CZ299837B6

CZ299837B6 - Cyklická oxosloucenina a farmaceutická kompozice s jejím obsahem

Info

Publication number: CZ299837B6
Application number: CZ0095599A
Authority: CZ
Inventors: T. Lum@Robert; R. Schow@Steven; Joly@Alison; Kerwar@Suresh; G. Nelson@Marek; M. Wick@Michael
Original assignee: Cv Therapeutics, Inc.
Priority date: 1996-09-24
Filing date: 1997-09-23
Publication date: 2008-12-10
Also published as: KR20000048577A; CA2266884A1; KR100363067B1; CN1231612A; GEP20012512B; PL332383A1; NO991406L; WO1998013061A1; US5834487A; EP0956031B1; JP2000509406A; US6117887A; NZ334377A; HUP9904693A2; RU2195310C2; NO323627B1; DE69733573D1; NO991406D0; EP0956031A1; CN1220520C

Abstract

Cyklická oxosloucenina obecného vzorce I, kde R.sub.1.n., R.sub.2.n., R.sub.4.n., R.sub.5.n., R.sub.6.n., R.sub.7.n., R.sub.8.n. a R.sub.9.n. predstavují atomy vodíku a R.sub.3.n. predstavuje methoxyskupinu, X predstavuje skupinu vzorce -D.sub.1.n.-D.sub.2.n.-E, kde D.sub.1.n. a D.sub.2.n. predstavují aminokyselinové zbytky a E predstavuje aminokyselinový zbytek nebo zbytek obecného vzorce -N-RR', kde každý ze symbolu R a R' je nezávisle zvolen z vodíku, alkylskupiny s l až 10 atomy uhlíku, substituované alkylskupiny s 1až 10 atomy uhlíku, arylskupiny a substituované arylskupiny. Použití terapeuticky úcinného množství této slouceniny pro výrobu farmaceutické kompozice pro lécení choroby zvolené z poruch bunecné proliferace, poruch imunitního systému a infekcních chorob u savcu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká cyklických oxosloučenin, které jsou vhodné pro inhibici buněčné proliferace, a jako takové jsou užitečné při léčení rakoviny, kardiovaskulárních chorob, například restenózy, odmítání transplantátu, dny a dalších proliferačních chorob a rovněž jsou možnými terapeutiky pro autoimunní nemoci, jako je revmatická artritida, lupus, diabetes typu I, násobná skleróza i o a podobné choroby a nemoci.

Dosavadní stav techniky

Multikatalytická proteináza nebo proteasom je vysoce konzervovaná buněčná struktura, která se podílí na proteolýze závislé na ATP u většiny buněčných proteinů. 20S í70Q-kDa)_proteasomobsahuje alespoň pět rozdílných proteolyrických aktivit, které mají nový typ mechanizmu, zahrnující treoninový zbytek na aktivním místě (Coux, O., Tnaka, K. a Goldberg, A. 1996 Ann. Rev. Biochem. 65:801-47).

Proteasom 20S kiystaluje z archaebakterie Thermoplasma acidophilum (Lowe, J., Stock, D., Jap. B., Zwickl, P., Bauminster, W., a Huber, R. 1995 Science 268:533-539). Archaebakteriální proteasom 20S obsahuje čtrnáct kopií dvou různých typů podjednotek, a a β, které tvoří cylindrickou strukturu, skládající se ze čtyř na sebe naskládaných kruhů. Vrchol a dno obsahuje sedm; a podjednotek, zatímco vnitřní kruhy obsahují sedm β podjednotek. Otvor se rozšiřuje přes střed struktury, která obsahuje proteolyticky aktivní místa a proteiny určené k degradaci procházející tímto kanálem. Eukaryotický proteasom 20S je komplexnější než proteasom archaebakterie, protože číslo rozdílných podjednotek se během vývoje zvyšuje, avšak podjednotky mohou být stále tříděny podle a a β nomenklatury archaebakterie podle své homologie. Kvartémí struktura euka30 ryotického komplexu je podobná struktuře archaebakterie, sestávající ze dvou a a β kruhů. Narozdíl od archaebakteriálního proteasomu, u kterého se primárně projevuje chimotrypsinu podobná proteolytická aktivita (Dahlmann, B., Kopp, F., Kuehn, L., Niedel, B., Pfeifer, G. 1989 FEBS Lett. 251:125-131, Seemuller, E., Lupas, A., Zuhl, F., Zwickl, P a Baumeister, W. 1995 FEBS Lett. 359:173; a Lowe, J,, Stock, D., Jap, B., Zwickl, P., Bauminster, W. a Huber, R. 1995

Science 268: 535-539). Eukaiyotický proteasom obsahuje alespoň pět identifikovatelných proteázových aktivit. Tyto aktivity jsou označovány chymotripsínu podobná, tripsinu podobná a peptidy lglutamyl-peptidová hydrolýza. Dvě ostatní aktivity také již byly popsány, jedna vykazuje preferenci pro štěpení peptidových vazeb na karboxylové straně rozvětveného řetězce aminokyselin a ostatní vůči vazbám mezi malými neutrálními aminokyselinami (Orlowski, M.

1990 Biochemistry 29: 10289-10297).

Ačkoliv proteasom 20S obsahuje proteolytické jádro, nemůže degradovat proteiny in vivo, ledaže je komplexován s čepičkou 19S buď v jednom, nebo druhém konci jeho struktuiy, který sám obsahuje násobné ATPase aktivity. Tato větší struktura je známá jako proteasom 26 a rychle odbourává proteiny, které byly vybrány k degradaci přidáním násobných molekul 8,5-kDa polypeptidu, ubiquitinu.

První stupeň vzhledem k ubiquitinaci proteinu se uskutečňuje aktivací ubiquitinové molekuly v její karboxylovém koncovém glycinovém zbytku přidáním ATP, který vytváří thioesterový meziprodukt s vysokým obsahem energie. Tento stupeň je katalyzován enzymem aktivujícím ubiquitin, El. Ubiquitin se pak převede na aktivní cysteinový zbytek ubiquitin konjugujícího enzymu, E2, Enzymy E2 vážou ubiquitin k E aminovým skupinám lysinových zbytků na proteinovém substrátu, který je určen k degradaci. Tento proces v některých případech také vyžaduje ubiquitin ligásu, E3. Opakovaná konjugace ubiquitinu na lysinové zbytky dříve vázaných ubiqui55 tinových částí vede k tvoření multi-ubiquitinových řetězců a vytváří se skelet ubiquitinu kolem

-1CZ 299837 B6 proteinového substrátu. Multi-ubiquitinované substrátové proteiny jsou rozpoznávány proteasomem 26 a jsou degradovány a multi-ubiquitinové řetězce jsou uvolňovány z komplexu a ubiquitin se recykluje.

