ES2232176T5

ES2232176T5 - Macromonomeros basados en peg, polimeros quimicamente inertes preparados a partir de los mismos y el uso de estos polimeros para sintesis organica y reacciones enzimaticas.

Info

Publication number: ES2232176T5
Application number: ES99945955T
Authority: ES
Inventors: Morten Meldal; Jens Buchardt; Jorg Rademann
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-09-28
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2019-09-28
Also published as: EP1137690B2; HU0103572D0; CA2345332A1; AU766181B2; EP1137690B1; ATE282057T1; HUP0103572A3; HUP0103572A2; WO2000018823A2; DE69921850T3; EP1137690A2; IL141849A0; ES2232176T3; CZ296517B6; WO2000018823A3; NZ511315A; NO20011554D0; DE69921850D1; CZ20011037A3; JP2002525405A

Abstract

Un macromonómero de polietilenglicol que tiene unidades que se repiten en el intervalo 6 a 300 y que tiene al menos un extremo terminado en un grupo éter que tiene la fórmula donde m es un número entero de 1-10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

Description

Macromonómeros basados en PEG, polímeros químicamente inertes preparados a partir de los mismos y el uso de estos polímeros para síntesis orgánica y reacciones enzimáticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a macromonómeros que contienen unidades que se repiten de etilenglicol, a polímeros químicamente inertes preparados a partir de los mismos, y al uso de dichos polímeros en ensayos bioquímicos en fase sólida.

Antecedentes de la invención

El uso de polietilenglicol terminado en acrilamida en la preparación de polímeros reticulados, se ha descrito en la Solicitud de Patente Internacional núm. WO 93/16118 y UK 9609911.4. Dichos polímeros tienen un uso particular como soportes sólidos para la síntesis de péptidos, oligonucleótidos u oligosacáridos, o como sustratos para la inmovilización de proteínas o como resinas cromatográficas. Se hinchan completamente en agua y puede usarse también para ensayos enzimáticos en fase sólida. Mientras los polímeros así producidos eran particularmente útiles como soportes para la síntesis de polipéptidos, la eliminación de los enlaces lábiles en el esqueleto de la matriz del polímero y el reemplazo con enlaces más inertes químicamente, los permite usarse como soportes para llevar a cabo una gran diversidad de reacciones orgánicas.

El documento US-A-5 352 756 describe polímeros reticulados de poli(etilen o propilen)glicol formados mediante copolimerización radical, usando un compuesto acrílico, de derivados de poli(etilen o propilen)glicol sustituidos en el extremo bis con restos acrílicos.

El documento US-A-5 573 934 describe i.a. polímeros reticulados de poli(etilenglicol) formados mediante la fotopolimerización de i.a. poli(acrilatos de etilenglicol) y útiles para el encapsulado de células o para mejorar la biocompatibilidad.

Mientras, todas las resinas basadas en PEG descritas previamente son bastante lábiles a las duras y generalmente usadas condiciones de reacción, tales como anhídrido acético y ácido de Lewis, cloruro de tionilo, hexametildisilazano de butil-litio o potasio, un polímero que contiene sólo enlaces éter primarios estables además de enlaces CH y CC, sería completamente estable bajos esas condiciones.

Con los requisitos anteriores en mente, se ha desarrollado actualmente una serie de macromonómeros de poli(etilen o propilen)glicoles terminados en oxetano o vinilfenilpropiléter de los que pueden prepararse resinas reticuladas en las que los enlaces lábiles en los polímeros basados en PEG descritos anteriormente se sustituyen por uniones éter estables, mientras se retiene el balance optimizado de carácter hidrofílico-hidrofóbico.

Compendio de la invención

En un aspecto, la presente invención tiene que ver con un macromonómero de tipo A que tiene la estructura:

1

donde ñ es un número real de 6-300, y ñ también significa el valor medio de n lo siguiente, y donde X e Y es cada uno independientemente un grupo de fórmula

2

donde m es 1-10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo,

o donde X es -OH, e Y es un grupo de fórmula

3

donde m es 1-10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

En un aspecto adicional, la presente invención tiene que ver con un macromonómero de tipo B que tiene la estructura:

4

donde R es H o alquilo o arilo o arilalquilo,

y ñ es un número real de 6-300 como se define anteriormente y donde X, Y y Z son cada uno independientemente OH o un grupo de la fórmula

5

donde m es un número entero de 1-10, a es como se define anteriormente, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo, con tal que al menos uno de X, Y o Z sea un grupo de la fórmula

6

donde m es un número entero de 1-10, a es como se define anteriormente, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

Descripción detallada de la invención

En el presente contexto, el término "alquilo" designa un resto alifático de 1 a 10 átomos de carbono tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo o decilo. El término "arilalquilo" designa un grupo arilo unido a una cadena alquileno de 1 a 5 átomos de carbono tal como metileno, etileno o propileno, y el grupo arilo aquí puede ser del tipo monocíclico o dicíclico aromático, que incluye tipos aromáticos carbocíclicos normales tales como fenilo, naftilo y bifenilo, además de tipos heterocíclicos tales como piridilo, bipiridilo, imidazolilo, triazolilo, pirrolilo, bipirrolilo, tiazolilo y oxazolilo.

El factor "a" como se aplica al sustituyente R indica que R está presente del anillo de fenilo un total de "a" veces, y que cada grupo R puede seleccionarse de la definición de R independientemente de los otros grupos R.

El factor "ñ" es como se define anteriormente, un número real de 6-300, y designa el número medio del grupo etilenoxi en cuestión, presente en el macromonómero.

