ES2235190T3 - Compuestos antibacterianos de nitroimidazol y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN UN METODO, COMPUESTOS Y COMPOSICIONES PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE MICROBIOS PATOGENOS IN VITRO Y PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES BACTERIANAS PATOGENAS, TALES COMO LAS INFECCIONES MICOBACTERIANAS, DE CLOSTRIDIUM, CRYPTOSPORIDIUM Y HELICOBACTER IN VIVO, UTILIZANDO COMPUESTOS BICICLICOS DE NITROIMIDAZOL. LOS METODOS, COMPUESTOS Y COMPOSICIONES SON PARTICULARMENTE UTILES PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, CLOSTRIDIUM DIFFICILE, CRYPTOSPORIDIUM PARVUM, Y HELICOBACTER PYLORI, Y SE PUEDEN UTILIZAR SOLOS O EN COMBINACION CON OTROS COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS.

Description

Compuestos antibacterianos de nitroimidazol y métodos de uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos derivados de nitroimidazol que son útiles para destruir microbios patógenos, a composiciones antimicrobianas que contienen los compuestos y al uso de los compuestos y las composiciones, solos o en combinación con otros agentes antimicrobianos, en el tratamiento de infecciones patógenas, tales como infecciones de micobacterias, Clostridium, Cryptosporidium o Helicobacter.

Antecedentes de la invención

Después de una disminución en las tasas de infección durante varias décadas, se está produciendo un incremento preocupante en la incidencia de la tuberculosis (TB). Debido a que la TB es altamente contagiosa, plantea una profunda amenaza a la salud pública. Las bacterias de la TB son fácilmente traspasadas de persona a persona en gotículas transportadas por aire formadas cuando una persona con TB activa estornuda o tose.

Aún más alarmante ha sido el aumento de la tuberculosis resistente a múltiples fármacos (MDRTB). Antes de 1984, aproximadamente 10% de las bacterias de TB aisladas de pacientes en los Estados Unidos eran resistentes incluso a un solo fármaco antibacteriano. En 1984, 52% de los pacientes estaban infectados con Mycobacterium tuberculosis (también denominados bacilos tuberculosos) resistentes a al menos un fármaco, y 32% eran resistentes a uno o más fármacos. Se han presentado epidemias de MDRTB en 13 estados. El diez por ciento de los casos de MDRTB registrados hasta la fecha se ha producido en personas previamente sanas cuya tasa de mortalidad - de 70 a 90% - ha sido casi la misma que la de personas inmunosuprimidas con MDRTB (Snider y Roper,
1992).

The United States Centers for Disease Control (CDC) ha publicado resultados preliminares de un estudio conjunto con the New York State Health Department que muestra que los casos de TB resistente a fármacos se han más que duplicado desde 1984. Los datos de los CDC del primer cuarto de 1991 muestran que muchas de estas cepas resistentes a fármacos son resistentes a ambos fármacos para TB de primera línea, rifampina e isoniazida. Se han presentado brotes de MDRTB en hospitales de Miami y la ciudad de Nueva York, así como en el sistema penitenciario del Estado de Nueva York. En un hospital de la ciudad de Nueva York, el intervalo medio entre el diagnóstico de MDRTB y la muerte era de solo cuatro semanas. Grupos adicionales de MDRTB fueron presentados a los CDC en 1990 y 1991 procedentes de Mississippi, Missouri y Michigan.

Existen cinco fármacos de primera línea que se sabe que son altamente eficaces contra Mycobacterium tuberculosis y cinco fármacos de segunda línea que pueden usarse cuando se detecta resistencia a uno o más de los fármacos de primera línea. Irónicamente, en los Estados Unidos, hasta Abril de 1992, hubo escasez de fármacos contra la tuberculosis, algunos de los cuales son crucialmente necesarios cuando está presente resistencia a los fármacos de primera línea rifampina e isoniazida. Esta escasez se ha producido debido a que varias compañías farmacéuticos han interrumpido la producción de estos fármacos.

Debido a su persistencia en el cuerpo, el bacilo tuberculoso es un patógeno notablemente difícil de controlar. Aunque la vacuna para el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) protege contra meningitis tuberculosa grave y TB diseminada en niños, su eficacia contra la TB pulmonar en adultos ha variado ampliamente en diferentes partes del mundo. El tratamiento de la TB convencional es eficaz, pero costoso, requiriendo el tratamiento diario con múltiples fármacos durante un mínimo de seis meses. Existe una tendencia común entre los pacientes con TB a interrumpir la toma de sus fármacos cuando los fármacos empiezan a tener su efecto beneficioso o a tomar las medicaciones solo intermitentemente. Cuando esto ocurre, las recaídas son frecuentes y muy a menudo son provocadas por bacilos tuberculosos resistentes a fármacos que han sobrevivido al transcurso inicial del tratamiento. El surgimiento de M. tuberculosis resistente a fármacos es en muchos modos un índice del cumplimiento individual de la quimioterapia contra la tuberculosis y de la incapacidad de la infraestructura de cuidado sanitario para asegurar un tratamiento adecuado. Muchas agencias de salud pública que en otro tiempo pudieron representar papeles clave en este procedimiento han tenido que recortar sus presupuestos drásticamente en los últimos años y de ahí que sean incapaces de realizar este servicio crucial.

La MDRTB es extraordinariamente difícil de tratar y una mayoría de los pacientes no responden a la terapia. Los costes de tratamiento totales para un individuo con MDRTB pueden ser tanto como 10 veces el coste de un tratamiento tradicional; el coste de los fármacos de tratamiento solos puede ser tanto como 21 veces mayor.

El tratamiento preferido para la TB clásica consiste en isoniazida, rifampina y pirazinamida. Para pacientes cuyos bacilos tuberculosos se cree que son resistentes a isoniazida, un cuarto fármaco, el etambutol, se añade comúnmente al régimen hasta que se conocen resultados de la susceptibilidad al fármaco. Los aislados de bacilos tuberculosos resistentes tanto a isoniazida como a rifampina, que representan ahora aproximadamente 20% en algunas ciudades, requieren un tratamiento especializado con medicaciones adicionales, que pueden incluir estreptomicina y ciprofloxacina durante casi dos años.

El bacilo tuberculoso es un organismo que crece lentamente. Se necesitan de tres a seis semanas para desarrollar la bacteria en el laboratorio clínico, y se necesitan de tres a seis semanas adicionales para rastrear con respecto a la resistencia a antibióticos. Tales procedimientos de laboratorio prolongados pueden dar como resultado un retraso en el diagnóstico, lo que significa que los pacientes con TB resistente a los fármacos no reconocida pueden tratarse ineficazmente y permanecer infectados durante un período más prolongado. En individuos positivos a HIV, la MDRTB habitualmente provoca la muerte en de 4 a 16 semanas después de ser diagnosticada, lo que es a menudo antes de que puedan completarse las pruebas de laboratorio sobre la susceptibilidad y la resistencia a los fármacos.

No existe una evidencia de que las velocidades de mutación en organismos de M. tuberculosis se hayan incrementado o que una virulencia creciente sea la responsable de las epidemias mortales recientes de TB. Es probable que las formas resistentes a los fármacos de tuberculosis surjan debido a la falta de cumplimiento del paciente del régimen de antibióticos de 6 a 12 meses requerido para tratar la TB. Los regímenes de tratamiento ineficaces también representan un papel en la incidencia creciente de TB. Para tratar la falta de cumplimiento, algunos estados con altas tasas de TB están considerando sistemas de protección, tales como expandir la terapia directamente observada (DOT); otros pueden restablecer instalaciones hospitalarias similares a los sanatorios para TB de la primera mitad de este siglo. También se han actualizado regímenes de tratamiento estándar para la TB. En lugar de tomar dos o tres antibióticos, los pacientes con TB toman ahora cuatro. Además, según se apunta previamente, la escasez actual de fármacos contra la tuberculosis en los Estados Unidos ha hecho difícil incluso el tratamiento estándar.

Una serie de derivados de nitroimidazo[2,1-b]oxazol fue descrita en Sehgal, K. y otros, "Novel Nitroimidazo[2,1-b]oxazole Formation from Reaction of 2,4(5)-Dinitroimidazole with Oxiranes (1)", J. Heterocyclic Chem. 16:1499-1500 (1979). Los compuestos de este tipo tienen la siguiente fórmula general (I):

1

Estos compuestos se describieron como agentes radiosensibilizadores potenciales para usar en la radioterapia del cáncer (Agrawal, K. y otros, "Potential Radiosensitizing Agents. Dinitroimidazoles", J. Med. Chem. 22(5):583-586 (1979); Sehgal, R. y otros, "Potential Radiosensitizing Agents. 2. Synthesis and Biological Activity of Derivatives of Dinitroimidazole with Oxiranes", J. Med. Chem. 24:601-604 (1981). Más recientemente, se presentó que ciertos compuestos de nitroimidazol exhiben propiedades antimicrobianas, incluyendo actividad antituberculosa (véanse, por ejemplo, Nagarajan, K. y otros, "Nitroimidazoles XXI. 2,3-dihydro-6-nitroimidazo[2.1-b]oxazoles with antitubercular activity", Eur. J. Med. Chem. 24:631-633 (1989) y actividad antibacteriana (véanse, por ejemplo, EP-A-632 040, que describe derivados de imidazol como agentes antiulcerosos, y GB-B-826 838, que describe derivados arilsulfanílicos de guanidinas bicíclicas como agentes bacteriostáticos). Además, se ha mostrado recientemente que el compuesto de fórmula (I) en el que R es etilo (2-etil-5-nitro-2,3-dihidro[2,1-b]imidazooxazol, también conocido como CGI 17341 de Ceiby-Geigy) exhibe actividad contra Mycobacterium tuberculosis (Ashtekar, D. y otros, In Vitro and In Vivo Activities of the Nitroimidazole CGI 17341 against Mycobacterium tuberculosis'', Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(2):183-186 (1993). Además, compuestos de nitroimidazol, incluyendo derivados bicíclicos, se describen en Nagarajan y otros (Indian J. Chem. 23B (1984) p 342-362), donde se prueban con respecto a la actividad contra E. histolytica; y en US 4.918.074 (Tsuda y otros), que describe una variedad de compuestos poliazoheterocíclicos para usar como agonistas y/o antagonistas del calcio.

La colitis pseudomembranosa (PMC) es una enfermedad intestinal grave marcada por una inflamación colónica intensa, diarrea, calambres abdominales y placas o pseudomembranas mucosales. La PMC está provocada por la superproducción de Clostridium difficile en el intestino. C. difficile es un anaerobio formador de esporas y es el principal patógeno nocosomial de la PMC. El sobrecrecimiento de C. difficile se produce cuando la flora bacteriana del tracto GI se ha modificado debido a un uso intensivo de antibióticos de amplio espectro. Dos toxinas, A y B, son producidas por C. difficile. Las toxinas atacan a las membranas o los microfilamentos de las células del colon produciendo inflamación y necrosis. La toxina A provoca hemorragia intestinal y secreción de fluidos mientras que la toxina B es citotóxica.

La PMC como una subclase de enfermedad diarreica se ha convertido en una complicación frecuente del uso de antibióticos. La PMC aparece normalmente 5-10 días después del comienzo de la terapia con antibióticos. Una diarrea acuosa es el síntoma más común, produciéndose 90-95% de todos los casos de PMC (Aronsson, B. y otros, J. Infect. Dis. 151:476-481 (1985)). Casos graves de PMC pueden provocar fiebre alta, leucocitosis, deshidratación, desequilibrio electrolítico y muerte (vénase Clostridium difficile: Its role in Intestinal Disease. R.D. Rolfe y S.M. Finegold, Ed., Academic Press Inc., Nueva York (1988) y R. Fekety, "Antibiotic-Associated Colitis. Mediguide to Infectious Disease" Vol. 4, pp. 1-7 (1984)).

Los pacientes con alto riesgo incluyen la tercera edad, pacientes con cáncer debilitados y pacientes que sufren cirugía abdominal. C. difficile no tratada produce 10-20% de mortalidad en la tercera edad en pacientes debilitados crónicamente (Dosik, G.M. y otros, Am. J. Med. 67:646-656 (1979)). La incidencia mundial de la PMC es desconocida debido a la falta de estudios apropiados. Sin embargo, en los países industrializados, C. difficile se está convirtiendo rápidamente en el patógeno bacteriano entérico más común después de Campylobacter y Salmonella (Bartlett, J., véase Clostridium difficile: Its role in Intestinal Disease. R.D. Rolfe y S.M. Finegold, Ed., Academic Press Inc., Nueva York, pp. 1-13 (1988)).

Los antibióticos más frecuentemente usados para tratar la PMC incluyen vancomicina, metronidazol y bacitracina. La vancomicina es un tratamiento muy costoso, 100-400 dólares durante el transcurso de diez días. Se ha observado un grado de recaída después de la terapia con vancomicina en animales experimentales (Swannson, B. y otros, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 35:1108-1111 (1991) y Bartlett, J.G. y otros, Clin. Infect. Dis.(S4) S265-72 (1994)). Debido al incremento de bacterias resistentes a vancomicina, el uso de vancomicina para infecciones por C. difficile puede estar en decadencia. El metronidazol es menos eficaz que la vancomicina, sin embargo, también es menos costoso. El metronidazol es absorbido oralmente y puede exponer a los pacientes a efectos secundarios potenciales que están asociados con el fármaco (PHYSICIANS DESK REFERENCE, 48ª EDICCION, 1994, pp. 1704-1706). El metronidazol tiene un grado de recaída similar a la vancomicina. La bacitracina es un polipéptido antibiótico y está disponible comercialmente como una mezcla de nueve péptidos. También es costosa y no está disponible una forma de dosificación oral conveniente

Los organismos del género Cryptosporidium son pequeños parásitos coccidios intracelulares obligados que infectan el revestimiento epitelial microvelloso del tracto digestivo y raramente el tracto respiratorio. Cryptosporidium parvum, que es el miembro más común del género, es el agente causal de la criptosporidiosis. Estos organismos son del mismo orden que Plasmodium (el parásito de la malaria), pero el ciclo vital de desarrollo, la capacidad de transmisión y las enfermedades son muy diferentes. Aunque reconocido e identificado como un parásito desde hace mucho tiempo, los primeros casos de criptosporidiosis humana se apreciaron en 1976. Cryptosporidium también es capaz de infectar diversos tipos de animales de granja y domésticos. Este parásito es reconocido en todo el mundo como un agente causal de la diarrea. Se cree que la fuente de infecciones humanas es a través de transmisión zoónica (principalmente terneros, pero también otros animales tales como roedores, cachorros de perro y cachorros de gato) y a través de contacto de persona a persona. Sin embargo, este modo de transmisión solo no explica la transmisión ampliamente extendida y los estudios epimediológicos han mostrado que Cryptosporidium parvum es un patógeno transmitido por el agua. En la primavera de 1993, se produjo una epidemia masiva de criptosporidiosis en el área metropolitana de Milwaukee que afectó a 400.000 personas estimadas (la epidemia simple más grande documentada de una enfermedad infecciosa en Norteamérica). Esta epidemia se relacionó con el suministro de agua de la ciudad.

