ES2238044T3 - Modulacion de la estimulacion inmunologica mediada por el oligonucleotido cpg mediante modificacion posicional de nucleosidos. - Google Patents

Modulacion de la estimulacion inmunologica mediada por el oligonucleotido cpg mediante modificacion posicional de nucleosidos.

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Abstract

Procedimiento para la modulación del efecto inmunoestimulador de un compuesto que contiene dinucleótidos CpG mediante la introducción de un fragmento inmunomodulador seleccionado de entre el grupo consistente en nucleósido abásico, enlace 1, 3-propanodiol (sustituido o no sustituido), nitropirrol, nitroindol, desoxiuridina, inosina, isoguanosina, 2-aminopurina, nebularina, 7-deazaguanosina, 4-tiodesoxiuridina, 4-tiotimidina, d-isoguanosina, d-iso-5- metilcitosina, base P y enlace 3¿-3¿ en una posición 5¿ ó 3¿ respecto al dinucleótido CpG.

Description

Modulación de la estimulación inmunológica mediada por el oligonucleótido CpG mediante modificación posicional de nucleósidos.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La invención se refiere a la utilización terapéutica de oligonucleótidos, en el enfoque antisentido y como agentes inmunoestimuladores.
Sumario de la técnica relacionada
Los oligonucleótidos se han convertido en herramientas indispensables en la biología molecular moderna, utilizándose en una amplia variedad de técnicas, desde los procedimientos de exploración diagnóstica a la PCR y la inhibición antisentido de la expresión génica. Esta amplia utilización de los oligonucleótidos ha conducido a una demanda creciente de procedimientos rápidos, económicos y eficientes de síntesis de oligonucleótidos.
La síntesis de oligonucleótidos para aplicaciones antisentido y diagnósticas en la actualidad puede llevarse a cabo rutinariamente. Ver, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, páginas 165-189 (editor S. Agrawal, Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, páginas 87-108 (editor F. Eckstein, 1991); y Uhlmann y Peyman, supra., Agrawal e Iyer, Curr. Op. In Biotech. 6: 12 (1995); y Antisense Research and Applications (editores Crooke y Lebleu, CRC Press, Boca Raton, 1993). Los primeros enfoques de la síntesis incluían químicas fosfodiéster y fosfotriéster. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) dan a conocer la utilización de la química del enlace fosfodiéster para la síntesis de oligonucleótidos. Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978), da a conocer la utilización de la química del enlace fosfotriéster para la síntesis de oligonucleótidos y polinucleótidos. Estos primeros enfoques en gran parte han dejado paso a enfoques más eficientes de la síntesis, tales como los enfoques de la fosforamidita y del H-fosfonato. Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), dan a conocer la utilización de desoxinucleósidos fosforamidita en la síntesis de polinucleótidos. Agrawal y Zamecnik, patente US nº 5.149.798 (1992) dan a conocer la síntesis optimizada de oligonucleótidos mediante el enfoque del H-fosfonato.
Se han utilizado los dos enfoques modernos citados para sintetizar oligonucleótidos que presentan una diversidad de uniones internucleotídicas modificadas. Agrawal y Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987), dan a conocer la síntesis de metilfosfonatos de oligonucleótido mediante la utilización de química de la fosforamidita. Connolly et al., Biochemistry 23: 3443 (1984), dan a conocer la síntesis de oligonucleótidos fosforotioato mediante la utilización de química de la fosforamidita. Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988) dan a conocer la síntesis de oligonucleótidos fosforamidato mediante la utilización de la química de la fosforamidita. Agrawal et al., Proc. Antl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988), dan a conocer la síntesis de oligonucleótidos fosforamidato y fosforotioato mediante la utilización de química del H-fosfonato.
Más recientemente, varios investigadores han demostrado la validez del enfoque antisentido en el tratamiento terapéutico de la enfermedad. Crooke, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii, dan a conocer la autorización positiva de comercialización de un oligonucleótido fosforotioato para el tratamiento de la retinitis inducida por citomegalovirus humano. Desgraciadamente, la utilización de oligonucleótidos fosforotioato se ha convertido en más compleja de lo previsto inicialmente. Determinados efectos provocados por los oligonucleótidos fosforotioato no han podido explicarse mediante el mecanismo antisentido esperado. Por ejemplo, McIntyre et al., Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993) dan a conocer que una cadena "sentido" de oligonucleótido fosforotioato provoca una estimulación inmunológica específica. Éste y otros efectos secundarios han complicado el panorama de los oligonucleótidos fosforo-
tioato.