Los macromonómeros de la invención pueden prepararse convenientemente haciendo reaccionar un derivado de metal alcalino, tal como derivado de litio, sodio, potasio o cesio, del polietilenglicol apropiado, preferiblemente el derivado de sodio, sustituido con el halógeno apropiado, por ejemplo, sustituido con bromo, cloro o yodo, o sustituido con arilsulfonato, tal como sustituido con tosilo, derivado de oxetanilalquilo para dar el correspondiente polietilenglicol coronado con oxetanilalquilo.

El polietilenglicol puede ser del tipo "estrella" proporcionado por tetra a hexa-ramificación del macromonómero, a partir de por ejemplo, un núcleo de átomo de carbono aromático o alifático sustituido con las cadenas PEG, o del tipo con forma de "T", donde el macromonómero PEG está tri-ramificado por un átomo de carbono ternario o cuaternario.

El derivado de metal alcalino de polietilenglicol con Li, Na, K o Cs puede formarse por reacción con un metal alcalino tal como sodio, potasio, litio o un hidruro de metal alcalino, por ejemplo NaH, KH, LiH, o por intercambio con alquilo- o alcoxilo- u otras sales de metal alcalino, por ejemplo, por ejemplo BuLi, KOtBu, Cs_{2}CO_{3}, KHMDS.

Los macromonómeros coronados con oxetanilalquilo pueden polimerizarse mediante el uso de un catalizador catiónico tal como, por ejemplo, sales o haluros de Et_{2}O:BF_{3}, TMSOTf, TfOH, TMSBr, TMSl, TiCl_{4} o ZnBr_{2} y otras sales de hafnio, itrio, tantalio y hierro para dar resina reticulada.

En aún un aspecto adicional de la invención, tiene que ver un polímero reticulado formado por la polimerización en masa de los productos de la reacción entre derivados mono y di-alcalinos de polietilenglicol con un derivado de oxetano u oxetanilalquilo que tiene la fórmula:

7

donde Z es Cl, Br, I, toluensulfoniloxi, CH_{3}SO_{3} o CF_{3}SO_{3}.

m es un número entero de 1 a 10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

Miembros de esta clase de compuestos pueden prepararse, por ejemplo, de la siguiente manera:

8

En los dibujos,

El polímero derivado de oxetano puede prepararse en un ordenamiento en forma de gotas o disolviendo el macromonómero oxetanilado en un volumen de un disolvente (por ejemplo, acetonitrilo) y suspendiendo la mezcla en aceite de silicona en presencia de un tensioactivo, típicamente un polímero obtenido por polimerización radical de metacriloxipropilpentametildisiloxano y monometiléter de metacriloilo de PEG 350. El ácido de Lewis BF_{3} se añade a baja temperatura justo antes de la suspensión en el aceite.

El polímero puede modificarse por un reticulante temporal que se divide selectivamente a un punto tardío en el tiempo para dar un polímero más expansible. Esto se consigue típicamente mediante incorporación de {bis-(3-metil-3-oxetanilmetoxi)-2-buteno y más tarde el doble enlace se divide por ozonolisis o reacción de metátesis catalizada por rutenio, usando un exceso de etileno.

La Figura 1 es una representación esquemática de las reacciones implicadas en la preparación de macromonómeros de polietilenglicol coronados con oxetano.

La Figura 2 es una representación de la resina reticulada obtenida por polimerización de polietilenglicol coronado con vinilfenilalquiléter.

La Figura 3 es una representación de la resina obtenida por la polimerización de polietilenglicol coronado con oxetano.

La Figura 4 es un rastro en ^{13}C-RMN en fase en gel del polímero reticulado de la Figura 2 derivado mediante Fmoc-Gly.

La Figura 5 es un rastro en ^{1}H-RMN en fase sólida con giro del ángulo mágico, con irradiación selectiva a 3,67 ppm para eliminar la señal de PEG del polímero reticulado de la Figura 2 después de la acilación con Fmoc-Gly. Se obtuvieron espectros resueltos y se obtuvieron resultados similares con la resina en la Figura 3 en espectroscopia ^{1}H-RMN en fase sólida MAS.

La Figura 6 es un rastro en ^{13}C-RMN en fase en gel del polímero reticulado de la Figura 3.

La Figura 7 muestra las reacciones orgánicas que han sido exitosas en la resina preparada por polimerización de macromonómeros derivados de 3-metiloxetan-3-ilmetilo.

La Figura 8 ilustra un ensayo enzimático en fase sólida en el que un sustrato apagado por fluorescencia unido a una resina preparada a partir de macromonómeros de vinilfenilpropil-PEG, se divide durante 1 h por migración de subtilisina Carlsberg a través de la red del polímero. Se obtuvo el mismo resultado con el polímero SPOCC.

La Figura 9 muestra una resina SPOCC en perlas obtenida mediante polimerización en aceite de silicona.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

Ejemplo 1 3-metil-3-(4-toluensulfonoximetil)-oxetano

Se disolvió cloruro de 4-toluensulfonilo (20 g, 105 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (50 mL) y piridina (50 mL). Bajo enfriamiento en un baño de hielo, se añadió en gotas 3-hidroximetil-3-metil-oxetano (100 mmoles, 9,9 mL). La reacción se calentó a temperatura ambiente toda la noche. Se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (100 mL) y se extrajo con agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio filtrado y los disolventes se separaron mediante evaporación. Los productos restantes se coevaporaron varias veces con tolueno para separar la piridina restante y con cloroformo para separar el tolueno. El producto bruto obtenido era de suficiente pureza para uso adicional. Rendimiento: 22 g de un sólido blanco cristalino (92%). TLC: Rf (éter de petróleo/acetato de etilo 1:1): 0,56. Los datos espectroscópicos estuvieron de acuerdo con la literatura (Dale, J.; Fredriksen, S.B. Act. Chem. Scand. B 1992, 46, 271-277).

