PL219045B1

PL219045B1 - Nowe estry (acyloksymetylo)akrylamidu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca je oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL219045B1
Application number: PL392651A
Authority: PL
Inventors: Ryszard Ostaszewski; Szymon Kłossowski; Izabela Ziuzia; Angelika Szokalska; Marta Świech; Jakub Gołąb
Original assignee: Inst Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2010-10-16
Filing date: 2010-10-16
Publication date: 2015-03-31
Also published as: PL392651A1; US9018255B2; RU2013122396A; EP2627628B1; CN103237786A; US20130317102A1; EP2627628A1; CN103237786B; RU2570576C2; WO2012050465A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są nowe estry (acyloksymetylo)akryl amidu o wzorze ogólnym (1), zwierająca je kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie do otrzymywania leków do zapobiegania lub leczenia chorób nowotworowych i chorób związanych ze wzmożoną proliferacją komórek.

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe estry (acyloksymetylo)akryl amidu, zwierająca je kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie do otrzymywania leków. Wynalazek znajduje zastosowanie w dziedzinie chemii medycznej, farmacji i medycyny.

W procesie kancerogenezy, jak również w późniejszych etapach progresji nowotworów niezwykle istotną rolę odgrywają enzymy kontrolujące stan redoks komórek, a wśród nich układ enzymatyczny złożony z dwóch białek: tioredoksyny i reduktazy tioredoksyny (TrxR). Podstawową funkcją tego układu jest ochrona komórek przed stresem oksydacyjnym. Zarówno tioredoksyna, jak i reduktaza tioredoksyny mogą redukować liczne cząsteczki, w tym reaktywne formy tlenu (ROS - reactive oxygen species). Jednakże, dopiero zdolność układu Trx-TrxR do oksydacyjnej modyfikacji dużych makromolekuł, szczególnie białek, powoduje, że układ ten kontroluje przebieg ważnych procesów, takich jak podziały komórkowe, czy też śmierć komórek w procesie apoptozy.

Tioredoksyna redukując określone związki ulega utlenieniu poprzez wytworzenie się w centrum aktywnym enzymu mostku di-siarczkowego pomiędzy dwiema cysteinami. Utleniona Trx nie może dalej działać jako reduktor, dlatego kolejnym etapem reakcji jest regeneracja Trx przez reduktazę tioredoksyny. Reduktaza z udziałem NADPH2 redukuje mostek di-siarczkowy, dzięki czemu tioredoksyna odzyskuje swoją aktywność.

Reduktaza tioredoksyny jest enzymem o masie cząsteczkowej 55 kDa, występującym w formie aktywnej jako homodimer (Gromer S et al., Med. Res. Rev., 2004, 24, 1, str. 40-89). W komórkach ssaków rozróżniane są trzy izoformy TrxR: cytoplazmatyczna (TrxR1), mitochondrialna (TrxR2) oraz glutationowa TrxR (wykazująca zdolność do redukcji glutationu). Enzym ten ma dwa miejsca aktywne: tzw. N-terminalne miejsce aktywne i C-terminalne miejsce aktywne. Pierwsze z nich zawiera dwie reszty cysteiny w pozycjach Cys59 i Cys64, natomiast miejsce C-terminalne zawiera cysteine w pozycji Cys497 i, co ciekawe, selenocysteine w pozycji Sec498. Fakt obecności selenu zamiast atomu siarki, tłumaczony jest mniejszym naprężeniem wiązań S-Se między sąsiadującymi resztami selenocysteiny i cysteiny w porównaniu do wiązania między dwiema cysternami. W komórkach eukariotycznych specyficzność substratowa TrxR jest mała. Ludzka reduktaza może redukować poza tioredoksyna szereg innych związków, w tym także regenerować utlenioną formę kwasu askorbinowego (witaminy C) (May J. M. et al., J. Biol. Chem., 1997; 272, str. 22607-22610).

Tioredoksyna jest niewielkim białkiem o masie ok. 12 kDa. Jej miejsce aktywne to tzw. „motyw tioredoksyny” zawierający sekwencję: (W)CGPC(K), przy czym aminokwasy umieszczone w nawiasach mogą się różnić w różnych typach tioredoksyn. Podobnie jak w wypadku TrxR podczas redukcji cząsteczek docelowych, obecne w miejscu aktywnym reszty cysteiny (Cys33 i Cys35) formują mostek di-siarczkowy. Jedna z katalitycznie aktywnych cystein jest wyeksponowana na zewnątrz enzymu, natomiast druga schowana do wewnątrz. Dodatkowa cysteina (Cys73) służy formowaniu homodimeru, charakterystycznego jednak tylko dla komórek ssaków. Tioredoksyna występuje w dwóch izoformach: cytoplazmatycznej (Trx1) oraz mitochondrialnej (Trx-2). Ponadto, istnieje szereg białek o aktywności tioredoksyny pełniących do dziś niewyjaśnione funkcje w różnych przedziałach komórkowych.

Zainteresowanie układem Trx-TrxR w kontekście leczenia chorób nowotworowych wynika miedzy innymi ze zwiększonej syntezy tych białek w komórkach nowotworowych w porównaniu do komórek prawidłowych (Berggren, M. et al., Anticancer Res 1996, 16, str. 3459 - 3466). Nasilone wytwarzanie białek układu Trx-TrxR sprzyja podziałom komórkowym. Tioredoksyna uczestniczy razem z glutaredoksyną w syntezie deoksynukleotydów, będąc donorem protonów dla reduktazy rybonukleotydów. W ten sposób szybko proliferującej komórce nowotworowej dostarczany jest substrat niezbędny do syntezy kwasów nukleinowych (Holmgren, A., J. Biol. Chem. 1989, 264, str. 13963 - 13966).

Układ Trx-TrxR jest również odpowiedzialny za hamowanie procesu apoptozy. Mechanizm ten polega między innymi na wiązaniu przez zredukowaną formę tioredoksyny czynnika ASK1 (apoptosis signal regulating kinase 1). Czynnik ten jest odpowiedzialny za aktywację szlaku kinaz uruchamiających proces apoptozy, a jego wydajne wiązanie przez występującą w dużej ilości tioredoksynę skutecznie zapobiega śmierci komórki nowotworowej (Ichijo, H. et al., Science 1997, 275, str. 90 - 94).

Ponadto, tioredoksyna wpływa na aktywność czynnika transkrypcyjnego NF-kB, również hamując proces apoptozy.

