ES2233960T3 - Copolimeros cationicos de vinilamina y alcohol vinilico para la administracion de oligonucleotidos. - Google Patents
Copolimeros cationicos de vinilamina y alcohol vinilico para la administracion de oligonucleotidos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION, SE REFIERE A UN METODO MEJORADO PARA LA LIBERACION DE OLIGONUCLEOTIDOS EN EL CITOPLASMA, UTILIZANDO COPOLIMEROS CATIONICOS BASADOS EN ALCOHOL DE VINILO CON BAJOS NIVELES DE VINIL AMINA (PVAVAMS). SE PROPORCIONAN ASIMISMO COMPOSICIONES MEJORADAS PARA SER UTILIZADAS EN DICHO METODO.
Description
Copolímeros catiónicos de vinilamina y alcohol
vinílico para la administración de oligonucleótidos.
La invención se refiere a un método mejorado para
la liberación citoplásmica de oligonucleótidos y a composiciones
mejoradas para uso con un método de este tipo.
Los oligonucleótidos son moduladores potentes de
las propiedades celulares a nivel del ADN o ARN. Los
oligonucleótidos pueden diseñarse para emparejarse base por base a
un segmento específico de ADN (oligonucleótidos formadores de
tripletes) o ARN (oligonucleótidos antisentido) y, después de unirse
al ácido nucleico deseado, influir en la transcripción y/o
traducción con consecuencias bioquímicas y funcionales previsibles
aguas abajo, es decir inhiben la expresión génica. Todavía no se
conoce el mecanismo exacto por el cual actúan los oligonucleótidos
para inhibir la expresión génica en todos los casos. Avances
recientes en técnicas de síntesis orgánica y purificación han
facilitado la factibilidad de diseño y síntesis de los
oligonucleótidos.
Puesto que los oligonucleótidos están diseñados
para unirse específicamente a secuencias emparejadas, poseen un alto
grado de especificidad, y tienen numerosas potenciales aplicaciones
terapéuticas. Por ejemplo, los dos problemas más comunes asociados
con el uso de agentes anticáncer y antivirales son la resistencia a
los fármacos y niveles inaceptables de toxicidad. Éstos se pueden,
en potencia, superar mediante el uso de oligonucleótidos con un alto
grado de especificad porque: (1) genes que no contienen la
secuencia diana teóricamente no se ven afectados por los
oligonucleótidos, lo que reduce la probabilidad de toxicidad, y (2)
solo una mutación puntual dentro del sitio de unión del
oligonucleótido y no fuera de él puede conducir a una resistencia a
los fármacos. Por lo tanto, los oligonucleótidos se consideran
representantes de una clase de potentes agentes anticáncer y
antivirales.
La biodisponibilidad intracelular ineficaz de
oligonucleótidos, es decir la cantidad de oligonucleótido intacto
que está disponible de forma que puede interactuar con la diana
deseada, ha supuesto un obstáculo importante en el desarrollo de
oligonucleótidos como agentes terapéuticos. Factores claves que
contribuyen a la biodisponibilidad intracelular ineficaz son una
mala estabilidad, unión no específica, y deficiente absorción
celular y tisular.
Mucho esfuerzo se ha dirigido al diseño de
derivados de oligonucleótidos con propiedades mejoradas.
Modificaciones en el nucleósido, el esqueleto de azúcares, el
extremo, o la estereoquímica comprenden las cuatro categorías
principales de derivatización; véase Uhlmann y Peyman,
Chem. Rev., 90: 543-584 (1990).
Además, se están investigando varias estrategias de suministro que
podrían salvar algunos de estos problemas; véase Akhtar y
Juliano, Trends in Cell Biology, 2:
139-144 (1992) y las referencias citadas en la
misma.
El mecanismo de absorción celular no se comprende
del todo. Por ejemplo, no está claro si la absorción de los
oligonucleótidos ocurre a través de un mecanismo de transporte en
la membrana celular descrito previamente, o a través de una vía
única; véase Wu-Pong, Pharmaceutical
Tech., Págs. 102-112 (Oct. 1994). Además,
parece que el mecanismo de absorción puede ser del tipo celular y/o
del tipo de oligonucleótido. Íd. La evidencia actual apunta a que
los oligonucleótidos penetran en las células predominantemente por
endocitosis. La endocitosis se clasifica típicamente como
endocitosis mediada por receptores (EMR), endocitosis por adsorción
(EA) o endocitosis en fase fluida (EFF).
Después de la endocitosis, los oligonucleótidos
tienen que escapar de sus compartimientos endosomales para poder
ejercer sus efectos en el núcleo o el citoplasma. El mecanismo
exacto y el alcance de la transferencia de oligonucleótidos desde
los endosomas a dianas del citoplasma y/o del núcleo todavía no se
ha determinado. Mecanismos posibles son difusión sencilla,
desestabilización transitoria de la membrana, o una fuga sencilla
durante un proceso de fusión en el cual los endosomas se fusionan
con otras vesículas tales como lisosomas. Para que los
oligonucleótidos absorbidos por endocitosis sean de utilidad, su
eflujo de compartimientos endosomales tiene que mejorarse.