Ejemplo 2 Polietilenglicol bis-oxetanilado (bis-(3-metil-3-oxetanilmetoxi)-PEG

Se secó cuidadosamente polietilenglicol (-400 o -1500; 10 mmoles) mediante coevaporación de agua con tolueno. Después se disolvió en tolueno y DMF (15 mL de cada uno). Se añadió hexametildisilazano de potasio (KHMDS) (22 mmoles) bajo agitación a temperatura ambiente, después de 15 minutos, los disolventes se separaron juntos con HMDS a 50ºC con baño de agua con el evaporador rotatorio. El PEG de potasio restante se redisolvió en DMF (15 mL). El derivado tosilado de oxetano (24 mmoles) se añadió en partes a temperatura ambiente y la reacción se calentó durante 12 horas a 75ºC. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió agua (2 mL) y se agitó durante 15 minutos para hidrolizar totalmente el agente alquilante no reaccionado. Los disolventes se separaron a 40ºC a presión reducida. La suspensión restante se resuspendió en CH_{2}Cl_{2} y se filtró a través de una capa de kieselguhr (Celite) (2 cm de kieselguhr en un filtro de cristal, humidificado con disolvente orgánico y comprimido) y finalmente se evaporó hasta sequedad. Rendimiento: 90% de 2a. El RMN del producto acetilado indicó la alquilación de >95% de los grupos PEG-hidroxi con anillos oxetano.

Cuando se empleó exceso reducido de los reactivos alquilantes 3 (15 y 18 mmoles), el porcentaje del grupo oxetanilo se disminuyó (66%, 80%).

Ejemplo 3 Acetilación de mezclas de PEG mono- y bis-oxetanilado

La mezcla de reacción del Ejemplo 2 (10 g) se disolvió en piridina (20 mL). Se añadió anhídrido acético (10 mL), y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Los disolventes se separaron a presión reducida, y el grado de acetilación se cuantificó por ^{1}H-RMN.

Ejemplo 4 SPOCC-resina formada por polimerización de PEG oxetanilado

Procedimiento A.: Se disolvió en argón PEG-1500 o -400 oxetanilado (1 a 20 mmoles) preparado como en el Ejemplo 2 o el derivado acetilado del Ejemplo 3, en un volumen igual de CH_{2}Cl_{2}, se enfrió a -20ºC y se agitó con un agitador magnético. Se añadió dietileterato de trifluoruro de boro (0,15 a 0,3 equivalentes). Se condujo el calentamiento gradualmente para determinar la temperatura a la que se da la polimerización (-10ºC, 2 h; 0ºC, 2 h; 4ºC, 2 h). Finalmente, la viscosidad de la disolución aumentó y la agitación magnética paró (punto de engomado). El punto de engomado se alcanzó después que la disolución se dejara a 4ºC durante 30 min. El polímero se almacenó a esta temperatura (2 d) y un día adicional a temperatura ambiente. Para el desarrollo, el polímero se cortó en pedazos. Éstos se hincharon (CH_{2}Cl_{2}, 2 h) y luego se granularon a través de un colador de metal (tamaño de poro de 1 mm) empleando una maja. La resina granulada se lavó cuidadosamente (CH_{2}Cl_{2}, THF, DMF, agua, DMF, THF, CH_{2}Cl_{2}), y se secó al vacío. Se determinaron los volúmenes de carga de resina e hinchado en diferentes disolventes. La capacidad de los polímeros del grupo hidroxilo se determinó mediante esterificación con fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc)-Gly usando el método MSNT (Tetrahedron Letters 1988, 29, 5871-5874) y se midió la absorbancia UV del aducto de diben-
zofulveno y piperidina formado por tratamiento de una muestra pesada de polímero con piperidina al 20%/DMF. 0,6.

La capacidad de hinchado del producto de polímero se determinó por el método de la jeringa (Azanneau, F.I., et al., J. Peptide Sci., 1995, 1, 31-44). Los volúmenes de hinchado del polímero fueron 11 mL/g en DMF; 12 mL/g en dicloruro de metileno y 14 mL/g en agua, respectivamente.

Ejemplo 5 SPOCC-resina formada por polimerización de PEG oxetanilado

Procedimiento B.: Se disolvió PEG-1500 oxetanilado del Ejemplo 3 en CH_{2}Cl_{2} (1 mL/g de monómero) y se enfrió a 0ºC. Se añadió catalizador ácido de Lewis BF_{3}OEt_{2} (0,4 equivalentes). Se calentó a temperatura ambiente y el punto de engomado se alcanzó después de 10 min., como se indicó por la viscosidad aumentada que paró el agitador magnético. Después que la agitación paró, la reacción se calentó a 60ºC durante 2 días. Después de enfriar a temperatura ambiente, se condujo el desarrollo como se describe en el procedimiento A.