Por otra parte, la observación de que los oligonucleótidos fosfodiéster y fosforotioato pueden inducir la estimulación inmunológica ha generado interés en el desarrollo de este efecto secundario como herramienta terapéutica. Estos esfuerzos se han centrado en los oligonucleótidos fosforotioato que contienen el dinucleótido CpG. Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992) dan a conocer que los oligonucleótidos fosfodiéster que contienen un palíndromo que incluye un dinucleótido CpG pueden inducir la síntesis de interferón-alfa y gamma y potenciar la actividad citotóxica natural. Krieg et al., Nature 371: 546-549 (1995) dan a conocer que los oligonucleótidos fosforotioato que contienen CpG son inmunoestimuladores. Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996) dan a conocer que tales oligonucleótidos activan las células B humanas. Moldoveanu et al., Vaccine 16: 1216-1224 (1998) dan a conocer que los oligonucleótidos fosforotioato que contienen CpG potencian la respuesta inmunológica contra el virus influenza. McCluskie y Davis, The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998) dan a conocer que los oligonucleótidos que contienen CpG actúan como potentes adyuvantes, potenciando la respuesta inmunológica contra el antígeno de superficie de la hepatitis B. Zhao et al., Bioorganic and Medical Chem. Letters 9: 3453-3458 (1999) demuestran que la sustitución de los desoxinucleósidos en la región flanqueante de los oligodesoxinucleótidos fosforotioato que contienen CpG con 2'-O-metilribonucleósidos resulta en la reducción o en el incremento de la actividad inmunoestimuladora.
Estos informes ponen claramente de manifiesto dejan claro que existe una necesidad de permitir modular la respuesta inmunológica provocada por los oligonucleótidos que contienen CpG. Idealmente, dicha modulación debería incluir la reducción del efecto inmunoestimulador para las aplicaciones antisentido, así como el incremento del efecto inmunoestimulador para las aplicaciones de inmunoterapia.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona procedimientos para modular la respuesta inmunológica provocada por los compuestos que contienen dinucleótidos CpG. Los procedimientos de acuerdo con la invención permiten reducir el efecto inmunoestimulador para las aplicaciones antisentido, así como incrementar el efecto inmunoestimulador para las aplicaciones de inmunoterapia. De esta manera, la invención proporciona adicionalmente compuestos que presentan niveles óptimos de efecto inmunoestimulador para cualquiera de las dos aplicaciones y procedimientos para preparar y utilizar dichos oligonucleótidos.
El presente inventor ha descubierto inesperadamente que la modificación posicional de los oligonucleótidos que contienen CpG afecta radicalmente a sus capacidades inmunoestimuladoras. En particular, las modificaciones 2' ó 3' de azúcares o bases de los oligonucleótidos, o la introducción de un enlace internucleósido modificado particularmente en las posiciones 5' ó 3', incluyendo las modificaciones 5' ó 3' terminales, en el dinucleótido CpG, potencia o reduce el efecto inmunoestimulador de los oligonucleótidos de una manera reproducible y predecible.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para modular el efecto inmunoestimulador de un compuesto que contiene dinucleótido CpG mediante la introducción de un fragmento inmunomodulador en una posición 5' ó 3' respecto al dinucleótido CpG.
En un segundo aspecto, la invención proporciona compuestos que presentan un efecto inmunoestimulador incrementado o reducido, comprendiendo los compuestos un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador, en los que el efecto inmunomodulador incrementado o reducido se compara respecto a un compuesto similar que carece del fragmento inmunomodulador.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que es complementario a un gen en un mamífero y que comprende un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador, para obtener una reducción antisentido-específica en la expresión del gen en el mamífero, que incluye un ser humano, en la que el oligonucleótido presenta un efecto inmunoestimulador menor que un oligonucleótido similar que carezca del fragmento inmunomodulador, en el que dicha composición farmacéutica es para la administración al mamífero.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto que comprende un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador, para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero, incluyendo un ser humano, en el que el compuesto presenta un efecto inmunoestimulador mayor que un compuesto similar que carezca del fragmento inmunomodulador, en el que dicha composición farmacéutica es para la administración al mamífero.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra las realizaciones preferidas de los fragmentos inmunomoduladores de acuerdo con la invención. Nótese que en las figuras, X3X4 es el lado 3' y X1X2 es el lado 5'. Esta utilización es ilustrativa únicamente para esta figura y no debe utilizarse para interpretar las reivindicaciones, que utilizan las designaciones Y y X que se enseñan en la presente memoria.