Dodatkowo zwiększając syntezę białka indukowanego hipoksją HIF-1 (hypoxia inducible factor), układ Trx-TrxR sprzyja powstawaniu naczyń krwionośnych w obrębie guza zwiększając jego możliwości

PL 219 045 B1 rozrostu. Zaobserwowano również, że zarówno złośliwość nowotworu, jak i rozwijająca się lekooporność komórek nowotworowych korelują z poziomem tioredoksyny.

Podsumowując, hamownie układu Trx-TrxR zwiększa wrażliwość komórek nowotworowych na czynniki wywołujące apoptozę, hamuje proliferację oraz negatywnie wpływa na proces angiogenezy.

W dziedzinie medycyny istnieje potrzeba wskazania selektywnych inhibitorów układu Trx-TrxR, będących potencjalnie bardzo skutecznymi lekami przeciwnowotworowymi, które mogą być stosowane w monoterapii, jak i w terapii łączonej z innymi zarejestrowanymi już formami leczenia chorób nowotworowych.

W ostatnich latach zsyntetyzowano grupę chemioterapeutyków, które hamują układ Trx-TrxR. Celem dla inhibitorów jest zarówno sama tioredoksyna, jak również reduktaza tioredoksyny. Projektując inhibitory, na pierwszy plan trzeba wziąć pod uwagę miejsca aktywne obu enzymów. Większość znanych inhibitorów wiąże się, odwracalnie, bądź nie, właśnie z dwiema cysteinami miejsca aktywnego (i selenocysteiną w ludzkiej TrxR).

W poniższej Tabeli przedstawiono znane inhibitory układu Trx-TrxR.

Cl «platyna (CDDP) CDDP- Nitrofuran	Cl. ^Xpt	Rak jąder, prostaty, mato guzy w płucach
o₂n^	a	cZ Aą 0	NH/· 1
2	a—pt/ Cl X)	^XH
ΡΧ-12			H «-Ν	4	<		ll-faza badań klinicznych w leczeniu raka trzustki
Czynniki alkilujące				i	X^NO, NOj	alkilują reszty cysteiny i selenocysteiny
			£			£
Kurkumina	MeO_x HO''			OH 7	X	^^.OMe ^^Όη	próby kliniczne w różnych rodzajach nowotworów
			li	OH 'Γί
Palmanjrnyęyna			&		8		rak sutka, guzy w płucach
Auranofina			OAc OAc			3	nowotwór jajnków

PL 219 045 B1

Jednym z najstarszych inhibitorów tioredoksyny, od dawna stosowanym w terapii nowotworów jest cisplatyna (1), jak również jej nowsze analogi (2). Mechanizm działania związków platyny w komórkach nowotworowych polega na bezpośrednim uszkadzaniu łańcucha DNA, co prowadzi do utworzenia trwałych adduktów. Okazuje się jednak, że jako dobry elektrofil, związek platyny jest efektywnym inhibitorem reduktazy tioredoksyny. Na tyle silnym, że może działać na enzym nawet w stechiometrycznych ilościach (Sasada, T. et al., Free Radic. Biol. Med. 1999, 27, str. 504 - 514).

Innym, bardzo obiecującym związkiem, selektywnie hamującym aktywność tioredoksyny jest disulfid 1-metylopropylo-2-imidazylowy, PX-12 (4). Został on odkryty podczas projektowania inhibitora reduktazy tioredoksyny, a obecnie znajduje się w II fazie badań klinicznych w leczeniu zaawansowanego raka trzustki. Interesującym, w aspekcie chemii medycznej, jest fakt, że grupa metylowa w łańcuchu alkilowym jest niezbędna do aktywności inhibitora. Związki o podobnej strukturze, jednak bez tej grupy były dla tioredoksyny nie inhibitorami a substratami. PX-12 może odwracalnie tworzyć disiarczki w miejscu aktywnym zarówno TrxR, jak i Trx, co prowadzi do ich utlenienia. Jednak tak utlenione enzymy, mogą być zregenerowane, a za inhibicję enzymu odpowiedzialne jest dopiero związanie z Cys73. Po pierwsze, blokuje to powstawanie aktywnego dimeru Trx, po drugie zaś tioredoksyna związana w tej pozycji nie będzie już substratem dla reduktazy tioredoksyny, a więc nie może być zregenerowana (Kirkpatrick, D.L. et al., Biochem. Pharmacol. 1998, 55, str. 987 - 994). Dodatkowym działaniem PX-12, obserwowanym in vivo jest hamowanie wytwarzania VEGF (ang. vascular endothelial growth factor, czynnik wzrostu komórek śródbłonka). Zwiększone wytwarzanie tioredoksyny w komórkach nowotworowych prowadzi często do podwyższonej syntezy VEGF, co z kolei przyspiesza angiogenezę wewnątrz guza. Jeżeli stężenie VEGF maleje, spada również wzrost naczyń włosowatych w nowotworze i dodatkowo hamuje rozwój guza.

Kurkumina (7) jest związkiem pochodzenia naturalnego, ekstrahowanym z Curcuma longa. Jest interesującym związkiem przede wszystkim ze względu na swoje szerokie spektrum działania. Oprócz zastosowania jako przyprawa (składnik curry), w kulturach azjatyckich, kurkumina była stosowana na przeróżne dolegliwości począwszy od anoreksji przez kaszel, choroby wątroby po zapalenie zatok (Calabrese, V. et al., Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, str. 1062 - 1073). Zwracając uwagę na strukturę chemiczną kurkuminy można łatwo zauważyć elektrofilowe centra w postaci akceptorów Michaela. Mogą one wchodzić w reakcje z nukleofilowymi resztami selenocysteiny i cysteiny w centrach aktywnych układu Trx-TrxR. Okazuje się, że rzeczywiście kurkumina bardzo silnie hamuje aktywność reduktazy tioredoksyny, zarówno w badaniach aktywności izolowanego enzymu, jak i w ekstrakcie komórek Hela (Fang, J., Lu, J., Holmgren, A., J. Biol. Chem. 2005, 280, str. 25284 - 25290). Kurkumina nie jest jednak selektywnym inhibitorem tego układu gdyż działa również na wiele kinaz, cyklin czy cyklooksygenazę.

