ES2230649T3 - Metodo de deteccion, identificacion, enumeracion y confirmacion de celulas cancerosas y/o de celulas progenitoras hematologicas circulante en una muestra sanguinea. - Google Patents
Metodo de deteccion, identificacion, enumeracion y confirmacion de celulas cancerosas y/o de celulas progenitoras hematologicas circulante en una muestra sanguinea.Info
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Abstract
PROCEDIMIENTO PARA ANALIZAR LA SANGRE QUE PERMITE AISLAR, DETECTAR, ENUMERAR Y CONFIRMAR BAJO LA AMPLIACION LA PRESENCIA O AUSENCIA DE CELULAS CANCEROSAS Y/O CELULAS PROGENITORAS HEMATOLOGICAS DE LAS QUE SE SABE QUE CIRCULAN EN LA SANGRE. EL ANALISIS SE REALIZA EN UNA MUESTRA DE SANGRE CENTRIFUGADA ANTICOAGULADA. EL ANALISIS IMPLICA EL EXAMEN MORFOMETRICO Y EPITOPICO DE LA MUESTRA DE SANGRE MIENTRAS ESTA SE HALLA DISPUESTA EN UN TUBO DE ENSAYO DE SANGRE CENTRIFUGADA. EL ANALISIS EPITOPICO PARA DETECTAR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE CELULAS CANCEROSAS SE BASA EN LA DETECCION DE EPITOPES QUE SE SABE QUE ESTAN PRESENTES SOLO EN CELULAS CANCEROSAS; Y EL ANALISIS EPITOPICO DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE CELULAS PROGENITORAS HEMATOLOGICAS QUE SE BASA EN LA DETECCION DE EPITOPES QUE SE SABE QUE ESTAN PRESENTES SOLO EN LA CELULAS PROGENITORAS HEMATOLOGICAS. LOS EPITOPES BUSCADOS DE LOS TIPOS DE CELULA DE INTERES SON EPITOPES DE LOS QUE SE SABE QUE ESTAN AUSENTES EN CELULAS NORMALES DE SANGRE QUE CIRCULA; Y LOS EPITOPES DE CELULAS CANCEROSAS DE INTERES SON LOS EPITOPES DEL LOS QUE SE SABE QUE ESTAN AUSENTES DE LAS CELULAS DE INTERES PROGENITORAS HEMATOLOGICAS. SE ACOPLAN FLUOROFOROS CON EMISIONES DIFERENCIADAS A ANTICUERPOS QUE SE DIRIGEN CONTRA LOS EPITOPES DE INTERES. EL ANALISIS MORFOMETRICO SE REALIZA MARCANDO LAS CELULAS EN LA MUESTRA DE SANGRE CON UNA MARCA INTRACELULAR COMO NARANJA DE ACRIDINA QUE DESTACA LA ESTRUCTURA INTRACELULAR DE LA CELULA. TATO LOS ANALISIS MORFOMETRICO COMO EPITOPICO SE REALIZAN PREFERENTEMENTE EN O CERCA DE LA CAPA PLANA DEL REVESTIMIENTO DE LA MEMBRANA INFLAMATORIA EXPANDIDA EN LA MUESTRA DE SANGRE CENTRIFUGADA. EL ANALISIS MORFOMETRICO Y/O EPITOPICO SE PUEDEN REALIZAR BAJO AMPLIACION VISUAL Y/O FOTOMETRICA.
Description
Método de detección, identificación, enumeración
y confirmación de células cancerosas y/o de células progenitoras
hematológicas circulante en una muestra sanguínea.
Esta invención se refiere a un método y conjunto
para la detección, identificación, enumeración y confirmación de
células cancerosas y/o progenitoras hematológicas circulantes en una
muestra de sangre entera anticoagulada que se contiene en un
conjunto de tubo transparente de muestra. Todos los pasos de
detección, identificación, enumeración y confirmación se pueden
realizar in situ en el conjunto de tubo de muestra. Más en
concreto, el método de esta invención implica la separación
centrífuga por densidad del contenido de la muestra de sangre de
manera que se garantice que las células cancerosas y/o progenitoras
hematológicas circulantes en la muestra de sangre sean desplazadas
físicamente por su densidad a una posición axial predeterminada en
la muestra de sangre y en el conjunto de tubo de muestra, y también
a un plano óptico restringido en el conjunto de tubo de muestra que
está adyacente a la pared del tubo de muestra, y finalmente a una
zona muy bien definida de dicho plano óptico.