Se han propuesto diversos métodos de síntesis en
la bibliografía para mejorar la biodisponibilidad intracelular. Un
enfoque descrito es la fijación covalente de ligandos de receptores
celulares específicos para iniciar la absorción celular por
endocitosis mediada por receptores; véase Vestweber y Schatz,
Nature, 338: 170-172 (1989). La
modificación covalente de oligonucleótidos generalmente implica el
uso de policationes y representa un proceso laborioso que requiere
una síntesis y purificación separadas para cada oligonucleótido
ensayado. Se ha descrito el uso de policationes tales como
poli-L-lisina en estudios de
transfección génica; véase Felgner, Advanced Drug Delivery
Reviews, 5: 163-187 (1990). Sin embargo,
a diferencia de la transfección génica, en la cual se necesitan
relativamente pocas copias de ADN, el uso de oligonucleótidos como
un agente terapéutico requeriría altos niveles de ADN, y
modificación covalente utilizando policationes tales como
poli-L-lisina podría resultar tóxico
para las células.
El documento
BE-A-751299 (KakenyaKu KaKo KK)
describe una composición de una poliamina básica y un ADN para el
uso en las lesiones de reabsorción provocadas por radiación.
El documento
WO-A-94/18834 (Virginia Tech
Intellectual Properties) describe un segmento de ADN que forma un
complejo con un policatión tal como polilisina o poliarginina para
inserción en el genoma de un animal receptor.
El enfoque más común que se está investigando es
el uso de vesículas de fosfolípidos (liposomas) para suministrar
oligonucleótidos a células; véase Akhtar et al.,
Nucleic Acids Res., 19: 5551-5559
(1991). Además de proteger los oligonucleótidos frente a una
degradación enzimática, los liposomas ofrecen el potencial de
controlar y mantener su liberación. Íd. El eflujo de
oligonucleótidos a partir de liposomas parece ser lento y sostenible
durante un periodo de varios días, lo que sugiere que pueden ser
útiles en el suministro de oligonucleótidos frente a dianas que
tienen una reposición lenta. Íd. Sin embargo, como en el
caso de otros policationes, lípidos catiónicos y liposomas (por
ejemplo, Lipofectin®) generalmente son tóxicos para las células y
suministran el ADN de forma ineficaz en presencia de suero;
véase Leonnetti et al., P.N.A.S. USA,
87: 2448-2451 (1990).
Existen publicaciones extensas sobre la síntesis
y el uso de copolímeros, basados en alcohol vinílico con niveles
variables de amina vinílica en la industria del papel; véase
la Publicación de Patente Europea 337310; la Publicación de
Patente Europea 339371; la Publicación de Patente Europea 617166;
las Patentes Estadounidenses 4.774.285, 4.880.497. 4978.427 y
5.270.379, y como floculantes; véase la Patente
Estadounidense 3.715.336. No se conoce informes hasta la fecha
relacionados con el uso de copolímeros de alcohol vinilo/amina
vinílica para la terapia celular.
Las modificaciones de oligonucleótidos y/o
sistemas de suministro de los mismos descritos en la bibliografía
han conducido a una mejorada eficacia de la absorción celular de
oligonucleótidos; sin embargo, todavía no han permitido que se
desarrolle el potencial completo de la tecnología de
oligonucleótidos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar
métodos mejorados para aumentar la biodisponibilidad intracelular
de oligonucleótidos. Es un objeto de la presente invención
proporcionar dichos métodos. Es un objeto adicional de la invención
proporcionar composiciones para el uso en dichos métodos.
La presente invención se refiere, más
concretamente, a un método mejorado para el suministro citoplásmico
de oligonucleótidos y a composiciones mejoradas para uso en dichos
métodos. La presente invención surgió de estudios en los cuales
copolímeros basados en alcohol vinílico y amina vinílica (PAVYAVs)
se utilizaron para suministrar polianiones (aquí, oligonucleótidos)
en células. De modo sorprendente, los PAVYAVs proporcionan un
sistema eficaz para conseguir el suministro nuclear de
oligonucleótidos en células, en la presencia de suero y con una
toxicidad baja.
Según la presente invención, se proporciona una
composición que comprende un copolímero de la fórmula general I,
(I)-(CH2-HCOH-)x-(CH2-HCNR1R2R3)y-Az-
donde R1, R2 y R3 son,
independientemente, hidrógeno, alquilo inferior ó
2-hidroxialquilo, o R1 = R2 = hidrógeno, alquilo
inferior ó 2-hidroxialquilo y R3 es un par de
electrones
solitario
A es el residuo de un monómero
vinílico
x, y y z son números enteros que
representan el número de monómeros incorporados y donde x + y + z =
1000
en donde x =
25-99.5% en moles, y = 0.5-75% en
moles, y z<50% en moles, combinada con un oligonucleótido, en
donde la relación en moles de "y" a unidades de anión es
0,1-100, opcionalmente en un vehículo
farmacéuticamente
aceptable.
Las composiciones de la presente invención
comprenden la combinación de PAVYAVs, con un contenido variable de
amina vinílica en % en moles con respecto a un oligonucleótido, tal
que la relación molar de amina vinílica polimerizada a unidades de
anión de oligonucleótido está entre 0,1-100.
Preferiblemente, la relación molar es 0,2-30. Se
prefiere más una fracción en moles de 0,2-15.
Los métodos de la presente invención comprenden
la administración in vitro de composiciones de PAVYAV/
oligonucleótido a las células, tal que el oligonucleótido se
transporte dentro de las células.
Los PAVYAVS utilizados por los métodos de la
presente invención se preparan utilizando monómeros vinílicos
hidrófobos e hidrófilos susceptibles a la polimerización y tienen
un contenido en amina vinílica de 0,5-75% en moles.