Ponieważ centrum aktywne tioredoksyny z resztami cysteiny lub selenocysteiny można rozpatrywać jako centrum nukleofilowe, można sobie wyobrazić, że czynniki alkilujące atom siarki będą kowalencyjnie i nieodwracalnie hamować aktywność enzymu. Dwa ze znanych czynników alkilujących atom siarki (Sun, Q. et al., J. Biol. Chem. 1999, 274, str. 24522 - 24530): jodoacetoamid (5) lub kwas jodooctowy były badane pod kątem swojej aktywności przeciwnowotworowej, jednak ze względu na niską selektywność mają one ograniczone znaczenie jako chemioterapeutyki. Oba wykazują jednak silną zdolność do hamowania aktywności reduktazy tioredoksyny. 1-chloro-2,4-dinitrobenzen jest niewielkim związkiem, który alkiluje zarówno resztę selenocysteiny oraz sąsiadującą z nią resztę cysteiny (Nordberg, J. et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, str. 10835 - 10842). Tak alkilowana TrxR aktywuje mitochondrialne kaspazy, co wywołuje efekt cytotoksyczny, m.in. wobec ludzkich komórek raka płuc.

Związki złota były początkowo stosowane w leczeniu schorzeń reumatoidalnych, jednak z uwagi na ich silne działanie cytotoksyczne wywierane na komórki nowotworowe, przybywa chemioterapeutyków opartych na związkach złota (I) lub złota (III). Mechanizm działania tych związków nie jest wciąż w pełni jasny. Postuluje się ten podobny do związków platyny, czyli polegający na bezpośrednim uszkodzeniu DNA. Ponieważ jednak złoto ma duże powinowactwo do grup tiolowych, możliwe jest, że to również tioredoksyna może być komórkowym celem tych terapeutyków. Przykładem takiego związku jest auranofina (9), znana ze swojego działania antyreumatycznego. Hamuje ona reduktazę tioredoksyny w nanomolarnych stężeniach, podczas gdy reduktazę glutationową dopiero w mikromolarnych (Gromer, S. et al., K., J. Biol. Chem. 1998, 273, str. 20096 - 20101). Reduktaza glutationową nie ma C-terminalego miejsca aktywnego z selenocysteiną. Można więc przypuszczać, że to właśnie centrum z selenocysteiną jest celem działania auranofiny. Badano również cytotoksyczność auranofiny względem komórek nowotworowych, które wykształciły oporność na cisplatynę (Marzano, C. et al., Free Radic. Biol. Med. 2007, 42, str. 872 - 881) i zaobserwowano wyraźną inhibicję TrxR (przy jednoPL 219 045 B1 czesnym braku inhibicji reduktazy glutationowej) oraz wysoką cytotoksyczność, co otworzyło nowe horyzonty w leczeniu nowotworów opornych na terapię cisplatyna. Ciekawa jest obserwacja dużo większej aktywności TrxR w komórkach opornych na cisplatynę. Potwierdza to ważną rolę wzmożonej syntezy reduktazy tioredoksyny i tioredoksyny w oporności na chemioterapeutyki.

Jak wynika z powyższych opisów znanych inhibitorów układu Trx-TrxR, większość z nich reaguje bezpośrednio z resztami tiolowymi lub selenolowymi w obu enzymach. Oddziaływania mają charakter bardzo silnych wiązań kowalencyjnych lub trwałych kompleksów z metalami. Wciąż jednak mechanizmy działania wielu z nich nie są do końca wyjaśnione. Ze względu na to, że znane dotychczas inhibitory są cząsteczkami relatywnie bardzo aktywnymi, niektóre z nich mogą przejawiać niekorzystny efekt, wynikający z niskiej selektywności wobec innych reszt cysteiny w innych enzymach.

Celem niniejszego wynalazku jest wskazanie nowych inhibitorów układu tioredoksyna - reduktaza tioredoksyny skutecznych i jednocześnie wykazujących wyższą selektywność. Czynnikiem wyróżniającym, pod tym względem, układ Trx-TrxR jest reszta selenocysteiny, która jest silniejszym nukleofilem od cysteiny, co może przesądzać o selektywności inhibitora.

Nieoczekiwanie, cel ten osiągnięto uzyskując nowe estry arylowe (2-hydroksymetylo)akrylamidu i kwasów karboksylowych. Związki według wynalazku okazały się być skutecznymi inhibitorami tioredoksyny (Trx). Związki te wykazują przy tym silne właściwości przeciwnowotworowe.

Przedmiotem wynalazku są zatem związki określone wzorem ogólnym (I):

R1 oznacza prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową C1-C8, fenyl, benzyl,

R2 oznacza atom wodoru, grupę CONHCH2COOX, gdzie X oznacza prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową C1-C8,

R3 oznacza grupę acylową kwasu karboksylowego wybraną spośród grup kwasu 2,6-dichlorobenzoesowego lub 2,6-di(trifluorometylo)benzoesowego;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku są związki wybrane z grupy obejmującej: (R)-2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis-(trifluorometylo)benzoesan;

(S)-2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan;

2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan;

2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan;

2-(benzylokarbamoilo)allilo2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan;

2-(benzylokarbamoilo)allilo2,6-dichlorobenzoesan.

Kolejnym przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek o wzorze ogólnym (I)

do zastosowania jako lek.

PL 219 045 B1

Przedmiotem wynalazku jest także związek według wynalazku o wzorze ogólnym (I) do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób nowotworowych, chorób związanych ze wzmożoną proliferacją komórek, korzystnie ostrych i przewlekłych odrzutów przeszczepów, chorób alergicznych i autoimmunizacyjnych, zespołów limfoproliferacyjnych, zespołów mielodsyplastycznych i mieloproliferacyjnych oraz stanów przednowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że jako substancję aktywną zawiera związek o wzorze ogólnym (I)

lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze ogólnym (I) do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób nowotworowych, chorób związanych ze wzmożoną proliferacją komórek, korzystnie ostrych i przewlekłych odrzutów przeszczepów, chorób alergicznych i autoimmunizacyjnych, zespołów limfoproliferacyjnych, zespołów mielodsyplastycznych i mieloproliferacyjnych oraz stanów przednowotworowych.

W opisie ujawniono sposób otrzymywania związków o wzorze ogólnym

w którym tworzenie wiązania amidowego wykonuje się poprzez sprzęganie kwasu karboksylowego z komponentem aminowym w środowisku rozpuszczalnika organicznego, w obecności czynnika sprzęgającego.