La citología es la ciencia y tecnología
implicadas en la caracterización morfológica de células de
mamíferos. La citología tiene utilidad clínica en medicina humana y
veterinaria. La citología se usa con mucha frecuencia para
diagnosticar la presencia o ausencia de malignidad en células
exfoliadas o recogidas: a) que son vertidas a una cavidad corporal
tal como el espacio pleural o peritoneo; b) que son vertidas a un
fluido corporal que se excreta como, por ejemplo, esputo u orina; c)
que se obtienen por raspado o cepillado de una superficie corporal,
tal como el cuello uterino, la cavidad uterina, o mucosa bronquial;
o d) que se obtienen por aspiración directa con aguja de un tumor
tal como tumores de la tiroides, mama, pulmón, o análogos.
Posteriormente, las células exfoliadas o recogidas se fijan
típicamente, tiñen y estudian visualmente, generalmente por
microscopia de campo brillante, y después, si es necesario, por
colorantes inmunológicos y/o otras técnicas moleculares.
Aproximadamente quinientas sesenta mil personas
morirán de tumores sólidos (predominantemente carcinomas) en los
Estados Unidos de América. Muchas de estas muertes podrían evitarse
mediante diagnóstico precoz de estas patologías. Por desgracia, con
la posible excepción de la prueba del Antígeno Específico de la
Próstata (PSA) para cáncer de próstata, no hay métodos prácticos y
rutinarios que se consideren efectivos para la detección precoz de
tumores sólidos mediante análisis de sangre.
Mediante la detección precoz de cáncer cervical,
el frotis de Pap ha disminuido por encima del setenta por ciento la
mortalidad por cáncer cervical en los Estados Unidos. El desarrollo
de una prueba análoga para otros tumores sólidos podría tener un
impacto similar en la mortalidad general por cáncer.
Se ha confirmado la presencia de células
cancerosas circulantes que son vertidas espontáneamente por los
tumores cancerosos a la corriente sanguínea circulante que
suministra oxígeno y nutrientes a los tumores. La presencia de tales
células en la corriente sanguínea ha sido inferida durante décadas a
causa de la proliferación de tumores cancerosos, por lo que se ha
descrito como la ruta hematógena, y en muy raras ocasiones se ha
observado en especímenes de sangre. Recientemente, procedimientos
sofisticados que emplean transcriptasa inversa en unión con la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), han sido capaces de
detectar la presencia de células tumorales por su firma molecular en
un número considerable de pacientes con cáncer, tanto cuando el
cáncer se localiza como después de haberse extendido.
Un medio adicional de detectar células cancerosas
circulantes emplea una tecnología denominada Separación de Células
Activada por Fluorescencia (FACS), tal como el fabricado por Becton
Dickinson and Company de Franklin Lakes, New Jersey. La detección
FACS de células cancerosas circulantes implica la detección de
células cancerosas detectando anticuerpos marcados con fluorescente
que se dirigen contra y unen a uno o varios epitopos que están
presentes sobre o en células cancerosas, y no están presentes sobre
o en células sanguíneas normales, y/o detectando combinaciones de
epitopos que están presentes sobre o en células sanguíneas normales
circulantes y que pueden estar presentes o no sobre o en células
cancerosas, o combinaciones de dichos métodos.