Stále se zkoumá, co způsobuje, že protein zůstává ubiquitinovaný. Je zřejmé, že výzkum musí probíhat v přesně kontrolovaných řadách případů, protože kritické načasování specifické proteinové degradace je rozhodující pro mnoho funkcí buněčného cyklu. Bylo navrženo několik signálů, které jsou do značné míry zaměřeny na vnitřní strukturní soustavy uvnitř vlastního substrátu. Jeden takový návrh je pravidlo N-konce („N-end rule“), ve kterém aminový koncový zbytek proteinu určuje jeho poločas života. Jiné proteiny, jako cykliny obsahují krátké sekvence aminokyselin označovaných „destrukční box“, které jsou pravděpodobně nezbytné pro degradaci. Dále se předpokládá, že sekvence „PĚST“, které se skládají z oblastí bohatých na prolin, aspartát, glutamát, serin a threonin také působí jako degradační signály. Má se za to, že takové vnitřní sekvence působí jako poznávací prvky mezi proteinovým substrátem ajeho specifickou ubiquiti15 načni mašinérií.

Byly popsány dva typy inhibitorů, které inhibují proteolytickou aktivitu proteasomu. O určitých peptidových aldehydech bylo uvedeno, že inhibují chymotripsinu podobnou aktivitu, spojenou sproteasomem (Vinitski, A., Michaud, C., Powers, J. a Orlowski, M. 1992 Biochemistry

31:9421-9428; Tsubuki, S„ Hiroshi, K„ Saito, Y„ Myashita, N„ Inomata, M. a Kawashima, S.,

1993 Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1195-1201; Rock, K. L„ Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K„ Stein, R., Dick, L., Hawang, D.^ a Goldberg, A. L. 1994 Cell 78:761-771). Jsou to Nacetyl-L-leucinyl-L-leucinal-L-norleucinal (ALLN) a příbuzná sloučenina, N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-methional (LLM) s Kj' 0,14 μΜ. Nej silnější inhibitor tohoto typu je strukturně příbuzná sloučenina, N-karbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norvalinal (MG 115), která vykazuje K, 0,021 μΜ. Ačkoliv tyto peptidové aldehydy jsou nejúčinnější proti chymotripsin podobné proteolytické aktivitě proteasomu, pečlivé studie ukázaly, že jsou nespecifickými proteásovými inhibitory. Poslední zprávy popisují řadu silných dipeptidových inhibitorů, které mají hodnotu lC₅o v rozsahu 10 až 100 nM in vitro (Iqbal, M„ Chatterjee, S„ Kauer, J. C„ Das, M.,

Messina, P., Freed, B., Bíazzo, W., a Siman, R. 1995, J, Med. Chem. 38:2276-2277) a série podobných silných in vitro inhibitorů dipeptidů odvozených od α-ketokarbonylového a boronového esteru (Iqbal M„ Chatterjee, S., Kauer, J. C., Mallamo, J. P., Messina, P, A., Reiboldt, A., a Siman, R. 1996 Bioorg. Med, Chem. Lett 6:287-290).

Další zpráva popisuje třídu sloučenin, které vykazuj í specifičnost při inhibici proteasomové aktivity (Fenteany, G., Standaert, R. F., Lané, W. S„ Choi, S., Corey, E. J., a Schreiber, S. L. 1995 Science 268:726-731), Lactacystin je metabolit Streptomyces, který specificky inhibuje proteolytickou aktivitu proteasomového komplexu^ Tato molekula byla původně objevena pro svoji schopnost indukovat neuritový výrůstek v neuroblastomové buněčné linii (Omura a kol., 1991

J. Antibiot. 44:113), později bylo ukázáno, že inhibuje proliferací několika buněčných typů (Fenteany a kol., 1994 Proc.Naťl. Acad. Sci USA 91: 3358). Použitím radioznačeného lactacystinu, vazebné studie provedené (Fenteany a kol., 1995 Science 268: 726-731) identifikovaly vazebná místa a mechanizmus působení. Tyto studie prokázaly, že se lactacystin váže ireversibilně k threonínovému zbytku umístěném v aminovém terminusu β podjednotky proteasomu. Rovněž byla zkoumána série analogů, založených na struktuře lactacystinu (Fenteany a kot., 1995 Science 268: 726-731). Tyto studie prokázaly, že β-laktonová struktura je podstatná pro jeho inhibiční aktivitu.

Nyní bylo dokázáno, že proteasom je hlavní extralysosomální proteolytický systém, který je zahr50 nut v degradační cestě vznikající v četných a rozmanitých buněčných funkcích, jako je buněčné dělení, zpracování antigenu a degradace regulačních proteinů s krátkou životností, jako jsou transkripční faktory, onkogenní produkty a cykliny (přehled v Ciechanover, A., 1994 Cell 79: 13-21). Primární funkce proteasomu je katalýza proteolýzy proteinů na malé peptidy. Nicméně bylo také demonstrováno, že ubiquitin-proteásomová cesta může katalyzovat regulované proteo-2CZ 299837 B6 ly tické zpracování velkého inaktivního prekurzoru na aktivní protein. Nej lepší dokumentovaný případ tohoto typu zahrnuje aktivaci transkripčního faktoru NF-κΒ (Palombella, V. I, Rando, O, J., Goldberg, A. L., a Maniatis, T. 1994 Cell 78: 773-785). Aktivní forma NF-κΒ je heterodimer, obsahující podjednotku p65 a p50. Posledně jmenovaná se nachází v cytosolu buňky v inak5 tivní prekurzorové formě, zejména pl05, 105-kDa polypeptidový prekurzor p50. Proteolytické zpracování pl 05 za vzniku p50 probíhá přes ubiquitin-proteasomovou cestu. Dále, zpracované p50 a p65 se udržují v cytosolu jako inaktivní komplex s inhibičním proteinem IkB. Zánětlivé signály aktivují NF-κΒ zavedením signalizační cesty pro úplnou degradaci I B a také stimulují zpracování pl 05 a pl 50* Tak jsou dva proteolytické případy oba řízené ubiquitin-proteasomovou cestou, požadovány pro signálem indukovanou aktivaci NF-κΒ, Není známo, co způsobuje zakončení proteolýzy p 105 následující vznik p50, ale předpokládá se, že konformace p50 může poskytovat jeho odolnost dalšímu zpracování a způsobit jeho disociaci z komplexu 26S.

