DE69633852T2

DE69633852T2 - Kationische kopolymere von vinylamine und vinylalkohol zur verabreichung von oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69633852T2
Application number: DE69633852T
Authority: DE
Inventors: S. Merrill GOLDENBERG; C. Alice BEEKMAN
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-01-25
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2016-01-12
Also published as: EP0806966A1; MX9705536A; SI0806966T1; IL116887A0; ZA96401B; DK0806966T3; BR9606783A; AU701543B2; DE69633852D1; JPH11503407A; EP0806966B1; ATE282433T1; PT806966E; CA2210875A1; CA2210875C; US5629184A; AU4655496A; ES2233960T3; WO1996022792A1

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die cytoplasmische Lieferung von Oligonucleotiden und verbesserte Zusammensetzungen zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Oligonucleotide sind starke Modulatoren von Zelleigenschaften auf dem DNA- oder RNA-Niveau. Oligonucleotide können entworfen werden, um sich an einem bestimmten Segment von DNA (Triplex bildende Oligonucleotide) oder RNA (Gegensinn-Oligonucleotide) über die Basen zu paaren, und, nach dem Binden an die gewünschte Zielnucleinsäure, eine Transkription und/oder Translation mit vorhersagbaren biochemischen und funktionalen Downstream-Folgen zu bewirken, d. h. sie inhibieren eine Genexpression. Der genaue Mechanismus, durch den Oligonucleotide wirken, um die Genexpression zu inhibieren, ist noch nicht in allen Fällen bekannt. Neuere Fortschritte in der organischen Synthese und den Reinigungsmethoden haben eine Praktikabilität zur Entwicklung und Synthese von Oligonucleotiden erleichtert.
Da Oligonucleotide entwickelt werden, um sich spezifisch an passende Sequenzen zu binden, besitzen sie einen hohen Grad an Spezifität und haben gewaltige potentielle therapeutische Anwendungen. Beispielsweise sind die zwei am weitesten verbreiteten Probleme, die mit der Verwendung von Antikrebs- und Antivirenmitteln verbunden sind, die Arzneimittelwiderstandsfähigkeit und nicht annehmbare Toxizitätsniveaus. Diese werden potentiell durch die Verwendung von Oligonucleotiden mit einem hohen Grad an Spezifität überwunden, da: (1) Gene, die nicht die Zielsequenz enthalten, theoretisch durch die Oligonucleotide nicht beeinflußt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Toxizität vermindert wird; und (2) lediglich eine Punktmutation innerhalb der Oligonucleotidbindungsstelle, nicht außerhalb, zu einer Arzneimittelwiderstandsfähigkeit führen kann. Daher wird von Oligonucleotiden angenommen, daß sie eine Klasse von starken Antikrebs- und Antivirenmitteln darstellen.
Eine unzureichende intrazelluläre Bioverfügbarkeit von Oligonucleotiden, d. h. der Menge an intaktem Oligonucleotid, die in einer Form verfügbar ist, die mit ihrem beabsichtigten Ziel wechselwirken kann, ist ein Haupthindernis in der Entwicklung von Oligonucleotiden als therapeutische Mittel gewesen. Schlüsselfaktoren, die zu einer unzureichenden intrazellulären Bioverfügbarkeit beitragen, sind schlechte Stabilität, nicht spezifische Bindung und schlechte zelluläre und Gewebeaufnahme.
Umfangreiche Arbeit ist durchgeführt worden, um Derivate von Oligonucleotiden mit verbesserten Eigenschaften zu entwickeln. Modifikationen im Nucleosid, der Zuckerhauptkette, dem Terminus oder der Stereochemie umfassen die vier Hauptderivatisierungskategorien; s. Uhlmann und Peyman, Chem. Rev., 90: 543–584 (1990). Zusätzlich werden einige Lieferstrategien untersucht, die einige dieser Probleme umgehen können; s. Akhtar und Juliano, Trends in Cell Biology 2: 139–144 (1992) und die darin genannten Verweise.
Der Mechanismus der zellulären Aufnahme ist nicht vollständig verstanden. Beispielsweise ist es unklar, ob eine Oligonucleotidaufnahme über einen zuvor beschriebenen Transportmechanismus in die Zellmembran oder durch einen einmaligen Weg stattfindet; s. Wu-Pong, Pharmaceutical Tec., S. 102–112 (Oktober 1994). Zusätzlich erscheint es, daß der Aufnahmemechanismus vom Zelltyp und/oder Oligonucleotidtyp abhängig sein kann. Id. Gegenwärtiger Beweis zeigt an, daß Oligonucleotide in Zellen vorherrschend durch Endocytose eintreten. Endocytose wird typischerweise als Rezeptor vermittelte Endocytose (RME), absorptive Endocytose (AE) und Fluidphasenendocytose (FPE) klassifiziert.
Der Endocytose folgend müssen die Oligonucleotide aus endosomalen Kompartimenten verschwinden, um ihre Wirkungen in dem Kern oder dem Cytoplasma auszuüben. Der genaue Mechanismus und das Ausmaß des Oligonucleotidtransfers von Endosomen zum Cytoplasma und/oder Kernzielen verbleibt unsicher. Mögliche Mechanismen sind eine einfache Diffusion, vorübergehende Membrandestabilisierung oder einfaches Auslaufen während eines Verschmelzungsfalles, in welchem Endosomen mit anderen Vesikeln, wie Lysosomen, verschmelzen. Damit Oligonucleotide, die durch Endocytose aufgenommen werden, nützlich sind, muß ihr Ausfluß aus den endosomalen Kompartimenten verbessert werden.