Ejemplo 6 SPOCC-resina formada por polimerización de PEG oxetanilado

Procedimiento C.: Se disolvió PEG-400 oxetanilado del Ejemplo 2 en diglima (1 mL/g de monómero) y se agitó a temperatura ambiente. Se añadió BF_{3}OEt_{2} lentamente y la agitación se paró después de 1 min. La reacción se calentó a 70ºC durante dos días. Después de enfriar a temperatura ambiente, se condujo el desarrollo como se describe en el procedimiento A.

Las cargas e hinchado obtenidos con resinas preparadas en los Ejemplos 4-6 se presentan en la tabla 1, y está claro que la mejor polimerización se obtiene con macromonómeros acetilados.

TABLA 1

9

Ejemplo 7

Los macropolímeros del tipo producido por la polimerización de los macromonómeros de los Ejemplos 2 y 3, se esperan de ambos que sean estables químicamente e inertes, pero que tengan respectivas propiedades físicas diferentes. Por ejemplo, en condiciones hidrogenolíticas, fuertemente básicas o fuertemente ácidas, ambas resinas son totalmente estables. Tienen, sin embargo, diferente preferencia por los disolventes de hinchado. En contraste a las resinas basadas en PEG presentadas anteriormente, las resinas de la presente invención son estables durante extendidos periodos de tiempo al cloruro de tionilo, HCl 6N, TMS-Br, TMS-OTf y Ac_{2}O, KOH concentrado, KHDMS/CH_{2}Cl_{2} y BuLi 3 mM.

Las principales ventajas de los polímeros obtenidos a partir de macromonómeros de la presente invención son la falta de grupos funcionales tales como amidas en el esqueleto del polímero, alta capacidad, optimo balance hidrofílico/hidrofóbico y alta estabilidad mecánica y, en particular, química. Los polímeros son rentables ya que se preparan fácilmente usando polietilenglicoles biocompatibles, de bajo coste, disponibles. Los grupos hidroxilo de los polímeros se dejan influir por un amplio intervalo de transformaciones del grupo funcional sin afectar al esqueleto del polímero. Las resinas macropoliméricas tienen una estructura abierta que permite a las enzimas penetrar en el interior de la red polimérica en condiciones acuosas. Además de sus excelentes propiedades de síntesis, se ajustan por lo tanto para la realización de ensayos enzimáticos en fase sólida usando sustratos apagados con fluorescencia o una combinación de sustratos apagados con fluorescencia e inhibidores, unidos ambos al polímero. En particular, la resina puede usarse en síntesis orgánica combinatoria de sustratos e inhibidores mediante el método de dividir y combinar, seguido por apantallamiento de alto rendimiento en fase sólida mediante la exposición a enzimas e inspección del desarrollo de la reacción. La estructura de los polímeros proporciona excelentes propiedades de flujo y accesibilidad del reactivo o disolvente bajo condiciones de reacción orgánica.

La modificación del grupo funcional se ilustra en los siguientes ejemplos donde los grupos hidroxilo se convierten en bromuros o grupos amino.

Ejemplo 8 Bromo-SPOCC-resina

Se suspendió resina del Ejemplo 4 (1 g, 0,6 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (10 mL). Se añadió trifenilfosfina (787 mg, 5 equivalentes) e imidazol (204 mg, 5 equivalentes). Después de la completa disolución, se enfrió en un baño de agua a 10ºC y se añadió bromo en gotas (155 l, 5 equivalentes). Posteriormente se separó el baño de agua y se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La resina se filtró y se lavó con DMF, agua, DMF, THF y CH_{2}Cl_{2}. El análisis elemental proporcionó un contenido en bromo de 0,86 mmoles/g resina.

Ejemplo 9 Amino-SPOCC-resina

Se suspendió resina del Ejemplo 4 (1 g, 0,6 mmoles) en una disolución de azida sódica en DMSO (390 mmoles, 10 equivalentes, 10 mL). La mezcla se calentó a 60ºC durante un periodo de 18 h. La resina se filtró y se lavó completamente con DMF, agua y DMF. La reducción se efectuó empleando 1,4-ditio-treitol (DTT) en combinación con 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undenc-7-eno (DBU) (10 mL de una disolución 0,5 M de DTT en DMF, que contenía 0,1 M de DBU). La resina se filtró y se lavó con DMF, THF y CH_{2}Cl_{2}. La carga de resina se determinó mediante medida espectrofotométrica de la división del Fmoc después de la funcionalización de una muestra de resina con Fmoc-succinimida (10 equivalentes, 4 h). Carga medida: 0,44 mmoles/g.

La utilidad de los polímeros obtenidos a partir de los macromonómeros de la presente invención para síntesis orgánica y compatibilidad simultánea con condiciones acuosas, se ilustra en los siguientes ejemplos:

Ejemplo 10 p-[-(L-seril-L-fenilalanil-L-leucil-glicilamido)-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacetilamido-SPOCC-resina

Se funcionalizó la SPOCC-resina (210 mg, 0,1 mmoles) con el unidor en pista protegido con Fmoc. Se disolvió (208 mg de unidor, 0,4 equivalentes) junto con TBTU (122 mg, 0,38 mmoles) y N-etilmorfolina (NEM) (83 L, 0,5 mmoles) en DMF (3 mL), y después de 10 minutos se añadió a la resina durante 3 h. Después de lavar con DMF (5 veces) el Fmoc-grupo se dividió (20% de piperidina en DMF, 2 y 16 minutos). La funcionalidad amina desprotegida se aciló con Fmoc-aminoácidos (3 equivalentes de Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Ser-OH) que se activaron con TBTU (93 mg, 0,29 mmoles) y NEM (66 l, 0,4 mmoles), como se describe para el unidor, y además se emparejaron durante 3 h cada uno. Después de la desprotección final de Fmoc, el producto se dividió de una muestra de resina (2 mg, 95% en TFA, 2 h) y se analizó por HPLC y MALDI-MS. r.t. = 24,0 min. MALDI-MS: Calculado (M = C_{20}H_{31}N_{5}O_{5}). Encontrado (MH^{+}, MNa^{+}, MK^{+}): 422 m/z, 444 m/z, 460 m/z. La carga final fue 0,36 mmoles/g.