Przedmiot wynalazku uwidoczniono w przykładach wykonania na rysunku, na którym na figurze 1 przedstawiono zestawienie wyników doświadczeń oceniających cytostatyczne/cytotoksyczne działanie badanych związków (ułożonych w kolumnach) względem szeregu linii komórek nowotworowych (opis linii POM prawej stronie schematu). Działanie cytostatyczne/cytotoksyczne wobec komórek przyklejających się do podłoża, wywodzących się z guzów litych (EMT6, PAN02, CT26 i T24) oceniono testem z fioletem krystalicznym, natomiast wobec komórek rosnących w zawiesinie przy użyciu testu MTT. b.d. = brak danych.

Natomiast na figurze 2 przedstawiono analizę cyklu komórek linii T24 po inkubacji z inhibitorami tioredoksyny.

Zgodnie z wynalazkiem, przeprowadzone badania wykazały, że estry (acyloksymetylo)akrylamidu mają znacznie korzystniejsze właściwości farmakologiczne niż disulfid 1-metylopropylo-2-imidazylowy, oznaczony w literaturze jako PX-12. Silniej niż PX-12 hamują aktywność tioredoksyny, są bardziej selektywne (w większych stężeniach hamują reduktazę tioredoksyny i w przeciwieństwie do PX-12 w ogóle nie hamują reduktazy glutationu), wykazują działanie cytostatyczne/cytotoksyczne wobec panelu ludzkich i mysich komórek nowotworowych wywodzących się zarówno z guzów litych (rak sutka, nerki, jelita grubego, trzustki), jak i układu krwiotwórczego (białaczki i chłoniaki).

Związki według wynalazku, oznaczone w niniejszym tekście skrótowo jako: 3a, L-3a, D-3a, 3b, 8a i 8b hamują aktywność tioredoksyny w stężeniach mniejszych niż związek PX-12 - modelowy inhibitor tego enzymu, którego działanie przeciwnowotworowe sprawdzane jest aktualnie w badaniach klinicznych.

PL 219 045 B1

Związki 3a, 8a i 8b są również bardziej selektywne od PX-12. Na przykład, związek 3a trzykrotnie silniej hamuje aktywność rekombinowanej tioredoksyny i około trzykrotnie słabiej hamuje aktywność rekombinowanej reduktazy tioredoksyny w porównaniu do modelowego związku PX-12. Ponadto, większa selektywność związku 3a wykazana została również w badaniach dotyczących aktywności reduktazy glutationu. Działanie cytostatyczne/cytotoksyczne 3a i PX-12 jest porównywalne wobec badanych linii ludzkich i mysich komórek nowotworowych.

Również związki L-3a, D-3a, 3b, 8a i 8b wykazują silne działanie cytostatyczne/cytotoksyczne wobec panelu ludzkich i mysich linii komórek nowotworowych. Wykazany wpływ badanych związków na zahamowanie podziałów komórkowych umożliwia ich stosowanie zarówno w leczeniu chorób nowotworowych, jak i innych jednostek chorobowych, u podłoża których leży nadmierna proliferacja komórek.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do leczenia chorób nowotworowych, zawierająca jako substancję aktywną estry (acyloksymetylo)akrylamidu w ilości niezbędnej do wywołania efektu cytotoksycznego, wraz z co najmniej jednym obojętnym, farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką a także kompozycja farmaceutyczna przeznaczona do leczenia chorób nowotworowych, zawierająca substancję aktywną, racemiczny lub enancjomerycznie wzbogacony 2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan, 2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan, 2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan, 2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan w ilości niezbędnej do wywołania efektu cytotoksycznego, wraz z co najmniej jednym obojętnym, farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką.

Będące przedmiotem wynalazku estry (acyloksymetylo)akrylamidu, mogą być stosowane w terapii pod postacią kompozycji farmaceutycznych przeznaczonych do podawania parenteralnego i doustnego. Kompozycje takie mogą być wytworzone w znany ze stanu techniki sposób w zakresie wytwarzania form leków.

Związki według niniejszego wynalazku mogą być więc wytworzone i podawane w bardzo różnych postaciach do podawania pozajelitowego i doustnego. Związki według wynalazku, mogą być podawane na drodze iniekcji dożylnych, domięśniowych, śródskórnych, podskórnych, wewnątrzotrzewnowych.

W przeznaczeniu do podawania drogą pozajelitową wytwarza się postacie dawek jednostkowych w formie płynnej z udziałem każdego ze związków według wynalazku, to jest 2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan, 2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan, 2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan, 2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan i jałowego wehiculum, przy czym korzystnie stosuje się dodatek wody. Wymienione związki, w zależności od rodzaju farmaceutycznie zgodnego nośnika mogą być zawieszone, albo rozpuszczone w wehikulum. Przy sporządzaniu roztworu, związek aktywny można rozpuścić w roztworze do wstrzykiwań i wyjałowić przez sączenie. Tak otrzymanym jałowym roztworem napełnia się fiolki lub ampułki, które następnie szczelnie się zamyka.

Preparat po wypełnieniu nim fiolki można również zamrozić i usunąć rozpuszczalnik w warunkach próżni. Następnie suchy liofilizowany proszek zamyka się szczelnie we fiolce, do której dołącza się drugą fiolkę zawierającą wodę do wstrzykiwań, w celu przygotowania iniekcyjnej formy leku. Jest oczywistym dla specjalistów, że przedstawione formy dawkowania mogą zawierać jako składnik aktywny, zarówno nowe związki jak i farmaceutycznie dopuszczalną sól każdego ze związków wg wynalazku.

Związki według wynalazku, tj. estry (acyloksymetylo)akrylamidu znajdują zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych. Ze względu na silne działanie cytostatyczne (hamowanie cyklu komórkowego w fazie G1, spadek odsetka komórek w fazie syntezy DNA). Ich korzystne właściwości sprawiają, że znajdują one również zastosowanie w leczeniu chorób, w których patogenezie odgrywa wzmożona proliferacja komórek, tak jak ostre i przewlekłe odrzucanie przeszczepów, choroby alergiczne i autoimmunizacyjne, zespoły limfoproliferacyjne, zespoły mielodsyplastyczne i mieloproliferacyjne oraz inne stany przednowotworowe.

Wynalazek zilustrowano za pomocą następujących przykładów wykonania:

1. Sposób otrzymania związków o wzorze ogólnym

N-(R1,R2-metylo)-2-[(acyloksy]metakrylamid, określającym nowe estry acyloksymetakrylamidu o wzorze 1, w którym R1 oznacza prostą lub rozgałęzioną alkilową grupę o C1-C8, podstawioną lub nie grupę fenylową, benzylową,

PL 219 045 B1

R2 oznacza atom wodoru, lub grupę CONHCH2COOX, gdzie X jest prostym lub rozgałęzionym podstawnikiem alifatycznym C1-C6,

R3 oznacza podstawnik fenylowy lub złożony podstawnik fenylowy posiadający w pozycjach 2,6 dwa te same lub różne podstawniki halogenowe (Cl, Br, I) lub trifluorometylowe.