Verschiedene synthetische Verfahren sind in der Literatur vorgeschlagen worden, um die intrazelluläre Bioverfügbarkeit zu verbessern. Ein berichteter Ansatz ist die kovalente Anfügung von spezifischen Zellrezeptorliganden, um eine zelluläre Aufnahme durch Rezeptor-vermittelte Endocytose zu initiieren; s. Vestweber und Schatz, Nature, 338: 170,172 (1989). Die kovalente Modifikation von Oligonucleotiden schließt im allgemeinen die Verwendung von Polykationen ein und ist ein arbeitsintensives Vorgehen, welches eine getrennte Synthese und Reinigung für jedes getestete Oligonucleotid erfordert. Von Polykationen, wie Poly-L-Lysin, wird berichtet, daß sie in Gentransfektionsstudien verwendet worden sind; s. Felgner, Advanced Drug Delivery Reviews, 5: 163–187 (1990). Jedoch würde, im Gegensatz zu einer Gentransfektion, wo verhältnismäßig wenig Kopien an DNA benötigt werden, eine Verwendung von Oligonucleotiden als ein therapeutisches Mittel höhere Gehalte an DNA erfordern, und eine kovalente Modifikation unter Verwendung von Polykationen, wie Poly-L-Lysin, könnte für die Zellen toxisch sein.
BE-A-751299 (Kakenyaku Kako KK) offenbart eine Zusammensetzung eines basischen Polyamins und einer DNA zur Verwendung zum Resorbieren von Läsionen, die durch Strahlung bewirkt werden.
WO-A-94/18834 (Virginia Tech Intellectual Properties, offenbart ein DNA-Segment, das mit einem Polykation komplexiert ist, wie Polylysin oder Polyarginin, zur Insertion in das Genom eines Empfängertiers.
Der populärste Ansatz, der gegenwärtig untersucht wird, ist die Verwendung von Phospholipidvesikeln (Liposomen), um Oligonucleotide an Zellen zu liefern; s. Akhtar et al., Nucleic Acids Res., 19: 5551–5559 (1991). Zusätzlich zum Schutz von Oligonucleotiden gegen einen enzymatischen Abbau liefern Liposomen das Potential, ihre Freigabe zu steuern und zu verzögern. Id. Ein Ausfluß von Oligonucleotiden aus Liposomen erscheint langsam und über eine Dauer von mehreren Tagen verzögerbar zu sein, was nahelegt, daß sie zum Liefern von Oligonucleotiden gegenüber Zielen geeignet sein können, die ein langsames Turnover aufweisen. Id. Jedoch sind, wie es mit anderen Polykationen der Fall ist, kationische Lipide und Liposomen (z. B. Lipofectin^®) im allgemeinen toxisch für die Zellen und unzureichend in ihrer DNA-Lieferung in der Gegenwart eines Serums; s. Leonetti et al., P. N. A. S. USA, 87: 2448–2451 (1990).
Es hat ausführliche Berichte über die Synthese und Verwendung von Copolymeren gegeben, auf der Basis von Vinylalkohol mit variierenden Gehalten an Vinylamin, in der Papierindustrie; s. europäische Patentveröffentlichung 337310; europäische Patentveröffentlichung 339371; europäische Patentveröffentlichung 617166; U.S.-Patent 4,774,285, 4,880,497, 4,978,427 und 5,270,379, und als Flockungsmittel; s. U.S.-Patent 3,715,336. Es gibt bis heute keine bekannten Berichte bezüglich der Verwendung von Vinylalkohol/Vinylamin-Copolymeren für eine zelluläre Therapie.
Die Oligonucleotidmodifikationen und/oder -liefersysteme, die in der Literatur beschrieben werden, haben zu einer verbesserten Effizienz einer zellulären Oligonucleotidaufnahme geführt; jedoch müssen sie noch ermöglichen, daß das volle Potential der Oligonucleotidtechnologie realisiert werden kann. Daher besteht die Notwendigkeit, verbesserte Verfahren zum Steigern der intrazellulären Bioverfügbarkeit von Oligonucleotiden zu entwickeln. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche Verfahren bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Zusammensetzungen zur Verwendung in solchen Verfahren zu liefern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein verbessertes Verfahren für die Cytoplasmalieferung von Oligonucleotiden und verbesserte Zusammensetzungen zur Verwendung in solchen Verfahren. Die vorliegende Erfindung erwuchs aus Studien, in denen Copolymere auf Vinylalkohol- und Vinylaminbasis (PVAVAMs) verwendet wurden, um Polyanionen (hier Oligonucleotide) an Zellen zu liefern. Überraschenderweise liefern die PVAVAMs ein effizientes System, um eine Kernlieferung von Oligonucleotiden in Zellen zu erreichen, in der Gegenwart von Serum und mit geringer Toxizität.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Copolymer der allgemeinen Formel I, -(CH2-HCOH-)x-(CH2-HCNR1R2R3-)y-Az- Iumfaßt, wobei R1, R2, R3 unabhängig Wasserstoff, niederes Alkyl oder 2-Hydroxyalkyl, oder R1 = R2 = Wasserstoff, niederes Alkyl oder 2-Hydroxyalkyl und R3 ein freies Elektronenpaar sind,
A der Rest eines Vinylmonomers ist,
x, y und z ganze Zahlen sind, die die Anzahl von eingebautem Monomer darstellen, und wobei x + y + z = 100 ist,
wobei x = 25–99,5 Mol.-%, y = 0,5–75 Mol.-% und z < 50 Mol.-% ist, kombiniert mit einem Oligonucleotid, wobei das Molverhältnis von y zu Anioneneinheiten 0,1–100 ist, optional in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Kombination von PVAVAMs, mit variierendem Mol.-%-Gehalt an Vinylamin, an einem Oligonucleotid, so daß das Molverhältnis von polymerisiertem Vinylamin zu Oligonucleotidanioneneinheiten zwischen 0,1–100 ist. Bevorzugt ist das Molverhältnis 0,2–30. Am bevorzugtesten ist das Molverhältnis 0,2–15.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen eine In-vitro-Verabreichung der PVAVAM/Oligonucleotid-Zusammensetzungen an die Zellen, so daß das Oligonucleotid in die Zellen transportiert wird.