Preferiblemente, los PAVYAVs se preparan utilizando polímeros
precursores de acetato vinílico/formamida vinílica y alcohol
vinílico/formamida vinílica y tienen un contenido en amina vinílica
de 4-20% en moles. En la realización más preferida,
el PAVYAV tiene un contenido de 6-15% en moles de
amina vinílica.
Los polianiones aquí descritos son generalmente
de un tamaño macromolecular. Sin embargo, también se describen
materiales de bajo peso molecular que tienen la capacidad de formar
complejos con PAVYAVs, es decir contienen regiones de carácter
aniónico (unidades aniónicas). El polianión es un oligonucleótido o
un polinucleótido. En una realización preferida de la invención, el
polianión es un oligonucleótido antisentido.
Copolímeros de la presente invención comprenden
el alcohol vinílico (AV) y amina vinílica (AMV) de la fórmula
general I,
(I)-(CH2-HCOH-)x-(CH2-HCNR1R2R3)y-Az-
donde R1, R2 y R3 son,
independientemente, hidrógeno, alquilo inferior ó
2-hidroxialquilo, o R1 = R2 = hidrógeno, alquilo
inferior ó 2-hidroxialquilo y R3 es un par de
electrones
solitario
A es el residuo de un monómero
vinílico
x,
y,
y z son números enteros que
representan el número de monómeros incorporados y donde x + y + z =
1000
Con el fin de describir la presente invención,
los copolímeros de la fórmula I serán denominados "PAVYAVs".
La frase "residuo de un monómero vinílico" se define como la
unidad de monómero después de la polimerización, y debe señalarse
que el PAVYAV final puede contener cantidades menores de unidades
residuales y fragmentos de iniciador.
En los PAVYAVs de la presente invención, se
prefiere que R1=R2=R3=hidrógeno y R3 sea un par de electrones
solitarios, y además, que x=25-99.5% en moles, y =
0,5-5% en moles, y z<50% en moles. Más preferido
es que x=80-96% en moles, y = 4-20%
en moles, y z \leq16% en moles. Lo más preferido es que
x=87-94% en moles, y = 6-13% en
moles, y z \leq10% en moles. Para los fines de la presente
invención, "% en moles" se define como el porcentaje de las
unidades molares totales en el polímero.
En general, el proceso de síntesis de polímeros
de PAVYAV dianas de la presente invención consiste en realizar una
serie de hidrólisis en un polímero precursor. El polímero precursor
se forma por la copolimerización de un monómero precursor de
alcohol vinílico tal como acetato vinílico (AcV) y un monómero
precursor de amina vinílica tal como formamida
N-vinílica (FNV). La polimerización por radicales
libres se lleva a cabo con métodos conocidos en el estado de la
técnica; véase, por ejemplo, Vinyl and Related
Polymers por C.E. Schildknecht, 1952, editado por John Wiley
& Sons, Inc. El acetato se hidroliza con una cantidad
catalítica (\sim 3% en moles) de base, tal como NaOH metanólico,
y la formamida se hidroliza con una cantidad levemente por encima de
la estequiométrica de bien o NaOH. Tales procesos de polimerización
se describen en detalle en la bibliografía; véase la
Publicación de Patente Europea 0339371 A2 (Pinschmidt y Lai), y las
referencias citadas en la misma. Una persona experta en la técnica
reconocerá variaciones en el método de preparación de los presentes
polímeros.
Monómeros vinílicos apropiados para la
polimerización incluyen monómeros convencionales hidrófobos e
hidrófilos. Monómeros apropiados hidrófobos incluyen, sin
limitación, acrilatos y metacrilatos de alquilo C_{1} a C_{18},
acrilamidas y metacrilamidas de alquilo C_{3} a C_{18},
acrilonitrilo, metacrilonitrilo, alquanoatos C_{1} a C_{18}
vinílicos, alquenos C_{2} a C_{18}, haloalquenos C_{2} a
C_{18}, estireno, alquil C_{1} a C_{6}- alquil éteres
vinílicos, en donde la parte alquilo tiene 1 a 6 átomos de carbono,
acrilatos y metacrilatos de perfluoroalquil C_{3} a
C_{12-}etil-tiocarbonilaminoetilo, acrilatos y
metacrilatos de fluoroalquilo, C_{3} a C_{12}, acriloxi- y
metacriloxi- aquilo-siloxanos,
N-vinil-carbazol, ésteres
alquílicos C_{1}-C_{12} de ácidos maleico,
fumárico, itacónico y mesacónico, y similares.
Ejemplos de monómeros hidrófobos apropiados
incluyen acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de
propilo, acrilato de isopropilo, acrilato de ciclohexilo, acrilato
de 2-etilhexilo, metacrilato de metilo, metacrilato
de propilo, acetato vinílico, propionato de vinilo, valerato de
vinilo, estireno, cloropreno, cloruro de vinilo, cloruro de
vinilideno, acrilonitrilo, 1-buteno, butadieno,
metacrilonitrilo, viniltolueno, vinil-etil-éter,
metacrilato de perfluorohexiletiltiocarbonilaminoetilo,
3-metacriloxipropilpentametildisiloxano, y
bis(metacriloxipropil)tetrametildisiloxano.
