KR100482774B1 - 폴리비닐이미다졸계 화합물을 포함하는 유전자 전달체 - Google Patents

폴리비닐이미다졸계 화합물을 포함하는 유전자 전달체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포내 독성이 낮고, 포함된 유전자의 발현효율을 향상시킬 수 있는 비닐이미다졸계 화합물의 단일 중합체 또는 공중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 전달체는 4-비닐이미다졸의 단일중합체, N-비닐이미다졸의 단일중합체 또는 4-비닐이미다졸과 N-비닐이미다졸의 공중합체를 포함한다. 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 발현효율면에서 종래에 사용된 PEI와 대등한 수준을 나타내고, 세포독성이 낮으며, DNA와 용이하게 결합하여 복합체를 형성하고, 형성된 복합체는 DNA 분해효소 등에 의하여 쉽게 해리되지 않는다는 장점이 있으므로, 유전자 치료 및 유전자 치료용 유전자 전달체의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

폴리비닐이미다졸계 화합물을 포함하는 유전자 전달체{Gene Carrier Comprising Poly(vinylimidazole) Compound}
본 발명은 폴리비닐이미다졸계 화합물을 포함하는 유전자 전달체에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 세포내 독성이 낮고, 포함된 유전자의 발현효율을 향상시킬 수 있는 비닐이미다졸계 화합물의 단일 중합체 또는 공중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
유전자치료(gene therapy)는 선천적 또는 후천적 유전질환, 바이러스성 질병, 암과 기타 각종 질환을 치료하기 위하여, DNA, RNA, 혹은 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide) 등의 유전물질을 약물(drug)로 인식하여 환자에 투여함으로써, 원하는 단백질을 발현시키거나 또는 원하지 않는 단백질의 발현을 억제하도록 하는 새로운 치료방법이다. 음이온을 띠고 분자량이 매우 큰 치료 유전물질은 생체에서 가수분해되기 쉽고 세포로의 투입이 어렵기 때문에, 그를 효율적으로 세포 내로 전달하기 위한 수송체(delivery system) 개발이 절실히 요구되고 있다. 현재, 가장 많이 쓰이는 유전자 전달의 방법은 레트로 바이러스나 아데노 바이러스의 뛰어난 세포감염능력을 이용하는 것이데, 바이러스들의 병원성 부분을 우선 제거한 후에 원하는 단백질을 발현할 수 있는 유전자와 재조합하여 세포 내로 감염시킴으로써, 유전자를 발현시키고 있다. 이 방법은 유전자 발현효율은 매우 높으나, 환자에 대한 안전성, 면역반응과 단백질 발현 정도를 조절하기 힘들다는 단점이 있어, 최근 들어서는 이에 대한 대체 방법으로, 바이러스를 쓰지 않는 DNA 전달 매개체, 즉 비바이러스성 유전자 전달체에 대한 개발이 활발히 진행되고 있다. 그 중에서 가장 많이 사용된 것은 주로 양성의 리포좀계로서, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드( N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium chloride, DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양전하성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivative), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있으며, 이들이 DNA와 결합하여 효율적으로 세포막 내부로 투입될 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다. 그러나, 이러한 리포좀은 제조가 번거롭고, 분자량이 큰 DNA에서의 내포율이 낮으며, 입자 크기가 클 뿐만 아니라, 높은 세포독성이 있다는 단점이 있어 실질적으로 응용되지 못하고 있는 실정이다. 최근에는, 양성의 고분자를 이용하려는 연구가 진행되고 있는데, 주로 디에틸아미노에틸 덱스트란(diethylaminoethyl dextran), 폴리라이신(poly(L-lysine)), 폴리에틸렌이민(poly(ethylenimine), PEI), 양전하성 덴드리머(cationic dendrimer), 키토산(chitosan) 등이 이용되고 있다.