Die PVAVAMs, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, werden unter Verwendung von hydrophoben und hydrophilen, polymerisierbaren Vinylmonomeren hergestellt und weisen einen Vinylamingehalt von 0,5–75 Mol.-% auf. Bevorzugt werden die PVAVAMs unter Verwendung von Vinylacetat/Vinylformamid und Vinylalkohol/Vinylformamid-Vorstufenpolymeren hergestellt und weisen einen Vinylamingehalt von 4–20 Mol.-% auf. Am bevorzugtesten weist das PVAVAM einen Vinylamingehalt von 6–15 Mol.-% auf.
Die hierin offenbarten Polyanionen sind im allgemeinen in ihrer Größe makromolekular. Jedoch werden ebenfalls Materialien mit geringem Molekulargewicht offenbart, welche die Fähigkeit haben, PVAVAMs zu komplexieren, d. h. enthaltend Bereiche von anionischem Charakter (Anioneneinheiten). Das Polyanion ist ein Oligonucleotid oder ein Polynucleotid. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polyanion ein Gegensinn-Oligonucleotid.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Copolymere der vorliegenden Erfindung sind von Vinylalkohol (VA) und Vinylamin (VAM) der allgemeinen Formel I, -(CH2-HCOH-)x-(CH2-HCNR1R2R3-)y-Az- Iumfaßt, wobei R1, R2 und R3 unabhängig Wasserstoff, niederes Alkyl oder 2-Hydroxyalkyl, oder R1 = R2 = Wasserstoff, niederes Alkyl oder 2-Hydroxyalkyl und R3 ein freies Elektronenpaar sind,
A der Rest eines Vinylmonomers ist,
x, y und z ganze Zahlen sind, die die Anzahl von eingebautem Monomer darstellen, und
wobei x + y + z = 100 ist.
Zu Zwecken der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die Copolymere der Formel I als „PVAVAMs" bezeichnet. Der Begriff „Rest eines Vinylmonomers" ist definiert als die Monomereinheit nach der Polymerisation, und es sollte erwähnt werden, daß das fertige PVAVAM kleinere Mengen an Resteinheiten und Initiatorfragmenten enthalten kann.
In den PVAVAMs der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß R1 = R2 = R3 = Wasserstoff oder R1 = R2 = Wasserstoff und R3 ein freies Elektronenpaar sind, und weiter, daß x = 25–99,5 Mol.-%, y = 0,5–75 Mol.-% und z < 50 Mol.-% ist. Bevorzugter ist x = 80–96 Mol.-%, y = 4–20 Mol.-% und z ≤ 16 Mol.-%. Es ist am bevorzugtesten, daß x = 87–94 Mol.-%, y = 6–13 Mol.-% und z ≤ 10 Mol.-% ist. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung wird „Mol.-%" als der Prozentanteil der gesamten Moleinheiten in dem Polymer definiert.
Im allgemeinen besteht das Verfahren zum Synthetisieren der PVAVAM-Zielpolymere der vorliegenden Erfindung in einem Durchführen einer Reihe von Hydrolysen an einem Vorstufenpolymer. Das Vorstufenpolymer wird durch Copolymerisieren eines Vinylalkohlvorstufenmonomers, wie Vinylacetat (VAc), und eines Vinylaminvorstufenmonomers, wie N-Vinylformamid (NVF), gebildet. Die freie Radikalpolymerisation wird durch Verfahren durchgeführt, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind; s. bspw. Vinyl and Related Polymers von C. E. Schildknecht, 1952, veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc. Das Acetat wird mit einem katalytischen Gehalt (~3 Mol.-%) einer Base, wie methanolischem NaOH, hydrolysiert, und das Formamid wird mit einem etwas größeren als stoichometrischen Gehalt von entweder HCl oder NaOH hydrolysiert. Solche Polymerisationensverfahren werden im Detail in der Literatur beschrieben; s. europäische Patentveröffentlichung 0339371 A2 (Pinschmidt und Lai) und die hierin genannten Verweise. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird Variationen in dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Polymere erkennen.
Geeignete Vinylmonomere zur Polymerisation schließen herkömmliche hydrophobe und hydrophile Monomere ein. Geeignete hydrophobe Monomere schließen, ohne Begrenzung, C₁- bis C₁₈-Alkylacrylate und -Methacrylate, C₃- bis C₁₈-Alkylacrylamide und -methacrylamide, Acrylnitril, Methacrylnitril, Vinyl-C₁- bis C₁₈-Alkanoate, C₂- bis C₁₈-Alkene, C₂- bis C₁₈-Halogenalkene, Styrol, C₁- bis C₆-Alkylstyrole, Vinylalkylether, wobei der Alkylbereich 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, C₃- bis C₁₂-Perfluoralkylethylthiocarbonylaminoethylacrylate und -methacrylate, C₃- bis C₁₂-Acrylate und -methacrylate, Acryloxy- und Methacryloxyalkylsiloxane, N-Vinylcarbazol, C₁-C₁₂-Alkylester von Malein-, Fumar-, Itacon- und Mesaconsäuren und dergleichen ein.
Beispiele von geeigneten hydrophoben Monomeren schließen Methylacrylat, Ethylacrylat, Propylacrylat, Isopropylacrylat, Cyclohexylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat, Methylmethacrylat, Propylmethacrylat, Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylvalerat, Styrol, Chloropren, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acrylnitril, 1-Buten, Butadien, Methacrylnitril, Vinyltoluol, Vinylethylether, Perfluorhexylethylthiocarbonylaminoethylmethacrylat, 3-Methacryloxypropylpentamethyldisiloxan und Bis-(Methacryloxypropyl)tetramethyldisiloxan ein.