Las indicaciones clínicas más comunes de infecciones por Cryptosporidium son diarrea acuosa frecuente y fiebre en grado bajo. Otros síntomas incluyen: calambres, náuseas, vómitos y pérdida de peso. Tanto la duración de los síntomas como la gravedad de la enfermedad y el desenlace varían de acuerdo con la edad y el estado inmunitario del paciente.

En personas inmunocompetentes, la infección provoca diarrea acuosa de una duración media de diez días (intervalo 1-20) con grados variables de presencia de otros síntomas. La infección se considera autolimitativa, pero, en niños y bebés, se ha asociado con la provocación de malnutrición, morbidez intensa y extensión para provocar grandes epidemias.

En personas inmunocomprometidas, la duración, la gravedad y el desenlace de la enfermedad dependen de la gravedad y la causa de la deficiencia inmunitaria. Por ejemplo, en ciertos pacientes con SIDA, las infecciones con Cryptosporidium provocan enfermedad diarreica prolongada grave con malnutrición y deshidratación y pueden ser un factor principal que conduce a la muerte debido a la pérdida excesiva de agua. También puede producirse la implicación de ramificaciones biliares y respiratorias y complica más la enfermedad. Para otros pacientes (por ejemplo, personas sometidas a terapia con esteroides), la infección puede depurarse con la terminación del agente inmunosupresor.

La infección comienza con que el organismo que coloniza el íleon y el yeyuno provoca una digestión deteriorada y una malabsorción debido al daño en las vellosidades inducido por los parásitos. La diarrea secretora (similar al cólera) sugiere un vertido mediado por toxinas de fluidos en el intestino, pero sin embargo hasta ahora no se han documentado toxinas. La Cryptosporidium se asocia con enfermedad diarreica en todas las áreas del mundo. Se estima que la presencia global de Cryptosporidium en individuos con diarrea es 2-2,5% para personas que viven en países industrializados y 7-8,5% para personas que viven en países en desarrollo. El grado de presencia global presentado en diversos estudios en Norteamérica ha variado entre 0,6%-4,3% (2% en pacientes con SIDA).

Actualmente no hay una terapia eficaz estándar para la criptosporidiosis. Como una enfermedad diarreica, la terapia para la criptosporidiosis se basa en aliviar los síntomas así como una terapia específica con fármacos anticriptosporidiales y globulina hiperinmune. El tratamiento actual en pacientes normales es sintomático. La substitución de fluidos y electrolitos es de principal importancia en el tratamiento. Agentes antidiarreicos no específicos tales como kaopectate, loperamida (Immodium), fenoxilato (Lomotil) y Pepto-Bismol no son consistentemente eficaces. Hasta la fecha, el tratamiento específico de personas inmunodeficientes con Cryptosporidium tampoco ha sido satisfactorio. Se ha evaluado un número de fármacos usando modelos y ninguno ha mostrado un buen porvenir para eliminar la infección. La inmunoterapia usando extractos de leucocitos dializables bovinos y la inmunidad láctea pasiva usando anticuerpos en calostro bovino hiperinmune han mostrado resultados diferentes.

Se han probado varias modalidades de tratamiento en casos individuales o en estudios controlados a escala limitada, y han mostrado diversos grados de éxito. Ejemplos incluyen: furoato de diloxamida y furazolidona (agentes que dañan el DNA, análogo de nitrofurano fármaco anti-Giardia), quinina más clindamicina, espiramicina (un macrólido) oral, alfa-difluorometilornitina (activa contra otros parásitos y P. carinii) e interleuquina-2.

Según se apunta previamente, el tratamiento eficaz de infecciones por Cryptosporidium no existe. Generalmente, esto no ha sido un problema importante en personas sanas debido a que la diarrea habitualmente dura menos de 20 días y los síntomas clínicos habitualmente se resuelven espontáneamente. Sin embargo, el reciente resurgimiento de grandes epidemias ha demostrado una asociación entre esta infección y la malnutrición y puede justificarse una terapia. Si estuviera disponible una terapia segura y eficaz, la mayoría de los médicos tenderían a tratar la infección, independientemente del estado inmunitario del paciente (esto se realizaría para evitar la progresión hasta una enfermedad más grave y para bloquear la transmisión a otros huéspedes susceptibles). Puesto que la mayoría de los pacientes inmunocomprometidos a menudo desarrolla una infección prolongada que amenaza la vida, se necesita una terapia eficaz para esta población de pacientes particular.

Helicobacter pylori provoca gastritis crónica en seres humanos y se le ha implicado como un factor patológico en úlceras gástricas y duodenales, carcinoma gástrico y dispepsia no ulcerosa. Estas son enfermedades importantes debido a su frecuencia, su impacto sobre la morbidez y la mortalidad y debido a su coste para el sistema sanitario. Enfermedades asociadas con infección por H. pylori son principalmente estados crónicos con causas multifactoriales, aunque los productos que erradican satisfactoriamente la infección por H. pylori deben reducir mucho la incidencia y la frecuencia de estas enfermedades.

Las ventas en todo el mundo de fármacos antiulcerosos superan 6,5 billones de dólares. Las enfermedades asociadas con H. pylori generan enormes cantidades de beneficios para las firmas farmacéuticas. El mercado para los fármacos para el GI está actualmente dominado por antagonistas del receptor de histamina H2. Por consiguiente, existe una necesidad médica de nuevos agentes anti-H. pylori. El principal avance entre las firmas farmacéuticas ha sido evaluar los productos existentes. Solo se están desarrollando dos nuevos antibióticos: biaxina de Abbott, que ha sido recientemente aprobada para el tratamiento de infecciones por H. pylori, y azitromicina, un macrólido relacionado de Pfizer, que ha mostrado porvenir.

Desde una perspectiva económica, los antibióticos representan el tratamiento de elección para la terapia de las úlceras duodenales. En comparación con otras opciones (terapia intermitente o de mantenimiento con antagonistas de H2, vagatomía altamente selectiva), los antibióticos son relativamente económicos y proporcionan el menor tiempo empleado con una úlcera activa.

El principal obstáculo para la erradicación satisfactoria de H. pylori es obtener un acceso al organismo. H. pylori es relativamente fácil de destruir in vitro. Es sensible a ácidos, bismuto y muchos antibióticos, pero ninguno de estos son eficaces cuando se usan para monoterapia in vivo. Los grados de erradicación con monoterapias raramente han superado 10%. El tratamiento satisfactorio de H. pylori requiere una comprensión de la fisiología de los sitios gastrointestinales donde reside la infección y la naturaleza farmacocinética de los agentes usados. Las bacterias residen bajo y dentro del moco gástrico, en glándulas gástricas y espacios intracelulares y en la mucosa duodenal. Estos sitios diversos significan que el aporte eficaz de agentes antimicrobianos ya sea local o sistémico es difícil de alcanzar. Se ha mostrado que los niveles de amoxicilina, bismuto e imipenem/cilastatina en la mucosa gástrica humana después de la administración oral superan la MIC in vitro para el organismo, aunque ninguno de estos agentes ha demostrado eficacia in vivo. Las razones para esto incluyen el fracaso de los fármacos para penetrar en todos los sitios de colonización por H. pylori y la incapacidad para mantener niveles bactericidas adecuados en la mucosa. El fracaso de fármacos como la clindamicina, la eritromicina y las quinolonas puede deberse al efecto del pH intragástrico. Además, el desarrollo de resistencia se produce rápidamente en H. pylori y se ha documentado para fluoroquinolonas, nitroimidazoles y macrólidos.

Sin embargo, continúa existiendo una necesidad en la técnica de agentes mejorados que exhiban actividad antimicrobiana contra las micobacterias patógenas, Clostridium, Cryptosporidium y Helicobacter, y más particularmente de agentes y sus derivados que puedan ser altamente útiles en el tratamiento de la MDRTB.

Sumario de la invención

Se ha descubierto ahora sorprendentemente que las micobacterias patógenas y otros microbios patógenos, tales como Clostridium, Cryptosporidium y Helicobacter, pueden controlarse in vitro o in vivo mediante ciertos derivados de nitroimidazol. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (IIIa) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un ser humano o un animal que sufre una infección por micobacterias patógenas:

2

en donde R_{1} es hidrógeno,

Y es CH_{2},

Z se selecciona de CH_{2}, CO, CHR_{4} o NR_{4}, donde R_{4} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, alcoxiarilo, alcoxialcoxiarilo, alquilheterociclo, alcoxiheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, alquilarilarilo, arilalquilarilo, -NHCOR_{5}, -OCONHR_{5}, -NHCONHR_{5}, OCO_{2}R_{5}, -NHSO_{2}R_{5}, -NHSO_{2}NHR_{5}, -NHC=NHR_{5} y NHR_{5}, donde R_{5} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, alcoxialquilarilo, alquilarilarilo, alcoxiarilo, alquilheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, arilalquilarilo y alcoxiheterociclo;

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Compuestos actualmente particularmente preferidos y nuevos de la invención son proporcionados por los compuestos de fórmula (IIIa):

3

en la que R_{1}, Y y Z son como se definen previamente.

En una modalidad actualmente preferida para el tratamiento de la tuberculosis, los métodos y los compuestos de la invención pueden emplearse solos o en combinación con otros agentes anti-Mycobacterium tuberculosis, tales como isoniazida, rifampina, pirazinamida, rifabutina, estreptomicina y ciprofoxacina, para proporcionar nuevos agentes para el tratamiento de la tuberculosis, incluyendo MDRTB.

Breve descripción de los dibujos

Los aspectos precedentes y muchas de las ventajas concomitantes de esta invención serán más fácilmente apreciados a medida que los mismos sean mejor entendidos mediante la referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se tome junto con los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 es una representación esquemática de rutas de síntesis alternativas de compuestos de la invención;

la figura 2 es una representación esquemática de rutas de síntesis adicionales de compuestos de la invención;

la figura 3 es una representación esquemática de una ruta de síntesis alternativa de compuestos de la invención; y

las figuras 4 y 5 son representaciones esquemáticas de rutas de síntesis alternativas de compuestos de la invención.

Descripción detallada de la modalidad preferida

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan métodos para el control de micobacterias patógenas, in vitro o in vivo. Así, en un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (IIIa) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un ser humano o un animal que sufre infección por micobacterias patógenas: en donde R_{1} es hidrógeno,

Y es CH_{2} y

Z se selecciona de CH_{2}, CO, CHR_{4} o NR_{4}, donde R_{4} es como se define previamente;

en donde R_{5} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilarilo, alquilarilarilo, alcoxialquilo, alcoxiarilo, alquilheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, alquilarilarilo y alcoxiheterociclo;

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula (IIIa) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un ser humano o un animal que sufre una infección por micobacterias patógenas, Clostridium, Cryptosporidium o Helicobacter.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula (IIIa) para tratar a sujetos humanos o animales que sufren una enfermedad microbiana patógena, por ejemplo tuberculosis, ya sea de origen de cepas sensibles o de cepas resistentes a múltiples fármacos (MDRTB).

En otro aspecto, la presente invención proporciona nuevos compuestos de nitroimidazol antimicrobianos de la fórmula (IIIa) en la que R_{1} es hidrógeno,

Y es CH_{2},

Z se selecciona de CH_{2}, CO, CHR_{4} o NR_{4}, donde R_{4} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, alcoxiarilo, alcoxialcoxiarilo, alquilheterociclo, alcoxiheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, alquilarilarilo, arilalquilarilo, -NHCOR_{5}, -OCONHR_{5}, -NHCONHR_{5}, OCO_{2}R_{5}, -NHSO_{2}R_{5}, -NHSO_{2}NHR_{5}, -NHC=NHR_{5} y NHR_{5}, donde R_{5} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, alcoxialquilarilo, alquilarilarilo, alcoxiarilo, alquilheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, arilalquilarilo y alcoxiheterociclo;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Según se usan previamente y en cualquier parte aquí, los siguientes términos tienen sus significados definidos más adelante:

El término "microbios patógenos" se refiere a organismos microbianos que no residen normalmente en un huésped humano o animal, y que son capaces de provocar un estado de enfermedad en el huésped. Ejemplos representativos de microbios patógenos incluyen, por ejemplo, Mycobacteria tuberculosis, Mycobacteria leprae, Mycobacteria avium y similares, incluyendo cepas de M. tuberculosis resistentes a múltiples fármacos, Clostridium difficile, Cryptosporidium parvum y Helicobacter pylori.

El término "acilamino" significa un radical acilo (CO-) al que está ligado un grupo amino.

El término "alquilo inferior", según se usa aquí, se refiere a grupos alquilo de cadena ramificada o lineal que comprenden de uno a diez átomos de carbono que no están substituidos o están substituidos, por ejemplo con uno o más grupos halógeno, incluyendo, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, neopentilo, trifluorometilo, pentafluoroetilo.

El término "alcoxi", según se usa aquí, se refiere a RO- en donde R es alquilo inferior según se define previamente. Ejemplos representativos de grupos alcoxi inferior incluyen metoxi, etoxi, t-butoxi, trifluorometoxi.

El término "arilo", según se usa aquí, se refiere a un fenilo o a un sistema anular carbocíclico bicíclico de 9 ó 10 átomos de carbono que tiene uno o más anillos aromáticos, incluyendo naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo. Los grupos arilo pueden no estar substituidos o estar substituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco substituyentes seleccionados independientemente de alquilo inferior, haloalquilo, alcoxi, arilo, alcoxiarilo y halo.