La tecnología FACS se basa así en la iluminación
de células, es decir, es fotométrica y utiliza especificidad
anticuerpo-epitopo, y no se puede utilizar para
analizar morfológicamente células in situ en el instrumento
FACS. La transcriptasa inversa/PCR, (el método molecular), y el
FACS, (el método inmuno-fenotípico), requieren que
se conozca el origen del tumor que se busca para seleccionar la
especie molecular específica o señales
inmuno-fenotípicas. Dichas técnicas han contribuido
a la confirmación de la teoría de que las células cancerosas do
circulan en la corriente sanguínea, pero estas técnicas no son
prácticas especialmente en aplicaciones en el punto de atención, en
virtud de su costo y/o naturaleza, para detectar la presencia o
ausencia de células cancerosas tumorales circulantes en la corriente
sanguínea. Así, no hay ningún procedimiento general o genérico de
análisis de sangre para la detección y confirmación de la naturaleza
maligna de células cancerosas circulantes, independientemente de su
origen, en un paciente. Además, ninguno de dichos métodos molecular
o inmuno-fenotípico utilizan in situ, es
decir, en un sistema de muestreo cerrado, análisis de base
citopatológica para determinar las características morfométricas de
células circundantes que permiten identificar y confirmar células
cancerosas.
Puesto que aproximadamente el ochenta y dos por
ciento de todos los cánceres son de origen epitelial (de los que el
setenta y dos por ciento son fatales), las células epiteliales
cancerosas deberán ser detectables en la sangre circulante. Aunque
la presencia de células epiteliales en la corriente sanguínea
circulante no demuestra, por sí misma, malignidad, alerta al
citólogo del mayor probabilidad de malignidad puesto que células
epiteliales no se observan normalmente en la corriente sanguínea
circulante. Sin embargo, en algunos casos, tal como después de
cirugía, o como resultado de trauma físico, o como resultado del uso
de hilo dental, o en casos de prostatitis, por ejemplo, es posible
que se pueda hallar células epiteliales no malignas en la corriente
sanguínea circulante. El análisis morfológico visual de células es
actualmente la forma más fiable de distinguir células cancerosas
epiteliales de las células epiteliales benignas que se hallan en la
muestra de sangre circulante. Un problema que existe en conexión con
los intentos de detectar células cancerosas circulantes en sangre
mediante análisis morfológico se refiere al hecho de que las células
cancerosas circulantes en sangre con frecuencia son virtualmente
indistinguibles de las células progenitoras hematológicas
circundantes, o blastos, por análisis citológico solamente.
La escasez de células cancerosas que pueden estar
presentes en una muestra de sangre circulante requeriría que el
citopatólogo examinase con esmero aproximadamente diez millones de
células nucleadas sanguíneas para hallar una célula cancerosa, y que
una célula cancerosa estuviese aleatoriamente en los diez millones
de células nucleadas sanguíneas, que a su vez estarían dispersadas
de forma homogénea en una masa de cinco mil millones de
constituyentes sanguíneos celulares no nucleados, es decir, los
eritrocitos, más dos cientos cincuenta millones de plaquetas, todos
los cuales se encontrarían en un mililitro de sangre. Tal tarea
sería muy lenta, y por ello inviable para uso al analizar sangre del
paciente para confirmar la presencia o ausencia de células
cancerosas.
Otro tipo de células circundantes nucleadas raras
que se puede hallar en una muestra de sangre son las células
progenitoras hematológicas (HPCs), que incluyen blastos, células
madre, y otros progenitores de células normalmente circundantes que
no están generalmente presentes en una muestra de sangre circulante
a niveles que pueden ser detectados utilizando instrumentos
hematotópicos actualmente disponibles, tal como contadores por
impedancia y examen de sangre periférica teñida. En pacientes que
reciben quimioterapia y en pacientes que reciben factor estimulante
de colonia granulocito humano (HGCSF), y otras citoquinas similares,
es más probable que estén presentes HPCs, pero en general en
cantidades muy bajas, es decir, de aproximadamente uno a mil por ml,
o menos, de la muestra. Así, las concentraciones bajas de HPCs en
una muestra de sangre hacen que las HPCs no sean detectables por
métodos rutinarios.
Es importante detectar y enumerar las HPCs porque
su enumeración puede permitir una recogida más eficiente de las HPCs
para terapias de trasplante de células madre importantes desde el
punto de vista clínico. Igualmente, la detección de células
cancerosas circulantes en pacientes cuyas HPCs se están recogiendo
es importante de manera que se pueda minimizar la reinfusión al
paciente de células cancerosas circulantes recogidas.