한편, 이러한 대부분의 비바이러스성 유전자 전달체는 바이러스성 유전자 전달체에 비하여 면역거절반응과 세포 독성이 작다는 장점이 있는 반면에, 유전자 발현이 매우 낮다는 단점이 있어, 현재 DNA를 엔도좀에서 빨리 방출시키고, 핵으로 이동시키는 방법을 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다. 예를 들어, GALA나 KALA의 첨가에 의한 pH 변화는 엔도좀막을 불안정화하여 DNA 복합체를 신속하게 해리시키고, 폴리아미도아민 덴드리머(polyamidoamine dendrimer)와 라이소모트로픽 시약인 클로로퀸(cholroquine)의 혼합은 유전자 발현효율을 증가시킬 수 있으며, 엔도좀을 파괴하는 펩타이드의 첨가로 유전자 발현효율을 향상시킬 수 있음이 보고되어 있다. 현재까지 개발된 비바이러스성 유전자 전달체 중에서 가장 우수한 것은 폴리에틸렌이민(PEI)으로 알려져 있는데, 엔도좀에서 PEI가 양성자화(protonation) 된 양자 스폰지(proton sponge) 역할을 수행하여, PEI/DNA 복합체를 신속하게 방출시킨다는 장점이 있다고 알려져 있다. 추가적으로, 엔도좀의 막을 파괴시키는 폴리펩타이드나 폴리아크릴산유도체를 DNA 복합체와 같이 주입함으로써 유전자 발현효율을 향상시키는 방법이 연구되고 있다. 그러나, 이러한 PEI의 장점에도 불구하고 PEI의 높은 세포독성, 비생분해성, 조직특이성의 결여 등의 단점이 해결되지 않고 있어, 이를 해결하려는 노력이 계속되고 있으나, 별다른 성과가 없는 실정이다.
따라서, 유전자 발현효율이 높으면서도 세포독성이 적은 유전자 전달체를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 유전자 발현효율이 높으면서도 세포독성이 적은 유전자 전달체를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 촉매로서 이용되어온 폴리비닐이미다졸계 화합물의 중합체를 유전자 전달체로서 이용할 경우 세포독성이 적고, 유전자 발현효율이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 폴리비닐이미다졸계 화합물을 포함하는 유전자 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 유전자 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 유전자 전달체는 4-비닐이미다졸(4-vinylimidazole, 4V)의 단일중합체{poly(4-vinylimidazole), P4V}, N-비닐이미다졸(N-vinylimidazole, NV)의 단일중합체{poly(N-vinylimidazole), PNV} 또는 4-비닐이미다졸과 N-비닐이미다졸의 공중합체{P(4V-co-NV)}를 포함한다.
종래 촉매로서 사용되어 온 4-비닐이미다졸(4-vinylimidazole)의 단일중합체(P4V)는 두 개의 pKa의 값을 갖는다. 즉, pK1=6.6과 pK2>14.5을 갖고 있기 때문에, pH에 따라서 산성, 중성형, 염기성형의 서로 상이한 상을 갖는다. 특히, 통상적인 엔도좀의 pH인 pH 5.5에서는 P4V의 양성자화가 진행되므로, 종래의 PEI와 동일한 수준의 "양자 스폰지(proton sponge)" 역할을 수행할 수 있다.
또한, N-비닐이미다졸(N-vinylimidazole)의 단일중합체(PNV)는 Ka의 값이 4.4이기 때문에, 4-비닐이미다졸과 N-비닐이미다졸을 공중합시켜서, 최적의 양자 스폰지역할을 할 수 있는 공중합체를 제조할 수 있는데, 아조비스 이소부티로 니트릴(azobisisobutyronitrile, AIBN)을 개시제로 사용하여 P4V와 PNV를 중합함으로써, 각각의 단일중합체 또는 공중합체, 바람직하게는 P(4V-co-NV)형태의 공중합체를 제조할 수 있다(참조: 도 1). 도 1은 폴리비닐이미다졸계 화합물의 공중합체를 제조하는 방법을 나타내는 모식도이다.
본 발명의 유전자 전달체의 제조방법은 4-비닐이미다졸과 N-비닐이미다졸을 0:100 내지 100:0(몰비)의 비율로 혼합하는 공정; 전기 혼합물을 질소조건 하에서 무수벤젠에 침지하고, AIBN을 개시제로 첨가한 후, 반응시켜서 반응물을 수득하는 공정; 및, 전기 반응물을 에탄올에 용해시키고, 아세톤으로 침전시킨 다음, 여과하여 수득한 고형물을 건조시키는 공정을 포함한다: 이때, 두 번째 공정에 첨가되는 AIBN의 농도가 특별히 제한되지는 않으나 0.01 내지 0.1M인 것이 바람직하고, 두 번째 공정 반응조건이 특별히 제한되지는 않으나 50 내지 80℃에서 12 내지 36시간동안 반응시킴이 바람직하다.