El término "alquilarilo" según se usa aquí, se refiere a un radical alquilo inferior al que está ligado un grupo arilo. Grupos arilalquilo representativos incluyen bencilo, feniletilo, hidroxibencilo, clorobencilo, fluorofeniletilo.

El término "arilalquilarilo", según se usa aquí, se refiere a un grupo alquilarilo como el definido previamente ligado a un grupo arilo. Grupos alquilarilarilo representativos incluyen 4-bencilfenilo, 3-bencilfenilo, 4-fenetilfenilo.

El término "arilarilo", según se usa aquí, se refiere a un grupo arilo como el definido previamente que está ligado a un grupo arilo. Grupos arilarilo representativos incluyen bifenilo, 4-(1-naftil)fenilo, 4-(2-naftil)fenilo.

El término "ariloxi", según se usa aquí, se refiere a RO-, en donde R es un grupo arilo. Un grupo arilalcoxi representativo incluye feniloxi, naftiloxi.

El término "alcoxiarilo", según se usa aquí, se refiere a un radical alcoxi inferior al que está ligado un grupo arilo. Un grupo arilalcoxi representativo incluye benciloxi, feniletoxi.

El término "cicloalquilo", según se usa aquí, se refiere a un grupo alicíclico que comprende de 3 a 7 átomos de carbono, incluyendo, pero no limitado a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo.

El término "alquilcicloalquilo", según se usa aquí, se refiere a un radical alquilo inferior al que está ligado un grupo cicloalquilo. Ejemplos representativos de alquilcicloalquilo incluyen ciclopropilmetilo, ciclohexilmetilo, 2-(ciclopropil)etilo.

El término "halógeno" o "halo", según se usa aquí, se refiere a yodo, bromo, cloro o fluoro.

El término "haloalquilo", según se usa aquí, se refiere a un radical alquilo inferior, según se define previamente, que tiene al menos un substituyente halógeno, por ejemplo, clorometilo, fluoroetilo o trifluorometilo.

El término "heterociclo substituido" o "grupo heterocíclico" o "heterociclo", según se usa aquí, se refiere a cualquier anillo de 3 o 4 miembros que contiene un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno y azufre o un anillo de 5 ó 6 miembros que contiene de uno a tres heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno o azufre; en donde el anillo de 5 miembros tiene 0-2 dobles enlaces y el anillo de 6 miembros tiene 0-3 dobles enlaces; en donde el átomo de nitrógeno y azufre puede estar opcionalmente oxidado; en donde los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente cuaternizados, e incluyendo cualquier grupo bicíclico en el que cualquiera de los anillos heterocíclicos previos esté condensado a un anillo bencénico u otro anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros definido de forma independiente anteriormente. Se prefieren heterociclos en los que el nitrógeno es el heteroátomo. También se prefieren heterociclos completamente saturados. Heterociclos preferidos incluyen: diazapinilo, pirilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazoílo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piridilo, piperidinilo, pirazinilo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, azetidinilo, N-metilazetidinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, indolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, furilo, tienilo, triazolilo y benzotienilo.

Los heterociclos pueden no estar substituidos o estar substituidos con uno, dos o tres substituyentes seleccionados independientemente de amino, alquilamino, halógeno, alquilacilamino, alquilo inferior, arilo, alcoxi.

Los heterociclos más preferidos incluyen imidazolilo, piridilo, piperazinilo, azetidinilo, tiazolilo,triazolilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo y los siguientes:

4

Los compuestos de la invención comprenden átomos de carbono asimétricamente substituidos. Tales átomos de carbono asimétricamente substituidos pueden dar como resultado los compuestos de la invención que comprenden mezclas de estereoisómeros en un átomo de carbono asimétricamente substituido particular o un estereoisómero simple. Como resultado, se incluyen en la presente invención mezclas racémicas, mezclas de diastereoisómeros, así como diastereoisómeros simples de los compuestos de la invención. Los términos configuración "S" y "R", según se usan aquí, son como se definen por las IUPAC 1974 RECOMMENDATIONS FOR SECTION E, FUNDAMENTAL STEREOCHEMISTRY, Pure Appl. Chem. 45:13-30 (1976). Los términos \alpha y \beta se emplean para posiciones de anillo de compuestos cíclicos. El lado \alpha del plano de referencia es el lado sobre el que está el substituyente preferido en la posición de número inferior. A los substituyentes que están en el lado opuesto del plano de referencia se les asigna el descriptor \beta. Debe apuntarse que esta utilización difiere de aquella para estereogeneradores cíclicos, en los que "\alpha" significa "debajo del plano" e indica la configuración absoluta. Los términos configuración \alpha y \beta, según se usan aquí, son como se definen por CHEMICAL ABSTRACTS INDEX GUIDE-APPENDIX IV (1987) párrafo 203.

Los compuestos actualmente preferidos de la invención incluyen compuestos de la fórmula (IVb):

5

en la que R_{1} y R_{4} son como se definen previamente; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Compuestos representativos de este grupo incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, 4-trifluorometoxibencilcarbamato de 3S-3-hidroxi-7-nitro-3,4-dihidro[2,1b]imidazopirano, 4-(trifluorometil)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro[2,1b]imidazopirano (PA Nº 1327, Ejemplo 27), 3S-4-(trifluorometil)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro[2,1b]imidazopirano (PA Nº 636, Ejemplo 29), 3S-4-(trifluorometoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2,1b]imidazopirano (PA Nº 824, Ejemplo 33), 4-bromobencilcarbamato de 3S-3-hidroxi-7-nitro-3,4-dihidro-[2,1b]imidazopirano y 4-clorofenilurea de 3S-3-amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2,1b]imidazopirano (PA Nº 1282, Ejemplo 38), y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

La presente invención también se refiere a los procedimientos para preparar los compuestos de la invención y a los productos intermedios sintéticos útiles en tales procedimientos, según se describe con detalle más adelante.

En un aspecto adicional más de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la presente invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. En general, los compuestos de la invención pueden prepararse mediante los procedimientos ilustrados en los Esquemas I (figuras 1 y 2), II (figura 3), III (figura 4) y IV (figura 5). De acuerdo con el Esquema de reacción I, se preparan compuestos de nitroimidazol funcionalizados 4, 7, 10, 13, 16, 18 y 20 mediante tres métodos. El primer método implica la alquilación de 2,4-dinitroimidazol (1b, R_{1}=H, Ind. J. of Chem. 21B:1022-1026 (1982)) o 2-cloro-4-nitroimidazol (1a) con los epóxidos 2 y 11 usando un procedimiento modificado de Agrawal y otros,(J. Med. Chem. 24:601-604 (1981)) en el que los compuestos 1a o 1b y los epóxidos 2 u 11 se calientan hasta 70ºC como una solución pura y se mantienen a 70ºC durante varias horas. Los productos de hidroxidinitroimidazol o cloronitroimidazol 3 (Z=CR_{2}OH) y 12 (X=OH) se aíslan como sólidos en bruto lavando la mezcla de reacción con éter dietílico y bicarbonato sódico acuoso. El hidroxiimidazol 3 (Z_{1}=CR_{2}OH) se protege como un derivado de éter seleccionado de, pero no limitado a, 2-tetrahidropiranilo (THP), trimetilsililo (TMS), t-butildimetilsililo (TBDMS), acetilo (Ac), bencilo (Bn) y 2,4-dimetoxibencilo. El segundo método implica la alquilación de 2-cloro-4-nitroimidazol 1a o 2,4-dinitroimidazol 1b con un haluro de alquilo 5 ó 14 o alcohol 5 (W=OH) para producir compuestos de dinitroimidazol o cloronitroimidazol substituidos 6, 15, 17 ó 19. El tercer método utilizado para la preparación de compuestos de 1-alquil-2,4-dinitroimidazol implica la reacción de 1 con olefinas pobres en electrones tales como 8 (Z=CCN, CCO_{2}Et, CSO_{2}R) para dar los imidazoles 9. La retirada del grupo protector R_{3} de los compuestos 3, 6 y 9 proporciona un alcohol (X=OH), una amina o amida (X=NR) o un mercaptano (X=SH). Cuando X es un metileno o metino, puede estar presente el grupo R_{3}. Los compuestos de nitroimidazol bicíclicos 4, 7, 10, 13, 16, 18 y 20 se obtienen mediante la reacción de 3, 6, 9, 12, 15, 17 y 19 (X=OH, NHR, SH, CHR, X=OCONHR, Y=CO o CR_{1}R_{2}) con bases tales como hidruro sódico, t-butóxido potásico, fluoruro de cesio, fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) y similares, en un disolvente orgánico inerte y seco tal como dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF) o dimetoxietano (DME).

La preparación de derivados de nitroimidazol bicíclicos se muestra en la figura 3. La desprotección de 4 (por ejemplo R=THP) con ácido acético en THF acuoso a temperatura ambiente hasta temperatura de reflujo durante varias horas da el alcohol 4 (R_{3}=H) que puede hacerse reaccionar con una variedad de reactivos acilantes y alquilantes para producir los análogos 21a, 21b y 24. Por ejemplo, el compuesto de carbamato 21 se prepara haciendo reaccionar 4 (R_{3}=H) con carbonildiimidazol (CDI) y una base tal como diazabicicloundeceno (DBU), hidruro sódico, t-butóxido potásico, bis(trimetilsilil)amida sódica y similares en un disolvente inerte y seco. El producto intermedio de acilimidazol 4 (R_{3}=C=Oimidazol) resultante se hace reaccionar con una amina primaria o secundaria para dar el carbamato. Alternativamente, el carbamato 21a puede prepararse a partir de 4 (R_{3}=H) y un isocianato usando catalizador de cloruro de cobre o yoduro de cobre. Los análogos de éter 24 se preparan haciendo reaccionar el alcohol 4 (R_{3}=H) con una variedad de reactivos alquilantes seleccionados de, pero no limitados a, yoduro de metilo, yoduro de octilo, bromuro de bencilo, cloruro de 4-benciloxibencilo, bromuro de 4-butilbencilo y similares, con bases fuertes tales como hidruro sódico, hidruro potásico, bis(trimetilsilil)amida sódica, en un disolvente aprótico seco a temperaturas entre -20ºC y 70ºC. La síntesis de los derivados amínicos y amídicos, 23 y 25 ó 26, respectivamente, avanza a través del producto intermedio, el ácido carboxílico 22 y el alcohol 4. La reacción de 1 con el éter TBDMS de \alpha-(hidroximetil)acrilato de etilo (8, R=H, Org. Synthesis, 66:220 (1987)) en presencia de una base, por ejemplo etóxido sódico en etanol, y la desprotección del éter silílico con fluoruro de tetrabutilamonio en THF da el éster etílico 10 (Z=CHCO_{2}Et, X=O, Y=CH_{2}, figura 1). El éster se hidroliza usando una base alcalina tal como hidróxido sódico, hidróxido de litio en agua, etanol acuoso, THF, dioxano y similares. El ácido carboxílico 22 resultante se hace reaccionar con trietilamina y difenilfosforilazida en tolueno a de 70 a 150ºC para dar un producto intermedio de isocianato. La reacción de un alcohol o una amina con el isocianato da el carbamato 26a (R_{5}=H, R_{7}=R_{8}O) o la urea 26b (R_{5}=H, R_{7}=R_{8}R_{9}N), respectivamente. Cuando el isocianato intermedio se hace reaccionar con t-butanol, se aísla el carbamato 26a (R_{5}=H, R_{7}=t-BuO) obtenido como producto. La alquilación del carbamato de t-butilo con electrófilos tales como un haluro de alquilo o alquilarilo y similares y la desprotección del grupo Boc (carbamato de t-butilo) con ácido trifluoroacético o ácido clorhídrico da la amina secundaria 23 (R_{5}=H, R_{6}=alquilo, alquilarilo). Alternativamente, el carbamato Boc 26a (R_{5}=H, R_{7}=t-BuO) se hace reaccionar con ácido trifluoroacético o ácido clorhídrico para dar la amina primaria 23 (R_{5}=R_{6}=H) que puede alquilarse reductivamente (RCHO, cianoborohidruro sódico) para dar la amina secundaria 23 (R_{5}=H, R_{6}=RCH_{2}). Una segunda alquilación de la amina secundaria con un electrófilo, tal como un haluro de alquilo o alquilarilo y similares, da una amina terciaria 23 (R_{5}=R_{6}=alquilo, =alquilarilo). Reacciones adicionales que sufre la amina primaria o secundaria 23 (R_{5}=R_{6}=H o R_{5}=H, R_{6}=alquilo, alquilarilo) incluyen la acilación con un cloruro de ácido, cloruro de sulfonilo, isocianato e isotiocianato para dar el derivado 26 (R_{5}=H o alquilo, alquilarilo, R_{7}=alquilo, alquilarilo, arilo, heterociclo), 23 (R_{5}=H o alquilo, alquilarilo, R_{6}=SO_{2}alquilo, SO_{2}alquilarilo, SO_{2}arilo, SO_{2}heterociclo), 26 (R_{5}=H o alquilo, alquilarilo, R_{7}=NHalquilo, NHheterociclo) y 23 (R_{5}=H o alquilo, alquilarilo, R_{6}=alquilNHC=S, alquilarilNHC=S, arilNHC=S, heterocicloNHC=S). La síntesis de derivados de carboxamida 25 se efectúa mediante la reacción del ácido 22 y una amina primaria o secundaria con un reactivo de acoplamiento de péptidos, tal como hidroxibenzotriazol (HOBT)/diciclohexilcarbodiimida (DCC) o hexafluorofosfato de 2-[1H-benzotriazol-1-il]-1,13,3-tetrametiluronio (HBTU) y similares. La reacción de acoplamiento de péptidos puede efectuarse en un disolvente aprótico polar (por ejemplo, dimetilformamida y N-metilpirrolidona (NMP) con una base tal como N-metilmorfolina y similares). Una síntesis alternativa de la amina 23 (R_{5}=R_{6}=H) implica la reacción del alcohol 4 (R_{3}=H) con cloruro de p-toluenosulfonilo en piridina. El sulfonato intermedio 4 (R_{3}=pCH_{3}C_{6}H_{4}SO_{2}) se hace reaccionar con azida sódica. La azida resultante se reduce con 1,3-propanodiol y trietilamina para dar la amina 23.