Schemat 1:

a) metanol, temp. pok., 16 godz., 46%

b) TFA, CH2CI2, 30 min, temp. pok. 70%

c) 4, aceton, temp. wrzenia, 59 - 87%

Związek 1: Etylo 2-(2-(2-(bromometylo)-M-(2,4-dimetoksybenzylo)akrylamido)-4-metylopentanamido) octan

Do roztworu aldehydu izowalerianowego (96 μ|, 0.88 mmol) w metanolu (1 ml) dodano 2,4-dimetoksybenzyloaminę (133 μ|, 0.88 mmol) i mieszano przez 30 minut. Następnie dodano kwas bromometylometakrylowy (146 mg, 0.88 mmol) i mieszano przez kolejne 30 minut. Mieszaninę schłodzono do temperatury 0°C i dodano izocjanooctan etylu (100 μ[ 0.88 mmol), następnie mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej. Odparowano rozpuszczalnik a pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej układem heksan:octan etylu (żel krzemionkowy, Rf = 0.33, 5:5, obj.:obj.). Otrzymano 207 mg bezbarwnego oleju (46%).

¹H NMR (200 MHz, CDCI3): δ 0.84 - 0.89 (m, 6H), 1.21 - 1.28 (m, 5H), 1.54 - 1.67 (m, 1H) 1.91 - 1.98 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.85 (d, J = 5.2 Hz), 4.04 - 4.23 (m, 4H), 4.55 - 4.70 (m, 2H), 5.43 (s, 1H), 5.54 (s, 1H), 6.39 - 6.43 (m, 2H), 7.43 (d, J = 9.2 Hz, 1H). ¹³C NMR (50 MHz, CDCI3): δ 14.5, 22.8, 22.9, 25.5, 33.4, 37.6, 41.7, 55.6, 55.6, 59.1, 61.6, 98.7, 104.3, 119.3, 130.3.,

140.4, 169.8. HR-MS (ESI, [M+Na⁺]) obliczona dla C23H33BrN2O6Na: 535,1414, zbadana: 535.1402;

Związek 2: Etylo 2-(2-(2-(bromometylo)akrylamido)-4-metylopentanamido) octan

Związek 1 (117 mg, 0.23 mmol) rozpuszczono w chlorku metylenu (2 ml), następnie dodano w temperaturze pokojowej kwas trifluorooctowy (475 μ^. Mieszaninę pozostawiono na 1 godzinę obserwując zmianę koloru z bezbarwnego na ciemnofioletowy. Zawartość kolby przeniesiono do rozdzielacza, dodano chlorek metylenu (4 ml) i dodawano nasycony roztwór węglanu sodu do momentu zniknięcia barwy fioletowej. Fazę wodną ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 8 ml), następnie połączone fazy organiczne suszono solanką i odparowano rozpuszczalnik. Pozostałość oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej układem heksan:octan etylu (żel krzemionkowy, Rf = 0.25, 6:4, obj.:obj.). Otrzymano 58 mg produktu (70%).

¹H NMR (200 MHz, CDCI3): δ 0.87 - 0.94 (m, 6H), 1.22 - 1.29 (m, 5H), 1.38 - 1.70 (m, 4H), 3.96 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.10 - 4.23 (m, 5H), 4.60 - 4.78 (m, 1H), 5.69 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.14 (m, 1H). ¹³C NMR (50 MHz, CDCI3): δ 14.5, 22.4, 23.3, 25.1, 30.7, 41.4, 41.7, 52.1, 61.8, 123.0, 141.3, 166.4, 170.0, 172.6; HR-MS (ESI, [M+Na⁺]) obliczona dla C14H23BrN2O4 Na: 385.0733, zbadana: 385.0740.

PL 219 045 B1

Metoda ogólna nr I otrzymywania racemicznych związków 3a-b:

Związek 2 0,1 mmol, rozpuszczono w acetonie. Dodano sól cezową kwasu karboksylowego (0.30 mmol). Reakcję prowadzono przez 30 min w temperaturze wrzenia. Rozpuszczalnik odparowano, pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i wodzie. Fazę wodną ekstrahowano octanem etylu, następnie połączone fazy organiczne przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, następnie solanką. Wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik odparowano a pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej układem heksan:octan etylu (żel krzemionkowy).

Związek rac-3a: 2-((1-((2-etoksy-2-oksoetyIo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)-allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan

Otrzymany metodą ogólną II. Biały proszek, t_t = 114 - 115°C. Wydajność 87%. Rf = 0.61 (5:5, obj.:obj.). ¹H NMR (200 MHz, CDCI3): δ 0.85 - 0.91 (m, 6H), 1.21 - 1.28 (m, 4H), 1.51 - 1.70 (m, 4H), 3.46 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.08 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.10 - 4.19 (m, 3H), 4.60 - 4.78 (m, 1H), 5.10 (s, 2H), 5.79 (s, 1H), 6.02 (s, 1H) 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.98 -7.03 (m, 1H), 7.72 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 2H). ¹³C NMR (50 MHz, CDCI3): δ 14.4, 22.4, 23.0, 25.0, 30.7, 41.2, 41.6, 51.9, 61.8, 65.6, 120.0, 124.3, 125.8, 129.0, 129.7, 130.2, 130.7 137.9, 166.4, 169.9, 172.6; Analiza elementarna obliczona dla C23H26F6N2O6: C, 51.11; H, 4.85; N, 5.18; zbadana: C, 51.00; H, 5.07; N, 4.86;

Związek rac-3b: 2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)-alIilo 2,6-dichlorobenzoesan

Otrzymany metodą ogólną II. Biały proszek, tt = 120 - 121°C. Wydajność 59%. Rf = 0.34 (5:5, obj.:obj.).

¹H NMR (200 Mhz, CDCI3) δ 0.83 (d, J = 6 HZ, 6H), 1.16 - 1.30 (m, 3H), 1.47 - 1.69 (m, 4H), 3.91 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 3.95 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 4,12 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.51 - 4.60 (m, 1H), 5.07 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 5.78 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 6.56 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.77 (bs, 1H), 7.20 - 7.25 (m, 3H) ¹³C NMR (50 MHz, CDCI3) δ 14.5, 22.4, 23.2, 25.1, 41.2, 41.7, 51.9, 61.9, 65.1, 124.6, 128.2, 131.4, 132.2,

138.1, 166.4, 169.8, 172.28; HR-MS (ESI, [M+Na⁺]) obliczona dla C21H26N2O6NaCl2: 495.10601.0733, zbadana: 495.10812.