전기 방법으로 제조된 P(4V-co-NV) 공중합체는 유전자 발현효율면에서 종래에 사용된 PEI와 대등한 수준을 나타내고, 세포독성이 낮으며, DNA와 용이하게 결합하여 복합체를 형성하고, 형성된 복합체는 DNA 분해효소 등에 의하여 쉽게 해리되지 않는다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 P(4V-co-NV) 공중합체는 유전자 치료 및 유전자 치료용 유전자 전달체의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: P4V-co-PNV 공중합체의 제조
유로케닉산(urocanic acid)을 220℃에서 열분해 하여 4-비닐이미다졸을 수득하고, N-비닐이미다졸(Sigma-Aldrich, USA)을 1:1(몰비)로 혼합한 다음, 무수벤젠에 침지하고, 0.0513M의 AIBN을 개시제로 첨가하여, 60℃에서 24시간 동안 반응시켜서 반응물을 수득하였다: 이때, 반응은 공기 중의 CO2에 의한 오염을 막기 위해 질소조건 하에서 수행하였다. 이어, 수득한 반응물을 에탄올에 용해시키고, 아세톤으로 침전시킨 다음, 여과하여 고형물을 수득한 후, 건조시켜서 순수한 P(4V-co-NV) 공중합체를 제조하였다.
제조된 공중합체를 확인하기 위하여, 전기 제조한 공중합체를 D2O에 용해시키고, NMR기기(600MHz, High Resolution NMR Spectrometer)를 사용하여 구조를 분석하였다(참조: 도 2). 도 2는 전기 제조된 공중합체의 NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프이고, 이를 분석하여 수득한 공중합체가 P(4V-co-NV) 공중합체임을 확인할 수 있었다.
실시예 2: DNA 복합체의 제조 및 특성분석
전기 제조된 공중합체를 이용하여 DNA 복합체를 제조하고, 제조된 복합체의 안정성을 측정한 다음, 배양된 세포에 투여하여, 전기 복합체의 유전자 발현효율 및 세포독성을 측정함으로써, 전기 공중합체의 특성을 분석하였다.
실시예 2-1: DNA 복합체의 제조
전기 실시예 1에서 제조된 P(4V-co-NV) 공중합체 수용액(10㎍/㎕) 1㎕와 녹색형광을 나타내는 단백질을 암호화하는 DNA인 pEGFP N1 400ng을 혼합하고, 상온에서 30분간 방치하여, DNA 복합체를 제조하였다.
실시예 2-2: DNase I을 이용한 DNA 복합체의 안정성 측정
전기 제조된 DNA 복합체와 2유닛의 디옥시뉴클레아제(DNase I)을 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, DNA 및 전기 DNA 복합체 10, 1, 0.1 또는 0.01㎍을 1%(w/v) 아가로스 젤을 이용한 전기영동에 적용하여, DNase I에 의한 영향을 측정하였다(참조: 도 3a, 도 3b). 도 3a는 DNase I을 처리하기 전의 DNA 및 DNA 복합체를 전기영동한 사진이고, 도 3b는 DNase I을 처리한 후의 DNA 및 DNA 복합체를 전기영동한 사진이며, 도 3a 및 도 3b에서 첫 번째 레인은 DNA, 두 번째 레인은 빈칸, 세 번째 레인은 10㎍의 DNA 복합체, 네 번째 레인은 1㎍의 DNA 복합체, 다섯 번째 레인은 0.1㎍의 DNA 복합체 및 여섯 번째 레인은 0.01㎍의 DNA 복합체를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b에서 보듯이, DNase I을 DNA 단독에 처리하였을 때는 30분 이내에 DNA가 모두 분해되는 것에 반하여, DNA 복합체는 분해되지 않고 유지되므로, 혈류 속에서 DNA를 분해시킬 수 있는 분해 요소들로부터 DNA를 충분히 보호해 줄 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 P(4V-co-NV) 공중합체를 이용할 경우, 안정한 DNA 복합체가 형성됨을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 콘드로이틴 설펙턴트를 이용한 DNA 복합체의 안정성 측정
전기 제조된 DNA 복합체는 DNA의 음성전하와 공중합체의 양성전하의 결합에 의하여 형성되는데, 강한 음성전하를 띠는 세포 외벽에 접촉할 경우 상기 결합이 붕괴될 수도 있다. 이에, 전기 제조된 DNA 복합체에 강한 음성전하를 띠는 콘드로이틴 설펙턴트를 첨가하여, 전기 제조된 DNA 복합체의 안정성을 측정하였다.