La figura 2 muestra un compuesto modificado de acuerdo con la invención y los resultados de los ensayos con bazos en los que se utiliza dicho compuesto.
La figura 3 muestra otro compuesto modificado de acuerdo con la invención y los resultados de los ensayos con bazos en los que se utiliza dicho compuesto.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La invención se refiere a la utilización terapéutica de oligonucleótidos, en el enfoque antisentido y como agentes inmunoestimuladores. Las patentes y publicaciones citadas en la presente memoria reflejan el nivel de conocimiento en el campo. En el caso de conflicto entre cualesquiera enseñanzas contenidas en cualquiera de las referencias de la técnica anterior aquí citadas y el contenido de la presente memoria, prevalecerá ésta última, para los propósitos de la invención.
La invención proporciona procedimientos para modular la respuesta inmunológica causada por los compuestos que contienen dinucleótido CpG. Los procedimientos de acuerdo con la invención permiten reducir el efecto inmunoestimulador para las aplicaciones antisentido, así como incrementar el efecto inmunoestimulador para las aplicaciones de inmunoterapia. De esta manera, la invención proporciona adicionalmente oligonucleótidos que presentan niveles óptimos de efecto inmunoestimulador para cualquiera de las dos aplicaciones y un procedimiento para preparar y utilizar dichos oligonucleótidos.
El presente inventor ha descubierto inesperadamente que la modificación posicional de los oligonucleótidos que contienen CpG afecta drásticamente a sus capacidades inmunoestimuladoras. En particular, las modificaciones de los azúcares o bases 2' ó 3' de los oligonucleótidos, o la introducción de un enlace internucleósido modificado, particularmente en las posiciones 5' ó 3' respecto al dinucleótido CpG, incluyendo las modificaciones 5' ó 3' terminales, o las combinaciones de las mismas, incrementa o reduce el efecto inmunoestimulador de los oligonucleótidos de una manera reproducible y predecible.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para modular el efecto inmunoestimulador de un compuesto que contiene dinucleótidos CpG mediante la introducción de un fragmento inmunomodulador en una posición 5' ó 3' respecto al dinucleótido CpG. Los compuestos preferidos de acuerdo con dicho aspecto de la invención generalmente incluyen secuencias oligonucleotídicas adicionales.
En determinadas realizaciones preferidas, el procedimiento se utiliza para preparar un oligonucleótido que es complementario a un gen o a un transcrito génico. En determinadas realizaciones preferidas, el oligonucleótido posee actividad antisentido. En algunas realizaciones preferidas, se introduce únicamente un fragmento inmunomodulador en el oligonucleótido por cada dinucleótido CpG presente en el oligonucleótido. En algunas realizaciones preferidas, únicamente se introduce un fragmento inmunomodulador en el oligonucleótido.
En determinadas realizaciones preferidas, el oligonucleótido preparado de acuerdo con dicho aspecto de la invención no presenta actividad antisentido y/o no es complementario a un gen.
En la presente memoria, el término "complementario" significa que posee la capacidad de hibridarse con una región genómica, con un gen o con un transcrito de ARN del mismo bajo condiciones fisiológicas. Dicha hibridación habitualmente es el resultado de la formación de puentes de hidrógeno que son específicos de bases entre hebras complementarias, preferiblemente formando pares de bases de Watson-Crick o de Hoogsteen, aunque otros modos de puentes de hidrógeno, así como de apilamiento de bases, también pueden conducir a la hibridación. En la práctica, dicha hibridación puede inferirse a partir de la observación de la inhibición de la expresión de genes especí-
ficos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "actividad antisentido" significa que el oligonucleótido, cuando se introduce en una célula o en un animal, provoca una reducción en la expresión del gen del que es complementario.