Se ha desarrollado una técnica para medir capas
constituyentes en una mezcla compleja de materiales centrifugando
una muestra de la mezcla de materiales en un tubo capilar u otro que
contiene un inserto, típicamente un flotador. El flotador es
preferiblemente cilíndrico, y tiene una gravedad específica que hace
que sedimente en la mezcla centrifugada en un grado tal que cree un
volumen anular libre en el tubo en el que sedimentará la capa, o
capas a medir. Las capas a medir son elongadas así físicamente, y
así se pueden medir más fácilmente y con mayor exactitud. Dicha
técnica se describe en las Patentes de Estados Unidos números
4.027.660, concedida el 7 de junio de 1977; 4.082.085 concedida el 4
de abril de 1978; 4.156.570 concedida el 29 de mayo de 1979, y
otras. Esta tecnología está siendo comercializada actualmente por
Becton Dickinson and Company bajo la marca comercial registrada
"QBC". Esta tecnología "QBC" ha sido adaptada para uso en
el aislamiento e identificación de infestación por microfilaria de
una muestra de sangre, como se expone en la Patente de Estados
Unidos número 4.190.328, concedida el 26 de febrero de 1980, las
Patentes de Estados Unidos números 5.403.714, concedida el 4 de
abril de 1995; 5.496.704, concedida el 5 de marzo de 1996;
5.506.145, concedida el 9 de abril de 1996; y otras describen el uso
de dicha tecnología "QBC" para analizar varios analitos en
sangre entera anticoagulada; y también para analizar en muestras de
tejido la presencia o ausencia de células cancerosas tumorales,
donde las muestras de tejido se mezclan con una solución tampón
salina antes del análisis.
Es evidente que existe una imperiosa necesidad de
un procedimiento simple y un sistema para llevar a cabo tal
procedimiento por el que en una muestra de sangre capilar o sangre
venosa se podría analizar rápidamente y con precisión la presencia o
ausencia de células cancerosas circulantes y/o células progenitoras
hematológicas. Además, el procedimiento deberá permitir diferenciar
células cancerosas de células progenitoras hematológicas; y también
poder confirmar la naturaleza de las células detectadas, todo ello
in situ, en la parafernalia del muestreo de sangre.
Esta invención se refiere a un método y aparato
para detectar visual y fotométricamente células cancerosas y/o
progenitoras hematológicas circulantes en una muestra de sangre
entera anticoagulada, muestra de sangre que se contiene en un tubo
transparente de muestra. La detección y confirmación de células
cancerosas y/o progenitoras hematológicas circulantes en la muestra
de sangre se puede alcanzar en cuestión de minutos utilizando el
hecho de que las células cancerosas circulantes que son de origen
epitelial, y las células progenitoras hematológicas, cuando están
presentes en la corriente sanguínea circulante, tienen una densidad
diferente de la de los otros constituyentes nucleados de la sangre
y, cuando se separan gravimétricamente, las células cancerosas
epiteliales y/o progenitoras hematológicas se dispondrán en, o junto
a, la capa de plaquetas de la muestra centrifugada de sangre. Hemos
determinado que las células cancerosas epiteliales y/o progenitoras
hematológicas circulantes no se disponen por sedimentación, es
decir, por tamaño, en la muestra centrifugada de sangre, sino que
más bien se disponen por densidad en la muestra centrifugada de
sangre. La capa de plaquetas es una capa de constituyentes
sanguíneos que carece generalmente de células nucleadas, y también
está libre de materiales que son susceptibles de tinción de ADN,
permitiendo así una identificación rápida de células nucleadas que
están cerca de la capa de plaquetas.
Esta invención permite el análisis morfométrico
visual in situ, es decir, en la parafernalia de muestreo, y
también el análisis epitópico marcado y la identificación de células
sospechosas, es decir, grandes, de baja gravedad específica, células
nucleadas que se hallan en la muestra centrifugada de sangre. La
invención también puede permitir el análisis in situ de las
células sospechosas en el conjunto de tubo de muestra. Tal análisis
puede confirmar si las células individuas sospechosas son
epiteliales y malignas; epiteliales y benignas; o de origen no
epitelial, pero son células progenitoras hematológicas, todo ello
sin sacar la muestra de sangre del tubo de muestra. Una ventaja
considerable de usar la parafernalia "QBC" para aislar e
identificar células cancerosas y/o progenitoras hematológicas
circulantes en sangre entera anticoagulada es que la parafernalia
"QBC" proporciona un sistema cerrado que no es susceptible de
contaminación cruzada por otras muestras. Esta ventaja es muy
importante en un sistema fiable de detección de eventos raros.