Geeignete hydrophile Monomere schließen, ohne Begrenzung, hydroxysubstituierte niedere Alkylacrylate und -methacrylate, N-Vinylformamid, Acrylamid, Methacrylamid, niederes C₁-C₂-Alkylacrylamid und -methacrylamid, ethoxylierte Acrylate und Methacrylate, hydroxysubstituiertes niederes Alkylacrylamid und -methacrylamid, hydroxysubstituierte niedere Alkylvinylether, Natriumstyrolsulfonat, 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, N-Vinylpyrrol, N-Vinylsuccinimid, N-Vinylpyrrolidon, 2- und 4-Vinylpyridin, Acrylsäure, Methacrylsäure, Amino (einschließlich quartäres Ammonium), niedere Monoalkylamino- oder niedere Dialkylamino-niedere Alkylacrylate oder -methacrylate, Allylalkohol und dergleichen.
Die Copolymere der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zu einem kleineren Grad mit Anhydriden, Epoxiden, Isocyanaten, reaktiven Carbonylen, Halogenalkylcarbonylen, Estern, Aziridinen, Michael-Akzeptoren, Säurechloriden, niederen Alkylhalogeniden und dergleichen modifiziert werden. Beispiele von modifizierenden Reagenzien schließen Succinsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid, Iodessigsäure, Polyoxyethylen oder Kohlenwasserstoffderivate, wie aktive Ester, Maleinimide, Vinylsulphone und dergleichen ein.
Die Längen der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können in einem gewissen Grad variieren, werden jedoch im allgemeinen von etwa 10 bis etwa 30 Nucleotide in der Länge sein. Es ist aus Gründen der kommerziellen Praktikabilität bevorzugt, daß die Oligonucleotide von etwa 14 bis etwa 20 Nucleotide lang sind, da längere Oligonucleotide innerhalb des Bereichs von 10 bis 30 Nucleotiden nicht spezifisch mit anderen Nichtzielsequenzen hybridisieren können, wenn das Oligonucleotid zu lang ist (d. h. im wesentlichen länger als 20 Nucleotide).
Bevorzugte Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung umfaßt werden, umfassen PVAVAMS, die mit Gegensinn-Oligonucleotiden kombiniert sind. Die Natur der Wechselwirkung ist unbekannt, ist jedoch vermutlich elektrostatisch. Die Zusammensetzungen können wie folgt charakterisiert werden: Das PVAVAM dient als ein "Träger" und das Oligonucleotid als ein "Reisender", und die PVAVAM/Oligonucleotid-Kombination ist ein "nicht kovalenter Träger/Reisender-Komplex oder -System". Die Fraktion von PVAVAM zu Oligonucleotid in den Zusammensetzungen basiert auf Amin enthaltenden Einheiten zu Phosphateinheiten und ist 0,001–1000, bevorzugt 0,01–500, bevorzugter 0,1–100, bevorzugter 0,2–30 und am bevorzugtesten 0,2–15.
Es wird in Erwägung gezogen, daß die PVAVAMs der vorliegenden Erfindung zur Lieferung von Polynucleotiden und Oligonucleotiden an Zellen verwendet werden können. Solche Zusammensetzungen können in Verfahren zur Verwendung im klinischen Einsatz bereitgestellt werden, z. B. Inhibierung von glatter Muskelzellenproliferation, Behandlung von Zellproliferationsfehlern, Entzündungsbehandlung und viraler Erkrankung. Eine Mischung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Löslichmacher, Hilfsmitteln und/oder Emulgatoren; s. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), S. 1435–1712, wird ebenfalls in Erwägung gezogen.
Beispiel 1 unten zeigt die Verfahren der Herstellung der Komponenten der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Beispiel 2 zeigt die Herstellung und die Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen (und Verfahren). Wie durch zelluläre Aufnahmestudien gezeigt, erleichtern die vorliegenden PVAVAM-Zusammensetzungen eine zelluläre Aufnahme von Gegensinn-Oligonucleotiden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt (i) eine Synthese von Oligonucleotiden, (ii) eine Fluoreszenz-Markierung der Oligonucleotide zur Verwendung als Markierungsmittel in den zellulären Aufnahmestudien in Beispiel 2 und (iii) die Herstellung verschiedener Copolymere.
I. Synthese der Oligonucleotide
Die Oligonucleotide, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, wurden unter Verwendung der Synthesevorrichtung von Applied Biosystems Inc. (Foster City, California) Modell 394 DNA synthetisiert. Phosphorothioat-modifizierte Verknüpfungen wurden durch Oxidieren der Phosphitverbindung eingeführt, die während der Oligonucleotidsynthese mit ³H-1,2-Benzodithiol-3-1,1-dioxid (Beaucage Reagenz, Glen Research, Sterling Virginia) anstelle der Standard-Iod-Oxidation gebildet wurde. Die vier geläufigen Nucleosidphosphoramidite (d. h. Adenosin Thymidin, Guanosin und Cytidin) und Desoxyinosinphosphoramidit wurden von Applied Biosystems Inc. käuflich erworben. Alle nicht modifizierten Phosphodiester und modifiziertes Thioat enthaltenden Oligonucleotide wurden durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55°C für 12 Stunden entschützt. Die Oligonucleotide wurden durch Gelausschlußchromatographie und Ethanolausfällung gereinigt und zur Trockne lyophilisiert.
Die Oligonucleotide, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, wurden vollständig mit Phosphorothioat-Verknüpfungen modifiziert und sind unten gezeigt:
OLIGO 1 GCT GTG GGG CGG CTC CTG
OLIGO 2 CGC CGT CGC GGC GGT TGG
Oligonucleotid 1 ist ein 18-mer Phosphorothioat-modifiziertes Oligonucleotid, welches eine ähnliche Basenzusammensetzung wie die menschliche anti-c-myb-Gegensinn-Sequenz aufweist. Oligonucleotid 2 ist ein 18-mer Phosphorothioat-modifiziertes Oligonucleotid mit keinem bekannten Gegensinn-Ziel.