El procedimiento de acuerdo con dicho aspecto de la invención puede llevarse a cabo convenientemente utilizando cualquiera de las bien conocidas técnicas de síntesis simplemente mediante la utilización de un sintón monómero de fragmento inmunomodulador apropiado en el proceso de síntesis en un ciclo que es posterior, inmediatamente o no, a la incorporación del dinucleótido CpG. Los monómeros preferidos incluyen fosforamiditas, fosfotriésteres y H-fosfonatos.
Para los fines de la invención, "introducir un fragmento inmunomodulador en la posición Y2" significa simplemente sintetizar un oligonucleótido que posee un fragmento inmunomodulador en dicha posición, con referencia a la estructura siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3',
en la que C es citosina, G es guanosina, una guanosina sustituida, incluyendo inosina y 7-deazaguanosina, y cada X e Y son independientemente un nucleósido o un fragmento inmunomodulador, y n es un número comprendido entre -6 y +20 y m es un número comprendido entre -9 y +20.
Los procedimientos de síntesis de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica.
En un segundo aspecto, la invención proporciona compuestos que presentan un efecto inmunoestimulador incrementado o reducido, comprendiendo los compuestos un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador, en los que el efecto inmunomodulador incrementado o reducido es respecto a un compuesto similar que carezca del fragmento inmunomodulador. Los compuestos preferidos de acuerdo con dicho aspecto de la invención generalmente incluyen secuencias oligonucleotídicas. Preferiblemente, tales secuencias oligonucleotídicas presentan entre 6 y 50 nucleótidos, más preferiblemente entre 12 y 35 nucleótidos.
Determinados compuestos preferidos de acuerdo con la invención presentan la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3',
en la que C es citosina, G es guanosina, una guanosina sustituida, incluyendo inosina y 7-deazaguanosina, y cada X e Y son independientemente un nucleósido o un fragmento inmunomodulador, y n es un número comprendido entre -6 y +20 y m es un número comprendido entre -9 y +20.
En las realizaciones particularmente preferidas, la secuencia de bases que se modifica para proporcionar el compuesto es:
5'-CTATCTGACGTTCTCTGT-3'
ó
5'-CCTACTAGCGTTCTCATC-3'
Los fragmentos inmunomoduladores preferidos incluyen uno o más nucleósidos abásicos, enlace 1,3-propanodiol (sustituida o no sustituida) y/o nucleósidos modificados que contienen bases, incluyendo nitropirrol, nitroindol, desoxiuridina, inosina, isoguanosina, 2-aminopurina, nebularina, 7-deazaguanosina, 4-tiodesoxiuridina, 4-tiotimidina, d-isoguanosina, d-iso-5-metilcitosina, base P y enlace 3'-3'. Como regla general, la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición Y6, Y5, Y4 ó Y3, o una combinación de las mismas, incrementa el efecto inmunoestimulador del oligonucleótido. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición Y2 mantiene el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición Y1 mantiene o reduce el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición C elimina el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición G elimina el efecto inmunoestimulador, excepto la 7-deazaguanosina, que mantiene el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición X1 mantiene o reduce el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición X2 presenta poco impacto sobre el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición X3 mantiene o incrementa el efecto inmunoestimulador. Generalmente la introducción de un fragmento inmunomodulador en la posición X4, X5, X6, X7-Xm, o cualquier combinación de las mismas, incrementa el efecto inmunoestimulador.
Determinados oligonucleótidos preferidos de acuerdo con dicho aspecto de la invención son complementarios con un gen o transcrito génico. Más preferiblemente, tales oligonucleótidos presentan actividad antisentido. En algunas realizaciones preferidas, el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador por cada dinucleótido CpG presente en el oligonucleótido. En algunas realizaciones preferidas, el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador. En otras realizaciones preferidas, los compuestos de acuerdo con dicho aspecto de la invención no poseen actividad antisentido y/o no son complementarios con un gen.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido que es complementario a un gen en un mamífero y que comprende un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador, para la obtención de una reducción antisentido-específica en la expresión del gen en el mamífero, que incluye un ser humano, en la que el oligonucleótido presenta menor efecto inmunoestimulador que un oligonucleótido similar que carezca del fragmento inmunomodulador, en el que dicha composición farmacéutica es para la administración al mamífero.