Ejemplo 11 p-[-(N-oxalil-L-fenilalanil-L-leucil-glicilamido)-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacetilamido-SPOCC-resina

Se trató la SPOCC-resina del Ejemplo 10 (200 mg, 0,072 mmoles) durante 3 h con una disolución acuosa de NaIO_{4} (92 mg, 6 equivalentes) en tampón de fosfato sódico (2,5 mL de 50 mmoles de NaH_{2}PO_{4}, pH 7), dando por resultado una disolución de ca. pH 5. La resina se filtró, se lavó con agua, DMF, THF y CH_{2}Cl_{2}, y se analizó. HPLC: r.t. = 25,6 min. MALDI-MS: Calculado (M = C_{19}H_{26}N_{4}O_{5}): 390,44. Encontrado (MNa^{+}, MH_{2}ONa^{+}): 413,3, 431,4 m/z.

Ejemplo 12 Reacción de aldehído-resina con fenil-litio

Se trató la SPOCC-resina del Ejemplo 11 (30 mg, 0,011 mmoles) con una disolución de fenil-litio (7 equivalentes en 1 mL de THF, 10 min. a 0ºC, seguido por 1,5 h a temperatura ambiente. Los análisis de la reacción proporcionaron una mezcla de diversos productos en el intervalo entre 24 y 37 min. de HPLC. Los productos en el intervalo entre 24 y 27 min expusieron la masa del material de partida. Los productos en el intervalo entre 31 y 37 min expusieron la masa de dímeros del material de partida. MALDI-MS: Calculado ((2xM): 780,88). Encontrado: ((2xM)Na^{+}): 804 m/z). No se observaron reacciones secundarias implicando a la resina en sí misma.

Ejemplo 13 p-[-(N-acril-L-fenilalanil-L-leucil-glicilamido)-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacetilamido-SPOCC

Se suspendió yoduro de metiltrifenilfosfonio (69 mg, 0,171 mmoles) en THF (2 mL) y se enfrió a -50ºC. Se añadió butil-litio (0,154 mmoles). La sal se disolvió y el color de la disolución cambió a un amarillo-naranja fuerte. Después de 20 min, la disolución se calentó a -10ºC. Se añadió resina del Ejemplo 11 (96 mg, 0,034 mmoles) en argón a la disolución agitada y se hizo reaccionar durante 2 h. La separación preparativa del producto (95% en TFA, 2 h) proporcionó una mezcla de compuestos de 2- y 3-hidroxipropionilo. Se obtuvieron a través de la hidratación del producto acrilamídico de la reacción de Wittig.

Ejemplo 14 N-(4-carboxil-but-2-trans-en-oil)-(L)-leucil-(L)-leucil-glicil-SPOCC-resina

Se trató resina liofilizada del Ejemplo 11 (90 mg, 0,041 mmoles) con tolueno (1 mL) y trietilortoformiato (0,5 mL) durante dos h y se lavó con tolueno seco (6x). Se disolvió trietilfosforoacetato (41 l, 5 equivalentes) en tolueno (1 mL). Se añadió butil-litio (4,5 equivalentes) a 0ºC. Después de 10 min se añadió la disolución a la resina y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 90 min. Después de lavar (DMF, THF, CH_{2}Cl_{2}) y secar, la resina resultante se analizó con MAS-RMN en fase sólida en CDCl_{3}. Se condujo la división de una muestra analítica y el análisis HPLC. Una parte de la resina (45 mg) se dividió y aisló mediante HPLC preparativo, dando el producto del título (5,2 mg, 64%, r.t. = 28,0 min. ^{1}H-RMN, 250 MHz, D_{4}-MeOD): = 0,88-0,98 (m, 12H, Leu-Me), 1,6-1,75 (m, 6H, Leu), 3,8-4,0 (2d, 2H, ^{2}J = 17,8 Hz, Gly-), 4,4-4,5 (m, 2H, Leu 6,68, 7,06 (2d, 2H, ^{3}J_{trans} = 15,5 Hz, protones olefínicos). ^{13}C-RMN, 60 MHz, D_{4}-MeOD): = 131,9, 137,3 (carbonos olefínicos). ES-MS: Calculado: M (C_{18}H_{29}N_{3}O_{7}) = 399,20. Encontrado: 400,2 m/z.

La utilidad de los polímeros para síntesis de péptidos y glicopéptidos se ilustra en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 15 N-(9-fluorenil-metoxicarbonil)-L-alanil-L-seril-L-fenilalanil-L-leucil-glicil-SPOCC-resina

Se hizo reaccionar dos veces SPOCC-400 (326 mg, 0,58 mmoles/g de carga, 0,19 mmoles) del Ejemplo 4 con una disolución de Fmoc-Gly-OH (339 mg, 3 equivalentes), MSNT (338 mg, 3 equivalentes) y N-metilimidazol (MeIm) (68 l, 2,25 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (4 ml) cada vez durante 45 minutos. Después de la desprotección de Fmoc (20% de piperidina en DMF, 2 y 16 min), el resto glicinilo se alargó con cuatros Fmoc-aminoácidos (3 equivalentes de Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser-OH y Fmoc-Ala-OH), que se activaron con TBTU (2,9 equivalentes, 177 mg) y NEM (4 equivalentes, 127 l). Todas las reacciones de acilación se realizaron después de 15 min de tiempo de mezcla para los reactivos en DMF (4 mL), un tiempo de reacción en la resina de 3 h, y seguido por protección con Fmoc. Después de la desprotección final de Fmoc, la resina se analizó con HPLC y MALDI-MS.