Monómeros hidrófilos apropiados incluyen, sin
limitación, acrilatos y metacrilatos de alquilo inferior
sustituidos con hidroxi, formamida N-vinílica,
acrilamida, metacrilamida, acrilamida y metacrilamida de alquilo
inferior C_{1}-C_{2}, acrilatos y metacrilatos
etoxilados, acrilamida y metacrilamide de alquilo inferior
sustituidos con hidroxi, éteres vinílicos de alquilo inferior
sustituidos con hidroxi, estireno-sulfonato sódico,
ácido
2-acrilamido-2-metilpropansulfónico,
N-vinilpirrol,
N-vinil-succinimida,
N-vinil- pirrolidina, 2 y 4-vinil-
piridina, ácido acrílico, ácido metacrílico, amino (incluido amonio
cuaternario), acrilatos o metacrilatos de monoalquilo
inferior-amino o dialquilo inferior amino, alcohol
alílico, y similares.
Los copolímeros de la presente invención también
son susceptibles a modificaciones menores con anhídridos, epóxidos,
isocianatos, carbonilos reactivos, haloalquilcarbonilos, ésteres,
aziridinas, aceptores de Michael, cloruros de ácidos, haluros de
alquilo inferior y similares. Ejemplos de reactivos modificadores
incluyen anhídrido succínico, anhídrido maleico, anhídrido
citracónico, ácido yodoacético, polioxietileno o derivados de
hidratos de carbono tal como ésteres activos, maleimidas, sulfonas
de vinilo y similares.
Las longitudes de los oligonucleótidos de la
presente invención pueden variar en cierto grado, pero generalmente
tienen una longitud de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30
nucleótidos. Por razones de practicidad comercial, se prefiere que
el oligonucleótido tenga una longitud de aproximadamente 14 hasta
aproximadamente 20 nucleótidos, ya que nucleótidos de mayor tamaño,
en el intervalo de 10 a 30, pueden hibridarse de forma no
específica a otras secuencias no diana si el oligonucleótido es
demasiado largo (es decir, sustancialmente más largo de 20
nucleótidos).
Composiciones preferidas incluidas en la presente
invención comprenden PAVYAVs en combinación con oligonucleótidos
antisentido. No se conoce la naturaleza de la interacción, pero se
supone que es de índole electroestática. Las composiciones se
pueden caracterizar de la siguiente forma: el PAVYAV sirve de
"vehículo" y el oligonucleótido de "pasajero", y la
combinación de PAVYAV y oligonucleótido es un "sistema o complejo
de vehículo y pasajero no covalente". La fracción de PAVYAV a
oligonucleótido en las composiciones está basada en las unidades
que contienen amina a unidades fosfato y varía de 0,001 a 1000,
preferiblemente de 0,01-500, más preferiblemente de
0,1-100, más preferiblemente de
0,2-30, y la fracción más preferida es de
2-15.
Se considera que los PAVYAVs de la presente
invención pueden usarse para el suministro de polinucleótidos y
oligonucleótidos a células. Dichas composiciones pueden
proporcionar los métodos de uso en un entorno clínico, por ejemplo,
la inhibición de la proliferación de células musculares lisas, el
tratamiento de trastornos de proliferación celular, la inflamación,
y el tratamiento de enfermedades virales. También se consideran las
mezclas de las composiciones de la presente invención con un
vehículo, farmacéuticamente diluyente, conservante, solubilizador,
adyuvantes y/o agentes emulsionantes farmacéuticamente aceptables;
véase Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª, Edición (1990, Mack
Publishing Co., Easton, PA 19042) páginas
1435-1712.
El Ejemplo 1 que figura continuación demuestra
los métodos de preparación de los componentes de las composiciones
de la presente invención. El Ejemplo 2 demuestra la preparación y
el uso de las presentes composiciones (y métodos). Como queda
demostrado en los estudios de absorción celular, las presentes
composiciones de PAVYAV facilitan la absorción celular de
oligonucleótidos antisentido.
Este ejemplo demuestra (i) la síntesis de
oligonucleótidos, (ii) el marcaje fluorescente de los
oligonucleótidos para uso como marcadores en los estudios de
absorción celular en el Ejemplo 2 y (iii) la preparación de diversos
copolímeros.
Los oligonucleótidos utilizados en los siguientes
ejemplos se sintetizaron con un sintetizador de ADN de Applied
Biosystems Inc. (Foster City, California), modelo 394. Enlaces de
fosforotioato modificados se introdujeron por oxidación del enlace
fosfito formado durante la síntesis de oligonucleótidos con
^{3}H-1,2-benzoditiol-3-1,1-dióxido
(reactivo de Beaucage, Glen Research, Sterling Virginia) en vez de
la oxidación estándar con yodo. Los cuatro fosforamiditos
nucleósidos comunes (es decir, adenosina, timidina, guanosina y
citidina) y deoxinosina fosforamidito se adquirieron de Applied
Biosystems Inc. Todos los fosfodiésteres sin modificar y los
oligonucleótidos modificados que contenían tioato se desprotegieron
con tratamiento con amoniaco concentrado a 55ºC durante 12 h. Los
oligonucleótidos se purificaron por cromatografía de exclusión de
gel y precipitación con etanol y se liofilizaron hasta
sequedad.
Los oligonucleótidos usados en los siguientes
ejemplos se modificaron completamente con enlaces fosforotioato y
se muestran a continuación:
| OLIGO 1 | GCT | GTG | GGG | CGG | CTC | CTG |
| OLIGO 2 | CGC | CGT | CGC | GGC | GGT | TGG |
El oligonucleótido 1 es un oligonucleótido
18-mero fosforotioato modificado que tiene una
composición de bases semejante a la secuencia humana
anti-c-myb antisentido. El oligonucleótido 2
es un oligonucleótido 18-mero fosforotioato
modificado sin ninguna diana antisentido conocida.