En referencia ahora a las figuras 4 y 5, compuestos específicos de la invención se preparan de acuerdo con los procedimientos esbozados. La reacción de 2-cloro-4-nitroimidazol 1a o 2,4-dinitroimidazol 1b (1 equivalente) con éter TBDMS de R- o S-glicidol (2 equivalentes) (Ejemplo 1) como una solución pura a 70ºC daba el hidroxiimidazol 27a o b. La protección del alcohol 27a como su éter tetrahidropiranílico (DHP, p-TsOH) y la desililación del grupo TBDMS con fluoruro de tetrabutilamonio producía el éter THP de nitroimidazol bicíclico 28. La desprotección del grupo THP se efectuó usando ácido acético en THF acuoso y el alcohol resultante se alquiló con bromuro de octilo e hidruro sódico en DMF a temperatura ambiente. El éter octílico 31a se obtuvo como un sólido cristalino blanco ([\alpha]^{25}D=-28,1º). La síntesis de la serie de éteres enantiómeros también se alcanzaba y se obtuvo ent-31a
([\alpha]^{25}D=+27,45º). Alternativamente, el alcohol 27b se tosiló con cloruro de p-toluenosulfonilo en piridina para dar el tosilato 30. El tratamiento del éter TBDMS 30 con TBAF separaba el grupo sililo con ciclación concomitante para dar el tosilato cíclico 31b. La reacción de 31b con azida sódica y la reducción (1,3-propanodiol, trietilamina) daba la amina 31d con buen rendimiento. La síntesis del análogo de nitroimidazol bicíclico que contiene nitrógeno 37 se efectuó usando un sistema similar. Así, la reacción de 1 con el Boc-epóxido daba 29. La protección del alcohol 29 como el éter TBMDS (TBDMSCl, imidazol, DMF) y la ciclación del Boc-aminoéter con hidruro sódico en DMF daba el imidazol 32. Los grupos protectores tanto Boc como TBDMS se retiraron tratando el compuesto 32 con HCl acuoso. El aminoalcohol se alquiló selectivamente (hidruro sódico, yoduro de metilo, DMF) para dar el derivado N-metílico 34 (R=CH_{3}) que se alquiló en una segunda etapa (hidruro sódico, cloruro de 4-benciloxibencilo, DMF, de 0ºC a temperatura ambiente) proporcionando el compuesto de azanitroimidazol 35. La figura 5 ilustra la preparación de derivados de lactamas cíclicas 37, aza-análogos 40, carbamatos cíclicos 41 y piranos 44. La 3-bromopropionamida y las 4-bromobutiramidas reaccionaban con la sal sódica de 1b en DMF para dar las amidas acíclicas 36. Las amidas cíclicas 37a y 37b se obtuvieron tratando 36a y 36b con hidruro sódico en DMF. La reducción del grupo carbonilo de 37a estaba afectada por borano en THF a temperatura ambiente, produciendo el aza-derivado 40 con buen rendimiento. El carbamato cíclico 41 se preparó haciendo reaccionar el alcohol 38 con isocianato de octilo en presencia de CuI para dar el carbamato 39 que se cicló bajo condiciones básicas (hidruro sódico, DMF). Finalmente, el análogo de piranilnitroimidazol 44 se preparó mediante la alquilación de 1b con el éter TBDMS bromado seguido por ciclación desprotectora o apertura de oxetano con 1b en presencia de tetrafluoroborato de litio en THF seguido por ciclación inducida por base (hidruro sódico, DMF) del alcohol 43.

Los compuestos de la presente invención pueden usarse en la forma de sales derivadas de ácidos inorgánicos u orgánicos. Estas sales incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropionato, dodecilsulfato, etanosulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, p-toluenOsulfonato y undecanoato. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo; haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; haluros de aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. Se obtienen de ese modo productos solubles o dispersables en agua o aceite.

Ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico. Las sales de adición básicas pueden prepararse in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos de fórmula (I), o separadamente haciendo reaccionar restos ácido carboxílico con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable o con amoníaco, o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cationes basados en los metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sales de sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y similares, así como cationes atóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina, incluyendo, pero no limitados a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares.

Los compuestos de la invención son útiles in vitro para inhibir el crecimiento de microbios patógenos e in vivo en huéspedes humanos y animales para tratar infecciones microbianas patógenas, incluyendo la tuberculosis. Los compuestos pueden usarse solos o en composiciones junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

La dosis diaria total administrada a un huésped en dosis simples o divididas puede estar en cantidades, por ejemplo, de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal al día y más preferiblemente de 1,0 a 30 mg/kg de peso corporal al día. Las composiciones unitarias de dosificación pueden contener tales cantidades de submúltiplos de las mismas para constituir la dosis diaria.

La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de dosificación simple variará dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular.

Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de administración, la ruta de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular que se somete a terapia.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse oralmente, parenteralmente, sublingualmente, mediante un aerosol de inhalación, rectalmente o tópicamente en formulaciones unitarias de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables atóxicos convencionales, según se desee. La administración tópica también puede implicar el uso de administración transdérmica tal como parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis. El término parenteral, según se usa aquí, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también pueden ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-propanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo blando incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de productos inyectables.

Pueden prepararse supositorios para la administración rectal del fármaco mezclando el fármaco en un excipiente no irritante adecuado, tal como mantequilla de cacao y polietilenglicoles que son sólidos a temperaturas normales pero líquidos a la temperatura rectal, y por lo tanto se fundirán en el recto y liberarán el fármaco.

Formas de dosificación sólidas para la administración oral pueden incluir cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es normal en la práctica, substancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo agentes lubricantes tales como estearato magnésico. En el caso de las cápsulas, las tabletas y las píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores. Pueden prepararse adicionalmente tabletas y píldoras con revestimientos entéricos.

Formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, ciclodextrinas y agentes edulcorantes, saboreantes y perfumantes.

Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en la forma de liposomas. Como se sabe en la técnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolípidos u otras substancia lipídicas. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono- o multi-lamelares que están dispersados en un medio acuoso. Puede usarse cualquier lípido atóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, además de un compuesto de la presente invención, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Métodos para formar liposomas se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volumen XIV, Academic Press, Nueva York, N.W., p. 33 y siguientes (1976).

Aunque los compuestos de la invención pueden administrarse como el único agente farmacéutico activo, también pueden usarse en combinación con uno o más agentes diferentes usados en el tratamiento de infecciones micobacterianas patógenas. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de M. tuberculosis incluyen, por ejemplo, isoniazida, rifampina, pirazinamida, etambutol, rifabutina, estreptomicina, ciprofloxacina y similares. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de Clostridium incluyen, por ejemplo, vancomicina, metronidazol, bacitracina y similares. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de Cryptosporidium incluyen, por ejemplo, furoato, furazolidona, quinina, espriamicina, alfa-difluorometilornitina, interleuqina-2 y similares. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de Helicobacter incluyen, por ejemplo, azitromicina, amoxicilina, claritromicina y similares.

Los compuestos previos que han de emplearse en combinación con los compuestos de nitroimidazol de la invención se usarán en cantidades terapéuticas según se indica en PHYSICIANS' DESK REFERENCE (PDR) 47ª Edición (1993), que se incorpora aquí mediante referencia, o tales cantidades terapéuticamente útiles que serían conocidas para un experto normal en la técnica.

Los compuestos de la invención y el otro agente antiinfectivo pueden administrarse a la dosis clínica máxima recomendada o a dosis inferiores. Los niveles de dosificación de los compuestos activos en las composiciones de la invención pueden variarse a fin de obtener una respuesta terapéutica deseada dependiendo de la ruta de administración, la gravedad de la enfermedad y la respuesta del paciente. La combinación puede administrarse como composiciones separadas o como una sola forma de dosificación que contiene ambos agentes. Cuando se administran como una combinación, los agentes terapéuticos pueden formularse como composiciones separadas que se administran al mismo tiempo o en tiempos diferentes, o los agentes terapéuticos pueden administrarse como una sola composición.

Lo precedente puede entenderse mejor mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan solamente para ilustración. Los compuestos de los Ejemplos 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 23 y 28 se usan en la preparación de compuestos que están dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 (3S)-1-(2'-Hidroxi-3'-t-butildimetilsililoxi)-propil-2,4-dinitroimidazol

6

Una mezcla de 1,93 g (10,5 milimoles) de éter terc-butildimetilsilílico de (S)-glicidol (Liu, H, y otros, J. Org. Chem., 57:2471 (1992)) y 1,11 g (7,0 milimoles) de 2,4-dinitroimidazol en EtOH (0,5 ml) se calentó a 70ºC durante 18 horas. La mezcla se enfrió y se añadió directamente a una columna de gel de sílice. El producto se purificó usando EtOAc/hexano (1:4) como el eluyente, para dar 1,28 g (53%) de (3S)-1-(2'-hidroxi-3'-t-butildimetilsililoxi)-propil-2,4-dinitroimidazol como un aceite amarillo: ^{1}H NMR (DMSO) \delta 8,60 (s,1H), 5,27 (d, 1H), 4,65 (dd, 1H), 4,27 (dd, 1H), 3,96 (m, 1H), 3,60 (dd,1H), 3,44 (m, 1H), 0,82 (s, 9H), 0,03 (s, 6H); MS 347(M+H)^{+}.

Ejemplo 2 3S-Tetrahidropiraniloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

7

Una solución del compuesto preparado en el Ejemplo 1 (1,24 g, 3,6 milimoles), 3,4-dihidro-2H-pirano (0,61 g, 7,16 milimoles) y 1,35 g (5,37 milimoles) de p-toluenosulfonato de piridinio en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con NaHCO_{3} saturado y agua. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. La purificación del residuo mediante cromatografía en gel de sílice usando hexano:EtOAc (10:1) como el eluyente daba 1,21 g del éter protegido con THP intermedio con un rendimiento de 79%.

Se añadieron 8,4 ml (8,4 milimoles) de fluoruro de tetrabutilamonio (solución 1,0 M en THF) gota a gota a una solución de 1,21 g (2,81 milimoles) del THP-éter en THF seco (10 ml). La mezcla de reacción se dejó agitar durante 1 h, después de lo cual el disolvente se evaporó. El residuo se diluyó con CHCl_{3} y se lavó con NaHCO_{3} saturado y agua. Los extractos orgánicos se secaron (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. La mezcla en bruto se sometió a cromatografía en columna, usando EtOAc:MeOH (97:3) como el eluyente, dando 0,55 g (73%) del compuesto del título: pf 138-139ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,42 (s, 1H), 4,85 (s,1H), 4,10-4,60 (m, 4H), 3,54-3,87 (m, 2H), 1,58 (m, 6H); MS 431 (M+H)^{+}.

Ejemplo 3 3S-Hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2,1b]imidazopirano

8

Una solución en THF (32 ml) de 4,06 g (15 milimoles) del THP-éter preparado en el Ejemplo 2, agua (16 ml) y ácido acético (64 ml) se calentó a 45ºC durante 18 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se cristalizó en MeOH a ebullición para dar 2,18 g (79%) del compuesto del título: pe 220ºC (desc.) ^{1}H NMR (DMSO) 8,07 (s, 1H), 5,69 (s, 1H), 4,17-4,39 (m, 4H), 3,98 (d, 1H); MS 186 (M+H)^{+}.

Ejemplo 4 3S-n-Octiloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro[2-1b]imidazopirano Procedimiento General para la Alquilación del Alcohol 4 (R_{3}=H) con Haluros de Alquilo

9

Se añadieron 0,26 g (6,66 milimoles) de NaH (60% en aceite) a una solución en DMF (7 ml ) del alcohol preparado en el Ejemplo 3 (1,03 g, 5,55 milimoles) enfriada hasta 0ºC. Después de 0,5 h, se añadieron 1,03 ml (5,68 milimoles) de 1-yodooctano y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La reacción se extinguió con agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se secaron (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. El residuo se sometió a cromatografía en columna (hexano:EtOAc) para dar 0,49 g (30%) del compuesto del título: pe 108-109ºC; [\alpha]^{25}D (CHCl_{3}, c=0,1)=-28,1º; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,41 (s, 1H), 4,55 (dd, 1H), 4,00-4,35 (m, 4H), 3,56 (m, 2H), 1,59 (m, 4H), 1,25 (s ancho, 8H), 0,87 (m, 3H); MS 298 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{14}H_{23}N_{3}O_{4}: C, 56,55; H, 7,80; N, 14,13. Encontrado: C, 56,66; H, 7,97; N, 14,00.

Ejemplo 5 (3R)-1-(2'-Hidroxi-3'-t-butildimetilsililoxi)-propil-2,4-dinitroimidazol

10

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 y substituir el éter t-butildimetilsilílico de glicidol (S) por éter t-butildimetilsilílico de glicidol (R) daba (3R)-1-(2'-hidroxi-3'-t-butildimetilsililoxi)propil-2,4-dinitroimidazol. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,13 (s, 6H), 0,94 (s, 9 H), 3,07 (d, 1 H), 3,75 (d, 2H), 4,13 (m, 1H), 4,53 (dd, 1H), 4,85 (dd,1H), 8,11(s,1H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 19,21, 26,77, 54,78, 65,02, 70,90, 125,96.

Ejemplo 6 3R-Tetrahidropiraniloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

El compuesto del título se preparó usando el procedimiento esbozado en el Ejemplo 2 y substituyendo el alcohol preparado en el Ejemplo 1 por el alcohol preparado en el Ejemplo 5 para dar el THP-éter cíclico: pe 145-146ºC; ^{1}H NMR (DMSO) \delta 1,43 (m, 4 H), 1,65 (m, 2H), 3,49 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 4,18-4,70 (m, 5H), 4,90 (m, 1H), 8,02, 8,05 (ss, 1H); ^{13}C NMR(DMSO) \delta 20,36, 20,25, 26,21, 26,25, 31,54, 31,61, 47,87, 49,61, 63,25, 63,43, 65,58, 65,72, 69,33, 71,44, 98,29, 98,45, 119,38, 119,45, 148,57.