En algunas realizaciones preferidas, el oligonucleótido únicamente presenta un fragmento inmunomodulador por cada dinucleótido CpG presente en el oligonucleótido. En algunas realizaciones preferidas, el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador.
En los procedimientos de acuerdo con dicho aspecto de la invención, preferiblemente, la administración de oligonucleótidos antisentido debe ser parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, intratraqueal o intrarrectal. La administración de las composiciones terapéuticas puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos a dosis y en periodos de tiempo efectivos para reducir los síntomas o los marcadores de sustitución de la enfermedad. Al administrarla sistémicamente, la composición terapéutica se administra preferiblemente a una dosis suficiente para alcanzar un nivel en sangre de oligonucleótido comprendido entre 0,001 micromolar y 10 micromolar. Para la administración localizada, pueden resultar efectivas concentraciones mucho menores que éstas y pueden ser toleradas concentraciones mucho más elevadas. Preferiblemente una dosis total de oligonucleótido estará comprendida entre 0,1 mg de oligonucleótido por paciente y día y 200 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal y día. Puede resultar deseable administrar simultáneamente, o secuencialmente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo como episodio único de tratamiento. En una realización preferida, tras la administración de la composición de materia, se realizaron una o más mediciones de los efectos biológicos, seleccionados de entre el grupo consistente en activación del complemento, mitogénesis e inhibición de la formación de coágulo de trombina.
El procedimiento de acuerdo con dicho aspecto de la invención resulta útil en modelos animales de enfermedad o de expresión génica y resulta adicionalmente útil en el tratamiento terapéutico de enfermedades humanas o animales.
\newpage
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto comprendido por un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador, para la inducción de una respuesta inmunológica en un mamífero, incluyendo un ser humano, en la que el compuesto presenta un efecto inmunoestimulador mayor que un compuesto similar que carezca del fragmento inmunomodulador, en el que dicha composición farmacéutica es para administrar al mamífero.
En los procedimientos de acuerdo con dicho aspecto de la invención, preferiblemente, la administración de compuestos debe ser parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, intratraqueal o intrarrectal. La administración de composiciones terapéuticas puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos a dosis y durante periodos de tiempo efectivos para reducir los síntomas o los marcadores de sustitución de enfermedad. Al administrarla sistémicamente, la composición terapéutica se administra preferiblemente a una dosis suficiente para alcanzar un nivel en sangre de oligonucleótido comprendido entre 0,001 micromolar y 10 micromolar. Para la administración focalizada, pueden resultar efectivas concentraciones mucho más bajas que las anteriormente indicadas, y pueden ser toleradas concentraciones mucho más elevadas. Preferiblemente una dosis total de oligonucleótido estará comprendida entre 0,1 mg de oligonucleótido por paciente y día y 200 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal y día. Puede resultar deseable administrar simultáneamente, o secuencialmente, una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo como episodio único de tratamiento. En una realización preferida, tras administrar la composición de materia, se realizan una o más mediciones de los efectos biológicos, seleccionados de entre el grupo consistente en la activación del complemento, mitogénesis e inhibición de la formación de coágulo de trombina.
En determinadas realizaciones preferidas, los compuestos de acuerdo con la invención se administran en combinación con vacunas, anticuerpos, citotóxicos, oligonucleótidos antisentido, vectores de terapia génica, vacunas ADN y/o adyuvantes con el fin de potenciar la especificidad o magnitud de la respuesta inmunológica. El compuesto o la vacuna, o ambos, opcionalmente pueden encontrarse unidos a una proteína inmunogénica, tal como la hemocianina de lapa, la subunidad B de la toxina del cólera o cualquier otra proteína portadora inmunogénica. Puede utilizarse cualquiera de entre la multitud de adyuvantes, incluyendo, sin limitación, el adyuvante completo de Freund. Para los fines de dicho aspecto "en combinación con" significa durante el curso del tratamiento de la misma enfermedad en el mismo paciente, e incluye administrar el oligonucleótido y/o la vacuna y/o el adyuvante en cualquier orden, incluyendo la administración simultánea, así como espaciando temporalmente hasta en varios días. Dicho tratamiento de combinación también puede incluir más de una sola administración del oligonucleótido y/o independientemente de la vacuna y/o independientemente del adyuvante. La administración del oligonucleótido y/o vacuna y/o adyuvante puede llevarse a cabo a través de la misma ruta o de diferentes rutas.