La fluoresceína se incorporó en los
oligonucleótidos en el extremo 5' utilizando fluoresceína amidita
adquirida de Glen Research (Sterling Virginia) que se utilizó según
las indicaciones del fabricante.
El texto que se presenta a continuación ilustra
la preparación y caracterización de los polímeros diana de PVAYAV
preparados a partir de la hidrólisis de polímeros precursores de
acetato vinílico/formamida vinílica y alcohol vinílico/formamida
vinílica. Los PAVYAVs preparados tenían un contenido variable en
amina vinílica. El contenido en amina vinílica de los PAVYAVs se
determinó por titulación potenciométrica.
Las preparaciones se ilustrarán en un
procedimiento de tres etapas: la Etapa 1 implica la síntesis del
polímero precursor de acetato vinílico/formamida vinílica; la etapa
2 implica la síntesis del polímero precursor de alcohol
vinílico/formamida vinílica; y la etapa 3 implica la síntesis del
copolímero PAVYAV diana. Los PAVYAVs preparados tenían un contenido
variable en amina vinílica (la relación de formamida
N-vinílica a acetato vinílico refleja la variación
del contenido de amina al de alcohol).
El contenido en amina vinílica en el PAVYAV se
midió por titulación potenciométrica de una cantidad pesada de
polímero (\sim0,5 g) disuelto en 100 mL de agua. Cuando el PAVYAV
estaba en forma de una base libre (por ejemplo, cuando se
había utilizado la hidrólisis de base acuosa de formamida), el pH
inicial estaba generalmente por encima de 10, y se llevó a
\sim1,99 con HCl, luego se aumentó a \sim12,01 con NaOH. Para
sales hidrocloruro generadas por hidrólisis ácida no acuosa de la
formamida, el pH inicial de 4 o inferior se aumentó a \sim12,01
con NaOH, luego se redujo a \sim1,99 con HCl. Las curvas de ambas
titulaciones para cada solución se compararon y mostraron una buena
concordancia para la respuesta de pH a mEq de titulante. Después de
la inspección de una representación gráfica de
\DeltapH/\DeltamEq, además de la propia curva de titulación, el
mEq de amina se determinó y se calcularon el porcentaje en peso y
el porcentaje en moles de amina.
Preparación
A
Etapa
1
El reactor (500 mL matraz con camisa de 4 bocas
equipado con un agitador de la parte de cabeza con palas de teflón
condensador, termómetro y conductos de alimentación de tubos de
teflon) contiene 1,42 g de formamida N-vinílica
(FNV), 84,28 g de acetato vinílico (AcV) (Polysciences) y 67 g de
metanol. La alimentación contiene 5,33 g de FNV y 36,55 g de AcV.
La polimerización se lleva a cabo a 60ºC bajo nitrógeno utilizando
0,51 g peroxineodecanoato de terc-butilo (AKZO
Chemicals Inc.). La alimentación se suministra a una velocidad de
aproximadamente 7 a 15 mL/h durante un periodo de 3 horas y se añade
metanol periódicamente para restaurar el volumen. La polimerización
se interrumpe con la adición de 14,8 mg de
metil-éter-hidroquinona (MEHQ) (Polysciences). El
exceso de AcV se repara por destilación azeotrópica con
metanol.
Etapa
2
El polímero de AcV/FNV (29 g) se mezcla
rápidamente con 1,6 g de NaOH al 50% (0,02 moles) en 150 mL de MeOH.
La hidrólisis se lleva a cabo a 40ºC durante 30 minutos. El
precipitado del polímero de AcV/FNV resultante se lava con MeOH y se
seca a 60ºC al vacío. El rendimiento es de 11,3 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FNV (8 g) se suspende en 72 mL
de metanol y se mezcla con 1,32 mL de HCl 12N (0,0158 moles) en 16
mL de metanol. La hidrólisis se lleva a cabo a 60ºC durante 2
horas. El polímero de AcV/FNV resultante se lava con metanol y se
seca a 50ºC al vacío. El rendimiento es de 8,08 g y el contenido en
amina es 4,6% en moles.
Preparación
B
Este polímero se prepara de forma similar a la
Preparación A con las siguientes modificaciones en la Etapa 1: el
reactor contiene 3,55 g de FVN, 81,7 g de AcV, 100 mL de metanol y
0,49 g de peroxineodecanoato de terc-butilo; la
alimentación contiene 12,5 g de FVN y 27,9 g de AcV; se añade una
cantidad adicional de 0,263 g de peroxineodecanoato
terc-butilo 2 ½ 2,5 horas después de la primera
adición. Adicionalmente, se añade metanol periódicamente para
restaurar el volumen. La polimerización se interrumpe con la
adición de 15,7 mg de MEHQ después de 4 horas de polimerización y,
en este momento, permanecen 8,5 mL de alimentación.