Ejemplo 7 3R-Hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

Se preparó 3R-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano usando el procedimiento esbozado en el Ejemplo 3 y substituyendo el THP-éter preparado en el Ejemplo 2 por el THP-éter del Ejemplo 6: pe 208ºC (descompuesto); ^{1}H NMR (DMSO) \delta 3,96 (d, 1H), 4,16-4,43 (m, 4H), 5,68 (d, 1H), 8,06 (s, 1H); ^{13}C NMR(DMSO) \delta 50,70, 60,52, 72,22, 119,53, 143,58, 148,62,

Ejemplo 8 3R-n-Octiloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

Se preparó 3R-n-octiloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano usando el procedimiento de alquilación esbozado en el Ejemplo 4 y el producto del Ejemplo 8: pe 104-106ºC; [\alpha]^{25}D (CHCl_{3}, c=1)+27,45º; ^{1}H NMR (DMSO) \delta 0,83 (t, 3H), 1,25 (m, 12H), 1,44 (m, 2H), 3,53 (q, 2H), 4,08 (q, 1H), 4,18 ppm (d, 2H), 4,49 (q, 2H), 8,03 (s, 1H); ^{13}C NMR(DMSO) \delta 15,35, 23,51, 26,94, 30,13, 30,50, 32,65, 48,07, 67,92, 69,37, 69,46, 119,38, 143,53, 148,57; MS 298 (M+H).

Análisis calculado para C_{14}H_{23}N_{3}O_{4}: C, 56,55; H, 7,80; N,14,13. Encontrado: C, 56,37; H, 7,86; N, 13,97.

Ejemplo 9 1-(2'-Hidroxi-3'-N-terc-butiloxicarbonil)propil-2,4-dinitroimidazol

14

Epóxido de N-(terc-butiloxicarbonil)alilamina

Una solución de 5,72 gramos (0,1 moles) de alilamina se añadió gota a gota a una solución de 130 ml de tetrahidrofurano (THF) recientemente destilado y 28,4 gramos (0,13 moles) de bicarbonato de di-terc-butilo bajo N_{2} a temperatura ambiente. Después de 3 h, el disolvente se retiró mediante evaporación giratoria y la Boc-amina se obtuvo como un aceite transparente: la ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 5,91-5,78 (m, 1H), 5,21-5,10 (m, 2H), 4,65 (s ancho, 1H), 3,75 (s ancho, 2H), 1,45 (s, 9H), indicaba que se sintetizaba el producto deseado.

Se añadieron 63 g (0,44 moles) de fosfato sódico anhidro dibásico y 84 g (0,489 moles) de ácido m-cloroperbenzoico a la N-(terc-butiloxicarbonil)alilamina en bruto en 700 ml de diclorometano. La reacción se agitó mecánicamente durante 24 h y se extinguió con bicarbonato sódico saturado y tiosulfato sódico (Na_{2}S_{2}O_{3}) saturado y se extrajo tres vecesde diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato magnésico y se concentraron bajo presión reducida. La cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con CH_{3}OH:CHCl_{3} (1:4) daba epóxido de N-(terc-butiloxicarbonil)alilamina con un rendimiento de 60% (10,3 g); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 4,95 (s ancho, 1H), 3,57-3,50 (m ancho, 1H), 3,26-3,15 (m, 1H), 3,09 (m, 1H), 2,79-2,76 (t, 1H, J=4,2 Hz), 2,60-2,58 (dd, 1H, J=2,7, 4,8 Hz).

1-(2'-hidroxi-3'-N-terc-butiloxicarbonil)-propil-2,4-dinitroimidazol

Una mezcla de 2,4-dinitroimidazol (158 mg, 1 milimol) y epóxido de N-(terc-butiloxicarbonil)alilamina (885 mg, 5 milimoles) se agitó bajo N_{2} durante 19 h a temperatura ambiente. La cromatografía sobre gel de sílice usando acetona:hexano (1:2) daba el compuesto del título con un rendimiento de 41%: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,21 (s, 1H), 5,49 (s ancho, 1H), 4,85 (d, 1H, J=13,2 Hz), 4,55-4,53 (m, 2H), 4,15 (s ancho, 1H), 3,37 (m ancho, 2H), 1,41 (s, 9H); MS (M+H)^{+} 332.

Ejemplo 10 N-(terc-butilcarboniloxi)-3S-terc-butildimetilsililoxi-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina

15

Éter TBDMS de 1-(2'-hidroxi-3'-N-(terc-butiloxicarbonil)-propil-2,4-dinitroimidazol

Se añadió una solución de 2,20 g (14,6 milimoles) de cloruro de terc-butildimetilsililo en 20 ml de DMF seca a una mezcla del compuesto de imidazol preparado en el Ejemplo 9 (1,32 g, 34,3 milimoles) en 30 ml de dimetilformamida (DMF) seca y 1,82 g (5,5 milimoles) del compuesto preparado en el Ejemplo 9. Después de 48 h, se añadió un volumen igual de éter y la mezcla se lavó tres veces con HCl 0,5 M, dos veces con bicarbonato sódico saturado y una vez con salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. La cromatografía sobre gel de sílice usando acetona:hexano (1:4) daba el compuesto del título con un rendimiento de 93%: pe 47,0-49,5ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,01 (s, 1H), 4,83-4,78(m, 2H), 3,22-3,17(m, 1H), 1,47(s, 9H), 0,85(s, 9H), 0,04(s, 3H), -0,24(s, 3H).

N-terc-butiloxicarbonil-3S-terc-butildimetilsililoxi-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina

Se añadieron 10 g (25 milimoles, 60%) de hidruro sódico en porciones a una solución de 5,11 g (11,5 milimoles) del éter TBDMS preparado en el Ejemplo 10 en 100 ml de DMF seca enfriada a 0ºC. Una vez que la adición se completaba, se dejaron 15 minutos adicionales a 0ºC antes de que la mezcla de reacción se calentara lentamente hasta temperatura ambiente. Cuatro horas más tarde, la reacción se extinguió con agua, la mezcla se extrajo con éter:tolueno (1:1). Las capas orgánicas combinadas se secaron, se filtraron y se evaporaron. El residuo en bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (acetona:hexano, 1:4) para dar el compuesto del título con un rendimiento de 51%: pe 59,5-61,3ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 7,52 (s, 1H), 4,37-4,33 (m, 1H), 4,19-4,14 (dd, 1H, J=3,55, 12,88 Hz), 4,12-4,05 (qd, 1H, J=1,63, 4,75, 13,43 Hz), 3,91-3,86 (m, 1H), 3,57-3,52 (dd, 1H, J=1,63, 13,42 Hz), 1,47 (s, 9H), 0,77 (s, 9H), 0,05 (s, 3H), 0,04 (s, 3H).

Ejemplo 11 3R-Hidroxi-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina

16

Se añadió 1 ml de HCl 2N a una solución del éter TBDMS (21,2 mg, 49 milimoles) preparado en el Ejemplo 10 en 5 ml de THF. Después de agitar a temperatura ambiente durante 18 h, la mezcla de reacción se concentró hasta sequedad, se disolvió en CHCl_{3} y se purificó en una columna de gel de sílice (CH_{3}OH:CH_{2}Cl_{2} 1:4) para dar 9,2 mg (85,0% de rendimiento) de 3R-hidroxi-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina como un sólido amarillo: pe 122ºC (descompuesto); ^{1}H NMR (D_{2}O) \delta 8,05 (s ancho, 1H), 4,51(m, 1H), 4,20 (s ancho, 2H), 3,55 (s ancho, 2H).

Ejemplo 12 3R-Hidroxi-1-metil-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina

17

Una solución en DMF del aminoalcohol preparado en el Ejemplo 11 se enfría hasta 0ºC y se añade un equivalente de hidruro sódico. La mezcla de reacción se agita durante 10 minutos, se añaden 2 equivalentes de yoduro de metilo y la mezcla de reacción se calienta hasta temperatura ambiente y se agita 1 h adicional. Se añade agua y se obtiene 3R-hidroxi-1-metil-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina mediante extracción con cloroformo.

Ejemplo 13 3R-Benciloxibenciloxi-1-metil-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina

18

Se sigue el procedimiento de alquilación general descrito en el Ejemplo 4, y substituir el alcohol preparado en el Ejemplo 3 por el alcohol preparado en el Ejemplo 12 y substituir el yoduro de n-octilo por cloruro de 4-benciloxibencilo da 3R-benciloxibenciloxi-1-metil-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-[2-1b]imidazopirimidina.

Ejemplo 14 4-Benciloxicarbamato de 3R-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

19

Usar el procedimiento del Ejemplo 4 y substituir el 1-yodooctano por 1,1-carbonildiimidazol daba 13 mg (9% de rendimiento) del acilimidazol: ^{1}H NMR (DMSO) \delta 8,05 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,01 (s, 2H), 5,36 (s, 1H), 4,61 (m, 2H), 4,37 (m, 2H).

Se añade 4-benciloxibencilamina (1,1 eq., Pandey, G,D y otros, Pol. J. Chem. 54:763 (1980)) a una solución del acilimidazol (1 eq.) en THF seco. Después de que la reacción sea completa, se obtiene el 4-benciloxicarbamato de 3R-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano.

Ejemplo 15 3R-Carboetoxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

20

Una solución de 2,4-dinitroimidazol (1 eq.), el éter TBS de \alpha-(hidroximetil)acrilato de etilo (1,1 eq., Org. Syn. 66:220 (1987)) y etóxido sódico en etanol se agita a temperatura ambiente. El tratamiento de la manera habitual da el producto. La ciclación del producto intermedio de éter TBDMS se efectúa mediante la reacción con fluoruro de tetrabutilamonio que se describe previamente.

Ejemplo 16 3R-Carboxilato-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

21

Una solución del éster preparado en el Ejemplo 15 y (1 eq.) de hidróxido sódico en EtOH se agita a temperatura ambiente. La adición de HCl acuoso da 3R-carboxilato-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano.

Ejemplo 17 4-Benciloxibenzamida de 3R-amino-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

22

Una solución de 3R-carboxilato-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano (Ejemplo 21, 1 eq.), trietilamina (1 eq.), difenilfosforilazida (1 eq.) en tolueno se calienta a 80ºC durante 4 h, se enfría y se añade t-butanol. La reacción se calienta hasta 70ºC durante 1 h adicional. El tratamiento de modo estándar da la Boc-amina. La desprotección del grupo Boc (ácido trifluoroacético:diclorometano, 1:1) y la adición de cloruro de 4-benciloxibenzoílo y trietilamina da la 4-benciloxibenzamida de 3R-amino-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano.

Ejemplo 18 Concentración Inhibidora Mínima (MIC) de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano Substituidos en 3(R) Contra M. bovis, M. tuberculosis (Sensible y Resistente a Múltiples Fármacos) y Clostridium difficile Inhibición In Vitro de Clostridium difficile

La concentración inhibidora mínima (MIC, \mug/ml) de los fármacos de prueba contra Clostridium difficile ATCC 17857 se determinó mediante el método de microdilución del caldo usando un inóculo, medios, condiciones de incubación y un punto final de acuerdo con los patrones aprobados de the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1993, Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria. M11-A3, Tercera edición. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA), excepto por la siguiente modificación: se incorporó enzima Oxyrase® (Oxyrase Inc., Mansfield, OH) en caldo de Wilkins-Chalgren (Remel, Lenexa, KS) para producir condiciones anaerobias y excluir cualquier requerimiento de incubación en atmósfera anaerobia (Spangler, S.K. y otros, "Oxyrase, a method which avoids CO_{2} in the incubation atmosphere for anaerobic susceptibility testing of antibiotics affected by CO_{2}" J Clin. Microbiol. 31:460-462 (1993); Spangler, S.K. y otros, "Susceptibilities of 201 anaerobes to erythromycin, azithromycin, clarithromycin, and roxithromycin by Oxyrase agar dilution and E-test methodologies", J. Clin. Microbiol. 33:1366-1367 (1995)). Así, el uso de este método permitía la incubación en aire ambiental en vez de en la atmósfera enriquecida en CO_{2}, H_{2} y N_{2} normalmente presente en cámaras y botellas anaerobias. El método de dilución del caldo de Oxyrase excluía la necesidad de tal equipo y proporcionaba un mecanismo para evitar los efectos del CO_{2} sobre el pH del medio y a su vez sobre la actividad de los compuestos de prueba. Se han demostrado previamente MICs falsamente elevadas debido a la disminución dependiente de CO_{2} en el pH (Barry, A.L. y otros, "In-vitro potency of azithromycin against gram-negative bacilli is method-dependent", J. Antimicrob. Chemother., 28:607-610 (1991), Hansen, S.L. y otros, "Effect of carbon dioxide and pH on susceptibility of Bacteroides fragilis group to erythromycin", Antimicrob. Agents Chemother., 19:335-336 (1981), Retsema, J.A. y otros, "Significance of environmental factors on the in vitro potency of azithromycin", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 10:834-842 (1991)). Este problema se eliminaba usando Oxyrase, ya que esta enzima retiraba O_{2} rápidamente convirtiéndolo en H_{2}O sin productos intermedios tóxicos. Se probaron microorganismos anaerobios de control de calidad (Bacteroides thetaiotamicrons ATCC 29741; Eubacterium lentum ATCC 43055) en microdilución de caldo de Oxyrase frente a clindamicina, metronidazol, mezlocilina y vancomicina para una garantía de calidad. Los resultados se aceptaban cuando las MICs de estas cepas recomendadas estaban dentro de los intervalos aceptables publicados por NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, M11-A3, Tercera edición, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA,
1993).

Inhibición In Vitro usando el método (rBGC) LUX

Se prepararon soluciones de reserva de los compuestos de prueba en dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma). Estas reservas se diluyeron adicionalmente en DMSO para obtener concentraciones adecuadas para determinaciones de la concentración inhibidora mínima (MIC) o de rastreo. Para pruebas de MIC, se usaron soluciones de dos veces que variaban de 8,0 \mug/ml a 0,002 \mug/ml. Con propósitos de rastreo, se probaron cuatro concentraciones: 25,0, 5,0, 1,0 y 0,2 \mug/ml.