SOCI2, CH2Cl2, 24 godz., temp. pok. 5 - 6%; e) 4, aceton, temp. wrzenia, 2 godz., 33 - 67%

Związek D-3a: (R)-2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamo-ilo)allilo2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan

Do kwasu bromometakrylowego (150 mg, 0.9 mmol) dodano świeżo destylowany chlorek tionylu (162 μ!, 2.2 mmol). Mieszaninę mieszano w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Nadmiar chlorku tionylu odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano chlorek metylenu (2 ml). Roztwór chlorku kwasowego schłodzono do temperatury 0°C. Dodano DMAP (45 mg, 0.4 mmol) oraz roztwór NH2-D-Leu-Gly-OEt (80 mg, 0.4 mmol) w chlorku metylenu (2 ml). Mieszano 1.5 godziny w temperaturze 0°C, a następnie 2 godziny w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowano a pozostałość oczyszczano na kolumnie chromatograficznej (Rf = 0.45 heksan:octan etylu 6:4 obj./obj., zgodny z rac-2). Otrzymano 12 mg bezbarwnego oleju (wydajność 6%).

Tak przygotowany związek D-2 (R)-etylo-2-(2-(2-(bromometylo)akrylamido)-4-metylopentanamido)octan, rozpuszczono w acetonie (5 ml), dodano sól cezową kwasu bis-(trifluorometylo)10

PL 219 045 B1 benzoesowego (39 mg, 0.1 mmol). Mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, następnie w temperaturze wrzenia przez 4 godziny. Osad odsączono, rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość oczyszczano na kolumnie chromatograficznej (R/ = 0.61 heksan;octan etylu 5:5 obj./obj., zgodny z rac-3a), otrzymując 12 mg bezbarwnego oleju z wydajnością 67%. HR-MS (ESI, [M+Na⁺]) obliczona dla Cj3Hj6F6NjO6Na: 563.1587, zbadana: 563.1592; [a]o = +20°(c= 1.2, CHCI3)

Związek L-3a: (S)-2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)-allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan

Do kwasu bromometakrylowego (84 mg, 0.5 mmol) dodano świeżo destylowany chlorek tionylu (111 gl, 1.5 mmol). Mieszaninę mieszano w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Nadmiar chlorku tionylu odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano chlorek metylenu (2 ml). Roztwór chlorku kwasowego schłodzono do temperatury 0°C. Dodano DMAP (62 mg, 0.5 mmol), roztwór NH2-L-Leu-Gly-OEt (110 mg, 0.5 mmol) w chlorku metylenu (2 ml). Mieszaninę mieszano 1.5 godziny w temperaturze 0°C, a następnie 2 godziny w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowano a pozostałość oczyszczano na kolumnie chromatograficznej. (R/ = 0.46 heksan:octan etylu 6:4, obj./obj., zgodny z rac-2). Otrzymano 18 mg bezbarwnego oleju (wydajność 5%).

Tak przygotowany związek L-2 (5)-etylo 2-(2-(2-(bromometyIo)akrylamido)-4-metylopentanamido)octan (16 mg, 0.04 mmol) rozpuszczono w acetonie (1 ml), dodano sól cezową kwasu 2,6-bis-(trifluorometylo)benzoesowego (36 mg, 0.09 mmol). Zawiesinę doprowadzono do temperatury wrzenia i mieszano ją do zaniku substratu (TLC, 2 godziny). Mieszaninę przesączono przez celit, usuwając nadmiar soli cezowej oraz bromek cezu. Rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu 10 ml. Przemyto kolejno: wodą (5 ml), nasyconym roztworem węglanu sodu (5 ml) oraz solanką. Fazę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i odparowano. Uzyskany olej przesączono przez żel krzemionkowy wymywając układem heksan:octan etylu. Uzyskano 8 mg produktu (wydajność 33%). HR-MS (ESI, [M+Na⁺]) obliczona dla C23H26F6N2O6Na: 563.1587, zbadana: 563.1582 [a]o= -23° (c = 0.8, CHCl3). Widmo ¹H NMR obu enancjomerów w pełni pokrywa się z widmem związku rac-3a.

Schemat 3:

f) iBuOCOCl, oMAP, oIPEA, BnNH2

Do roztworu kwasu 7 (0.7 mmol) w THF (5 ml) dodano chloromrówczan izobutylu (0.7 mmol) w temperaturze -10°C. Mieszano przez 30 min, a następnie dodano benzyloaminę (0.7 mmol). Mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze -10°C oraz 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik odparowano, rozpuszczono w octanie etylu (20 ml) i przemyto kolejno nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (10 ml), kwasem cytrynowym (10%>, 10 ml) oraz solanką (10 ml). Pozostałość oczyszczano na kolumnie chromatograficznej (żel krzemionkowy, heksan:octan etylu).

Związek 8a: 2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan ¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 4.50 (d, J = 5.8 Hz, 2H,), 5.13 (s, 2H), 6.03 (s, 1H), 6.37 (bs, 1H), 7.28 (s, 5H), 7.71 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (COCI3, 50 MHz) δ 44.1,66.0,

124.5, 125.8, 127.9, 128.1, 129.0, 130.1, 130.2, 130.7, 138.1, 138.4, 166.1 Analiza elementarna: obliczona dla: C20H21NO3: C, 55.69; H, 3.51; N, 3.25; zbadana: C, 55.61; H, 3.38; N, 3.21;

Związek 8b: 2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan ¹H NMR (COCI3, 200MHz) δ 4.45 (d, J = 6 Hz, 2H), 5,09 (s, 1H), 5,75 (s, 1H) 6.0 (s, 1H), 6,35 (bs, 1H), 7.18 - 7.24 (m, 8H). ¹³C NMR (COCI3, 50 Mhz): δ 44.2, 65.5, 124.7, 127.9, 128.2, 129.0,

131.5, 132.2, 138.1, 138.4, 164.5, 166.0; Analiza elementarna obliczona dla C18H15CI2NO3. 1H2O: C, 56.56; H, 4.48; N, 3.66; zbadana: C, 56.89; H, 4.36; N, 3.28