Las células cancerosas y/o progenitoras
hematológicas en cuestión se encuentran cerca de la capa de
plaquetas en una muestra de sangre que ha sido centrifugada en dicha
parafernalia de tubo e inserto de "QBC", cuando la muestra de
sangre es examinada bajo ampliación apropiada. El procedimiento de
esta invención así implica dos pasos que se realizan in situ
mientras la muestra de sangre permanece en el tubo de muestra.
Un paso implica la detección de iluminación
epitópica característica en las células para determinar el origen
epitelial, u origen de progenitor hematológico, de las células
nucleadas observadas en el tubo. Este paso se puede caracterizar
como un análisis "epitópico". Al realizar el paso epitópico, se
puede utilizar antígenos epiteliales específicos, tal como
E-cadherina, cadherina 11, antígeno epitelial de
membrana (EMA), antígeno carcinoembriónico (CEA), integrinas,
EP-CAM, MUC3, CD-44, receptores del
factor de crecimiento, tal como receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGF), receptor del factor de crecimiento hepatocítico
(HGF), entre otros para la detección de células de origen
epitelial.
Para detectar células de origen HPC, se puede
usar anticuerpos marcados específicos epitópicos HPC que se dirigen
contra CD-33, CD34, por ejemplo. Las células
epiteliales no serán reconocidas por dichos anticuerpos específicos
de HPC, ni las células HPC serán reconocidas por los anticuerpos
específicos epiteliales marcados u otras partículas de unión. Se
puede usar encapsulación liposómica del marcador para mejorar la
relación de señal a ruido, y/o cambiar la densidad de las células
diana. La encapsulación de colorantes en liposomas, la modificación
de los liposomas con agentes de unión, y la unión de liposomas
marcados a analitos diana en una muestra, se describen en la Patente
de Estados Unidos número 5.593.848, concedida el 14 de enero de 1997
a R. A. Levine y otros.
El otro paso implica el examen morfológico de
células para identificar células sospechosas, o para confirmar la
naturaleza maligna de las células. Por lo tanto, el otro paso se
puede caracterizar como un análisis "morfométrico" o
"morfológico". Se puede emplear en este paso un colorante
morfométrico universal tal como naranja de acridina, DAPI, Hoechst,
o colorantes de la marca "SYTO", o análogos. Estos dos pasos se
pueden realizar por orden, es decir, se puede usar uno para
identificar células sospechosas en la muestra de sangre, y se puede
usar el otro para confirmar la naturaleza maligna o benigna de las
células sospechosas. La decisión de recurrir al análisis epitópico o
morfométrico, o ambos, para determinar la malignidad de una célula
depende del tipo de tumor(es) que se encuentren. En algunos
casos, los elementos morfométricos solos son suficientemente
característicos para no requerir ninguna prueba de confirmación
adicional. En otros casos, puede ser suficiente un análisis
epitópico solo. Generalmente es deseable y prudente utilizar ambos
análisis epitópico y morfométrico al analizar la muestra de
sangre.
El análisis morfométrico de células nucleadas
sospechosas que se detectan cerca de la capa de plaquetas en la
muestra centrifugada de sangre lo puede realizar visualmente un
citopatólogo, analizando la muestra de sangre in situ en el
tubo, o el citopatólogo analizando visualmente una imagen, o una
serie de imágenes, de las células sospechosas, imágenes que son
capturadas in situ en el tubo, manualmente con cámara
manejada por personal técnico, o son capturadas automáticamente por
un instrumento automático de formación de imágenes.
Los pasos de análisis o captura visual o de
imagen del método de análisis de sangre de esta invención se
realizan con ampliación óptica de la muestra centrifugada de sangre
mientras ésta última permanece en el tubo de muestra. El análisis
morfométrico de las imágenes capturadas de células nucleadas de la
muestra de sangre se puede realizar a distancia en las imágenes
capturadas.