Skutečnost, že proteasom hraje důležitou úlohu v aktivaci NF-κΒ může být využita klinicky, použitím inhibitorů namířených vůči proteolýze proteasotnu, Při určitých nemocech může být normální funkce aktivního NF-κΒ lidskému zdraví škodlivá, jak bylo pozorováno u zánětlivýeh odezev následující bakteriální, fungální nebo virální infekce. Tak mohou inhibitory aktivace NFκΒ mít, v důsledku své schopnosti zabránit sekreci citokinů, potenciální využití v léčbě ARDS (acute respirátory distress syndrome) a AIDS. Jelikož je aktivace NF-κΒ také podstatná pro angiogenézi, inhibitory proteasomu mohou být využity v léčbě těch nemocí, které jsou spojeny s abnormální neovaskutarizací.

p53 byl prvně popsán jako onkoprotein, ale jíž bylo ukázáno, že je zahrnut v mnoha buněčných pochodech (přehled Ko, L. J. a Proves, C. 1996 Genes Dev. 10, 1054-1072). O p53 se uvádí, že indukuje apoptózu v několika hematopoietických buněčných liniích (Oren, M., 1994 Semin Cán.cer Biol., 5, 221-227) přes působení mnoha různých stimulů, včetně poškození DNA, virální infekce a odstranění faktorů růstu. Nicméně je důležité uvést, že apoptóza může být indukována v p53-nezávislém způsobu, například působením glukokortikoidů. Indukce p53 vede k zastavení buněčného růstu ve fázi G1 buněčného cyklu a rovněž k zániku buněk apoptózou. Obě tyto funk30 ce umožňují p53 regulovat poškození DNA, a tím snižovat propagaci mutací DNA, když se buňky dělí. p53 zastavuje buňky v G1 indukováním inhibitoru kinázy závislém na cyklinu, p2l, který postupně způsobuje akumulaci hypofosforylované formy retinoblastomového genového produktu. Předpokládá se, že p53 působí jako kontrolní bod v buňce následující poškození DNA, prvně způsobí zastavení buněčného dělení a apoptózu. Je známo, že degradace p53 probíhá přes ubiqui35 tin-proteasomovou cestu a přerušení degradace p53 je možný mód zavedení apoptózy. Další možné využití inhibitorů proteasomu spočívá v léčbě nemocí, které vznikají z abnormální buněčné proliferace. _{α H}

Je dobře dokumentováno, že ubiquitin-proteasomová cesta je důležitá pro regulovanou destrukci cyklinů, které řídí výstup z mitózy a umožňují buňkám postupovat do další fáze buněčného cyklu. Tak inhibiění degradace cyklinů použitím inhibitorů proteasomu způsobuje zástavu růstu. Proto další možné využití inhibitorů proteasomu je jejich použití při léčbě nemocí, které vznikají ze zrychleného buněčného dělení, Tyto nemoci zahrnují rakovinu, kardiovaskulární nemoci, jako je myokarditida, restenóza následující angioplastiku, reneální nemocí, jako je lupus, polycystická nemoc ledvin, fungální infekce, dermatologické nemoci, jako je psoriáza, léčení abnormálního poranění, keloidy, imunologické nemoci, jako je autoimunita, astma, alergie, akutní a zpožděná hypersensitivita, transplantované versus hostitelské nemoci, odmítnutí transplantátu a neuroimunologické nemoci, jako je násobná skleróza a akutní rozšířená encefalomyelitida.

-3CZ 299837 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je cyklická oxosloučenina obecného vzorce I

kde io R_b R₂, R_b Rs, R$, R7, Re a R<> představují atomy vodíku a R₃ představuje methoxyskupinu,

X představuje skupinu vzorce

-D,-D₂-E kde

Di a O₂ představují aminokyselinové zbytky a

E představuje aminokyselinový zbytek nebo zbytek obecného vzorce

-N-RR', * ' kde každý ze symbolů R a R' je nezávisle zvolen z vodíku, alkylskupiny s 1 až 10 atomy uhlíku, substituované alkylskupiny s 1 až 10 atomy uhlíku, arylskuptny a substituované arylskupiny.

Výhodná provedení této sloučeniny zahrnují tyto aspekty;

substituovanou alkylskupínu s 1 až 10 atomy uhlíku je alkylskupina s 1 až 10 atomy uhlíku substituovaná arylskupinou nebo substituovanou arylskupinou;

- Di a D₂ jsou zvoleny zL-leucinu a D-leucinu, přičemž přednostně Di znamená L-leucin a D₂ znamená D-leucin;

význam E je zvolen z Gly-NH₂, benzylaminu, dibenzylaminu a 2,6-difluorbenzylaminu;

- cyklickou oxosloučeninou je sloučenina obecného vzorce

-4CZ 299837 B6

kde R] znamená atom vodíku a význam R₂ je zvolen z benzylskupiny, hydroxyethylskupiny, adamantylskupiny, fenylskupiny, fenethylskupiny nebo cyklohexylmethylskupiny; nebo Ri zna5 mená benzylskupinu a R₂ znamená methylskupinu nebo benzylskupinu; přičemž přednostně R] znamená atom vodíku a R₂ znamená benzylskupinu;

- cyklickou oxosloučeninou je sloučenina obecného vzorce

kde význam R zvolen z 1-indanylskupiny, piperonylskupiny, 2,6-difluorbenzylskupiny, benzylskupiny, 4-methoxybenzylskupiny a 4-nitrobenzylskupiny; přičemž přednostně R znamená 2,6difluorbenzylskupinu.