Una cepa recombinante del bacilo Calmette Guerin de Mycobacterium bovis (rBGC) se empleó como el organismo de estimulación. Esta cepa se transformó con un vector lanzadera integrador que tenía un casete de expresión de luciferasa de luciérnaga (lux). Este vector se denominó pMV361-lux.

Se preparó un cultivo en fase logarítmica de la cepa rBCG:pMV361-lux en caldo Middlebrook 7H9 (Difco) complementado con 10% (v/v) de enriquecimiento de ADC (BBL) y 0,5% (v/v) de glicerol. El cultivo se diluyó para obtener un inóculo bacteriano final de 1x10^{5} unidades formadoras de colonias por ml. Un volumen de cultivo de 2 ml se inoculó con 50 \mul de cada concentración de compuesto de prueba. Se incluyeron tubos de control que contenían rBCG:pMV361-lux en ausencia de antibióticos. Se incluyó isoniazida (Sigma) como un control en cada experimento de ensayo. Los tubos de ensayo se incubaron a 37ºC durante 6 días.

La actividad de luciferasa se determinó mediante el ensayo de partes alícuotas de 0,1 ml de cada tubo en una placa de microvaloración de 96 pocillos blanca opaca. Las reacciones se iniciaron mediante la inyección automatizada de 0,1 ml de luciferina (1 mM) en un luminómetro Wallac Autolumat modelo 96P. El valor de la MIC o la concentración activa más baja se definió como la concentración más baja de compuesto que daba una lectura luminiscente \leq 1/100 el valor obtenido para el control de crecimiento libre de antibiótico.

Concentración Inhibidora Mínima (MIC) según se Determina mediante el Método BACTEC®

El sistema BACTEC®, disponible de Becton-Dickenson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, MD, usa un principio radiorrespirométrico por el que el dióxido de carbono liberado por el catabolismo de ácido palmítico marcado con ^{14}C se detecta espectrofotométricamente y se cuantifica en unidades arbitrarias de medida denominadas unidades de Índice de Crecimiento (GI). Los criterios de determinación del punto final para los procedimientos BACTEC se basan en un 1% de "corte" de resistencia convencional en el que el organismo bajo escrutinio se considera resistente a la concentración de fármaco que se prueba si se observa un crecimiento de más de 1% de la población bacteriana. Así, se realiza una comparación entre el crecimiento en presencia del agente antimicrobiano y el crecimiento del mismo organismo diluido 10^{-2} en medio libre de fármaco. Los viales BACTEC son inoculados con 0,1 ml del organismo (concentración bacteriana final, 1-5x10^{5} unidades formadoras de colonias por ml) y 0,1 ml de diversas concentraciones del agente antimicrobiano. Los valores de GI se controlan diariamente hasta que se alcanza un valor de \leq 30 para el control de 10^{-2}. El cambio en los valores de GI (GI) se usa a continuación para determinar la susceptibilidad del organismo a cada concentración de agente probada. Si el GI del control es mayor que el del fármaco, entonces se considera que el organismo es susceptible a esa concentración. A la inversa, si el GI del control tiene un valor inferior que el del fármaco, esto indica resistencia. Se considera que el fármaco tiene una actividad límite a una concentración particular si el valor de GI del control y el fármaco son iguales.

Concentraciones Inhibidoras Mínimas (MICs)

Las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de diversos compuestos antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano substituidos en 3(S) contra M. bovis BCG (cepa recombinante, usando el método LUX descrito previamente), M. tuberculosis (cepa sensible H37Rv y resistente a múltiples fármacos, ambas usando el método BACTEC) y Clostridium difficile se determinaron para compuestos sintetizados usando los procedimientos descritos aquí, que tienen la estructura general:

23

donde R es el substituyente mostrado en la Tabla 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Concentración Inhibidora Mínima (MIC) de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imida-zopirano Substituidos en 3(R) Contra M. bovis, M. tuberculosis (Sensible y Resistente a Múltiples Fármacos) y Clostridium difficile

24

^{a} método LUX

^{b} método BACTEC

A = Mycobacterium bovis BCG (cepa recombinante), método LUX

B = Mycobacterium tuberculosis H37Rv (cepa sensible), método BACTEC

C = Mycobacterium tuberculosis (cepa resistente a múltiples fármacos), método BACTEC

D = Clostidium difficile ATCC 17857

Bn = bencilo

Ph = fenilo

Ejemplo 19 Concentración Inhibidora Mínima (MIC) de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano Substituidos en 3(R) Contra M. bovis, M. tuberculosis (Sensible y Resistente a Múltiples Fármacos) y Clostridium difficile

Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 18 para determinar las concentraciones inhibidoras mínimas de diversos compuestos antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4dihidro-[2-1b]imidazopirano substituidos en 3(R) preparados usando los procedimientos descritos aquí, que tienen la siguiente fórmula general:

25

donde R es el substituyente mostrado en la Tabla 1. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2 Concentración Inhibidora Mínima (MIC) de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imida-zopirano Substituidos en 3(R) Contra M. bovis, M. tuberculosis (Sensible y Resistente a Múltiples Fármacos) y Clostridium difficile

26

Ejemplo 20 Inhibición In Vivo de Especies de Mycobacterium

Se probaron compuestos con respecto a la actividad in vivo frente a cepas micobacterianas que se habían transformado con vectores que tenían el gen de luciferasa de luciérnaga (lux). Los experimentos preliminares usaban una cepa de bacilo de Calmette Guerin de Mycobacterium bovis recombinante (rBCG) mientras que los estudios ulteriores se realizaron con una cepa Erdman de Mycobacterium tuberculosis recombinante (rMTB). La cepa rBCG se había transformado con un vector extracromosómico denominado pMH30; la cepa rMTB se había transformado con un vector integrador denominado pHM46. Se usaron ratones BALB/c hembra de 4 a 6 semanas de edad. Se incluyeron cinco ratones en cada grupo de prueba. Se incluyó un grupo que no recibía terapia con fármacos. Se prepararon cultivos en fase logarítmica de las cepas micobacterianas en caldo Middlebrook 7H9 (Difco) complementado con 10% (v/v) de enriquecimiento de ADC (BBL), 0,5% (v/v) de glicerol y 20 \mug/ml de kanamicina.

Se inyectó en la vena de la cola de cada ratón un volumen de 150 \mul de cultivo que contenía aproximadamente 1x10^{7} unidades formadoras de colonias por ml. La terapia con fármaco se inició 1 día o 7 días después de la inyección con las cepas rBCG o rMTB, respectivamente. Los compuestos de prueba se administraron diariamente mediante una sonda oral. Para los experimentos con rBCG, los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO/aceite de sésamo y se administraron a los ratones en 50 mg/kg. Para los estudios de protección de ratones con Erdman de Mycobacterium tuberculosis (rMTB), los compuestos de prueba se aportaron en la formulación CM-2 (véase el Ejemplo 42) a una dosis de 25 mg/kg. Los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical 10 días después de la iniciación de la terapia. Los bazos y los pulmones se extirparon de cada animal y se homogeneizaron en PBS de Dulbecco estéril (Gibco) que contenía 1% de Triton X-100. Se ensayaron partes alícuotas de 200 \mul duplicadas del homogenado en un luminómetro Wallac Autolumat modelo 953B. Se calcularon los valores de RLU medios, la desviación estándar de la media y la significación estadística (prueba t de dos colas pareada). Los resultados se muestran en las siguientes Tablas 3a-3c:

TABLA 3a Actividad Antimicobacteriana In Vivo de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano contra Mycobacterium bovis (rBCG) en Bazos

27

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3b Actividad Antimicobacteriana In Vivo de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano contra Mycobacterium tuberculosis (rMTB) en Bazos

28

TABLA 3c Actividad Antimicobacteriana In Vivo de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano contra Mycobacterium tuberculosis (rMTB) en Pulmones

29

A Significación estadística a partir de la prueba t de dos colas apareada

B Animales infectados pero no tratados que servían como el control negativo.

Ejemplo 21 3S-Azido-7-nitro-2,3-dihidro-[2-1b]imidazopirano

30

Método A

p-Toluenosulfonato de 3R-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

Una solución de 1 g (5,4 milimoles) del alcohol preparado en el Ejemplo 7 en piridina seca (5 ml) y 2 g (10,5 milimoles) de cloruro de p-toluenosulfonilo se agitó a 40-50ºC durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en agua fría y el precipitado se recogió mediante filtración, se lavó con metanol y se secó (MgSO_{4}) para dar 1,54 g (83%) del compuesto del título: ^{1}H NMR (DMSO: \delta 2,44 (s, 3H), 4,20 (d, 1H), 4,32-4,45 (m, 2H), 4,57 (d, 1H), 7,51 (d, 2H), 7,87 (d, 2H), 8,81 (s,1H); ^{13}C NMR (DMSO) \delta 22,60, 48,65, 69,72, 71,07, 119,25, 129,08, 131,84, 133,86, 147,08; MS 340 (M+H)^{+}.

Una solución de 430 mg (1,27 milimoles) del tosilato preparado previamente y 100 mg (1,53 milimoles) de azida sódica en 5 ml de DMSO seco se calentó en un baño de aceite (65ºC) durante 24 h. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, se extinguió con agua y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se secaron (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. El residuo se recristalizó en acetato de etilo/hexano para dar la azida como agujas de color amarillo claro: pe 157,5ºC (desc.); [\alpha]^{25}D (DMF, c=1,0)=-84,2º; ^{1}H NMR (DMSO) \delta 4,18 (d, 1H), 4,33 (dd, 1H), 4,57(d, 2H), 4,65 (d, 1H), 8,08 (s, 1H); ^{13}CNMR (DMSO)548,11, 52,28, 69,57, 69,71, 119,39, 129,07, 131,82, 143,59, 148,14; MS 211(M+H)^{+}.

Método B

p-Toluenosulfonato de (3R)-1-(2'-hidroxi-3'-t-butildimetilsililoxi)-propil-2,4-dinitroimidazol

El alcohol en bruto (12,4 g) obtenido a partir del Ejemplo 5 se disolvió en 50 ml de piridina seca y se añadieron 14 g (73,5 milimoles) de cloruro de p-tolueosulfonilo. La reacción se agitó a 60ºC durante 6 h. La piridina se retiró mediante evaporación a presión reducida y el residuo se distribuyó entre 300 ml de acetato de etilo y 300 ml de HCl acuoso 0,01 N. La capa orgánica se separó, se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El producto en bruto se purificó mediante cristalización en acetato de etilo/hexano para dar 8,1 g del tosilato. Se obtuvo una segunda partida de tosilato a partir de las aguas madres mediante cromatografía en columna (hexano:acetato de etilo, 6:1): rendimiento 2,9 g. Se obtuvo un rendimiento total de 61% (11 g): pe 139-141,5ºC; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,05 (s, 6H), 0,85 (s, 9H), 3,84 (dd, 1H), 3,93 (dd, 1H), 4,39 (dd, 1H), 4,77 (m, 1H), 4,90 (dd, 1H), 7,18 (d, 2H), 7,47 (d, 2H), 7,65 (s, 1H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}) \delta 54,55, 4,52, 19,21, 22,58, 26,74, 52,89, 63,97, 79,26, 125,57, 128,10, 131,16, 132,97, 144,06, 147,50; MS 443 (M- t-butilo)^{+}.

p-Toluenosulfonato de 3R-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

El tosilato preparado previamente (9,4 g, 18,8 milimoles) se disolvió en 60 ml de THF seco y se añadieron a la mezcla de reacción a temperatura ambiente 19 ml (1,0 M) de fluoruro de tetrabutilamonio en THF. La solución resultante se agitó durante 5 minutos, momento en el cual el producto precipitaba. El precipitado se lavó con metanol y se secó sobre P_{2}O_{5} para dar 4,66 g (73%) del tosilato idéntico a la muestra preparada en el Ejemplo 28.

Ejemplo 22 3S-Amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

31

Se añadió un exceso de dos veces de propano-1,3-ditiol (0,25 ml) y trietilamina (0,348 ml) a una solución del azidocompuesto preparado en el Ejemplo 21 (105 mg, 0,5 milimoles) en 2,5 ml de metanol seco recientemente destilado (magnesio metálico). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, tiempo durante el cual la solución de reacción se volvía transparente. Los disolventes se retiraron mediante evaporación a presión reducida y el residuo se aplicó a una columna Dowex 50 (forma H^{+} en metanol) y se lavó con metanol para retirar el tiol que quedaba. El producto se obtuvo eluyendo la columna con metanol:trietilamina (19:1). Después de la retirada de los disolventes, el residuo se neutralizó con 0,5 ml de HCl 1N hasta pH 6 y la solución se evaporó hasta sequedad dando 110 mg del compuesto del título (100%): ^{1}H NMR (DMSO) \delta 4,05 (s, 1H), 4,24 (d, 1H), 4,41 (dd, 1H), 4,61(s, 2H), 8,18 (s, 1H); ^{13}CNMR (DMSO) \delta 43,00, 49,85, 72,10, 119,56, 143,39, 148,74; MS 184 (amina M)^{+}.

Ejemplo 23 4-Trifluorometoxifenilacetamida de 3S-(4-amino)-7-nitro-3,4-dihidro-[2,1-b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

32

Cianuro de 4-trifluorometoxibencilo. Se añadieron 441 mg (8,99 milimoles) de cianuro sódico a una solución que contenía 2,085 g (8,18 milimoles) de bromuro de 4-trifluorometoxibencilo en 10 ml de DMF seco. La reacción se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, se vertió en agua y se extrajo con acetato de etilo (2x40 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron. El producto en bruto se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.

Ácido 4-trifluorometoxifenilacético. El cianuro obtenido a partir de la reacción previa se calentó a temperatura de reflujo en 50 ml de NaOH acuoso 1N durante 1 h y se enfrió hasta temperatura ambiente y se acidificó hasta pH 3 con H_{2}SO_{4} 1N. Se recogió un sólido blanco y se secó sobre P_{2}O_{5} proporcionando 1,6 g de ácido (rendimiento total para las dos etapas 88,9%): pe 85-86ºC; ^{1}H NMR (DMSO) \delta 3,66 (s, 2H), 7,30 (d, 2H), 7,41 (d, 2H), 12,50 (ancho, 1H); ^{13}CNMR (DMSO) \delta 122,09, 132,64, 135,96, 148,63, 173,74.