El procedimiento de acuerdo con dicho aspecto de la invención resulta útil para los estudios de modelos del sistema inmunológico y resulta adicionalmente útil en el tratamiento terapéutico de las enfermedades humanas o animales.
Para los propósitos de todos los aspectos de la invención, el término "oligonucleótido" incluye los polímeros de dos o más desoxirribonucleótidos, o cualquier nucleósido modificado, incluyendo los 2'-halo-nucleósidos, ribonucleósidos 2' ó 3'-sustituidos, ribonucleósidos 2' ó 3'-O-sustituidos, deazanucleósidos o cualquier combinación de los mismos. Tales monómeros pueden estar unidos entre sí mediante cualquiera de entre los numerosos enlaces internucleósido conocidos. En determinadas realizaciones preferidas, estos enlaces internucleósido pueden ser enlaces fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato o fosforamidato, enlaces 2'-5' de cualquiera de los anteriormente indicados, o combinaciones de los mismos. El término oligonucleótido también abarca los polímeros que poseen bases o azúcares químicamente modificados y/o que poseen sustituyentes adicionales, incluyendo sin limitación los grupos lipofílicos, agentes intercalantes, diaminas y adamantano. El término oligonucleótido también abarca PNA, LNA y oligonucleótidos que comprenden esqueletos o secciones de esqueleto formadas por azúcares no pentosa (por ejemplo por hexosas). Para los propósitos de la invención, los términos "2'-O-sustituidos" y "3'-O-sustituidos" significan (respectivamente) sustitución de la posición 2' (ó 3') del grupo de pentosa con un halógeno (preferiblemente Cl, Br o F) o un grupo O-alquilo inferior que contiene 1 a 6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo o alilo con 2 a 6 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede no estar sustituido o estar sustituido por ejemplo con halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o grupos amino; o dicha sustitución 2' puede ser con un grupo hidroxi (produciendo un ribonucleósido), un grupo amino o halo, pero no con un grupo H 2' (ó 3'). Para los propósitos de todos los aspectos de la invención, los términos "CpG" o "dinucleótido CpG" se refieren al dinucleótido 5'-desoxicitidina-desoxiguanidina o al análogo desoxiguanidina 3', en el que p es un enlace internucleótido y en el que el esqueleto de azúcares del dinucleótido puede ser de ribosas, desoxirribosas o ribosas 2'-sustituidas, o de combinaciones de las mismas. En las realizaciones preferidas de los primeros tres aspectos de la invención, p se selecciona de entre fosfodiéster, fosforotioato, alquilfosfonato, fosfotriéster, fosforotioato estereoespecífico (Rp o Sp) o alquilfosfonato y de entre cualquiera de los enlaces covalentes 2'-5' de los anteriormente indicados. Las realizaciones no fosfodiéster, no fosforotioato reducirán adicionalmente los efectos inmunoestimuladores. En las realizaciones preferidas de los tres últimos aspectos de la invención, p se selecciona de entre fosfodiéster, fosforotioato y fosforoditioato.
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar adicionalmente determinadas realizaciones preferidas de la invención y no pretenden limitar el alcance de la misma.
Ejemplo 1 Modulación del efecto inmunoestimulador in vitro
Con el fin de estudiar el impacto del sitio de modificación química de los oligonucleótidos PS que contienen un motivo CpG, se seleccionaron dos oligonucleótidos, oligo 1 y oligo 2, cada uno de los cuales contenía un motivo CpG. Con el fin de evaluar la actividad inmunoestimuladora de los oligonucleótidos en el presente estudio, se utilizó un ensayo de proliferación celular de bazo de ratón.