II. Markierung der Oligonucleotide
Fluorescein wurde in die Oligonucleotide an dem 5'-Ende unter Verwendung eines Fluoresceinamidits eingeführt, das von Glen Research (Sterling Virginia) käuflich erworben wurde und gemäß den Spezifikationen des Herstellers verwendet wurde.
III. Copolymerherstellung
Der Text unten veranschaulicht die Herstellung und Charakterisierung von PVAVAM-Zielcopolymeren, die durch die Hydrolyse von Vinylacetat/Vinylformamid und Vinylalkohol/Vinylformamid-Vorstufenpolymeren hergestellt werden. Die hergestellten PVAVAMs wiesen einen variierenden Vinylamingehalt auf. Der Vinylamingehalt der PVAVAMs wurde durch potentiometrische Titration bestimmt.
1. Herstellung der PVAVAMs
Die Herstellungen werden in einer dreischrittigen Vorgehensweise veranschaulicht: Schritt 1 schließt die Synthese des Vinylacetat/Vinylformamid-Vorstufenpolymers ein; Schritt 2 schließt die Synthese des Vinylalkohol/Vinylformamid-Vorstufenpolymers ein; und Schritt 3 schließt die Synthese des PVAVAM-Zielpolymers ein. Die hergestellten PVAVAMs wiesen einen variierenden Vinylamingehalt auf (Verhältnis von N-Vinylformamid zu Vinylacetat spiegelt die Variation von Amin-zu-Alkoholgehalt wider).
2. Charakterisierung der PVAVAMs
Der Vinylamingehalt des PVAVAM wurde durch potentiometrische Titration einer abgewogenen Menge an Polymer (≈ 0,5 g), gelöst in 100 ml Wasser, gemessen. Wenn das PVAVAM in der Form einer freien Base war (z. B. wenn die wäßrige Basenhydrolyse des Formamids verwendet worden war), war der anfängliche pH-Wert i. a. über 10 und wurde auf ≈ 1,99 mit HCl gebracht, dann auf ≈ 12,01 mit NaOH angehoben. Für Hydrochloridsalze, die durch die nicht wäßrige Säurehydrolyse des Formamids gebildet wurden, wurde der anfängliche pH-Wert von 4 oder kleiner auf ≈ 12,01 mit NaOH angehoben, dann auf ≈ 1,99 mit HCl abgesenkt. Die Kurven beider Titrationen für jede Lösung wurden verglichen und zeigten eine gute Übereinstimmung für die Abhängigkeit des pH-Werts auf mEq des Titrationsmittels. Nach Untersuchung einer Auftragung von ΔpH/ΔmEq ebenso wie der Titrationskurve selbst wurde der mEq des Amins bestimmt und der Gewichtsprozentanteil und Molprozentanteil des Amins berechnet.
Herstellung A
Schritt 1
Der Reaktor (ummantelter 500 ml 4-Hals-Kolben, ausgerüstet mit einem Überkopfrührer mit Teflon-Flügeln, Kondensator, Thermometer und Teflonröhrenzuführleitungen) enthielt 1,42 g N-Vinylformamid (NVF), 84,28 g Vinylacetat (VAc) (Polysciences) und 67 g Methanol. Die Aufgabe enthielt 5,33 g NVF und 36,55 g VAc. Die Polymerisation wird bei 60°C unter Stickstoff unter Verwendung von 0,51 g tert-Butylperoxyneodecanoat (AKZO Chemicals Inc.) durchgeführt. Die Aufgabe wird mit einer Geschwindigkeit von etwa 7 bis 15 ml/h über eine dreistündige Dauer geliefert und Methanol wird periodisch zugefügt, um das Volumen wieder einzustellen. Die Polymerisation wird durch die Zugabe von 14,8 mg Methyletherhydrochinon (MEHQ) (Polysciences) gestoppt. Überschüssiges VAc wird durch azeotrope Destillation mit Methanol entfernt.
Schritt 2
VAc/NVF-Polymer (29 g) wird schnell mit 1,6 g 50%igem NaOH (0,02 Mol) in 150 ml MeOH gemischt. Die Hydrolyse wird bei 40°C für 30 Minuten durchgeführt. Der resultierende VA/NVF-Polymerniederschlag wird mit MeOH gewaschen und bei 60°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute ist 11,3 g.
Schritt 3
VA/NVF-Polymer (8 g) wird in 72 ml Methanol suspendiert und mit 1,32 ml 12 N HCL (0,0158 Mol) in 16 ml Methanol gemischt. Die Hydrolyse wird bei 60°C für zwei Stunden durchgeführt. Das resultierende VA/VAM-Polymer wird mit Methanol gewaschen und bei 50°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute ist 8,08 g, und der Amingehalt ist 4,6 Mol.-%.
Herstellung B
Dieses Polymer wird auf eine ähnliche Art und Weise wie Herstellung A mit den folgenden Modifikationen in bezug auf Schritt 1 hergestellt: Der Reaktor enthält 3,55 g NVF, 81,7 g VAc, 100 ml Methanol und 0,49 g tert-Butylperoxyneodecanoat; die Aufgabe enthält 12,5 g NVF und 27,9 g VAc; zusätzliche 0,263 g tert-Butylperoxyneodecanoat werden 2½ Stunden nach der ersten Zugabe zugefügt. Zusätzlich wird Methanol periodisch zugefügt, um das Volumen wieder einzustellen. Die Polymerisation wird durch die Zugabe von 15,7 mg MEHQ nach 4 Stunden Polymerisation gestoppt, und an dieser Stelle bleiben 8,5 ml Aufgabe über.
Schritt 2
VAc/NVF-Vorstufenpolymer (41 g) in 230 ml Methanol wird schnell mit 1,04 g 50%igem NaOH gemischt und bei 40°C für 30 Minuten hydrolysiert. Der VA/NVF-Polymerniederschlag wird mit Methanol gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute ist 23,64 g.