Una solución de ácido 4-trifluorometoxifenilacético (110 mg, 0,5 milimoles), 110 mg (0,5 milimoles) de la sal de hidrocloruro de amina preparada en el Ejemplo 29, 227 mg (0,6 milimoles) de HBTU y 121 mg (1,2 milimoles) de N-metilmorfolina (NMMM) en 5 ml de DMF se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. El producto se extrajo con acetato de etilo, se lavó con HCl 0,01 N, NaHCO_{3} saturado y agua. La capa orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}) y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice usando acetato de etilo como el eluyente proporcionando 136 mg (70%) del compuesto del título: pe 167-168ºC (desc.); ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 4,16-4,53 (m,5H), 5,11(s, 2H), 7,13-7,34(m, 611); ^{13}CNMR (CDC13) \delta 43,61, 48,96, 67,04, 70,58, 116,40, 121,91, 130,17, 144,13, 148,30; MS 403 (M+H)^{+}.

Ejemplo 24 Fenilacetamida de amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano 3S

33

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 23 y substituir el ácido 4-trifluorometoxifenilacético por ácido fenilacético daba el compuesto del título: ^{1}H NMR (cdlc_{3}) \delta 3,64 (s, 2H), 4,00 (d, 1H), 4,16 (dd, 1H), 4,33 (dd, 1H), 4,50 (d, 1H), 4,77 (m, 1H), 7,20-7,31 (m, 6H), 8,87 (d, 1H); ^{13}C NMR(CDCl_{3}) \delta 41,27, 43,83, 49,02, 71,03, 116,09, 127,84, 129,46, 130,32, 136,27, 143,94, 148,76, 172,84; MS 303 (M+H)^{+}.

Ejemplo 25 4-Bromofenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

34

Se añadió cloruro de cobre (0,11 milimoles) a una solución de 210 mg (1,13 milimoles) del alcohol preparado en el Ejemplo 3 y 246 mg (1,24 milimoles) de isocianato de 4-bromofenilo en DMF seca (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h, se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió EtOAc (50 ml). La solución orgánica se lavó con HCl 0,2 M (20 ml) y agua (2x40 ml). Los extractos orgánicos se separaron, se secaron (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano:EtOAc) para dar 334 mg (77%) del compuesto del título: pe 235ºC (desc.); ^{1}H NMR (DMSO) \delta 10,06 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,46 (m, 4H), 5,43 (s, 1H), 4,65 (s, 2H), 4,41 (q, 2H); MS 383 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{13}H_{11}N_{4}O_{5}Br: C, 40,75; H, 2,89; N,14,62. Encontrado: C, 40,77; H, 2,92; N, 14,51.

Ejemplo 26 4-(Trifluorometoxi)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

35

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 25 y substituir el isocianato de 4-bromofenilo por isocianato de 4-(trifluorometoxi)fenilo daba el compuesto del título: pe 220ºC (desc.); ^{1}H NMR (DMSO) \delta 10,12 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,55 (d, 2H) 7,32 (d, 2H), 5,44 (s,1H), 4,61 (s, 2H), 4,35 (q, 2H); MS 388 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{14}H_{11}N_{4}O_{6}F_{3}: C, 43,31; H, 2,86; N,14,43. Encontrado: C,43,23; H, 2,87; N, 14,32.

Ejemplo 27 4-(Trifluorometil)feilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

36

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 25 y substituir el isocianato de 4-bromofenilo por isocianato de 4-(trifluorometil)fenilo daba el compuesto del título (denominado en el Ejemplo 25 PA Nº 1327): pe 240ºC (desc.); ^{1}H NMR (DMSO) \delta 10,33 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,67 (s, 4H), 5,47 (s, 1H), 4,66 (s, 2H), 4,38 (q, 2H); MS 373 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{14}H_{11}N_{4}O_{5}F_{3}: C, 45,17; H, 2,98; N, 15,05. Encontrado: C, 44,60; H, 2,89; N, 14,86.

Ejemplo 28 4-(Trifluorometoxi)bencilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

37

Se añadió hidruro sódico (1,34 milimoles) en porciones a una solución de 207 mg (1,12 milimoles) del alcohol preparado en el Ejemplo 3 y 217 mg (1,34 milimoles) de 1,1-carbonildiimidazol en DMF seca (5 ml) a -60ºC. La mezcla de reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 3 h. Se añadió 4-(trifluorometoxi)bencilamina y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se diluyó con EtOAc (50 ml), se extinguió con HCl 0,2 M (40 ml), la capa orgánica se separó, se lavó con agua (2x40 ml), se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. El residuo se sometió a cromatografía en columna (EtOAc:hexano) proporcionando 82 mg (18%) del compuesto del título: pe 182ºC (desc.); ^{1}H NMR (DMSO) \delta 8,09 (d,2H), 7,35 (d, 4H), 5,30 (s, 1H), 4,57 (s, 2H), 4,21-4,35 (m, 4H); MS 403 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{15}H_{13}N_{4}O_{6}F_{3}: C, 44,79; H, 3,26; N, 13,93. Encontrado: C, 44,61; H, 3,26; N, 13,82.

Ejemplo 29 3S-4-(Trifluorometoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

38

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 33 y substituir el bromuro de 4-(trifluorometoxi)bencilo por cloruro de 4-trifluorometilbencilo daba el compuesto del título (denominado en el Ejemplo 25 PA Nº 636) con un rendimiento de 68%: pe 215-216ºC; ^{1}H NMR (DMSO) \delta 8,04 (s, 1H), 7,70 (d, 2H), 7,54 (d, 2H), 4,76 (m, 3H), 4,50 (d, 1H), 4,27 (m, 3H); MS 344 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{14}H_{12}N_{3}O_{4}F_{3}: C, 48,99; H, 3,52; N, 12,24. Encontrado: C, 48,45; H, 3,53; N, 12,11.

Ejemplo 30 4-(2,2,2-Trifluoroetoxi)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

39

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 28 y substituir la 4-(trifluorometoxi)bencilamina por 4-(2,2,2-trifluoroetoxi)anilina (Chem, Pharm, Bull., 44(2):314-327 (1996)) da el compuesto del título.

Ejemplo 31 4-(2,2,3,3-Tetrafluoropropoxi)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

40

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 28 y substituir la 4-(trifluorometoxi)bencilamina por 4-(2,2,3,3-tetrafluoropropoxi)anilina (Chem, Pharm, Bull., 44(2):314-327 (1996)) da el compuesto del título.

Ejemplo 32 4-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropoxi)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

41

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 28 y substituir la 4-(trifluorometoxi)bencilamina por 4-(2,2,3,3,3-pentafluoropropoxi)anilina (Chem, Pharm, Bull., 44(2):314-327 (1996)) da el compuesto del título.

Ejemplo 33 3S-4-(Trifluorometoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

42

Se añadió hidruro sódico (0,09 moles) durante 5 minutos a una solución de bromuro de 4-(trifluorometoxi)bencilo (0,09 moles) y el alcohol (0,075 moles) que se preparaba en el Ejemplo 3 en DMF seca (90 ml) enfriada hasta -60ºC. Después de 1 h, la mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas adicionales. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (400 ml), se lavó con agua (3x200 ml), se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se evaporó. El residuo se sometió a cromatografía en columna (EtOAc:hexano) y el producto obtenido se recristalizó en metanol a ebullición, dando 18,6 g (70%) del compuesto del título (denominado en el Ejemplo 25 PA N1 824): pe 149-150ºC; ^{1}H NMR (DMSO) \delta 8,05 (s,1H), 7,43 (d, 2H), 7,35 (d, 2H), 4,69 (m, 3H), 4,50 (d,1H), 4,26 (m, 3H); MS 360 (M+H)^{+}.

Análisis calculado para C_{14}H_{12}N_{3}O_{5}F_{3}: C, 46,81; H, 3,37; N, 11,70. Encontrado: C, 46,58; H, 3,34; N, 11,67.

Ejemplo 34 3S-4-(Yodo)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

43

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 33 y substituir el bromuro de 4-(trifluorometoxi)bencilo por bromuro de 4-yodobencilo (preparado en dos etapas a partir de ácido 4-yodobenzoico mediante la reducción del ácido con borano en THF seguido por bromación del alcohol bencílico con PBr_{3} en THF a 0ºC) da el compuesto del título.

Ejemplo 35 3S-4-(Trifluoroetoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

44

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 33 y substituir el bromuro de 4-(trifluorometoxi)bencilo por bromuro de 4-(trifluoroetoxi)bencilo (preparado a partir de 4-(trifluoroetoxi)benzoato de etilo (Chem, Pharm, Bull., 44(2):314-327 (1996)) mediante reducción con hidruro de litio y aluminio y bromación del alcohol bencílico resultante con PBr_{3}) da el compuesto del título.

Ejemplo 36 3S-4-(2,2,3,3-Tetrafluoropropoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

\vskip1.000000\baselineskip

45

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 33 y substituir el bromuro de 4-(trifluorometoxi)bencilo por bromuro de 4-(2,2,3,3-tetrafluoropropoxi)bencilo (preparado a partir de 4-(2,2,3,3-tetrafluoropropoxi)benzoato de etilo (Chem, Pharm, Bull., 44(2):314-327 (1996)), reducción con hidruro de litio y aluminio y bromación del alcohol bencílico resultante con PBr_{3}) da el compuesto del título.

Ejemplo 37 4-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano 3S

\vskip1.000000\baselineskip

46

Usar el procedimiento descrito en el Ejemplo 33 y substituir el bromuro de 4-(trifluorometoxi)bencilo por bromuro de 4-(2,2,3,3,3-pentafluoropropoxi)bencilo (preparado a partir de 4-(2,2,3,3,3-pentafuoropropoxi)benzoato de etilo (Chem, Pharm, Bull., 44(2):314-327 (1996)) reducción con hidruro de litio y aluminio y bromación del alcohol bencílico resultante con PBr_{3}) da el compuesto del título.

Ejemplo 38 4-Clorofenilurea de 3S-3-amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

47

Se añadieron 95 mg de isocianato de 4-clorobencilo en DMF a un matraz que contenía 69 mg (0,312 milimoles) de la sal de ácido clorhídrico de amina preparada en el Ejemplo 29 y 63 mg (0,624 milimoles) de N-metilmorfolina en DMF. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se vertió en HCl 0,01N y se extrajo con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó con NaCO_{3} acuoso saturado, agua, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice usando acetato de etilo como el eluyente para dar 93 mg (88%) del compuesto del título (denominado en el Ejemplo 25 PA Nº 1282): ^{1}H NMR (DMSO) \delta 4,07-4,58 (m, 5H), 6,92 (d, 1H), 7,28 (d, 2H), 7,40 (d, 2H), 8,10 (s,1H), 8,56 (s,1H); MS 338 (M+H)^{+}.

Ejemplo 39 Derivado de 2-(5-clorobencimidazol) de 3S-3-amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano

48

El compuesto del título se prepara haciendo reaccionar el aminiocompuesto preparado en el Ejemplo 22 con 2,5-diclorobencimidazol usando los procedimientos descritos en la Patente de Gran Bretaña Nº 1015937.

Ejemplo 40 Inhibición de Mycobacterium bovis (rBCG) bajo condiciones anaerobias

Una cepa recombinante de bacilo Calmette Guerin de Mycobacterium bovis (rBCG) se empleó como el organismo de prueba. Esta cepa se transformó con un vector lanzadera integrador que tenía un casete de expresión de luciferasa de luciérnaga (lux), denominado 361-lux. Se preparó un cultivo en fase logarítmica de rBCG-361-lux en caldo Middlebrook 7H9 (Difco) complementado con 10% (v/v) de enriquecimiento con ADC (BBL). Se pusieron partes alícuotas de 2 ml en tubos de plástico de 15 ml con tampón roscado y el oxígeno se retiró mediante la adición de 40 \mul de Oxyrase for Broth (Oxyrase Inc., Mansfield, OH). Después de 24 h de incubación a 37ºC, los compuestos listados en la Tabla 4 se añadieron hasta concentraciones finales de 0, 0,15, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5 ó 5,0 mg/ml. Después de 72 h de incubación anaerobia con los fármacos a 37ºC, los bacilos se sometieron a turbulencia en alto durante 10 segundos, se nodulizaron mediante centrifugación (10 minutos a 2.500 rpm en una centrífuga Beckman GS-6R) y se resuspendieron en medio reciente como previamente. Este procedimiento retiraba los fármacos mientras que recreaba el ambiente aerobio. Puesto que las micobacterias no crecerán sin oxígeno incluso en ausencia de compuestos inhibidores, el efecto de los fármacos bajo condiciones anaerobias solo puede medirse después de un período de recuperación adecuado. De acuerdo con esto, los bacilos libres de fármaco reaireados se incubaron 48 horas a 37ºC, después de lo cual se ensayaron partes alícuotas de 100 \mul duplicadas en un luminómetro Wallac Microlumat modelo 96P. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Actividad Anaerobia de PA-824 y Otros Compuestos Antimicobacterianos contra Mycobacterium bovis (rBCG-lux)

49

Todos los valores son % de control, medidos en RLUs.

Ejemplo 41 Inhibición In Vitro de Helicobacter pylori

Se obtuvieron cepas de referencia de Helicobacter pylori del Dr. Mike Osato, Departmen of Gastroenterology, Baylor College or Medicine, Huston, TX. Las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC, \mug/ml) de los fármacos de prueba se determinaron mediante el método de microdilución del caldo usando procedimientos de acuerdo con patrones aprobados de the National Committee for Clinical Laboratory Standards y las referencias citadas allí (Coudron, P.E. y C.W. Stratton, J. Clin. Microbiol 33(4): 1028-1030 (1995); DeCross, A.J., B.J. Marshall, R.W. McCallum, S.R. Hoffman, L.J. Barrett y R.L. Guerrant, J. Clin. Microbiol 31(8):1971-1974 (1993); Malanoski, G.J., G.M. Eliopoulous, M.J. Ferraro, R.C. Moellering, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(2):131-133 (1993) y National Committee for Clinical Laboratory Standards, Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, M11-A3, Tercera edición, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA, (1993)), excepto por las siguientes modificaciones:

1.