Etapa
2
El polímero precursor de AcV/FNV (41 g) en 230 mL
de metanol se mezcla rápidamente con 1,04 g de NaOH al 50% y se
hidroliza a 40ºC durante 30 minutos. El precipitado del polímero de
AcV/FNV se lava con metanol y se seca a 45ºC al vacío. El
rendimiento es de 23,64 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FNV (10 g) se disuelve en 40 g
de H_{2}O, se añaden 2,515 g de NaOH al 50% y la mezcla se
calienta a 80ºC durante 8 horas. El producto se dializa
exhaustivamente (Spectrapor, 3500 MWCO) frente a agua desionizada y
80% de esta solución se liofiliza para proporcionar un material
blanco a modo de algodón. El rendimiento del polímero de AV/FVM es
de 5,67 g y el contenido en amina es 13,9% en moles.
\newpage
Preparación
C
Este polímero se prepara de forma similar a la
Preparación A, con las siguientes modificaciones en la Etapa 1: el
reactor contiene 2,48 g de FVN, 83 g de AcV, 120 mL de metanol y
0,51 g de peroxineodecanoato de terc-butilo; la
alimentación contiene 9,12 g de FVN y 31,95 g de AcV. Se añade
metanol periódicamente para mantener el volumen. Se añade una
cantidad adicional de peroxineodecanoato de
terc-butilo 2 horas después de la adición inicial.
La polimerización se interrumpe con la adición de 20 mg de MEHQ
después de 3 horas y 40 minutos de polimerización.
Etapa
2
El polímero de AcV/FNV (12,5% en sólidos) en
aproximadamente 200 mL de metanol se mezcla rápidamente con 0,759 g
de NaOH al 50% y se calienta hasta 40ºC durante 25 minutos. El
precipitado del polímero de AcV/FNV se lava con metanol y se seca a
45ºC al vacío. El rendimiento es de 14,8 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FNV (13,0 g) se suspende en
117 mL de metanol. A esto se añade, gota a gota, 3,02 mL de HCl 12N
(0,0362 moles) en 26 mL de metanol. La mezcla se calienta a 60ºC
durante 2 horas. Después de lavar y liofilizar, el rendimiento del
AcV/FVM resultante es de 8,5 g y el contenido en amina es 8,6% en
moles.
Preparación
D
Este polímero se prepara de forma similar a la
Preparación B, con las siguientes modificaciones en la Etapa 1: el
reactor contiene 3,55 g de FVN, 81,70 g de AcV, 100 mL de metanol y
0,49 g de peroxineodecanoato de terc-butilo; la
alimentación contiene 12,55 g de FVN y 27,90 g de AcV.
Adicionalmente, se añade metanol periódicamente para restaurar el
volumen. La polimerización se interrumpe con la adición de 21,6 mg
de MEHQ después de 4 ^{1}/_{2} horas de polimerización.
Etapa
2
El polímero de AcV/FNV (aproximadamente 34 g) en
aproximadamente 200 mL de metanol se mezcla rápidamente con 0,847 g
de NaOH al 50% (0,0106 moles) a 40ºC durante 25 minutos. El polímero
se lava con metanol y se seca a 45ºC al vacío. El rendimiento de
polímero de AcV/FNV es de 22,7 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FVN (20 g) se mezcla con 80 g
de agua y 5,0 g de NaOH al 50% y se calienta a 80ºC durante 6 horas.
Después de dializar y liofilizar, el rendimiento del AcV/FVN
resultante es de 12,38 g, y el contenido en amina es 10,4% en
moles.
Preparación
E
Este polímero se prepara de forma similar a la
Preparación A con las siguientes modificaciones en la Etapa 1: el
reactor contiene 3,05 g de FVN, 82,3 g de AcV, 100 mL de metanol y
0,6 g de peroxineodecanoato de terc-butilo; la
alimentación contiene 11,08 g de FVN y 29,58 g de AcV. Se añade
metanol periódicamente para mantener el volumen. La polimerización
se interrumpe con la adición de 19,4 mg de MEHQ después de 4¼ horas
de polimerización.
Etapa
2
El polímero de AcV/FNV (aproximadamente 52 g) en
250 mL de metanol se mezcla rápidamente con 1,28 g de NaOH al 50%
(0,016 moles) a 40ºC durante 25 minutos. El polímero se lava con
metanol y se seca a 45ºC al vacío. El rendimiento de polímero de
AcV/FNV es de 29,97 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FNV (18 g) se suspende en 180
mL de metanol. A la suspensión se añaden, gota a gota, 4,2 mL de HCl
12N en 36 mL de metanol. La mezcla se calienta a 60ºC durante 2
horas. Después de filtrar, lavar y secar a 50ºC al vacío, el
material se disuelve en \sim4 litros de agua y a continuación la
mitad del material se liofiliza. El rendimiento del AcV/FNV
resultante es de 6 g, y el contenido en amina es 10,4% en moles.
Preparación
F
Este polímero se prepara de forma similar a la
Preparación C, con las siguientes modificaciones en la Etapa 1 para
reducir el peso molecular con respecto a la Preparación C: el
reactor contiene 0,62 g de FVN, 20,87 g de AcV, 169 mL de metanol y
0,5 g de peroxineodecanoato de terc-butilo; la
alimentación contiene 2,28 g de FVN, 7,99 g de AcV y 32,7 mL de
metanol. Se añade metanol periódicamente para mantener el volumen.
La polimerización se interrumpe con la adición de 23 mg de MEHQ
después de 4 horas de polimerización.
Etapa
2
El polímero de AcV/FNV (aproximadamente 17 g) en
aproximadamente 108 mL de metanol se mezcla rápidamente con 0,447 g
de NaOH al 50% (0,056 moles) a 40ºC durante aproximadamente 20
horas. El polímero se lava con metanol y se seca a 45ºC al vacío.