PL 219 045 B1

2. Wyniki badań in vitro

2.1. Badanie aktywności układu tioredoksyna - reduktaza tioredoksyny oraz reduktazy glutationu z zastosowaniem rekombinowanych enzymów

2.1.1. Oznaczanie aktywności tioredoksyny

Metoda oznaczania aktywności tioredoksyny opiera się na redukcji insuliny przez tioredoksynę. Tioredoksyna odnawiana jest przez reduktazę tioredoksyny, przy udziale NADPH. Powstałe w rekcji wolne grupy tiolowe -SH reagują z kwasem 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowym (DTNB). Zakończenie reakcji powoduje powstanie barwnego roztworu. Intensywności zabarwienia oznaczana spektrofotometrycznie przy długości fali 412 nm i odpowiada liczbie zredukowanych grup sulfhydrylowych. Reakcja przeprowadzana była w 37°C przez 30 min w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl i 20 mM EDTA o pH 7,6. Stosowane stężenia substratów reakcji wynosiły: 0,25 μΜ ludzkiej rekombinowanej tioredoksyny i 0,325 μΜ szczurzej rekombinowanej reduktazy tioredoksyny (IMCO Corporation Ltd AB, Szwecja) oraz 316 μΜ insuliny, 0,8 μΜ NADPH, 8 mM DTNB (Sigma Aldrich).

Wyniki hamowania tioredoksyny w układzie przedstawionym powyżej zaprezentowano w tabeli 1. Nieoczekiwanie, wszystkie z badanych związków okazały się silniej hamować enzymatyczną aktywność tioredoksyny od znanego inhibitora PX-12. Największą aktywność wykazały związki 3a, L-3a, D-3a oraz 3b, dla których IC50 było około 5 razy mniejsze niż dla PX-12.

T a b e l a 1

BADANY ZWIĄZEK	IC₅₀ [μΜ]
PX-12	15,4
3a	3,2
L-3a	2,8
D-3a	3,5
3b	2,9
8a	8,6
8b	5,9

2.1.2. Badanie aktywności reduktazy tioredoksyny przy użyciu rekombinowanego enzymu W reakcjach, w których oznaczano aktywność rekombinowanej szczurzej reduktazy tioredoks yny wykorzystano reakcję barwną z kwasem 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowym. Powstały w wyniku aktywności reduktazy tioredoksyny NADP reaguje z DTNB dając żółte zabarwienie roztworu, którego intensywność oznaczana jest spektrofotometrycznie przy długości fali 412 nm po 5 i 15 min inkubacji w temperaturze pokojowej. W reakcji zastosowano odczynniki według zestawu do analizy dla reduktazy tioredoksyny (Thioredoxin Reductase Assay Kit, Sigma) oraz szczurzą rekombinowaną reduktazę tioredoksyny w stężeniu 0,165 μΜ. W tabeli nr 2 przedstawiono wartości IC50 hamowania aktywności reduktazy tioredoksyny przez PX-12, 3a, 8a i 8b. Najbardziej aktywnym spośród badanych związków był PX-12, który hamował aktywność reduktazy tioredoksyny w niskich, mikromolowych stężeniach (IC₅₀ po 5 min wynosi 13 μM). Spośród pozostałych, jedynie związek 3a nieznacznie hamował aktywność reduktazy tioredoksyny, ale w znacznie wyższych stężeniach niż PX-12 (wartość IC50 niemal trzykrotnie wyższa).

T a b e l a 2

IC₅0 hamowania aktywności reduktazy tioredoksyny [μΜ]
Czas pomiaru od rozpoczęcia reakcji	PX-12	3a	8a	8b
5 min	13	37,1	>40	>40
15 min	24	>40	>40	>40

2.1.3. Badanie aktywności reduktazy glutationu

Struktury przestrzenne centrów aktywnych reduktazy glutationu oraz enzymów układu Trx-TrxR wykazują wysokie podobieństwo. W celu dalszego sprawdzenia selektywności badanych związków zbadano ich aktywność względem reduktazy glutationu w porównaniu ze znanym inhibitorem jakim

PL 219 045 B1 jest PX-12. W reakcjach, w których oznaczano aktywność rekombinowanej ludzkiej reduktazy glutationu wykorzystano reakcję barwną z kwasem 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowym, podobnie jak w wypadku reduktazy tioredoksyny. Aktywność oznaczano po 5 i 10 min inkubacji w temperaturze pokojowej. W reakcji zastosowano odczynniki według zestawu do analizy dla reduktazy glutationu (Glutathion Reductase Assay Kit, Sigma) oraz ludzką rekombinowaną reduktazę tioredoksyny (Sigma) w ilości 0,04 U. Jedynym aktywnym spośród badanych związków był PX-12, który hamował aktywność reduktazy glutationu w mikromolowych stężeniach (IC₅₀ po 5 min wynosi 19,8 μΜ). Żaden z pozostałych badanych związków (3a, 8a i 8b) nie hamował aktywności reduktazy glutationu, nawet w stężeniach 100 μΜ. Wyniki przedstawione w tabelach 1, 2 i 3 wskazują, że związki 3a, 8a i 8b są znacznie bardziej selektywnymi inhibitorami tioredoksyny od PX-12.

T a b e l a 3

IC50 hamowania aktywności reduktazy glutationu [μΜ]
Czas pomiaru od rozpoczęcia reakcji	PX-12	3a	8a	8b
5 min	19,8	>100	>100	>100
10 min	28,6	>100	>100	>100

2.2. Ocena cytostatycznego/cytotoksycznego działania badanych związków

Działanie cytostatyczne/cytotoksyczne badano z wykorzystaniem następujących linii komórek nowotworowych: EMT6 (mysi rak sutka), PANC02 (mysi rak trzustki), B78 (czerniak mysi), C-26 (mysi rak okrężnicy), K562 (ludzka przewlekła białaczka szpikowa), T24 (ludzki rak pęcherza), RAJI (ludzki chłoniak Burkitta), Ramos (ludzki chłoniak Burkitta). Hodowle prowadzone były z zastosowaniem mediów DMEM (EMT6, PANC02, B78), RPMI (C-26, Raji, Ramos), IMDM (K562), McCoy's (T24) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Invitrogen) i antybiotyków (Sigma).

W celu określenia cytostatycznego/cytotoksycznego działania badanych związków zakładano hodowle komórkowe na płytkach 96-studzienkowych. Po 24 h dodawano inhibitory w określonych stężeniach. Wyniki odczytywano stosując metody kolorymetryczne po 72 godzinach inkubacji. Do oznaczenia działania cytostatycznego/cytotoksycznego stosowano barwienie fioletem krystalicznym (odczyt przy długości fali 595 nm) lub MTT (Sigma; odczyt przy długości fali 570 nm).