Se cultivaron linfocitos de bazo de ratón con oligonucleótidos a concentraciones de 0,1, 1 y 10 \mug/ml. Oligo 1 y oligo 2 inducirán un efecto dosis-dependiente sobre la proliferación celular. A 0,1 \mug/ml, el índice de proliferación se incrementará. La sustitución del desoxinucleótido flanqueante 5' (Y1) del motivo CpG de oligo 1 o de oligo 2 con un fragmento inmunomodulador de acuerdo con la invención resultará en la supresión completa de la proliferación celular a todas las concentraciones utilizadas (figura 1). A 0,1 \mug/ml, el índice de proliferación celular será similar al del medio solo. La sustitución del desoxinucleósido 3'-flanqueante (X1) del motivo CpG de oligo 1 o de oligo 2 con 2'-OMe no presentará un gran impacto sobre la proliferación celular, sino que puede reducirla ligeramente. Se llevaron a cabo sustituciones similares en oligo 1 y en oligo 2, en la región 3'-flanqueante del motivo CpG. Se sintetizaron los oligonucleótidos en los que un desoxinucleósido es sustituido con un fragmento inmunomodulador de acuerdo con la invención en la posición X3, X4, X5 o X6. El índice de proliferación de estos oligonucleótidos se incrementará.
Ejemplo 2 Efecto de los fragmentos inmunomoduladores sobre el peso del bazo
Tras observar que las sustituciones anteriormente indicadas modulaban la actividad inmunoestimuladora en ensayos de cultivo celular, se administraron los oligonucleótidos indicados en las figuras 2 y 3 intraperitonealmente en ratones y se pesaron los bazos para confirmar que las sustituciones presentaban efectos similares in vivo. La administración de oligo 1 o de oligo 2 provocará un incremento sustancial en el peso del bazo. La sustitución de un desoxinucleótido apartado del motivo CpG, hacia el extremo 5', en las posiciones Y6, Y5, Y4 ó Y3, provocará el incremento progresivo de los pesos de los bazos, confirmando un incremento en su actividad inmunoestimuladora. Las sustituciones de un desoxinucleósido hacia el extremo 3' del motivo CpG, en general, provocarán un incremento menos significativo de los pesos de los bazos. Se muestran los datos en las figuras 2 y 3.
Ejemplo 3 Síntesis de oligonucleótidos que contienen fragmentos inmunomoduladores
Se sintetizaron oligonucleótidos en una escala de 1 micromolar utilizando un sintetizador automático de ADN (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). Se adquirieron desoxinucleósidos fosforamidita estándares en PerSeptive Biosystems. Se adquirió 1',2'-dideoxirribosa fosforamidita, propil-1-fosforamidita, 2'-desoxi-5-nitroindol-ribofuranosil fosforamidita, desoxiuridina fosforamidita, fosforamidita dP, d-2-aminopurina fosforamidita, d-nebularina fosforamidita y d-7-deazaguanina fosforamidita en Glen Research (Sterling, VA). Se adquirió desoxiinosina fosforamidita en ChemGenes (Ashland, MA). Se utilizaron ciclos normales de apareamiento para todas las fosforamiditas. Se utilizó reactivo de Beaucage como oxidante para obtener la modificación fosforotioato. Tras la síntesis, los oligonucleótidos fueron desprotegidos incubando oligonucleótidos unidos a CPG con solución concentrada de hidróxido amónico durante 1,5 a 2 horas a temperatura ambiente y después incubando el sobrenadante de hidróxido amónico durante 12 horas a 55 grados C. La solución de hidróxido amónico se evaporó a sequedad en un evaporador centrífugo speed-vac y se purificaron oligonucleótidos 5'-DMTr mediante HPLC en una matriz C18 de fase reversa utilizando un sistema de disolventes de acetato amónico 0,1 M y proporción 1:5 de acetato amónico 0,1 M en acetonitrilo. A continuación, los oligonucleótidos se trataron con ácido acético al 80% para eliminar el grupo DMTr, se convirtieron en la forma sódica y se desalaron mediante diálisis frente a agua destilada. Los oligonucleótidos se liofilizaron y se redisolvieron en agua. La caracterización se llevó a cabo mediante PAGE desnaturalizante y espectrometría de masas MALDI-TOF.