El rendimiento de polímero de AcV/FVN es de 4,04 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FNV (3,7 g) se suspende en
33,3 mL de metanol. A esto, se añade, gota a gota, 0,85 mL de HCl
12N en 7,32 mL de metanol. La mezcla se calienta a 60ºC durante 2 ½
horas. Después de filtrar, lavar y secar a 50ºC al vacío, el
rendimiento del AV/FVM resultante es de 1,86 g, y el contenido en
amina es 8,8% en moles.
Preparación
G
Este polímero se prepara de forma similar a la
Preparación F con las siguientesmodificaciones en la Etapa 1 para
reducir el peso molecular con respecto a la Preparación C: el
reactor contiene 2,48 g de FVN, 83,00 g de AcV, 200 mL de metanol y
0,51 g de peroxineodecanoato de terc-butilo; la
alimentación contiene 9,12 g de FVN y 31,95 g de AcV. Se añade
metanol periódicamente para mantener el volumen. La polimerización
se interrumpe con la adición de 22 mg de MEHQ después de 2 ¾ horas
de polimerización. El volumen final que queda en la alimentación es
14,5 mL.
Etapa
2
El polímero de AcV/FNV (aproximadamente 47 g) en
aproximadamente 225 mL de metanol se mezcla rápidamente con 1,23 g
de NaOH al 50% a 40ºC durante aproximadamente 30 minutos. El
polímero se lava con metanol y se seca a 45ºC al vacío. El
rendimiento de polímero de AcV/FVN es de 27,58 g.
Etapa
3
El polímero de AcV/FNV (10 g) se suspende en 90
mL de metanol y se le añaden 2,3 mL de HCl 12N en 20 mL de metanol.
La mezcla se calienta a 60ºC durante 2 horas. Después de filtrar,
lavar y secar a 50ºC al vacío, el rendimiento de AcV/FVM resultante
es de 8,2 g, y el contenido en amina es 8,6% en moles.
Este ejemplo describe la preparación de
composiciones de PAVYAV/oligonucleótidos y experimentos de
absorción celular utilizando las composiciones.
Los oligonucleótidos utilizados en este ejemplo
son los descritos en el Ejemplo 1. Los PAVYAVs utilizados en este
ejemplo tenían un contenido en amina vinílica variable y se
prepararon y caracterizaron de forma similar a los preparados en el
Ejemplo 1. Las composiciones de PAVYAV/oligonucleótido se prepararon
mezclando una solución de polímero (1-10% p/v en
agua) y oligonucleótido fluoresceinado 1 mM
(18-mero, en agua) con el medio en un volumen total
de 1 mL. En la mayoría de los experimentos, se utiliza medio mínimo
(DMEM), pero, el medio CHO con 5% de suero puede sustituirse con
resultados similares. En el diseño de los tratamientos, la
concentración de oligonucleótido se mantuvo en 10 \muM (180 \muM
en fosfatos nucleósidos) y el polímero se añadió en tal cantidad
que el nivel total de amina polimérica alcanzó un múltiplo dado de
los fosfatos (véase la Tabla I). Las composiciones de
PAVYAV/oligonucleótidos se prepararon con una antelación de 25
minutos y se calentaron en la incubadora a 37ºC y bajo 10% de
CO_{2}.
Cultivos adherentes de células CHO D^{-} se
mantuvieron en 25 mL de medio en matraces T75 de cultivo celular en
la incubadora a 37ºC y bajo 10% de CO_{2}. El medio de cultivo
consistía en medio Eagle modificado por Dulbecco (MEMD, tal
como se describe en el catálogo de Gibco, catálogo nº
11965-050), suplementado con suero bovino fetal al
5% (Hyclone nº 1905-AA, inactivado por 30 minutos
de tratamiento térmico en un baño de agua a 60ºC), 1% de suplemento
HT "100X" (Gibco 11067-014) y 1% de MEM
"100X" aminoácidos no esenciales (Gibco
14190-144).
Las células se inocularon para experimentos en el
momento de paso, cuando las células habían alcanzado confluencia. Se
llevó a cabo una tripsinización para recoger las células de la
superficie del matraz. La solución de tripsina era una dilución
"10X" de tripsina-EDTA en el PBS de Dulbecco
(Gibco 14190-144), tal que la concentración final
era 1,5X (por ejemplo, 100 mL de tripsina se mezclaron con 567 mL
de PBS -ésta dilución se llevó a cabo anteriormente y se sometió a
una filtración estéril- se aliquotó a recipientes estériles y se
almacenó a -20ºC. La solución de tripsina se descongeló y calentó,
y se filtró de nuevo justo antes de usarse). Para recuperar las
células, se reparó el medio por aspiración y cualquier medio
residual (que contenía un inhibidor de tripsina) se lavó con dos
lavados rápidos de 8-10 mL con solución de tripsina,
seguido de una incubación durante 5 minutos de las células con 5 mL
de solución de tripsina. Las células liberadas se resuspendieron
para proporcionar un concentrado "5X". Típicamente, los
subcultivos tuvieron una dilución de 1/10 ó 1/20 (por ejemplo, para
un subcultivo de 25 mL a 1/10, se utilizaron 0,5 mL de suspensión
celular). Para los experimentos, las células se inocularon en
placas de cultivo fisularde 6 pocillos (Falcon nº 3046) a razón de
5 mL por pocillo. Una dilución de 1/10 generalmente estaba lista
para el día siguiente, mientras que una de 1/20 estaba lista en dos
días.