Předmětem vynálezu je dále také použití terapeuticky účinného množství cyklické oxosloučeniny podle kteréhokoliv z provedení uvedených výše pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení choroby zvolené z poruch buněčné proliferace, poruch imunitního systému a infekčních chorob u savců. .. - . .

Výhodná provedení tohoto použití zahrnují tyto aspekty:

- savcem je člověk;

- terapeuticky účinné množství leží v rozmezí od 0,001 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti savce;

porucha buněčné proliferace je zvolena z reumatoidní arthritis, lupusu, diabetes typu í, roztroušené sklerosy, rakoviny, restenosy, choroby hostitel-roub a dny;

poruchou buněčné proliferace je restenosa, rakovina, nebo polycystická choroba ledvin;

- farmaceutická kompozice indukuje apoptosu;

- infekční choroba je zvolena z 1BD, Crohnovy choroby, AIDS, ARDS a fungálních chorob;

*5CZ 299837 B6 porucha imunitního systému je zvolena zreumatoidní arthritis, autoimunitních chorob, odmítání transplantátu a psoriasy;

- farmaceutická kompozice je ve formě roztoku nebo tablet.

Rl	R2	R3	R4	R5	R6	R7	R8	R9	Dl
				Me			=N-0H	OMe
				Ph	COO Et		COOEt		OEt
		OMe		COO Me					OMe

Je na znalostech odborníka, že stereoisomery sloučenin zde popsané a rovněž isomery a stereoisomery složek, které zahrnují sloučeniny identifikované v popisu vynálezu rovněž spadají do rozsahu sloučenin, které jsou užitečné v terapeutické metodě podle vynálezu.

Jestliže sloučenina užitečná ve způsobu podle vynálezu obsahuje bazickou skupinu, může se připravit kyselá adiční sůl. Kyselé adiční soli sloučenin se připraví standardním způsobem ve vhodném rozpouštědle z původní sloučeniny a přebytku kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, fosforečná, octová, maleinová, jantarová nebo methansulfonová. Jestliže finální sloučenina obsahuje kyselou skupinu, může se připravit kationtová sůl. Typicky se výchozí sloučenina zpracuje přebytkem alkalického činidla, jakoje hydroxid, uhličitan nebo alkoxid, obsahující vhodný kation. Kationty, jako jsou Na⁺, K⁺, Ca⁺² a NH⁴⁺jsou příklady kationtů, přítomných ve farmaceuticky přijatelných solích. Některé ze sloučenin tvoří vnitřní soli nebo obo20 jetné soli, které mohou být také přijatelné.

Sloučeniny popsané shora jsou užitečné pro léčbu chorob buněčné proliferace, infekčních nemocí a imunologických nemocí u savců, zejména u lidí, kteří vyžadují takovou léčbu. Choroby buněčné proliferace, které mohou být léčeny použitím sloučenin popsaných shora zahrnují rakovinu, kardiovaskulární nemoc,jakoje myokarditida, restenosu následující angioplastiku, renální nemoci, jako je lupus a polycystická nemoc ledvin, odmítnutí implantátu, dna a ostatní proliferační nemoci. Autoimunní nemoci, které mohou být léčeny sloučeninami podle vynálezu zahrnují revmatickou artritidu, lupus, diabet typu I, násobnou sklerózu a podobné choroby a nemoci. Infekční nemoci, které mohou být léčeny použitím .sloučenin popsaných shora zahrnují IBD,

Crohnovu nemoc, AIDS, ARDS a podobné choroby. Sloučeniny popsané shora se mohou také použít k léčení fungálních nemocí, kožních nemocí jako je psořiáza, léčení abnormálního poranění, keloidů, imunologických nemocí jako je autoimunita, astma, alergie, akutní a zpožděná hypersensitivita, transplantované versus hostitelské nemoci, odmítnutí transplantátu a neuroimunologické nemoci, jakoje násobná skleróza a akutní rozšířená encefalomyeíitida.

Způsob léčení těchto nemocí a chorob zahrnuje podání parenterálně nebo orálně, účinného množství vybrané sloučeniny nebo jejich kombinaci, výhodně dispergované ve farmaceutickém nosiči. Dávkové jednotky jsou obvykle vybrány v rozsahu 0,01 až 100 mg/kg, ale mohou být snadno určeny odborníkem v závislosti na cestě podání, věku a stavu pacienta. Dávkové jednotky mohou být jednou až desetkrát denně u akutních nebo chronických nemocí. Sloučeniny podle vynálezu nevykazují žádné neočekáváte lne toxické účinky.

