BSc2159 - - - -

24: BSc2185 - - - -

25: BSc2186 0,981 - 4,04

26: BSc2187 0,441 - 1,72

27: BSc2188 0,350 - 7,966

28: BSc2189 0,072 - > 10

3: MG132 0,0242 2,240 9,215 2,288

Los valores de IC50 se calcularon a partir de la inhibición del proteasoma para

5 concentraciones crecientes del inhibidor. Las muestras se preincubaron durante 15 min en hielo. El ensayo se inició mediante la adición 50 µM de uno de los siguientes sustratos peptídicos fluorogénicos:

LLVY -MCA y GLL–MCA para actividad de tipo quimiotripsina, 10 VGR –MCA para actividad de tipo tripsina, LLE –MCA para actividad de tipo caspasa.

La liberación de MCA se determinó a una emisión de 460 nm (excitación 390 nm). Los valores de IC50 calculados para MG132 sirvieron como controles.

Ejemplo 7: Sensibilidad de las células frente a los compuestos añadidos

A menudo, los inhibidores de la proteasa son muy tóxicos para los organismos o las células individuales (1). Por consiguiente, los inhibidores seleccionados se ensayaron en cultivos celulares.

Se evaluó la viabilidad de las células HeLa en presencia de diferentes compuestos en cultivos de 24 horas. Se evaluó la viabilidad de las células HeLa mediante tinción de violeta cristal tras incubación con los inhibidores. Las células se lavaron una vez con PBS, se fijaron con glutardialdehído 1% durante 30 min y se lavaron de nuevo. Finalmente, las células fijadas se tiñeron con violeta cristal 0,1% en PBS durante 30 min, y a continuación se lavaron cuidadosamente con agua a efectos de eliminar el colorante no enlazado. El colorante residual se eluyó con Triton X-100 0,1% en PBS, y se determinó a 550 nm.

Las células HeLa toleraron concentraciones de 1 µM de sustancias inhibidoras e inactivas (figura 5A). La tasa de supervivencia se redujo marcadamente para las soluciones 10 µM, en particular para los inhibidores más potentes (compuestos 15, 28, 27) (figura 5B).

Una aplicación en cultivos celulares o en animales requiere que las concentraciones de los inhibidores se seleccionen tan bajas como sea necesario. La actividad proteasómica específica se redujo hasta un valor inferior al 50% en las células tratadas con 1 µM de los compuestos 15, 22, 25, 26, o 28, respectivamente (figura 6A). Se observó una marcada reducción de la actividad específica para los compuestos 7, 13 y 27. Los compuestos 18 y 21 mostraron una inhibición muy débil de la actividad proteasómica (datos no representados). Cabe destacar que se observó una reducción de la actividad proteolítica incluso para una concentración de 10 nM de los compuestos 15, 22 y 28.

Ejemplo 8: Detección de las proteínas poliubiquitiniladas acumuladas

Una inhibición específica del proteasoma conduce a una acumulación de proteínas poliubiquitiniladas. Efectivamente, la cantidad de proteínas poliubiquitiniladas aumentó durante la incubación con los inhibidores. Los primeros efectos se observaron tras 2 horas para el compuesto 15 (figura 6B), así como para los compuestos 20, 22, 25 y 28 (datos no representados). Los resultados para los compuestos 15, 25, 26, 27 y 28 tras 24 horas de incubación se muestran en la figura 6C. Se separaron 50 µg de lisados de células enteras mediante SDS-PAGE y se absorbieron sobre una membrana de PVDF (Millipore). Los blots se bloquearon mediante una suspensión de leche al 5%. Las proteínas poliubiquitiniladas se detectaron mediante anticuerpos antiubiquitina (DAKO), y anticonejo marcado con POD como anticuerpo secundario (DIANOVA), y se visualizaron mediante ECL.

Ejemplo 9: Ensayo de apoptosis

Los proteasomas determinan el equilibrio sensible entre la vida y la muerte de las células controlando los factores de transcripción y las proteínas implicadas en la apoptosis. La reducción de la actividad proteasómica podría conducir a la iniciación de la apoptosis, tal como se ha documentado para el inhibidor proteasómico 3 (MG132) (29).

Para ello, se sembraron 10.000 células HeLa por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cocultivaron durante 20 horas con 1 µM de los inhibidores 7, 8, 11, 13-16, 18, 20-23 y 25-28. La inducción de la apoptosis se determinó midiendo la actividad de la caspasa 3/7 (Apo-One®-Assay, Promega).

El tratamiento de las células con la mayoría de los inhibidores dio lugar a una reducción de la viabilidad celular. Para los inhibidores 7, 15, 26 y 28, se pudo atribuir la causa de la reducción de la viabilidad (figura 7) a una apoptosis inicial mediante la activación de las caspasas 3 y 7.