Schritt 3
Das VA/NVF-Polymer (10 g) wird in 40 g H₂O gelöst, 2,515 g 50%iges NaOH werden zugefügt und die Mischung bei 80°C für 8 Stunden erwärmt. Das Produkt wird erschöpfend (Spectrapor, 3500 MWCO) gegen deionisiertes Wasser dialysiert und 80% dieser Lösung werden zu einem baumwollartigen, weißen Material lyophilisiert. Die Ausbeute des resultierenden VA/VAM-Polymers ist 5,67 g, und der Amingehalt ist 13,9 Mol.-%.
Herstellung C
Dieses Polymer wird auf eine ähnliche Art und Weise wie Zubereitung A mit den folgenden Modifikationen gegenüber Schritt 1 hergestellt: Der Reaktor enthält 2,48 g NVF, 83 g VAc, 120 ml Methanol und 0,51 g tert-Butylperoxyneodecanoat; die Aufgabe enthält 9,12 g NVF und 31,95 g VAc. Methanol wird periodisch zugefügt, um das Volumen zu halten. Zusätzliche 0,29 g tert-Butylperoxyneodecanoat werden 2 Stunden nach der anfänglichen Zugabe zugefügt. Die Polymerisation wird durch die Zugabe von 20 mg MEHQ nach 3 Stunden und 40 Minuten Polymerisation gestoppt.
Schritt 2
Das VAc/NVF-Polymer (12,5% Feststoffe) in etwa 200 ml Methanol wird schnell mit 0,759 g 50%igem NaOH gemischt und bei 40°C für 25 Minuten erwärmt. Der VA/NVF-Polymerniederschlag wird mit Methanol gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute ist 14,8 g.
Schritt 3
Das VA/NVF-Polymer (13,0 g) wird in 117 ml Methanol suspendiert. Zu diesem werden tropfenweise 3,02 ml 12 N HCl (0,0362 Mol) in 26 ml Methanol zugefügt. Die Mischung wird bei 60°C für 2 Stunden erwärmt. Nach Waschen und Lyophilisieren ist die Ausbeute des resultierenden VA/VAM 8,5 g, und der Amingehalt ist 8,6 Mol.-%.
Zubereitung D
Dieses Polymer wird auf eine ähnliche Art und Weise wie Zubereitung B mit den folgenden Modifikationen gegenüber Schritt 1 hergestellt: Der Reaktor enthält 3,55 g NVF, 81,70 g VAc, 100 ml Methanol und 0,49 g tert-Butylperoxyneodecanoat; die Aufgabe enthält 12,55 g NVF und 27,90 g VAc. Zusätzlich wird Methanol periodisch zugegeben, um das Volumen wieder einzustellen. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 21,6 mg MEHQ nach 4½ Stunden Polymerisation gestoppt.
Schritt 2
Das VAc/NVF-Polymer (etwa 34 g) in etwa 200 ml Methanol wird schnell mit 0,847 g 50%igem NaOH (0,0106 Mol) bei 40°C für 25 Minuten gemischt. Das Polymer wird mit Methanol gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an VA/NVF-Polymer ist 22,7 g.
Schritt 3
Das VA/NVF-Polymer (20 g) wird mit 80 g Wasser und 5,0 g 50%igem NaOH gemischt und bei 80°C für 6 Stunden erwärmt. Nach Dialysieren und Lyophilisieren ist die Ausbeute des resultierenden VA/VAM 12,38 g, und der Amingehalt war 10,4 Mol.-%.
Zubereitung E
Dieses Polymer wird auf eine ähnliche Art und Weise wie Zubereitung A mit den folgenden Modifikationen gegenüber Schritt 1 hergestellt: Der Reaktor enthält 3,05 g NVF, 82,3 g VAc, 100 ml Methanol und 0,6 g tert-Butylperoxyneodecanoat; die Aufgabe enthält 11,08 NVF und 29,58 g VAc. Methanol wird periodisch zugefügt, um das Volumen zu halten. Die Polymerisation wird durch die Zugabe von 19,4 mg MEHQ nach 4½ Stunden Polymerisation gestoppt.
Schritt 2
Das VAc/NVF-Polymer (etwa 52 g) in 250 ml Methanol wird schnell mit 1,28 g 50%igem NaOH (0,016 Mol) bei 40°C für 25 Minuten gemischt. Das Polymer wird mit Methanol gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an VA/NVF-Polymer ist 29,97 g.
Schritt 3
Das VA/NVF-Polymer (18 g) wird in 180 ml Methanol suspendiert. Zu diesem werden tropfenweise 4,2 ml 12 N HCl in 36 ml Methanol zugefügt. Die Mischung wird bei 60°C für 2 Stunden erwärmt. Nach Filtrieren, Waschen und Trocknen bei 50°C im Vakuum wird das Material in etwa 4 1 Wasser gelöst und dann die Hälfte des Materials lyophilisiert. Die Ausbeute des resultierenden VA/VAM ist 6 g, und der Amingehalt ist 10,4 Mol.-%.
Zubereitung F
Dieses Polymer wird auf eine ähnliche Art und Weise wie Zubereitung C mit den folgenden Modifikationen gegenüber Schritt 1 hergestellt, um das Molekulargewicht verglichen mit Zubereitung C zu vermindern: Der Reaktor enthält 0,62 g NVF, 20,87 g VAc, 169 ml Methanol und 0,5 g tert-Butylperoxyneodecanoat; die Aufgabe enthält 2,28 g NVF, 7,99 g VAc und 32,7 ml Methanol. Methanol wird periodisch zugefügt, um das Volumen zu halten. Die Polymerisation wird durch Zugabe von 23 mg MEHQ nach 4 Stunden Polymerisation gestoppt.