Farmaceutické prostředky sloučenin podle vynálezu nebo jejich derivátů mohou být formulovány jako roztoky nebo lyofilizované prášky pro parenterální podání. Prášky mohou být před použitím upravený přidáním vhodného ředidla nebo jiného farmaceuticky přijatelného nosiče. Kapalná formulace je obvykle pufrový, isotonický nebo vodný roztok. Příklady vhodných ředidel jsou nor-6CZ 299837 B6 mální fyziologický roztok, standardní 5% dextróza ve vodě nebo pufrový sodný nebo amonný acetátový roztok. Takové formulace jsou zejména vhodné pro parenterální podání, ale mohou také být použity pro orální podání. Může být žádoucí přidat pomocné látky, jako je polyvinylpyrrolidon, želatina, hydroxycelulosa, akácie, polyethylenglykol, mannitol, chlorid sodný a citrát sodný. Alternativně mohou být sloučeniny zapouzdřeny, tabletovány nebo mohou být připraveny jako emulze nebo sirup pro orální podání. Za účelem zvýšení stálosti prostředku nebo usnadnění přípravy se mohou přidávat farmaceuticky přijatelné pevné nebo kapalné nosiče. Kapalné nosiče zahrnují sirup, arašídový olej, olivový olej, glycerin, fyziologický roztok, alkohol a vodu. Pevné nosiče zahrnují škrob, laktózu, síran vápenatý, dehydrát, terra alba, stearát horečnatý nebo kyselo linu stearovou, talek, pektin, akácii, agar nebo želatinu. Nosič také může zahrnovat materiály s prodlouženým uvolňováním, jako je glyceryl monostearát nebo glyceryl distearát, samotný nebo s voskem. Množství pevného nosiče se liší, výhodně je mezi 20 mg až 1 g na jednotkovou dávku. Farmaceutické prostředky jsou připraveny následujícími konvenčními technikami používanými ve farmacii a zahrnující mletí, smíchání, granulaci a lisování, je-li to nezbytné pro table15 tové formy, nebo mletí, míchání a plnění do tvrdých želatinových kapslí. Jestliže se použije kapalný nosič, preparát bude ve formě sirupu, elixíru, emulze, nebo vodné nebo nevodné suspenze. Taková kapalná formulace může být podávána přímo nebo může být plněna do měkkých želatinových kapslí.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Sloučeniny užitečné při terapeutických metodách podle vynálezu se připraví konvenčními způsoby organické chemie. Kopulační složky jsou velmi dobře známé ve stavu techniky, jako je DCC a jiné karbodiimidy, EDC, BOP a PPA a mohou být případně použity s dalšími reakčními složkami, jako je HOBT, NMM a DMAP, které mohou usnadňovat reakci. Příprava sloučenin obecného vzorce I, kde D_b D₂ a E jsou aminokyseliny je velmi dobře známá ve stavu techniky a používá buď technik konvenční roztokové fáze, nebo pevné fáze, jak je popsáno v Bodanszky „The Practice of Peptide Synthesis“, Springer-Verlag, 1. vydání, 1984, Vhodné chránící skupiny pro aminoskupinu jsou popsány Greenem a kol., „Protective Group in Organic Synthesis“, 2. vydání, John Wiley and Sons, New York, 1991. Benzy loxykarbony lové, Zerc-butoxy karbony lové a fluorenylmethoxykarbonylové skupiny jsou zvlášť výhodné jako amino chránící skupiny.

Syntéza peptidu v pevné fázi se provádí následujícím způsobem. Amidová pryskyřice se umístí do injekční stříkačky opatřené fritovým filtrem. U pryskyřice se odstraní chránící skupina použitím 20% piperídínu v DMF. Po 20 minutách se pryskyřice promyje pětkrát DMF, pětkrát metha40 nolem a potom pětkrát DMF. Roztok aminokyseliny (E), karbodiimidu a HOBT v DMF se vtáhne do injekční stříkačky a reakční směs se nechá míchat 4 až 20 hodin. Reakční roztok se vytlačí a směs se promyje pětkrát DMF, pětkrát methanolem a potom pětkrát DMF. Tento cyklus se opakuje tolikrát, dokud se nezískají žádané sekvence. Použité finální kopulační činidlo 5-methoxyl-indanon-3-octová kyselina, karbodiimid a HOBT. Po konečném promytí pryskyřice se peptidový fragment rozštěpí z pryskyřice použitím 95 % TFA/5 % vody. Koncentrace štěpící směsi poskytuje bílou pevnou látku.

Příklad 2

Sloučeniny podle vynálezu připravené podle způsobu příkladu 1 se zkouší následujícím způsobem.. Katalytická podjednotka proteasomu 20S (také známá jako multikatalytický proteinasový komplex) se připraví z hovězího mozku a čistí se do homogenity podle publikovaného způsobu (Wilk S. a Orlowski, M., 40 842 J. Neurochem (1983)). Chymotriptická účinnost komplexu se

- 7.

měří zvýšením fluorescence následující štěpení substrátového peptidu sukcinyl-leucin-leucinvaíin-tyrosin-7-amino-4-methylkumarinu. Standardní in vitro zkouška se skládá z 2 gg proteasomu 20S, 0,1 až 100 gg/ml inhibitoru proteasomu v 200 μί 50 mM HEPES obsahující 0,1 % dodecylsulfátu sodného pH 7,5. Proteolytická reakce je vyvolána přidáním 50 μΜ fluorogenního peptidového substrátu a nechá se probíhat po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Reakce se zakončí přidáním 100 μί 100 mM acetátového pufru, pH 4,0. Rychlost proteolýzyje přímo úměrná množství uvolněného aminomethylkumarinu, který se měří fluorescentní spektroskopií (EX 370 nm, EM 430 nm). Struktuiy testovaných sloučenin a výsledky testů jsou uvedeny v tabulce 2 dále.

Tabulka 2

Sloučenina	R3	Dl	D2	E	IC50 _;ug/ml
1	MeO	d-leu-NH2			5
2	MeO	d-Ieu	d-leu-NH2		1
3	MeO	leu-NH2			>10
4	MeQ	d-leu	his-NH2		>10
5	MeO	leu	leu-NH2		>10
6	MeO	d-leu	leu-NH2		>10

-RCZ 299837 Bó

Sloučenina	R3	Dl	D2	E	IC50 ug/mí
7	MeC	1 leu	dJeu-NH2		>10
8	MeC	Nle-NH2			>10
9	MeO	, d-Níe-NH2			>10
10	MeO	Nva-NH2			>10
11	MeO	d-leu	Aib-NH2		>10
¹²	MeO	d-phe-NH2			>10
13	MeO	CHÁ	Leu-NH2		>10.
14	MeO	phe	Ieu-NH2		>10
15	MeO	Nle	d-Leu-NH2 \|	>10
16	MeO	Nle	leu-NH2		>io
17	MeO	leu	leu	gly-NH2	>10
18	MeO	d-íeu	leu	gly-NH2 .	5
19	MeO	d-leu \|	d-leu	gíy-NH2 j	>10
20
.21	MeO	leu	d-leu	gíy-NH2	OJ
22	MeO	d-Nle	d-ieu-NH2		>10
23	MeO	d-Nle	leu-NH2		>10
24	MeO	phe-NH2			>10
25	MeO	Tic*NH2			>10
26	MeO	Tič	d-leu-NH2		>10 i
27	MeO	d-phe	d-Ieu-NH2		¹⁰
28	MeO	leu	Aib-NH2		>10
29	MeO	CHA-NH2			>10
30	MeO	d-val	d4eu-NH2		>10
31	MeO	d-pro.	d-leu-NH2		10