Medio: Infusión de cerebro-corazón complementada con 10% de suero equino y 0,25% de extracto de levadura

2.

Atmósfera de incubación: 35ºC, 10% de CO_{2}

3.

Inóculo: dilución 1:20 de una suspensión ajustada hasta turbidez de McFarland 1

4.

Tiempo de incubación: 72 horas

Las placas de prueba se examinaron visualmente al final de la incubación y los valores de MIC se determinaron como la concentración más baja que daba como resultado la inhibición completa del crecimiento.

Se probaron amoxicilina, metronidazol y claritromicina contra H. pylori ATCC 43 usando las condiciones descritas previamente. Las MICs resultantes estaban dentro de los valores esperados para estos fármacos. Las concentraciones inhibidoras mínimas (MIC) de diversos compuestos antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano substituidos en 3(S) contra H. pylori ATCC 43 se determinaron para compuestos sintetizados usando los procedimientos descritos aquí, que tienen la estructura general:

50

donde R es el substituyente mostrado en la Tabla 1. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5 Concentraciones Inhibidoras Mínimas (MIC) de Compuestos Antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano substituidos en 3(S) contra Helicobacter pylori

51

Ejemplo 42 Formulación CM-2 para Administración Oral e Intravenosa

Se añadió PA 824 (Ejemplo 41, 10 mg) a una solución de 1 ml de hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (Aldrich) acuosa al 10% (p/v) y se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. La suspensión resultante se sometió a ultrasonidos con un disruptor celular Vibra Cell (Sonics and Materials Inc.) durante 10 minutos usando una graduación de la punta de la sonda de 25% de amplitud. Se añadió lecitina congelada (100 mg, 10% (p/v), Sigma) y la suspensión se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente, se enfrió en un baño de hielo-agua y se sometió a ultrasonidos a 30% de amplitud durante 15 minutos manteniendo la temperatura de la solución por debajo de 50ºC.

Ejemplo 43 Actividad in vitro de PA 824 contra M. tuberculosis en Macrófagos Humanos

M. tuberculosis es muy propensa a la supervivencia dentro de células de macrófagos. Para ejercer un efecto, por lo tanto, un antibiótico debe ser capaz de penetrar en la membrana celular del mamífero y a continuación permanecer estable dentro del ambiente celular hostil. Además, las concentraciones del antibiótico en el sitio intracelular en el que reside el patógeno deben alcanzar niveles suficientemente altos para ejercer un efecto. La carga de patógeno dentro de los macrófagos durante el transcurso de la enfermedad representa una fuente medible de organismos viables, de modo que la capacidad para determinar si un antibiótico puede afectar a estos organismos es un criterio útil para predecir la eficacia terapéutica. En estos estudios, se usó un ensayo de bioluminiscencia para determinar la viabilidad bacteriana. Se usó H_{37}Rv de M. tuberculosis transformada con un vector integrador que tenía el gen de luciferasa de luciérnaga como la cepa de estimulación.

Células monocíticas THP-1 humanas (ATCC TIB-202) se diferenciaron como macrófagos mediante el tratamiento con 50 ng/ml de 12-miristato-13-acetato de forbol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se distribuyeron con una densidad de 4x10^{5}células por ml a pocillos de una placa de microvaloración de fondo plano de 48 pocillos. Después de la incubación a 37ºC durante 48 horas en una atmósfera de 5% de CO_{2}, las monocapas celulares se lavaron con medio RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT) inactivado térmicamente y se infectaron con un cultivo bacteriano en fase logarítmica con una multiplicidad de infección de 1:1. Después de la incubación durante 4 h a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}, las células se lavaron cinco veces con solución salina equilibrada de Hanks (GIBCO BRL) para retirar las bacterias del medio extracelular. Las células eucarióticas se sometieron a lisis mediante la adición de 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato que contenía 1% de Triton X-100. Partes alícuotas de 0,1 ml de lisado se transfirieron a una placa de microvaloración blanca opaca (MicroLite Nº 1, Dynatech Inc., Chantilly, VA) y las determinaciones luminiscentes se realizaron en un luminómetro Wallac Microlumat LB96P (Wallac Instruments, Gaithersburg, MD) para obtener una lectura de pretratamiento el día cero. Alternativamente, partes alícuotas de 0,2 ml se transfirieron a un tubo de ensayo Falcon 2054 y las medidas de la RLU se realizaron en un instrumento a Wallac Autolumat LB 953. El luminómetro inyectaba automáticamente 0,1 ml de luciferina 1 mM (R & D Systems, Minneapolis, MN) preparada en citrato trisódico 0,1M (pH 5,1) en cada tubo o pocillo. La luminiscencia se midió durante 15 segundos y se expresaba como unidades de luz relativas (RLUs). Se añadió medio reciente (RPMI + 10% de FBS) a los pocillos restantes. Para investigar los efectos de los fármacos antimicobacterianos, el medio se complementó con concentraciones seleccionadas de isoniazida o rifampina (Sigma) preparadas en agua desionizada estéril o dimetilsulfóxido (Sigma), respectivamente. El fármaco se dejó en contacto con las células durante el transcurso del experimento o se retiró después de 1,5 h lavando la monocapa con medio RPMI reciente. Las células en pocillos por duplicado se sometieron a lisis a intervalos diarios deseados y se realizó el ensayo de bioluminiscencia descrito previamente. Tanto la isoniazida como la PA 824 se probaron a concentraciones equivalentes a sus valores de MIC in vitro y a concentraciones por encima y por debajo de este valor. Se incluyeron controles que no recibían tratamiento con fármaco, pero se trataban con agua desionizada estéril o DMSO para simular los efectos de los diluyentes usados para preparar isoniazida y PA 824, respectivamente.

Los propios macrófagos no contribuían a la reacción de luminiscencia, puesto que los niveles de RLU para células infectadas permanecían en valores de fondo a lo largo del transcurso del experimento. Durante este tiempo, los valores de RLU para macrófagos infectados con la cepa de M. tuberculosis recombinante se incrementaban drásticamente reflejando un crecimiento intracelular de las bacterias recombinantes. Según se muestra en las Tablas 6-8, concentraciones de PA 824 de 0,25 \mug/ml y mayores eran suficientes para prevenir el crecimiento intracelular de M. tuberculosis. Se observó una clara respuesta relacionada con la dosis a concentraciones de hasta 2,0 \mug/ml. La isoniazida alcanzaba una inhibición similar a concentraciones por encima de 0,06 \mug/ml.

TABLA 6 Valores de RLU para Controles

52

TABLA 7 Valores de RLU para INH Medidos a 0,13, 0,06 y 0,03 \mug/ml

53

TABLA 8 Valores de RLU para PA 824 Medidos a 2,0-0,6 \mug/ml

54

Los valores de RLU se miden para cuatro determinaciones

SD: desviación estándar de la media

Ejemplo 44 Valores de Concentración Inhibidora de Compuestos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano Substituidos en 3(S) Contra el Protozoo Intestinal Cryptosporidium parvum

La prueba de susceptibilidad frente a Crypotosporidium se realizó de acuerdo con procedimientos publicados (K. Woods, M. Nesterenko, S. Upton, "Development of a microtiter ELISA to quantify development of Cryptosporidium parvum in vitro", FEMS Microbiology Letters, 128:89-94 (1995).

Los compuestos se solubilizaron hasta una concentración de 100 mg/ml en DMSO al 100%. Soluciones en DMSO de los compuestos de prueba se añadieron a los pocillos de prueba de una microplaca a un volumen que producía una concentración final de DMSO de 0,2%. Se prepararon microcapas de células de adenocarcinoma ileocecal humano (HCT-8) mediante crecimiento en medio RPMI 1640 en bandejas de cultivo tisular de 95 pocillos durante 24 horas. Los ooquistes de C. parvum se dejaron exquistar en lejía al 10% durante 10 minutos antes del uso. Las monocapas se infectaron a continuación con 2-3 x 10^{4} ooquistes/pocillo y se incubaron en presencia o ausencia de compuesto durante 48 h a 35ºC en 5% de CO_{2} y 95% de humedad. El fondo consistía en pocillos que contenían ooquistes muertos (ciclo de congelación-descongelación después de 30 segundos de exposición a nitrógeno líquido). Los pocillos de control del crecimiento se infectaron con 2-3x10^{4} ooquistes/pocillo en ausencia de compuestos de prueba. Al final de la incubación, los pocillos se lavaron y se fijaron añadiendo 100 \mul de formalina al 4% en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) por pocillo durante 2 h. Después de bloquear con albúmina de suero bovino al 1% y Tween 20 al 0,002%, se añadieron 50 \mul de antisuero anti-proteína de membrana de Cryptosporidium de rata. Después de 30 minutos, los pocillos se lavaron en PBS y se añadieron 50 \mul de anticuerpo secundario (anti-anticuerpo de rata caprino conjugado con peroxidasa de rábano picante). Después de 20-30 minutos, los pocillos se lavaron de nuevo en PBS y se añadieron 50 \mul de solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. Las placas se dejaron revelarse durante 10-15 minutos y la densidad óptica se leyó a 630 nm. El porcentaje de inhibición se calculó comparando la densidad óptica del grupo tratado con fármaco con la del control no tratado. Según se muestra en la Tabla 9, PA 824 en una concentración de 25 \mug/ml inhibía el crecimiento en 52% (IC50=25 mg/ml). También se observó una clara respuesta relacionada con la dosis para PA 824.

Las concentraciones inhibidoras de diversos compuestos antibacterianos de 7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano substituidos en 3(S) contra Cryptosporidium parvum usando el método descrito previamente se determinaron para compuestos sintetizados usando los procedimientos descritos aquí, que tienen la estructura general:

55

donde R es el substituyente mostrado en la Tabla 1. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9 Porcentaje de Inhibición de C. parvum por el Compuesto PA Indicado

56

Claims (8)

1. Un compuesto de la fórmula:

57

en la que R_{1} es hidrógeno,

Y es CH_{2}; y Z es CH_{2}, CO, CHR_{4} o NR_{4}, donde R_{4} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, alcoxiarilo, alcoxialcoxiarilo, alquilheterociclo, alcoxiheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, alquilarilarilo, arilalquilarilo, -NHCOR_{5}, -OCONHR_{5}, -NHCONHR_{5}, OCO_{2}R_{5}, -NHSO_{2}R_{5}, -NHSO_{2}NHR_{5}, -NHC=NHR_{5} y NHR_{5}, en donde R_{5} se selecciona de hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxialquilo, alcoxiarilo, alcoxialcoxiarilo, alquilheterociclo, alcoxiheterociclo, heterociclo substituido, heterociclo, alquilarilarilo, arilalquilarilo;

en donde el alquilo inferior es un grupo alquilo de cadena ramificada o lineal que comprende de uno a diez átomos de carbono que no están substituidos o están substituidos con uno o más grupos halógeno, en donde alcoxi se refiere a RO-, en donde R es alquilo inferior según se define previamente;

en donde el arilo es un fenilo o un sistema anular carbocíclico bicíclico de 9 ó 10 átomos de carbono que tiene uno o más anillos aromáticos, en donde dichos grupos arilo pueden no estar substituidos o estar substituidos con uno, dos, tres, cuatro o cinco substituyentes seleccionados independientemente de alquilo inferior, haloalquilo, alcoxi, arilo, alcoxiarilo y halo;

en donde un heterociclo es un anillo de 3 ó 4 miembros substituido o no substituido que contiene un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno y azufre o un anillo de 5 ó 6 miembros substituido o no substituido que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno o azufre, en donde el anillo de 5 miembros tiene 0-2 dobles enlaces y el anillo de 6 miembros tiene 0-3 dobles enlaces; en donde el átomo de nitrógeno y azufre puede estar opcionalmente oxidado; en donde los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente cuaternizados; e incluyendo cualquier grupo bicíclico en el que cualquiera de los anillos heterocíclicos previos está condensado a un anillo bencénico u otro anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros, en donde los restos heterociclo pueden estar opcionalmente substituidos con de uno a tres substituyentes recogidos independientemente de amino, alquilamino, halógeno, alquilacilamino, alquilo inferior, arilo y alcoxi;

en donde el cicloalquilo es un grupo alicíclico que comprende de tres a siete átomos de carbono;

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R_{4} es hidrógeno, alquilo inferior, arilo, alquilarilo, alcoxiarilo y alcoxialcoxiarilo.

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la fórmula; 3S-n-octiloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 3R-n-octiloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 4-benciloxibenzamida de 3R-amino-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 4-trifluorometoxifenilacetamida de 3S-(4-amino)-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; fenilacetamida de 3S-amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 4-bromofenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; (4-trifluorometil)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 4-(trifluorometoxi)bencilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 3S-4-(trifluorometil)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 4-(2,2,2-trifluoroetoxi)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 4-(2,2,3,3,3-pentafluoropropoxi)fenilcarbamato de 3S-hidroxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 3S-4-(yodo)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihi-
dro-[2-1b]imidazopirano; 4-clorofenilurea de 3S-3-amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; derivado de 2-(5-clorobencimidazol) de 3S-3-amino-7-nitro-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 3S-4-(trifluorometoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; 3S-4-(trifluoroetoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano;
3S-4-(2,2,3,3-tetrafluoropropoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano y 3S-4-(2,2,3,3,3-pentafluoropropoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; y los estereoisómeros y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

4. Un compuesto de acuerdo con cualquiera reivindicación precedente, que tiene la fórmula 3S-4-(trifluorometoxi)benciloxi-7-nitro-2H-3,4-dihidro-[2-1b]imidazopirano; y los estereoisómeros y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

5. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y los estereoisómeros y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, para usar como un producto farmacéutico.

6. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un ser humano o un animal que sufre una infección por micobacterias patógenas, Clostridium, Crypotosporidium o Helicobacter.

7. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la bacteria patógena es Mycobacteria leprae, Mycobacterium avium complex, Clostridium difficile o Helicobacter pylori.

8. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la bacteria patógena es una cepa resistente a múltiples fármacos de Mycobacteria tuberculosis.