Schritt 2
Das VAc/NVF-Polymer (etwa 17 g) in etwa 108 ml Methanol wird schnell mit 0,447 g 50%igem NaOH (0,056 Mol) bei 40°C für etwa 20 Stunden gemischt. Das Polymer wird mit Methanol gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an VA/NVF-Polymer ist 4,04 g.
Schritt 3
Das VA/NVF-Polymer (3,7 g) wird in 33,3 ml Methanol suspendiert. Zu diesem werden tropfenweise 0,85 ml 12 N HCl in 7,32 ml Methanol zugefügt. Die Mischung wird bei 60°C für 2½ Stunden erwärmt. Nach Filtrieren, Waschen und Trocknen bei 50°C im Vakuum ist die Ausbeute des resultierenden VA/VAM 1,86 g, und der Amingehalt ist 8,8 Mol.-%.
Zubereitung G
Dieses Polymer wird auf eine ähnliche Art und Weise wie Zubereitung F mit den folgenden Modifikationen gegenüber Schritt 1 hergestellt, um das Molekulargewicht verglichen mit Zubereitung C zu vermindern: Der Reaktor enthält 2,48 g NVF, 83,00 g VAc, 200 ml Methanol und 0,51 g tert-Butylperoxyneodecanoat; die Aufgabe enthält 9,12 g NVF und 31,95 g VAc. Methanol wird periodisch zugefügt, um das Volumen zu halten. Die Polymerisation wird durch die Zugabe von 22 mg MEHQ nach 2¾ Stunden Polymerisation gestoppt. Das Endvolumen, das in der Aufgabe belassen wird, ist 14,5 ml.
Schritt 2
Das VAc/NVF-Polymer (etwa 47 g) in 225 ml Methanol wird schnell mit 1,23 g 50%igem NaOH bei 40°C für etwa 30 Minuten gemischt. Das Polymer wird mit Methanol gewaschen und bei 45°C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an VA/NVF-Polymer ist 27,58 g.
Schritt 3
Das VA/NVF-Polymer (10 g) wird in 90 ml Methanol suspendiert und zu diesem werden 2,3 ml 12 N HCL in 20 ml Methanol zugegeben. Die Mischung wird bei 60°C für 2 Stunden erwärmt. Nach Filtrieren, Waschen und Trocknen bei 50°C im Vakuum ist die Ausbeute des resultierenden VA/VAM 8,2 g, und der Amingehalt ist 8,6 Mol.-%.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von PVAVAM/Oligonucleotid-Zusammensetzungen und zelluläre Aufnahmeexperimente unter Verwendung der Zusammensetzungen.
I. Herstellung der Zusammensetzungen
Die in diesem Beispiel verwendeten Oligonucleotide sind diejenigen, die im Beispiel 1 beschrieben wurden. Die in diesem Beispiel verwendeten PVAVAMs wiesen einen variierenden Vinylamingehalt auf und wurden hergestellt und charakterisiert auf eine ähnliche Art und Weise wie solche, die im Beispiel 1 hergestellt wurden. Die PVAVAM/Oligonucleotid-Zusammensetzungen wurden durch Mischen der Polymerlösung (1–10% w/v in Wasser) und 1 mM fluoresziertem Oligonucleotid (18-mer, in Wasser) mit Medium in 1 ml Gesamtvolumen gemischt. In den meisten Experimenten wird Minimalmedium (DMEM) verwendet, jedoch kann CHO-Medium mit 5% Serum mit ähnlichen Ergebnissen ersetzt werden. Im Entwurf der Behandlungen wurde die Oligonucleotidkonzentration bei 10 μM (180 μM in Nucleosidphosphaten) gehalten und Polymer wurde zugefügt, so daß der gesamte polymere Amingehalt ein gegebenes Vielfaches der Phosphate (s. Tabelle I) war. Die PVAVAM/Oligonucleotid-Zusammensetzugen wurden 25 Minuten im voraus hergestellt und in dem Inkubator bei 37°C und 10% CO₂ gewärmt.
II. Zelluläre Aufnahmeexperimente
Adhärentkulturen von CHO D^–-Zellen wurden in 25 ml Medium in T75 Gewebekulturkolben in einem Inkubator bei 37°C und 10% CO₂ gehalten. Das Kulturmedium bestand aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, wie im Gibco-Katalog, Katalog-Nr. 11965-050) beschrieben, ergänzt mit 5% Fötalrinderserum (Hyclone Nr. 1905-AA, inaktiviert durch 30minütige Wärmebehandlung in einem Wasserbad von 60°C), 1% "100X" L-Glutamin (Gibco 25030-016), 1% "100X" HT Supplement (Gibco 11067-014) und 1% "100X" MEM nicht essentielle Aminosäuren (Gibco 14190-144).
Die Zellen wurden für die Experimente zum Zeitpunkt des Durchgang ausplattiert, wenn die Zellen Konfluenz erreicht hatten. Eine Trypsinierung wurde durchgeführt, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu gewinnen. Die Trypsinlösung war eine Verdünnung von "10X" Trypsin-EDTA (Gibco 15400-021) in Dulbecco's PBS (Gibco 14190-144), so daß die Endkonzentration 1,5X war (z. B. 100 ml Trypsin wurden mit 567 ml des PBS gemischt – diese Lösung wurde im voraus hergestellt, steril gefiltert, in sterilen Behältern aliquotiert und bei –20°C gelagert. Die Trypsinlösung wurde aufgetaut, erwärmt und unmittelbar vor Verwendung wieder filtriert). Um die Zellen zu gewinnen, wurde das Medium abgesaugt und jegliches Restmedium (welches Trypsininhibitor enthält) wurde mit zwei schnellen 8–10 ml Spülungen der Trypsinlösung, gefolgt von einer 5minütigen Inkubation der Zellen mit 5 ml Trypsinlösung weggespült. Die abgetrennten Zellen wurden wieder suspendiert, um ein "5X"-Konzentrat herzustellen. Subkulturen waren typischerweise bei 1/10- oder 1/20-Verdünnung (z. B. wurden für eine 25 ml Subkultur bei 1/10 0,5 ml Zellsuspension verwendet). Für die Experimente wurden die Zellen in Gewebekulturplatten mit sechs Bohrungen (Falcon-Nr. 3046) mit 5 ml pro Bohrung ausplattiert. Eine 1/10 Verdünnung wurde im allgemeinen am nächsten Tag fertig, eine 1/20 in zwei Tagen.