La detección de células nucleadas sospechosas de
ser cancerosas o de origen progenitor hematológico que se hallan en
la muestra centrifugada de sangre cerca de la capa de plaquetas se
puede basar en tinción diferencial de las células sospechosas como
resultado de la presencia y/o ausencia de epitopos de superficie de
los que se sabe que están presentes o ausentes en la mayoría de las
células epiteliales, y/o en la mayoría de las células cancerosas y/o
progenitoras hematológicas, y también se sabe que están ausentes en
células sanguíneas no nucleadas y nucleadas normales circulantes o
sus precursores. Se puede acoplar fluoróforos u otros colorantes o
marcadores detectables con emisiones distintivas, tal como rodamina,
fluoresceína, Cy3, Cy5, rojo Texas, Bodipy, o análogos, a
anticuerpos o antígenos, directamente o después de encapsularse en
liposomas, como se describe en dicha Patente de Estados Unidos
número 5.593.848.
Otra forma de detectar células nucleadas en la
muestra de sangre implica la adición a la muestra de sangre de un
colorante universal de células nucleadas tal como naranja de
acridina, Hoescht, DAPI, o colorantes de la marca "SYTO" por
ejemplo, que son capaces de teñir de forma diferencial todas las
células nucleadas que se pueden hallar en la muestra de sangre para
iluminar y clarificar de forma diferencial la morfología de todas
las células nucleadas en la muestra de sangre.
Los colorantes epitópicos y el colorante
universal fluorescerán máximamente a diferentes longitudes de onda,
permitiendo así la detección de células sospechosas visualmente o
por medio de un instrumento automatizado. Por ejemplo, la muestra
centrifugada de sangre se puede explorar con un instrumento
apropiado para identificar todas las células nucleadas en la región
de interés, y después explorar de nuevo con un filtro de luz
diferente para identificar todas las células epiteliales en la
muestra de sangre. De esta forma, se puede identificar células que
requieren inspección visual de la morfología anormal. El examen
morfométrico visual se puede realizar como una prueba de detección
preliminar o se puede realizar como la prueba de confirmación
siguiente de la naturaleza de las células sospechosas.
El análisis visual morfométrico preliminar, o el
análisis epitópico fotométrico, se realizará cerca de la capa de
plaquetas de la capa leucocitaria expandida en la muestra de sangre.
El hecho de que células cancerosas circulantes de origen epitelial,
ejemplificadas por cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de
mama, cáncer de recto/colon, cáncer ovárico, y cáncer de riñón,
entre otros, se pueden hallar cerca de la capa de plaquetas en una
muestra de sangre entera anticoagulada centrifugada sin necesidad de
un gradiente de densidad extraño, y pueden ser identificadas
morfológica y colorimétricamente in situ en el tubo de
muestra de sangre como cancerosas, no se describe en la literatura.
Además, el hecho de que las células progenitoras hematológicas
circulantes, que se derivan de la médula ósea y son precursores de
leucemia, se pueden hallar sin necesidad de un gradiente de densidad
extraño cerca de la capa de plaquetas en una muestra de sangre
entera anticoagulada centrifugada y pueden ser identificadas
epitópicamente, tampoco se describe en la literatura.
Por lo tanto, un objeto de esta invención es
proporcionar un método y aparato para detectar, identificar y
confirmar la presencia o ausencia de células cancerosas y/o
progenitoras hematológicas circulantes en una muestra de sangre
entera anticoagulada centrifugada que se contiene en un tubo
transparente.
Un objeto adicional de esta invención es
proporcionar un método y aparato del carácter descrito donde las
células cancerosas y/o progenitoras hematológicas circulantes se
aíslan de una amplia mayoría de células nucleadas sanguíneas no
cancerosas y no progenitoras hematológicas en la muestra de
sangre.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
método y aparato del carácter descrito donde el paso de detección
preliminar se puede realizar visual o epitópicamente por
instrumentación apropiada, y también donde el paso de confirmación
siguiente se puede realizar visual o epitópicamente.