Claims (27)

1. Procedimiento para la modulación del efecto inmunoestimulador de un compuesto que contiene dinucleótidos CpG mediante la introducción de un fragmento inmunomodulador seleccionado de entre el grupo consistente en nucleósido abásico, enlace 1,3-propanodiol (sustituido o no sustituido), nitropirrol, nitroindol, desoxiuridina, inosina, isoguanosina, 2-aminopurina, nebularina, 7-deazaguanosina, 4-tiodesoxiuridina, 4-tiotimidina, d-isoguanosina, d-iso-5-metilcitosina, base P y enlace 3'-3' en una posición 5' ó 3' respecto al dinucleótido CpG.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto comprende además secuencias oligonucleotídicas adicionales.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el compuesto presenta la estructura:
5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3',
en la que C es citosina, G es guanosina, una guanosina sustituida, incluyendo inosina y 7-deazaguanosina, y cada X e Y es independientemente un nucleósido o un fragmento inmunomodulador, y n es un número comprendido entre -6 y +20 y m es un número comprendido entre -9 y +20.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la secuencia oligonucleotídica es complementaria a un gen.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la secuencia oligonucleotídica no es complementaria a un gen.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador por cada dinucleótido CpG presente en el oligonucleótido.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador.
8. Compuesto, en el que el compuesto presenta la estructura:
5'-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3',
en el que C es citosina, G es guanosina, una guanosina sustituida, incluyendo inosina y 7-deazaguanosina, y cada X e Y es independientemente un nucleósido o un fragmento inmunomodulador, y n es un número comprendido entre -6 y +20 y m es un número comprendido entre -9 y +20,
que presenta un efecto inmunoestimulador incrementado o reducido, comprendiendo el compuesto un dinucleótido CpG y un fragmento inmunomodulador seleccionado de entre el grupo consistente en nucleósido abásico, enlace 1,3-propanodiol (sustituida o no sustituida), nitropirrol, nitroindol, en el que el efecto inmunomodulador incrementado o reducido se produce respecto a un compuesto similar que carece del fragmento inmunomodulador.
9. Compuesto, en el que el compuesto presenta la estructura:
5-Yn...Y6-Y5-Y4-Y3-Y2-Y1-CG-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9...Xm-3',
en la que C es citosina, G es una guanosina sustituida, incluyendo inosina y 7-deazaguanosina, y cada X e Y es independientemente un nucleósido o un fragmento inmunomodulador, y n es un número comprendido entre -6 y +20 y m es un número comprendido entre -9 y +20, que presenta un efecto inmunoestimulador incrementado o reducido, comprendiendo el compuesto un fragmento inmunomodulador seleccionado de entre el grupo consistente en nucleósido abásico, enlace 1,3-propanodiol (sustituida o no sustituida), nitropirrol, nitroindol, desoxiuridina, inosina, isoguanosina, 2-aminopurina, nebularina, 7-deazaguanosina, 4-tiodesoxiuridina, 4-tiotimidina, d-isoguanosina, d-iso-5-metilcitosina, base P y enlace 3'-3', en el que el efecto inmunomodulador incrementado o reducido se produce respecto a un compuesto similar que carece del fragmento inmunomodulador.
10. Compuesto según la reivindicación 8 ó 9, en el que el compuesto comprende además secuencias oligonucleotídicas adicionales.
11. Compuesto según la reivindicación 10, en el que la secuencia oligonucleotídica es complementaria a un gen.
12. Compuesto según la reivindicación 10, en el que la secuencia oligonucleotídica no es complementaria a un gen.
\newpage
13. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador por cada dinucleótido CpG presente en el oligonucleótido.
14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el oligonucleótido posee únicamente un fragmento inmunomodulador.
15. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para utilización terapéutica.
16. Compuesto según la reivindicación 15, para la obtención de una reducción antisentido-específica en la expresión de un gen.
17. Compuesto según la reivindicación 15, para la inducción de una respuesta inmunológica.
18. Composición farmacéutica que comprende el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14.
19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, que está destinada a ser administrada a un mamífero.
20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que el mamífero es un ser humano.
21. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, que está destinada a ser administrada por vía parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, intratraqueal o intrarrectal.
22. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, que está destinada a administrar dicho compuesto a una dosis suficiente para conseguir un nivel en sangre de dicho compuesto comprendido entre 0,001 micromolar y 10 micromolar.
23. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, que es está destinada a administrar dicho compuesto a una dosis comprendida entre 0,1 mg por paciente y día y 200 mg por kg de peso corporal y día.
24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, que está destinada a ser administrada con un adyuvante.
25. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, que es está destinada a ser administrada en combinación con una vacuna.
26. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, que está destinada a ser administrada para la obtención de una reducción antisentido-específica en la expresión de un gen.
27. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, que está destinada a ser administrada para la inducción de una respuesta inmunológica.
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