Ejemplo 16 N-(9-fluorenil-metoxicarbonil)-L-alanil-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-D-galactopiranosil)-L-seril-L-fenilalanil-L-leucil- glicil-SPOCC-resina

Se liofilizó resina de Ejemplo 15 (100 mg, 0,04 mmoles) a partir de tolueno seco (3 mL) en una velocidad de aspiración toda la noche. Se disolvió tricloroacetimidato de Tetra-O-acetil-D-galactopiranosilo (0,12 mmoles, 3 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (1,5 mL) y se añadió a la resina. Se añadió trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf) (120 L de una disolución 1M en CH_{2}Cl_{2}) en argón y se hizo reaccionar durante una hora. La resina se filtró entonces, se lavó con CH_{2}Cl_{2}, THF, DMF, THF, y CH_{2}Cl_{2} y se secó al vacío. Se repitió el procedimiento de glicosilación. Se condujo el análisis con HPLC y MALDI-MS después de la división con NaOMe en MeOH (0,02M, 2 h). Se había alcanzado la glicosilación completa. HPLC.: r.t. = 20,1 min. MALDI-MS: Calculado: M(C_{29}H_{45}N_{5}O_{12}): 655,7 Da. Encontrado (MNa^{+}): 656 m/z.

Ejemplo 17 L-alanil-O-(-D-galactopiranosil)-L-seril-L-fenilalanil-L-leucil-glicinahidrazida

Se trató resina del Ejemplo 16 (2 mg, 0,035 mmoles) durante 2 h con 20% de hidracina en agua. HPLC: r.t. = 22,0 min. MALDI-MS: Calculado: M(C_{29}H_{47}N_{7}O_{11}): 669,7 Da. Encontrado (MNa^{+}): 694 m/z.

La utilidad de las resinas para reacciones enzimáticas se ilustra en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 18 L-alanil-(3-nitro)-L-tirosinil-L-glicil-L-prolinil-L-leucil-glicil-L-leucil-L-tirosinil-alanil-arginil-(N-2-aminobenzoil)-L-lisinil-glicil-glicil-SPOCC-resina

Se trató dos veces SPOCC-1500 del Ejemplo 3 (65 mg, 0,027 mmoles) con una disolución de Fmoc-Gly-OH (41 mg, 5 equivalentes), MSNT (40 mg, 5 equivalentes), y MeIm (8 L, 3,75 equivalentes) en CH_{2}Cl_{2} (4 mL) durante 45 min. La resina se filtró y se lavó con CH_{2}Cl_{2} y DMF. El grupo con Fmoc se dividió (20% de piperidina en DMF, 2 y 16 min) y se lavó de nuevo con DMF. El nonapéptido protegido total de la secuencia Fmoc-A(NO_{2})YGPLGL(^{t}Bu)YA(Pmc)R(Boc-Ab_{2})KG-OH (43 mg, 3 equivalentes) se disolvió en DMF (4 mL) junto con TBTU (6,8 mg, 2,9 equivalentes) y NEM (3,7 L, 4 equivalentes). Después de 15 min, la última disolución se añadió a la resina y se hizo reaccionar durante 3 h. La resina se lavó ampliamente con DMF y se trató dos veces con TFA al 95% (10 min, 2,5 h) para separar los grupos protectores de la cadena lateral. Posteriormente, la resina se lavó con ácido acético al 95% (4 veces 5 min), trimetilamina al 5% en DMF (tres veces 2 min), DMF (dos veces 2 min), THF y CH_{2}Cl_{2}, seguido por secado al vacío. El péptido se dividió de la resina con NaOH 1M durante 2 h para análisis. HPLC: r.t. = 32,0 min. MALDI-MS: Calculado M(C_{68}H_{99}N_{19}O_{19}) = 1486,7 Da. Encontrado (MH^{+}, MNa^{+}-H_{2}O) 1487,
1493 m/z.

Ejemplo 19 División enzimática del decapéptido enlazado a la SPOCC-resina del Ejemplo 18

I. Subtilisina: La resina (2 mg) se trató con una disolución de subtilisina (10^{-7}M) en tampón fosfato de pH 7 (50 mmoles de NaH_{2}PO_{4} en H_{2}O). Después de 15 min, se observó fuerte fluorescencia bajo radiación UV. Después de tres h la resina se lavó (agua, DMF, THF, CH_{2}Cl_{2}) y se secó. Una parte de la resina tratada enzimáticamente (1 mg) se trató con NaOH (50 L de una disolución 0,1M, 2 h) y el producto se analizó por HPLC seguido por espectrometría de masas. La otra parte de la resina (1 mg) se sometió a la degradación de Edman. El HPLC indicó la división completa del sustrato de péptido de partida. HPLC: r.t. = 22,0 min. MALDI-MS: Calculado M(C_{26}H_{42}N_{10}O_{7}) = 606,7 Da. Encontrado 617,6 m/z. Degradación de Edman (3 ciclos): A, Abz-; R-; K-.