즉, 전기 제조된 DNA 복합체를 0, 1, 5, 10 또는 20㎕의 콘드로이틴 설펙턴트(220㎍/㎕)와 각각 혼합하고, 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 반응전 DNA 복합체와 함께 1%(w/v) 아가로스 젤을 이용한 전기영동을 수행하였다(참조: 도 4). 도 4는 콘드로이틴 설펙턴트를 처리한 효과를 나타내는 전기영동 사진으로서, 첫 번째 레인은 콘드로이틴 설펙턴트를 처리하지 않은 대조군, 두 번째 레인은 빈칸, 세 번째 레인은 1㎕의 콘드로이틴 설펙턴트를 처리한 실험군, 네 번째 레인은 5㎕의 콘드로이틴 설펙턴트를 처리한 실험군, 다섯 번째 레인은 10㎕의 콘드로이틴 설펙턴트를 처리한 실험군 및 여섯 번째 레인은 20㎕의 콘드로이틴 설펙턴트를 처리한 실험군을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 콘드로이틴 설펙턴트를 처리하여도 DNA 복합체가 유지됨을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 P(4V-co-NV) 공중합체을 이용할 경우, 안정한 DNA 복합체가 형성됨을 알 수 있었다.
실시예 2-4: 세포독성의 측정
HeLa와 MC3T3-E1 세포주를 각각 96웰 플레이트에 각 웰당 104 개의 농도로 분주하고, MEM- α배지(Sigma-Aldrich Chem. Co., USA)를 이용하여 24시간 동안 배양하였다. 이어, 전기 배양된 세포주에 PEI와 P(4V-co-NV) 공중합체를 각각 1, 10, 100, 또는 1000 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 각 세포주의 생존율을 측정하여, 각 화합물의 세포독성을 분석하였다(참조: 도 5a, 도 5b). 도 5a는 MC3T3-E1 세포주에서 PEI와 P(4V-co-NV) 공중합체의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프로서, (■)는 P(4V-co-NV) 공중합체를 나타내고, (▲)는 PEI를 나타내며, 도 5b는 HeLa 세포주에서 PEI와 P(4V-co-NV) 공중합체의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프로서, (◆)는 P(4V-co-NV) 공중합체를 나타내고, (▲)는 PEI를 나타낸다. 도 5a 및 도 5b에서 보듯이, 본 발명의 P(4V-co-NV) 공중합체는 PEI에 비하여 현저히 낮은 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-5: 유전자 발현효율의 측정
전기 DNA 복합체가 유전자를 효과적으로 발현시킬 수 있는지를 알아보기 위하여, 루시퍼라제(luciferase)를 암호화하는 유전자가 포함된 플라스미드 벡터인 pGL3를 이용하였다.
먼저, pGL3; pGL3와 PEI가 1:2(w/w)로 혼합되어 제조된 DNA/PEI 복합체; 및, pGL3를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 제조된 DNA 복합체를 각각 준비하였다. 이어, 전기 실시예 2-4에서 준비된 각 세포주에 전기 준비된 각 시료를 첨가하여 배양한 다음, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였으며, 세포용해 완충용액(lysis buffer, Promega, USA)을 30분동안 처리하고, 화학발광기(lumenometer)를 사용하여 루시퍼라제의 발광도를 측정함으로써, 유전자의 발현효율을 측정하였다(참조: 도 6a, 도 6b). 도 6a는 MC3T3-E1 세포주에서 유전자 발현효율을 비교한 그래프이고, 도 6b는 HeLa 세포주에서 유전자 발현효율을 비교한 그래프이다. 도 6a 및 도 6b에서 보듯이, 본 발명의 P(4V-co-NV) 공중합체를 이용할 경우, DNA를 단독으로 처리할 경우보다는 유전자의 발현효율이 우수하였고, PEI와 유사한 유전자 발현효율을 나타내었다.