W tabeli 4 zestawiono podsumowanie wyników doświadczeń (LD50), w których porównano cytostatyczne/cytotoksyczne działanie modelowego inhibitora tioredoksyny PX-12 oraz związku 3a. W większości badanych linii komórek nowotworowych związki te miały podobną wartość LD50. Jedynie wobec linii EMT6 (mysi rak sutka) związek 3a okazał się ponad dwukrotnie bardziej aktywny.

T a b e l a 4

LD50 badanych związków [μΝΙ] po 72 h inkubacji
Linia komórek nowotworowych	PX-12	3a
EMT6	12,7	5,3
PANC02	3,8	3,2
C-26	5,4	3,2
B78	5,3	4,3
RAJI	5,9	4,6
Ramos	3,7	3,3
K562	4,9	3,8
T24	4,5	5,1

Podobne analizy wykonano dla innych badanych związków. Wyniki przedstawiono na figurze 1. Wszystkie związki wykazują działanie cytostatyczne/cytotoksyczne wobec komórek nowotworowych, najsilniejsze wobec komórek wywodzących się z układu krwiotwórczego (przewlekła białaczka szpikowa K562, chłoniak Burkitta RAJI).

PL 219 045 B1

2.3. Analiza cyklu komórkowego - wpływ badanych związków na proces dzielenia się komórek

Cykl komórkowy składa się z serii zdarzeń prowadzących do podziału komórki. W przebiegu cyklu komórkowego wyróżniamy fazę G1 (będącą przerwą między podziałami), fazę S (podwajania materiału genetycznego) oraz fazę G2/M (podziału - mitozy). Analiza cyklu komórkowego przy pomocy cytometru przepływowego pozwala określić procent komórek znajdujących się w poszczególnych fazach. Ponadto, wyznaczany jest odsetek komórek w tak zwanej fazie subG1 - a więc takich, których materiał genetyczny uległ degradacji w wyniku apoptozy lub nekrozy.

Cykl komórkowy badano z wykorzystaniem linii nowotworowej T24 po 72 godzinach inkubacji z PX-12 oraz mieszaniną racemiczną 3a. Komórki wybarwiono jodkiem propidyny w stężeniu 10 pg/μΙ i analizowano przy pomocy cytometrii przepływowej. Wyniki analizy zaprezentowano na figurze 2. Odsetek komórek namnażających materiał genetyczny (faza S) wyraźnie zmniejsza się po inkubacji z inhibitorami tioredoksyny.

Piśmiennictwo:

Berggren, M., Gallegos, A., Gasdaska, J.R., Gasdaska, P.Y., Warneke, J., Powis, G., Anticancer Res 1996, 16, str. 3459 - 3466

Gromer S., Urig S., Becker K. Med. Res. Rev. 2004 24, 1, str. 40 - 89

May J. M., Mendiratta S, Hill K.E., Burk R.F., J. Biol. Chem., 1997; 272, str. 22607 - 22610

Holmgren, A., J. Biol. Chem. 1989, 264, str. 13963 - 13966

Ichijo, H., Nishida, E., Irie, K., ten Dijke, P., Science 1997, 275, str. 90 - 94

Sasada, T., Nakamura, H., Ueda, S., Sato, N., Free Radic. Biol. Med. 1999, 27, str. 504 - 514

Kirkpatrick, D. L., Kuperus, M., Dowdeswell, M., Potier, N., Biochem. Pharmacol. 1998, 55, str. 987 - 994

Calabrese, V., Bates, B.E., Mancuso, C., Cornelius, C., Ventimiglia, B., Cambria, M.T., Di Renzo, L., De Lorenzo, A., Dinkova-Kostova D., Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, str. 1062 - 1073

Fang, J., Lu, J., Holmgren, A., J. Biol. Chem. 2005, 280, str. 25284 - 25290

Sun, Q., Wu, Y., Zappacosta, F., Jeang, K. T., Lee, B. J., Hetfield, L. D., Gladyshev, N. V.,

J. Biol. Chem. 1999, 274, str. 24522 - 24530

Nordberg, J., Zhong, L., Holmgren, A., Arner, E. S., J. Biol. Chem. 1998, 273, str. 10835 - 10842

Gromer, S., Arscott, L. D.,Williams, C. H., Jr., Schirmer, R.H., Becker, K., J. Biol. Chem. 1998,

273, str. 20096 - 20101

Marzano, C, Gandin, V., Folda, A., Scutari, G., Free Radie. Biol. Med. 2007, 42, str. 872 - 881.

Claims

1. Związek o wzorze ogólnym (I):

gdzie:

R1 oznacza prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową C1-C8, fenyl, benzyl,

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że wybrany jest z grupy obejmującej związki: (R)-2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis-(trifluorometylo)benzoesan;

PL 219 045 B1 (S)-2-((1-((2-etoksy-2-oksoetylo)amino)-4-metylo-1-oksopentan-2-ylo)karbamoilo)allilo 2,6-bis-(trifluorometylo)benzoesan;

2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-bis(trifluorometylo)benzoesan;

2-(benzylokarbamoilo)allilo 2,6-dichlorobenzoesan.

3. Związek o wzorze ogólnym (I), określony w zastrz. od 1 do 2 do zastosowania jako lek.

4. Związek o wzorze ogólnym (I), określony w zastrz. od 1 do 2, do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób nowotworowych, chorób związanych ze wzmożoną proliferacją komórek, korzystnie ostrych i przewlekłych odrzutów przeszczepów, chorób alergicznych i autoimmunizacyjnych, zespołów limfoproliferacyjnych, zespołów mielodsyplastycznych i mieloproliferacyjnych oraz stanów przed nowotworowych.

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera związek o wzorze ogólnym (I), określony w zastrz. od 1 do 2.

6. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze ogólnym (I), określony w zastrz. od 1 do 2, do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób nowotworowych, chorób związanych ze wzmożoną proliferacją komórek, korzystnie ostrych i przewlekłych odrzutów przeszczepów, chorób alergicznych i autoimmunizacyjnych, zespołów limfoproliferacyjnych, zespołów mielodsyplastycznych i mieloproliferacyjnych oraz stanów przednowotworowych.

PL 219 045 B1

Rysunki działanie cytostatyczne/cytotoksyczne [% kontroli]