II. Matriz-metaloproteasa-9: La resina (2 mg) se trató con una disolución de MMP-9 (100 nM y 275 nM) en tampón de pH 7,72 (tampón 17, obtenido de CCBR, Ballerup) durante 24 h. En ambos casos no se observó fluorescencia significativa. La división y el análisis de HPLC como se describe en I. dio exclusivamente el sustrato de péptido de partida.

Ejemplo 20 Polimerización en suspensión del polímero derivado de Oxetano en gotas mediante el procedimiento A (SPOCC resina)

El tensioactivo (25 mg/g de macromonómero) se disolvió en dicloroetano (0,38 ml/g de macromonómero) y se mezcló con el macromonómero (4 g) en argón. Después que se obtuvo una disolución homogénea, la disolución se enfrió en un baño de hielo y se añadió BF_{3}OEt_{2} (0,1 ml/g de macromonómero) con agitación y exclusión de humedad. Después de 2 min la mezcla se añadió al aceite de silicona (20 ml/g de macromonómero) a rt. de agitación a 150 rpm. Después de 2 h a rt., la temperatura se aumentó a 60ºC y la polimerización se dejó toda la noche sin agitación. Las partículas de polímero resultantes se filtraron en un embudo de cristal sinterizado. Las gotas se lavaron con diclorometano, dimetilformamida, metanol y agua. Las gotas se trataron con HCl 6M durante 2 h a rt. y se lavaron ampliamente con agua, metanol, dimetilformamida y diclorometano. Las gotas se secaron y se clasificaron. Distribución de gotas (medida en metanol); X > 1000 \mum : X > 500 \muM : X > 300 \muM : X < 300 \muM (3:20:5:1). Rendimiento total de las gotas: 2,9 g, 73%.

Ejemplo 21 Polimerización en suspensión del polímero derivado de Oxetano en gotas, mediante el procedimiento B (SPOCC resina preparada con adición de 3-metil-oxetan-il-metanol)

El tensioactivo (25 mg/g de macromonómero) se disolvió en dicloroetano (0,38 ml/g de macromonómero) y se mezcló con el macromonómero (preparado a partir de PEG-1500, 2,3 g) y 3-metil-3-oxetanometanol (27 \muL-100 \muL) en argón. Después de obtenerse una disolución homogénea, la disolución se enfrió en un baño de hielo y se añadió BF_{3}OEt_{2} (0,1 ml/g de macromonómero) con agitación y exclusión de humedad. Después de 45 segundos, la mezcla se añadió al aceite de silicona (20 ml/g de macromonómero) a rt. agitando a 200 rpm. Después de 2 h a rt., la temperatura se aumentó a 60ºC, y la polimerización se dejó toda la noche sin agitación. Las partículas de polímero resultantes se filtraron en un embudo de cristal sinterizado. Las gotas se lavaron con diclorometano, dimetilformamida, metanol y agua. Las gotas se trataron con HCl 6M durante 2 h a rt., y se lavaron ampliamente con agua, metanol, dimetilformamida y diclorometano. Las gotas se secaron y se clasificaron. Distribución de gotas (medida en metanol); X > 1000 \mum : X > 500 \mum : X > 300 \mum : X < 300 \mum (6:17:7:0). Rendimiento total de gotas: 1,7 g,
74%.

Ejemplo 22 (bis-(3-metil-3-oxetanilmetoxi)-2-buteno

Se disolvió 1,4-trans but-2-endiol (11 mmoles) en tolueno y DMF (15 mL de cada uno). Se añadió a temperatura ambiente hexametildisilazano de potasio (KHMDS) (22 mmoles) bajo agitación, después de 15 min los disolventes de separaron junto con HMDS a 50ºC en baño de agua con el evaporador rotatorio. El alcohol potásico restante se redisolvió en DMF (15 mL). El derivado de oxetano mesilado (24 mmoles) se añadió en partes a temperatura ambiente, y la reacción se calentó de 12 hrs a 75ºC. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió agua (2 mL) y se agitó durante 15 min para hidrolizar totalmente el agente alquilante no reaccionado. Los disolventes se separaron a 40ºC a presión reducida. Los remanentes se disolvieron en CH_{2}Cl_{2} y se extrajeron con agua. La fase orgánica se secó y evaporó. Rendimiento: 90% del compuesto del título. El RMN del producto indicó que la alquilación fue
cuantitativa.

Ejemplo 23 SPOCC-resina formada por polimerización de PEG oxetanilado y un reticulante temporal corto

PEG-1500 oxetanilado (1 a 20 mmoles) preparado como en el Ejemplo 2 y el reticulante preparado en el Ejemplo 22 (5-50% en moles) se disolvieron en argón en un volumen igual de CH_{2}Cl_{2}, se enfrió a -20ºC, y se agitó con una barra magnética de agitación. Se añadió dietileterato de trifluoruro de boro (0,15 a 0,5 equivalentes), y la disolución se agitó a -10 dejando después calentarse a temperatura ambiente donde se formó el polímero. Después de 2 h la temperatura se aumentó a 60ºC toda la noche. El polímero se cortó en pedazos. Estos se hincharon (CH_{2}Cl_{2}, 2 h) y luego se granularon a través de un colador de metal (tamaño de poro de 1 mm) empleando una maja. La resina granulada se lavó cuidadosamente (CH_{2}Cl_{2}, THF, DMF, agua, DMF, THF, CH_{2}Cl_{2}) y se secó al vacío. La carga fue comparable con la del polímero preparado en el Ejemplo 4. La capacidad de hinchado del producto de polímero fue considerablemente menor que la del polímero descrito en el Ejemplo 4, dependiendo de la cantidad de reticulante añadido.