En general, las células tenían una confluencia de
30-50% en el momento del experimento. Los
tratamientos se llevaron a cabo reparando por aspiración el medio
viejo y añadiendo la solución de tratamiento que contenía el
PAVYAV/oligonucleótido. Las soluciones de tratamiento pueden
contener suero. Se tuvo cuidado para que las células no se secaran.
Después de incubar las células durante una hora, las soluciones de
tratamiento se separaron por aspiración para eliminarlas y los
pocillos se lavaron 5 veces con MEMD, 2 mL por lavado, luego medio
completo se añadió a los pocillos para la "persecución".
Las células vivas se examinaron bajo un
microscopio invertido con dispositivosfluorescentes NIKON® Diaphot
y una cámara Polaroid®. Se visualizó primero un campo dado con
contraste de fase, luego se redujo la intensidad de la luz visible
para visualizar el campo fluorescente correspondiente. Si se observó
absorción nuclear, se volvió a la imagen de fase de la célula para
evaluar la salud y la integridad de la célula. Se puntuó la
absorción como se indica abajo:
- \underline{Puntuación}
- \underline{Localización \ de \ la \ fluorescencia}
- 0
- Poca o ninguna fluorescencia asociada a las células
- 1
- Generalmente asociada a la superficie, algo de fluorescencia endosomal
- 2
- Pesada, tanto superficial como endosomal
- 3
- Lisa y citoplásmica difusa y de la célula entera
- 4
- Inicialmente superficial y endosomal; hasta un 5% de los núcleos teñidos después de unas pocas horas de "persecución"
- 5
- Inicialmente superficial y endosomal con función nuclear del 10% o inferior; 30-40% de los núcleos teñidos después de unas horas
- 6
- Inicialmente el 80% o superior de los núcleos teñidos
- D
- Sin puntuación, las células desintegraron al principio de la persecución
Los resultados de los experimentos de absorción
se recogen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Este ejemplo ilustra que se puede conseguir una
mejora en la absorción celular con una liberación nuclear
sustancial y baja toxicidad mediante el uso de PAVYAVs. En ausencia
de PAVYAV, la mayoría de las células son no fluorescentes, mientras
que en presencia del homopolímero de amina vinílica, las células se
desintegran en fragmentos fluorescentes. En general, niveles más
altos de amina conducen a citotoxicidad mientras que niveles más
bajos conducen a una distribución endosomal/lisosomal. Para el
suministro citoplásmico o nuclear, hay una tendencia de una
relación de amina a unidad aniónica más alta a un % en moles en el
PAVYAV de amina más baja: por ejemplo, a un % en moles de amina de
10,4, un múltiplo preferido de amina a unidad aniónica es 4,9,
mientras que a un % en moles de amina de 8,8, un múltiplo preferido
es 9,5.
Claims (12)
1. Una composición que comprende un copolímero de
la fórmula general I,
(I)-(CH2-HCOH-)x-(CH2-HCNR1R2R3)y-Az-
en donde R1, R2 y R3 son,
independientemente, hidrógeno, alquilo inferior ó
2-hidroxialquilo, o R1 = R2 = hidrógeno, alquilo
inferior ó 2-hidroxialquilo y R3 es un par de
electrones
solitario
A es el residuo de un monómero
vinílico
x, y y z son números enteros que
representan el número de monómeros incorporados y donde x + y + z =
1000
en donde x =
25-99,5% en moles, y = 0,5-75% en
moles, y z <50% en moles, combinada con un oligonucleótido, en
donde la relación molar de "y" a unidades de anión es
0,1-100, opcionalmente en un vehículo
farmacéuticamente
aceptable.
2. Una composición según la reivindicación 1, en
donde x=80-96% en moles, y = 4-20%
en moles, y z \leq16% en moles.
3. Una composición según la reivindicación 1, en
donde x=85-94% en moles, y = 6-15%
en moles, y z \leq9% en moles.
4. Una composición según la reivindicación 1, 2 ó
3, en donde la relación en moles de "y" a unidades aniónicas
es 0,2-30.
5. Una composición según la reivindicación 1, 2 ó
3, en donde la relación en moles de "y" a unidades aniónicas
es 2-15.
6. Una composición según la reivindicación 1, 2 ó
3, en donde R1 = R2 = R3 = hidrógeno, y en donde A es un residuo de
acetato vinílico y formamida vinílica.
7. Una composición según la reivindicación 1, 2 ó
3, en donde R1 = R2 = R3 = hidrógeno, en donde R3 es un par de
electrones solitario, y en donde A es un residuo de acetato
vinílico y formamida vinílica.
8. Una composición según las reivindicaciones 6 ó
7, en donde dicho oligonucleótido comprende un esqueleto de
fosfato.
9. Una composición según la reivindicación 8, en
donde dicho oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido.
10. Una composición según la reivindicación 9, en
donde la longitud de dicho oligonucleótido antisentido es de 10 a 30
nucleótidos.
11. Una composición según la reivindicación 10,
en donde la longitud de dicho oligonucleótido antisentido es de 18
nucleótidos.
12. Un método in vitro para influir en la
absorción celular de un oligonucleótido que comprende la
administración de la composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 a las células tal que el oligonucleótido se
transporte dentro de las células.
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|---|---|---|---|
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