-9CZ 299837 Bó

Sloučenina	R3	Dl	D2	E	ÍC50 ug/ml
32	: MeC	) d-cha	d-Ieu-NH2		>10
33	MeC	d-leu	d-val-NH2		>10
34	MeC	d-val	d-val-NH2		>10
35	MeO	d-cha	d-cha-NH2		>10
36	MeO	d-phg-NH2			>10
37	MeO	d-phg	d-Ieu-NH2		>10
. 38	MeO,	benzyl			>10
39	MeO	dibenzýlamin			>10
40	MeO	giy	gly	gly-NH2	>Kb
⁴¹	MeO	leu	giy	gly-NH2	>10
42	MeO	giy	d-leu	gly-NH2	>io: f
43	MeO	íile	d-leu	gly-NH2	>10 i
44	MeO	nva	d-leu	gly-NH2	>10
45	MeO	phe	d-leu	gly-NH2	>10
46	MeO	cha	d-leu	gly-NH2	>10
47	MeO	val	d-leii	gly-NH2	>10
48	MeO	phg	d-leu	gly-NH2	>10
49	MeO	pro	d-leu	gly-NH2	>10
50	MeO	leu	d-leu	gly-NH2	0.5
51	MeO	leu	d-leu	gty-NH2	0,5
. . 52	MeO	d-leu.	ala-NH2		>10
53	MeO	d-leu	d-ala-NH2		>10
54	MeO	d-leu	d-pn>NH2		>10
55	MeO	d-pro-NH2			>10
56	MeO	d-leu	d-phe-NH2		>10

- 10CZ 299837 B6

Sloučenin:	i R3	Dl	D2	E	IC50 ug/ml
57	MeC	) d-nva	ddeu-NH2		>10
58	MeC	nva	d-Ieu-NH2		>10
59	MeO	d-ala	d-leu-NH2		>10
⁶⁰	MeO	d-tic,	d-leu-NH2		>10 f
61	MeO	d-ser	d-leii-NH2		>10
62	MeO	diisopropyl	1 f >10
63	MeO	morfolin			>10
64	MeO	pyrrolidin*			>10
65	MeO	i feriethy lamin			>10 ¹
66	MeO	fenpropy lamin			>10 1
67	MeO	piperidini	j	>10
68	MeO	diethyJániin		>10
69	MeO ₍	cykl obuty lamin			>10
70	MeO	heptylámine			>10
71	MeO	3- mcthoxyprop ylaniin.			>10
72	MeO	3.4- dimethoxy feněthylamin			>10
73	MeO	N- methylbenzyl amin			>10
74	MeO	cyklopentyla min,			>10
75	MeO	2,6- dimethylpiper idin<			>10

II

Sloučenina

R3

Dl

D2

ÍC50 ug/ml [ MéO [ N benzylethanol amin.

>10

MeO índolin >10

MeO dimethylamin >10

I MeO I bis(2methoxyethyl )amin,

MeO‘ piperonýlami ne

I MeO | 4hydroxypiperi din.

MeO 3-iodoaníIin

MeO k

aminoindan

MeO etháňolamin

MeO

4methoxybeňz ylaminn

MeO leu d-nle gly-NH2

MeO leu d-nva gly-NH2

MeO leu d-phe gly-NH2

MeO leu d-cha gly-NH2

MeO leu d-val gly-NH2

MeO

MeO leu leu d-arg d-asp >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 >10 d-phg d-pro d-leu-NH2 d-leu-NH2 gIy-NH2 gly-NH2 >10 >10 >10 . i? _

Sloučení ní	R3	Dl	D2	E	1C5Ó ug/ml
95	MeC	) d-asn	d-leu-ŇH2		10
96	MeC	d-asn	d-Ieu-NH2:		>10
97'	MeO	d^glu	d-Ieu-NH2		>10:
98	MeO	d-gln	d-leu-NH2		>10
99	MeO	d-his	ď-Ieu-NH2		>10
100	MeO	d-lys:	d-leu-NH2		>1,0
101	MeO	d-thi	d-íeu-NH2		>10
1,02	MeO	d-tyr	d-leu-NH2		>10
103	MeO	d-trp	d-leu-NH2		>10
1 104	MeO	4- (amihomethyl )pyridin
105 1	MeO	1,2- diaminoprqpa n			>10
106	MeO	thiomorfolin			>10 '
107	MeO	' 2- methoxybenz : ylamiil·			>10
108	MeO	4- methylpiperid in			>10
109	MeO	3-pyTrolidinol			>10
110	MeO	4-amÍiio-l- benzylpiperid in-			>10
111	MeO	3-amino-l,2- propanďiol			>10
112	MeO	1(2- aminoethyl)p			>10

CZ 299837 Bó

Sloučenina

R3

Dl

D2

IC50 ug/ml 'yrrolidin

113

MeO

2-amino-2methyl-1p rop ano 1 >10

114

MéO

2(ámionraethy )pyridiri >10

115

MeO

2(methylamio) ethanol >10

116

MeO

3-Ppyridylmethy Jamio)propío ni trií.

>10

117

MeQ

2méthyoxethyl anum

118

MeO

2-amiho-Jfenyl-l ,3propanediol

119

MeO

2pyrrolidinom ethanol

120

MeO

3-fenyl-1 propylamin, >10 >10 >10 >10

121

MeO p-anisiditii >10

122

MeO anilin >1Ó

123

MeO leú d-leu d-val-NH2 >10

MeO leu d-leu val-NH2 >10

Í25

MeO leu d-leu d-ala-NH2 >10

126

MeO leu d-leu a!a-NH2 >10

127

MeO leu d-leu d-phe-NH2 >10 _ υ _

Sloučenina

R3

Dl

D2

IC50 ug/ml

128

MeO leu d-leu phe-NH2 >10

129

MěO d-leu d-arg_rNH2 >10

130

MeO d-leu d-ásp-NH2, >10

131

MeO d-léu drasn-NH2 >10

132

MeO d-leu d-cha-NH2 >10

133

MeO d-leu d-glu-NH2 >10

134

MeO d-leu d-nle-NH2 >10.