Im allgemeinen waren Zellen zum Zeitpunkt des Experiments zu 30–50% konfluent. Behandlungen wurden durchgeführt durch Absaugen des alten Mediums und Zufügen der Behandlungslösung, die das PVAVAM/Oligonucleotid enthielt. Die Behandlungslösungen können Serum enthalten. Sorgfalt wurde beachtet, um die Zellen nicht zu trocknen. Nachdem die Zellen für eine Stunde inkubiert worden waren, wurden die Behandlungslösungen abgesaugt und die Bohrungen fünfmal mit DMEM, 2 ml. pro Wäsche, gewaschen, dann wurde Vollmedium zu den Bohrungen für die "Verfolgung" zugefügt.

Die lebenden Zellen wurden auf einem invertierten NIKON^® Diaphot-Mikroskop mit Fluoreszenzanfügungen und Polaroid^®-Kamera untersucht. Ein gegebenes Feld wurde zunächst durch Phasenkontrast beobachtet, dann wurde das sichtbare Licht gedämpft, um das entsprechende Fluoreszenzfeld zu beobachten. Wo eine Kernaufnahme erkannt wurde, wurde das Phasenbild der Zelle wieder zurückgebracht, um die Gesundheit und Integrität der Zelle zu beurteilen. Die Aufnahme wurde wie folgt bepunktet:

Punkte	Fluoreszenzlokalisierung
0	Wenig oder keine zellassoziierte Fluoreszenz
1	Hauptsächlich assoziiert mit der Oberfläche, etwas endosomal
2	Kräftig, sowohl Oberfläche als auch endosomal
3	Glatt und diffus cytoplasmisch und in der gesamten Zelle
4	Anfänglich Oberfläche und endosomal; bis zu 5% der Kerne verfärbten sich nach wenigen Stunden der Verfolgung,
5	Anfänglich Oberfläche und endosomal mit 10% oder weniger Kernfärbung; 30–40% der Kerne verfärbten sich nach wenigen Stunden
6	Anfänglich 80% oder mehr der Kerne verfärbten sich
D	Keine Punkte, Zellen zerfielen bei Beginn der Verfolgung

Die Ergebnisse der Aufnahmeexperimente sind in Tabelle 1 dargelegt.
Tabelle 1
Dieses Beispiel veranschaulicht, daß man eine verbesserte zelluläre Aufnahme mit beträchtlicher Kernlieferung und geringer Toxizität durch die Verwendung von PVAVAMs erreichen kann. In der Abwesenheit von PVAVAM sind die meisten Zellen nicht fluoreszierend, während in der Gegenwart von Vinylaminhomopolymer die Zellen auf einen Fluoreszenzrest vermindert sind. Im allgemeinen führen höhere Amingehalte zu einer Cytotoxizität, während geringere Gehalte zu einer endosomalen/lysosomalen-Verteilung führen. Für eine cytoplasmische Kernlieferung gibt es einen Trend eines höheren Verhältnisses von Amin- zu Anioneneinheiten bei einem geringeren Molprozentgehalt an Amin in dem PVAVAM: Beispielsweise bei 10,4 Mol.-% Amin ist ein bevorzugtes Amin-zu-Anionen-Einheit-Vielfaches 4,9, während bei 8,8 Mol.-% Amin ein bevorzugtes Vielfaches 9,5 ist.

Claims

Zusammensetzung, die ein Copolymer der allgemeinen Formel I, -(CH2-HCOH-)x-(CH2-HCNR1R2R3-)y-Az- Iumfaßt, wobei R1, R2 und R3 unabhängig Wasserstoff, niederes Alkyl oder 2-Hydroxyalkyl, oder R1 = R2 = Wasserstoff, niederes Alkyl oder 2-Hydroxyalkyl und R3 ein freies Elektronenpaar sind, A der Rest eines Vinylmonomers ist, x, y und z ganze Zahlen sind, die die Anzahl von eingebautem Monomer darstellen, und wobei x + y + z = 100 ist, wobei x = 25–99,5 Mol.-%, y = 0,5–75 Mol.-% und z < 50 Mol.-% ist, kombiniert mit einem Oligonukleotid, wobei das Molverhältnis von y zu Anioneneinheiten 0,1–100 ist, optional in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der x = 80–96 Mol.-%, y = 4–20 Mol.-% und z ≤ 16 Mol.-% ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der x = 85–94 Mol.-%, y = 6–15 Mol.-% und z ≤ 9 Mol.-% ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei der das Molverhältnis von y zu Anioneneinheiten 0,2–30 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei der das Molverhältnis von y zu Anioneneinheiten 2–15 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei der R1 = R2 = R3 = Wasserstoff ist, und wobei A ein Rest von Vinylacetat und Vinylformamid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei der R1 = R2 = Wasserstoff ist, wobei R3 ein freies Elektronenpaar ist, und wobei A ein Rest von Vinylacetat und Vinylformamid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, bei der das Oligonukleotid eine Phosphathauptkette umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, bei der das Oligonukleotid ein Gegensinn-Oligonukleotid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, bei der die Länge des Gegensinn-Oligonukleotids von 10 bis 30 Nukleotiden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei der die Länge des Gegensinn-Oligonukleotids 18 Nukleotide ist.
In-vitro-Verfahren zum Bewirken einer zellulären Aufnahme eines Oligonukleotids, umfassend eine Verabreichung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 an die Zellen, so daß das Oligonukleotid in die Zellen transportiert wird.