실시예 2-6: 현미경을 이용한 특성분석
간암 세포주인 Hep G2에 PEI 복합체와 실시예 2-1에서 제조된 복합체를 각각 첨가하여 배양한 각 세포주를 광학현미경과 형광현미경으로 관찰하여, 세포의 형태적인 변화 및 녹색형광 단백질의 발현여부를 확인하였다(참조: 도 7a, 도 7b, 도 7c, 도 7d). 도 7a는 실시예 2-1에서 제조된 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 광학 현미경 사진이고, 도 7b는 실시예 2-1에서 제조된 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 형광 현미경 사진이며, 도 7c는 PEI 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 광학 현미경 사진이고, 도 7d는 PEI 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 형광 현미경 사진이다. 도 7b 및 도 7d에서 보듯이, PEI와 P(4V-co-NV) 공중합체를 이용한 경우, 모두 세포내에서 녹색형광이 발광되었으므로, 유전자의 전달에는 이상이 없음을 알 수 있었다. 반면, 도 7a 및 도 7c에서 보듯이, P4V-co-PNV 공중합체를 이용한 경우에는 세포주의 형태적인 이상이 발견되지 않았으나, PEI를 이용할 경우에는 괴사된 세포주가 현저히 증가함을 발견하였으므로, PEI에 의한 세포독성보다 P(4V-co-NV) 공중합체에 의한 세포독성이 현저히 낮음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 세포내 독성이 낮고, 포함된 유전자의 발현효율을 향상시킬 수 있는 비닐이미다졸계 화합물의 단일 중합체 또는 공중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 유전자 전달체는 4-비닐이미다졸의 단일중합체, N-비닐이미다졸의 단일중합체 또는 4-비닐이미다졸과 N-비닐이미다졸의 공중합체를 포함한다. 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 발현효율면에서 종래에 사용된 PEI와 대등한 수준을 나타내고, 세포독성이 낮으며, DNA와 용이하게 결합하여 복합체를 형성하고, 형성된 복합체는 DNA 분해효소 등에 의하여 쉽게 해리되지 않는다는 장점이 있으므로, 유전자 치료 및 유전자 치료용 유전자 전달체의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 폴리비닐이미다졸계 화합물의 공중합체를 제조하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 전기 제조된 공중합체의 NMR 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 3a는 DNase I을 처리하기 전의 DNA 및 DNA 복합체를 전기영동한 사진이다.
도 3b는 DNase I을 처리한 후의 DNA 및 DNA 복합체를 전기영동한 사진이다.
도 4는 콘드로이틴 설펙턴트를 처리한 효과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 5a는 MC3T3-E1 세포주에서 PEI와 P(4V-co-NV) 공중합체의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 HeLa 세포주에서 PEI와 P(4V-co-NV) 공중합체의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 MC3T3-E1 세포주에서 유전자 발현효율을 비교한 그래프이다.
도 6b는 HeLa 세포주에서 유전자 발현효율을 비교한 그래프이다.
도 7a는 실시예 2-1에서 제조된 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 7b는 실시예 2-1에서 제조된 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 7c는 PEI 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 7d는 PEI 복합체가 첨가된 세포주를 나타내는 형광 현미경 사진이다.

Claims (4)

  1. 4-비닐이미다졸(4-vinylimidazole, 4V)의 단일중합체{poly(4-vinylimidazole), P4V}, N-비닐이미다졸(N-vinylimidazole, NV)의 단일중합체{poly(N-vinylimidazole), PNV} 또는 4V와 NV가 1:1(몰비)의 비율로 중합된 공중합체를 포함하는 유전자 전달체.
  2. (i) 4-비닐이미다졸과 N-비닐이미다졸을 1:1(몰비)의 비율로 혼합하는 공정;
    (ii) 전기 혼합물을 질소조건 하에서 무수벤젠에 침지하고, AIBN(azobis isobutyro nitrile)을 개시제로 첨가한 후, 반응시켜서 반응물을 수득하는 공정; 및,
    (iii) 전기 반응물을 에탄올에 용해시키고, 아세톤으로 침전시킨 다음, 여과하여 수득한 고형물을 건조시키는 공정을 포함하는, 유전자 전달체의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    AIBN의 농도는 0.01 내지 0.1M인 것을 특징으로 하는
    유전자 전달체의 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    (ⅱ) 공정의 반응조건은 50 내지 80℃에서 12 내지 36시간동안
    반응시키는 것을 특징으로 하는
    유전자 전달체의 제조방법.
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