Claims

1. Un macromonómero que tiene la estructura:

10

donde ñ es un número real de 6-300, y donde X e Y es cada uno independientemente un grupo de la fórmula

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11

donde m es un número entero de 1-10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo, o donde X es -OH e Y es un grupo de la fórmula

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12

donde m es un número entero de 1-10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

2. Un macromonómero que tiene la estructura:

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13

donde R es H o alquilo o arilo o arilalquilo, y ñ es un número real de 6-300 como se define anteriormente, y donde X, Y y Z son cada uno independientemente OH o un grupo de la fórmula

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14

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15

\newpage

3. Un macromonómero según la reivindicación 1 que está terminado en un grupo 3-metiloxetan-3-ilmetiléter y tiene la fórmula:

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16

donde R y m son como se definen en la reivindicación 1.

4. Un macromonómero según la reivindicación 3, que se ha acetilado o cuyos grupos hidroxilo libres han sido protegido temporalmente de otros modos.

5. Un procedimiento para la preparación de los macromonómeros según la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar un derivado de metal alcalino de un polietilenglicol que tiene 6-300 unidades que se repiten con un compuesto que tiene la fórmula:

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17

donde Z es Cl, Br, I, toluensulfoniloxi o CF_{3}SO_{3}, y donde m es un número entero de 1-10, y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

6. Un procedimiento para la preparación del macromonómero de la reivindicación 2, que comprende hacer reaccionar un derivado de metal alcalino de un polietilenglicol que tiene la fórmula:

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18

donde R es H o alquilo o arilo o arilalquilo y ñ es 6-300 con un compuesto que tiene la fórmula:

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19

donde Z es Cl, Br, I, toluensulfoniloxi o CF_{3}SO_{3}, y donde m es 1-10 y R es H o alquilo o arilo o arilalquilo.

7. Un procedimiento según las reivindicaciones 5 o 6, en el que el derivado de metal alcalino es un derivado de sodio.

8. Un procedimiento según las reivindicaciones 5 o 6, en el que el derivado de metal alcalino es un derivado de potasio.

9. Un polímero reticulado formado mediante la polimerización de un macromonómero según la reivindicación 1.

\newpage

10. Un polímero reticulado según la reivindicación 9, en el que el macromonómero tiene la estructura reivindicada en la reivindicación 3, la polimerización se inicia por un catalizador catiónico y la estructura del polímero puede representarse mediante la estructura:

20

donde R es como se define en la reivindicación 1.

11. Un polímero reticulado según la reivindicación 9, en el que el macromonómero usado para su preparación tiene la estructura de la reivindicación 4, y se obtiene la estructura per-O-acetilada o con el hidroxilo protegido temporalmente de otras formas, análoga a la estructura hidroxilada de la reivindicación 10.

12. Un polímero reticulado formado por la polimerización en masa de un macromonómero de la reivindicación 2.

13. Una resina en perlas según la reivindicación 10 u 11, formada mediante polimerización de gotitas en aceite de silicona.

14. Una resina en perlas según la reivindicación 10 u 11, formada mediante polimerización por pulverización en un gas inerte caliente.

15. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 como soportes para síntesis orgánica.

16. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 como soportes para reacciones enzimáticas en fase sólida.

17. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 como soportes para síntesis de péptidos, ADN, ARN y oligosacáridos.

18. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 como soportes para ligación de péptidos, proteínas, ADN o ARN.

19. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 para separaciones cromatográficas.

20. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 para purificación por afinidad.

21. El uso de polímeros preparados según la reivindicación 9 para la inmovilización de proteínas.

22. El uso de polímeros según la reivindicación 16, en el que la enzima interactúa con un sustrato o un inhibidor unido al soporte.

23. El uso no terapéutico de polímeros según la reivindicación 9, en el que el uso implica liberación de un medicamento unido al soporte sólido.

24. El uso según la reivindicación 23, donde la liberación del medicamento está mediada por una enzima.

25. El uso de polímeros según la reivindicación 9, para espectroscopia RMN con giro del ángulo mágico en fase sólida.

26. El uso de polímeros según la reivindicación 9 para química combinatoria.

27. Un polímero en gotas según la reivindicación 9, formado por polimerización en suspensión en aceite de silicona.

28. Un polímero en gotas según la reivindicación 27, donde las gotas se estabilizan mediante un tensioactivo.

29. Un polímero en gotas según la reivindicación 28, donde el tensioactivo se obtiene mediante polimerización radical de una mezcla de PEG-OMe acriloilado y acriloil-propilpentametildisiloxano.

30. Un polímero según la reivindicación 9, con adición de un reticulante temporal corto que puede dividirse selectivamente en un instante posterior para dar por resultado la expansión de la resina.

31. Un polímero según la reivindicación 30, donde el reticulante corto tiene la estructura

21

donde R es un puente alquilideno, arilideno, silano, siloxano, tioéter o éter, químicamente susceptible a las condiciones selectivas de división.

32. Un macromonómero según las reivindicaciones 1 a 4, preparado según la reivindicación 5 o 6, pero con la inversión del electrófilo y nucleófilo de modo que se prepara el tosilato o triflato o haluro de PEG y se hace reaccionar con el alcóxido metálico de 3-metil-oxetan-3-ilmetanol o vinilfenilpropanol.