Un objeto complementario de esta invención es
proporcionar un método y aparato del carácter descrito donde las
células nucleadas aisladas en la muestra de sangre centrifugada se
pueden confirmar como malignas o benignas (negativas), o como
células progenitoras hematológicas, in situ en el tubo.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
método y aparato del carácter descrito que permite la enumeración de
células cancerosas y/o progenitoras hematológicas circulantes
detectadas en la muestra de sangre.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
método y aparato del carácter descrito donde el análisis de sangre
de muestra se lleva a cabo in situ en un sistema cerrado,
sistema que es resistente a la contaminación de entorno ambiente,
reduciendo por ello la posibilidad de resultados positivos
falsos.
Estos y otros objetos y ventajas de la invención
serán más fácilmente evidentes por la siguiente descripción
detallada de la invención tomada en unión con los dibujos anexos, en
los que:
La figura 1 es una vista en alzado lateral de un
conjunto de parafernalia de tubo y flotador que se puede utilizar
para efectuar el procedimiento de esta invención.
La figura 2 es una vista esquemática de un
conjunto de instrumentos microscópicos automáticos que está adaptado
para uso en unión con la parafernalia de la figura 1 para realizar
el procedimiento de esta invención.
La figura 3 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada de células cancerosas de mama cultivadas
(MDA-MB-468) que se añadieron a una
muestra de sangre entera anticoagulada teñida con naranja de
acridina, y las células se aislaron, identificaron visualmente, y
confirmaron visualmente en la muestra centrifugada de sangre usando
una lente objetivo 10X en un conjunto de instrumentos microscópicos
configurados apropiadamente.
La figura 4 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada de células cancerosas de colon
HT-29 que se añadieron a una muestra de sangre
entera anticoagulada teñida con naranja de acridina, células que se
aislaron, identificaron visualmente, y confirmaron visualmente in
situ en el tubo conteniendo la muestra centrifugada de sangre
usando una lente objetivo 10X en un conjunto de instrumentos
microscópicos configurado apropiadamente.
La figura 5 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada de una sola célula cancerosa de colon
HT-29 añadida a una muestra de sangre entera
anticoagulada teñida con naranja de acridina usando una lente
objetivo 50X sumergida en aceite en un conjunto de microscopio de
configuración apropiada, célula que se aisló, identificó
visualmente, y confirmó visualmente in situ en el tubo
conteniendo la muestra centrifugada de sangre.
La figura 6 es una ilustración gráfica parecida a
la figura 5 de la microfotografía tomada in situ en un tubo
de muestra de la única célula cancerosa de colon
HT-29 en una muestra de sangre entera anticoagulada
teñida con naranja de acridina usando una lente objetivo 50X
sumergida en aceite en un conjunto de instrumentos microscópicos
configurado apropiadamente, donde la célula cancerosa se iluminó con
E-cadherina marcada con Cy3 en la muestra
centrifugada de sangre.
La figura 7 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada in situ en un tubo de muestra de
células cancerosas de colon HT-29 cultivadas que se
añadieron a una muestra de sangre entera anticoagulada teñida con
naranja de acridina y que se aislaron, detectaron visualmente y
confirmaron usando una lente objetivo 200X sumergida en aceite en un
conjunto de instrumentos microscópicos configurado
apropiadamente.
La figura 8 es una ilustración gráfica parecida a
la figura 7 de la microfotografía tomada de las células cancerosas
de colon HT-29 cultivadas que se añadieron a una
muestra de sangre entera anticoagulada teñida con naranja de
acridina y que se aislaron, detectaron visualmente y confirmaron
usando una lente objetivo 200X sumergida en aceite en un conjunto de
instrumentos microscópicos configurado apropiadamente, donde las
células cancerosas se iluminaron con E-cadherina
marcada con Cy3 en la muestra centrifugada de sangre.
La figura 9 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada de células cancerosas de colon
HT-29 cultivadas que se añadieron a una muestra de
sangre entera anticoagulada teñida con naranja de acridina y que se
aislaron, identificaron visualmente a una ampliación de 200X, y
confirmaron visualmente en la muestra centrifugada de sangre.