135

MeO d-leu d-tyr-NH2 >10

136

MeO d-letf d-trp-NH2 >10

137

MeO d-leu d-gíň-NHZ >10

138

MeO d-leu d-lys-NH2 >10

139

MeO d-leu d-íiva-NH2 >10

140

MeO d-íeu d-phg-NH2 >10

141

MeO d-leu d-ser-NH2 >10

142

MeO d-leu d-thi-NH2 >10

143

MěO d-leu d-tic-NH2 >10

144

MeO

N-(4hydroxyfen

Ylí2naftylamiri, >10

145

MeO

2-aminó-4,6dihydroxy-5méthylpyrimj din.

>10

146

MeO (hydroxymeth yi>2pyrrolidinork.

>10

147

MeO

3hydroxydife >10

Sloučenina

R3

Dl

D2

IC50 ug/ml nylamin..

148

MeO

2-amino^4fenyjfenol >10

149

MeO

2-(4methoxýbenz ylaminó)pýri din.

>10

150

MeO hexamethyíen diaminr >10

151

MeO

4-hvdK>xy-4fenylpipedd.

in

152

MeO

4-iodoanilin

153

MeO

2-methyI-6nitroanilin' ,

154

MeO (rH>5(hydroxymeíh yl)-2pynOlidíhon

155

MeO

2-aminó.-4chloro-ómethylpyrimidin·

156

MeO

2-amino-5chloropyridin ί 57

MeO

3,4dichloro anilin >10 >10 >10 >10 >10' >10 >10

158

MeO

4-.amino-2merkaptopyri midin >10

159 leu d-leu gly-NH2 >10

160

MeO indolin >10

Sloučenin	^a R3	Dl	D2	E IC50 1 ug/ml
161	MeC	fenylpropyl		) >50
162	MeO	p-anisidín		i ^>5°.
163	MeO	piperonýl		I >50
164	MeO	2-pyrroIidin methanol		1 >5,0
165	MeO	2-amino-í- . feny 1-1,3propanediol		1 >50
166	MeO	N-benzyl- ethanolamín;		1 >50
167	MeO	dimethylamid		>50
168	MeO	arnlino		\| :>5Ó
169	MeO	bis-2-, methoxyethyl amin		1 >50
170	MeO	leu	d-lcu	aib-NH2 \| >10
¹⁷¹	MeO	leu	d-íeu-OH		>io
172	MeO	leu	d-íeu-OH		^>10
173	MeO	leu	d-leu	benzyl	0.5
174	MeO	léu	d-leu	morfolin	>10
175	MeO	leu	d-leu	pipeidinyl	>10
176	MeO	leu	d-léu	pyrrolídino	>10
177	MeÓ	;lěu	d-lěu	dibenzyl	1
¹⁷⁸	MeO	ícu	d-leu	hydroxyethyl	>10
179	MeO	^lcu	d-leU	N-methylbenzyl	>10
180	MeO	leu	d-leu	N-methylbenzyl	>10
181	MeÓ	aminomethYl cyklohexana			>10

Sloučenina	R3	Dl	D2	E	IC50 ug/ml
j		roid
I 182	MeO	leu	aminémethylcyklohexanamid	>10
1 183	MeO	leu	aminomethvlcyclo hexananud	gly-NH2	>10
\| 184	MeO	leu	d-leu	fenyl	>10
1 185	MeO	leu	d-leu	fcnethyl	>10
1 186	MeO	leu	d-leu	fenpropyl	>10
1 187	MeO	leu	d-leu	indan	0.5
1 188	MeO	leu	d-leu	aminomethylcyclohe xan.	>10
1 189	MeO	leu	d-leu	arainomethylpyridin	>10
190	MeO	leu	d-leu	adarnantyl	>10
1 191	MeO	leu	d-leu	tetrahydroisochinolin	>10
j 192	MeO	leu	d-lcu	4-pyridýlmethyl	10
1 193	MeO	leu	d-leu	N-benzýlhydroxam ový	0.4.
\| 194	MeO	leu	d-leu	4-raethoxybenzyl	>10
195	MeO	leu	d-leu	4-nitrobenzyl	10
196	MeO	leu	d-leu	2,6-difluorobenzyj	0.08
197	MeO	lěu	d-leu	piperonyl	0.2
198	MeO	d-leu .	benzyl		>10
199	MeO	d-leu	dibenzyl		>10
200	MeO	d-leu	isoamyl		>10

Příklad 3

Sloučeniny připravené podle způsobu příkladu 1 se zkoušely proti několika různým buněčným liniím. Buněčné monovrstvy se kultivovaly v přítomnosti testované sloučeniny po dobu 18 hodin, aby se určila jejich schopnost inhibovat buněčnou proliferaci. Buněčná proliferace byla stanovena kolorimetricky použitím vodné neradioaktivní zkoušky buněčné proliferace Celltiter 96 (Celltiter 96 Aqueous non-radioactive cell proliferation assay (Promega)), kde buněčná proliferace je přímo úměrná absorbancí při 490 nm. Výsledkyjsou udávány jako IC50 v pg/mí na inhibici buněčné proliferace v různých buněčných typech.

_!« CZ 299837 B6

Sloučenina	RAW	MCF-7	OVCAR	CaCo	PancT
173	20	10	8	17	17 f
187 1	10	6	5	8^: 1 7 í
194	I i		3	í ⁸
Í9Ó 1	7		2	8
197	12		2	8

Příklad 4

Sloučeniny připravené podle způsobu příkladu 1 byly testovány na inhibici LPS indukované syntézy TNF. Buňky RAW se předběžně ošetřily různými koncentracemi testované sloučeniny 1 hodinu před podáním polysacharidu (100 ng/ml). Supematanty buněčné kultury se sklidily po 1 hodině a zkoušely se na koncentraci TNF použitím ELISA (Biosource).

Stouceníná	IC₅₀(gg/ml)
1 173	5
187 j	5
194 1 3
196 3
197 3

Příklad 5 ¹⁵

Tento příklad zkoumá schopnost sloučeniny 173 a zejména sloučeniny 187 popsané v tabulkách 1 & 2 shora inhibovat proteasomovou účinnost, jak indikováno, částečně, přítomností IkB a/nebo pl 05 v inhibovaných buňkách. Aby došlo k přemístění NF-κΒ do jader v odpovědi na stimulus jako je lipopolysacharid (LPS) a aktivaci transkripce musí dojít ke dvěma proteolytickým jevům, zejména degradaci ínhibičního proteinu IkB a zpracování pl05 na p50. Proteolytické případy slouží k demaskování nukleárního lokalizačního signálu NF-κΒ.