Se observaron resultados parecidos por microscopia de fluorescencia de fragmentación de núcleo con tinción de DAPI (datos no mostrados).

Ejemplo 10: Las células tumorales muestran una sensibilidad más elevada frente a los inhibidores

Se incubaron células de melanoma humano (MeWo) durante 72 h con diferentes concentraciones de los inhibidores 15 y 28, y se determinó la viabilidad de las células mediante tinción de violeta cristal (figura 8). Se observó una tasa de supervivencia del 50% de las células para el compuesto 15 a una concentración de 15 nM, en comparación con el compuesto 3 (MG132) con 35 nM. Los fibroblastos tratados con ambos compuestos como control mostraron una reducción de la viabilidad del 50% en condiciones idénticas a aproximadamente 500-1.000 nM.

Se obtuvieron resultados parecidos para el compuesto 28 (datos no mostrados).

Ejemplo 11: Exámenes sobre la detención del ciclo celular

Se cocultivaron células de melanoma humano (MeWo) con los compuestos 15 y 3 (MG132) durante 24 horas. Las células se lavaron con PBS, se fijaron en etanol al 70% y a continuación se trataron con ARNasa. El ADN se tiñó con yoduro de propidio (5 µg/ml) y se analizó mediante citometría de flujo (citómetro de flujo FACS Calibur; Beckton Dickinson). De este modo, se pudo detectar la dispersión relativa de las células que estaban presentes en las diferentes fases del ciclo celular. En las condiciones anteriores, se pudo observar una detención del ciclo celular en la fase G2 utilizando 50 nM del inhibidor 15. Comparativamente, para una detención del ciclo en la fase G2 en las mismas células fueron necesarias 100 nM de 3 (MG132) (figuras 8B, C). La significancia estadística se detectó mediante el ensayo de chi al cuadrado.

Ejemplo 12: Cocristalización

Además, se determinó la estructura cristalina del complejo levadura-proteasoma 20S en complejo con el inhibidor 15.

Para ello, se generaron cristales del proteasoma 20S de S. cerevisiae en gotas colgantes a 24ºC, tal como se ha descrito anteriormente (6), y se incubaron durante 60 min con el compuesto 15. La concentración proteínica utilizada para la cristalización fue de 40 mg/ml en Tris-HCl (10 mM, pH 7,5) y EDTA (1 mM). Las otras contenían 3 µl de proteína y 2 µl de solución de reserva, que contenía 30 mM de acetato de magnesio, 100 mM de ácido morfolino-etansulfónico (pH 7,2) y 10% de MPD.

El grupo espacial pertenecía a P21 con unas dimensiones celulares de a = 135,8 Å, b = 300,1 Å, c = 144,4 Å y β = 113,1°. Los datos para 2,8 Å se obtuvieron utilizando radiación de sincrotrón con λ = 1,05 Å en la línea de haz BW6 del DESY de Hamburgo (Alemania). Se sumergieron los cristales en un tampón crioprotector (30% de MPD, 20 mM de acetato de magnesio, 100 mM de ácido morfolino-etansulfónico, pH 6,9), y se congelaron en un flujo de nitrógeno líquido a 90K (Oxford Cryo Systems). Se evaluaron las intensidades de rayos X utilizando el paquete de software MOSFILM (versión 6.1), y se llevó a cabo una reducción de datos con CCP4 (24). La anisotropía de la difracción se corrigió mediante un factor de temperatura anisotrópica general por comparación de las amplitudes de estructura observadas y calculadas utilizando el programa X-PLOR (25). Se registró un número global de 2.383.416 reflexiones que llevaron a 248.616 reflexiones únicas (96,9% de exhaustividad). El Rmerge correspondiente fue del 8,7% para una resolución de 2,8 Å (41,9% para la última envoltura de resolución). La densidad electrónica se mejoró mediante la generación de valores promedio y la retransformación de las reflexiones 10 veces por encima del eje de simetría doble no cristalográfico, utilizando el paquete de software MAIN (26). Se llevaron a cabo refinamientos convencionales de cuerpos sólidos cristalográficos, posicionales y de factor de temperatura con X-PLOR utilizando la estructura del complejo levadura-proteasoma 20S como modelo inicial (6). Para la modelación se utilizó el programa MAIN. La estructura se refinó a un factor R de 21,7% (factor R libre de 24,9%) con desviaciones rms de los valores objetivo de 007 Å por enlace y 1,30° por ángulo (27). Se llevaron a cabo experimentos de modelación utilizando las coordenadas del complejo levaduraproteasoma 20S con el programa MAIN (26).

Los datos muestran que el compuesto 15 se enlaza con una orientación parecida a la treonina en el centro activo, tal como se observó para el inhibidor de calpaína I (6). Se encontró una densidad electrónica definida en todos los centros activos, lo que indicaba que el compuesto 15 no tiene ninguna especificidad por las subunidades para concentraciones elevadas de los inhibidores (10 mM). El aldehído funcional del inhibidor forma un enlace hemiacetal covalente con la Thr10γ . El esqueleto peptídico de 15 adopta una conformación β, llena la separación entre las hembras β y genera una estructura de lámina β antiparalela (figura 8). La cadena lateral de la leucina se dirige al bolsillo S1, mientras que la cadena lateral P2 no está en contacto con la proteína. La cadena lateral de la leucina en P3 interactúa estrechamente con los aminoácidos de la subunidad β adyacente. En general, los bolsillos de especificidad S1 y S3 juegan un papel dominante en el enlazamiento del inhibidor, tal como también se ha observado en las estructuras cristalinas del proteasoma 20S en complejo con lactacistina (6) y vinilsulfona (30). El carácter neutro de Met45 en la subunidad β5 un papel dominante para la especificidad de esta subunidad. Los datos cristalográficos (figura 9) indican que la cadena lateral de Leu en P1 del compuesto 15 provoca una conversión estructural de Met45. A diferencia de la estructura cristalina del proteasoma en complejo con lactacistina, Met45 se desplaza en 3 Å, evitando el contacto con la cadena lateral de leucina en P1 del compuesto 15, haciendo que el bolsillo S1 sea más espacioso. Cabe destacar que las interacciones hidrofóbicas entre el residuo de leucina del inhibidor y Met45 son débiles, por lo que el tiempo de residencia promedio del compuesto en el centro activo es reducido. La especificidad de los bolsillos β1y β2 está definida por cargas positivas o negativas que desestabilizan las interacciones proteína-ligando. Sin embargo, la reactividad inherente del aldehído en el compuesto 15 provoca el enlazamiento en todos los centros activos proteolíticos. El grupo funcional de este inhibidor adopta un papel dominante en el enlazamiento.

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Claims

1. Compuesto de fórmula

imagen1

en el que

R1es Boc, Z, Ac o H, 10

L es Leu, X es Asp(OR4), 15 R2 es CH2-CH(CH3)2, R3 es CH2-OH, CH═O, CH(OH)-C≡C-fenilo, CH(OH)-C(O)-NH-R5 o C(O)-C(O)-NHR5,

20 R4es t-butilo, bencilo o H, R5 es bencilo, 3-picolilo o fenilo, y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

25

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que

R1es Boc o Z, 30

L es Leu, X es Asp(OR4), 35 R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3 es CH2-OH,

R4 es t-butilo. 40

3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 es Boc, Z o Ac, L es Leu,

X es Asp(OR4),

R2 es CH2-CH(CH3)2,

R3es CH═O,

R4 es t-butilo o bencilo.

4.: Procedimiento para preparar un compuesto según la reivindicación 1, que comprende la condensación de dipéptidos protegidos de la manera habitual y aminoácidos con aminoalcoholes, y su posterior oxidación para proporcionar aldehídos peptídicos.

5.: Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la oxidación se lleva a cabo utilizando reactivos de yodo hipervalente, en particular IBX en DMSO.

6.: Compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el tratamiento de enfermedades.

7.: Composición farmacéutica, que comprende un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

8.: Composición farmacéutica según la reivindicación 7, caracterizada porque el compuesto está presente en una cantidad tal que la concentration está comprendida entre 0,001 y 100 µM durante el tratamiento in vivo.

9.: Composición farmacéutica según la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque el compuesto está presente en una cantidad que inhibe de manera eficaz la función del proteasoma en una célula o un mamífero.

10.: Utilización de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3 para preparar un medicamento para inducir la apoptosis en las células.

11.: Utilización de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3 para preparar un medicamento para inhibir la actividad proteolítica del proteasoma 20S, el proteasoma 26S y el inmunoproteasoma.

12.: Utilización según la reivindicación 11, en la que la actividad de tipo tripsina del proteasoma 20S y el proteasoma 26S se inhibe de manera específica.

5 13. Utilización según la reivindicación 11, en la que la actividad de tipo quimiotripsina del proteasoma 20S y el proteasoma 26S se inhibe de manera específica.

14. Utilización según la reivindicación 11, en la que las actividades de tipo

10 quimiotripsina, tipo tripsina y tipo caspasa del proteasoma 20S y el proteasoma 26S se inhiben de manera simultánea.

15. Procedimiento ex vivo para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa, que

15 comprende poner en contacto una célula y un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 3, o una célula y una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 7 a 9.