. io.

Inhibice LPS-indukované degradace IkB

Buňky RAW byly ošetřeny různými koncentracemi testované sloučeniny jednu hodinu před přidáním lipopolysacharidu (100 ng/ml). Veškeré buněčné lysáty byly sklizeny po jedné hodině, pomocí SDS-PAGE bylo odděleno 10 pg proteinu, poté převedeno do nitrocelulózy a zkoumáno na imunoreaktivitu pomocí protilátky IxBa. Westernový skvrny (viz obr. I) byly pozorovány za použití detekční soustavy Boehringer Mannheim Chemíluminescent. Skvrny prokázaly, že I B se nachází v buňkách ošetřených tak malým množstvím jako je 5 pg/ml sloučenin 173 a 187, io Inhibice LPS-indukovaného zpracování pl 50 na p50

Sloučenina 187, jak je popsána v tabulkách 1 & 2 shora se použije k ošetření buněk RAW, jak je popsáno shora a veškeré buněčné lysáty, připravené jako je popsáno shora se analyzují na imunoreaktivitu vůči protilátce anti-P50. Výsledky uvedené na obr. 2 indikují, že p50 a pl50 jsou pří15 tomné v buňkách ošetřených tak malým množstvím, jako je 5 pg/ml sloučeniny 187, zatímco v neošetřených buňkách byla většina pl05 zpracována na p50. inhibice NF-κΒ do frakce buněk indukovaného pomocí LPS

Buňky RAW se ošetří jednu hodinu sloučeninou 187 (20 pg/ml) a potom se inkubují lipopolysacharidem (100 ng/ml) další jednu hodinu. Nukleární frakce se připraví podle standardních procedur. Vazebné reakce na zkoušku změny mobility gelu obsahovaly 5 pg jaderného proteinového extraktu, 50 000 cpm ³²P-značeného NF-κΒ konvenčního vazebného olinukleotidu v přítomnosti nebo nepřítomnosti čtyřicetinásobku neznačeného nukleotidu. Zkouška na změnu mobility gelu uvedená na obrázku 3 ukazuje, že sloučenina 187 je účinná při inhibici akumulace NF-κΒ v jádrech buněk.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Cyklická oxosloučenina obecného vzorce f kde

40 R|, R₂, R₅, R₆. R₇, Rg a R₉ představují atomy vodíku a

R₃ představuje methoxyskupinu,

X představuje skupinu vzorce 45

-D₍-D₂-E

kde

Di a D₂ představují aminokyselinové zbytky a

E představuje aminokyselinový zbytek nebo zbytek obecného vzorce

-N-RR',

10 kde každý ze symbolů R a R' je nezávisle zvolen z vodíku, alkylskupiny s 1 až 10 atomy uhlíku, substituované alkylskupiny s 1 až 10 atomy uhlíku, aryl skupiny a substituované arylskupiny.
2. Cyklická oxosloučenina podle nároku 1, kde substituovanou alkylskupinou s 1 az 10 atomy

15 uhlíku je alkylskupina s 1 až 10 atomy uhlíku substituovaná arylskupinou nebo substituovanou arylskupinou.
3. Cyklická oxosloučenina podle nároku 1 nebo 2, kde významy Di a D₂ jsou zvoleny z L-leucinu a D-leucinu.
4. Cyklická oxosloučenina podle nároku 3, kde Di znamená L-leucin a D₂ znamená D-leucin.
5. Cyklická oxosloučenina podle nároku 4, kde význam E je zvolen z Gly-NH₂, benzylaminu, dtbenzylaminu a 2,6-difluorbenzylaminu.
6. Cyklická oxosloučenina obecného vzorce

Leu-Ď-Le’j-NRiR₃

30 kde Rj znamená atom vodíku a význam R₂ je zvolen z benzylskupiny, hydroxyethyl skupiny, adamantylskupiny, fenylskupiny, fenethylskupiny nebo cyklohexylmethylskupiny; nebo R_t znamená benzylskupinu a R₂ znamená methylskupinu nebo benzylskupinu.
7. Cyklická oxosloučenina podle nároku 6, kde R_t znamená atom vodíku a R₂ znamená benzyl35 skupinu.

. 91 _
8. Cyklická oxosloučenina obecného vzorce kde význam R je zvolen z 1-indanylskupiny, piperonylskupiny, 2,6-difluorbenzylskupiny, benzyl skupiny, 4-methoxybenzylskupiny a 4~nitrobenzylskupiny.
9. Cyklická oxosloučenina podle nároku 8, kde R znamená 2,6-difluorbenzylskupinu.
10. Použití terapeuticky účinného množství cyklické oxosloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení choroby zvolené z poruch buněčné proliferace, poruch imunitního systému a infekčních chorob u savců.

15
11. Použití podle nároku 10, kde savcem je člověk.
12. Použití podle nároku 10 nebo 11, kde terapeuticky účinné množství leží v rozmezí od 0,001 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti savce.

20
13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, kde porucha buněčné proliferace je zvolena z reumatoidní arthritis, lupusu, diabetes typu I, roztroušené sklerosy, rakoviny, restenosy, choroby hostitel-roub a dny.
14. Použití podle nároku 13, kde poruchou buněčné proliferace je restenosa.
15. Použití podle nároku 13, kde poruchou buněčné proliferace je rakovina.
16. Použití podle nároku 13, kde farmaceutická kompozice indukuje apoptosu.

30
17, Použití podle nároku 13, kde poruchou buněčné proliferace je polycystická choroba ledvin.
18. Použití podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, kde chorobou je infekční choroba.
19* Použití podle nároku 18, kde infekční choroba je zvolena z IBD, Crohnovy choroby, AIDS,

35 ARDS a fungálních chorob.
20. Použití podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, kde porucha imunitního systému je zvolena z reumatoidní arthritis, autoimunitních chorob, odmítání transplantátu a psoriasy.

40
21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 11 až 20, kde farmaceutická kompozice je ve formě roztoku.
22. Použití podle kteréhokoliv z nároků 11 až 20, kde farmaceutická kompozice je ve formě tablety.