La figura 10 es una ilustración gráfica parecida
a la figura 9 de la microfotografía tomada de células cancerosas de
colon HT-29 cultivadas en la muestra de sangre
entera anticoagulada teñida con naranja de acridina a ampliación
200X donde las células cancerosas se iluminaron con
E-cadherina marcada con Cy3 en la muestra
centrifugada de sangre.
La figura 11 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada de células cancerosas de mama circulantes
detectadas en una muestra de sangre entera anticoagulada teñida con
naranja de acridina tomada de una paciente que se sabía que tenía
cáncer metastásico de mama, células que se aislaron, identificaron
visualmente usando un conjunto de microscopio que tiene una lente
objetivo 50X, y confirmaron visualmente in situ en el tubo
conteniendo la muestra centrifugada de sangre.
La figura 12 es una ilustración gráfica parecida
a la figura 11, pero mostrando las células cancerosas de mama
circulantes iluminadas con E-cadherina marcada con
Cy3 en la muestra centrifugada de sangre.
La figura 13 es una ilustración gráfica de una
microfotografía tomada de células cancerosas de próstata circulantes
tomadas de un paciente del que se sabía que tenía cáncer metastásico
de próstata, células que se aislaron, identificaron visualmente a
ampliación 500X, y confirmaron visualmente in situ en el tubo
conteniendo la muestra centrifugada de sangre.
La figura 14 es una ilustración gráfica parecida
a la figura 13, pero mostrando las células cancerosas de próstata
circulantes iluminadas con E-cadherina marcada con
Cy3 en la muestra centrifugada de sangre.
Con referencia ahora a los dibujos, se muestra en
la figura 1 una vista en alzado lateral de un conjunto de tubo de
muestra y flotador, que se denomina a continuación en general como
"la parafernalia" y que incluye un tubo transparente de muestra
2 que contiene un inserto de plástico alargado o flotador 4. El tubo
2 tiene un extremo inferior 6 que se cierra por medio de un tapón de
cierre 10. El tubo 2 puede ser un tubo capilar, o puede ser un tubo
más grande tal como se describe en la Patente de Estados Unidos
número 5.086.784, concedida el 11 de febrero de 1992. El grosor del
intervalo entre el agujero del tubo y el inserto 4 será al menos
aproximadamente diez micras de manera que sea accesible a células
diana.
La figura 2 es una ilustración esquemática de un
conjunto de instrumento microscópico colorimétrico automático, que
se designa en general con el número 12, y que se puede usar para
explorar una muestra de sangre centrifugada que se contiene en la
parafernalia representada en la figura 1, y puede, sin intervención
humana, diferenciar colorimétricamente entre tipos diferentes de
células en las capas exploradas, y puede crear y almacenar o
transmitir una imagen de las capas de células exploradas. El
conjunto de instrumento 12 incluye una etapa 14 que incluye al menos
un soporte rotativo 16 que engancha los extremos del tubo de muestra
2 y permite que el tubo de muestra 2 gire alrededor de su eje cuando
se explora el contenido del tubo 2. Un motor eléctrico reversible 18
gira selectivamente un tornillo de accionamiento 20 en direcciones
contrarias de manera que el tubo 2 se pueda mover axialmente en una
dirección y después en la dirección inversa cuando el tubo 2 se hace
girar gradualmente en la etapa 14. De esta manera, se puede explorar
todo el contenido circunferencial del tubo 2. La realización
automática del conjunto de instrumento 12 incluye una cámara CCD 22
que, por medio de un divisor de haz 24 y lente 26, es enfocada al
intervalo anular conteniendo muestra en el conjunto de tubo 2,
intervalo que está situado entre la pared del agujero del tubo y la
superficie exterior del inserto 4. Se apreciará que el rango
operativo de la lente 26 será al menos igual al grosor del intervalo
entre el agujero del tubo y el inserto 4 en el tubo 2. La cámara CCD
22 ve y registra imágenes de la muestra mediante una pluralidad de
diferentes filtros de ondas luminosas de emisión 28, 30 y 32 que se
montan en una rueda de filtros selectivamente rotativa 34. El
conjunto de instrumento 12 también incluye una fuente de luz de
excitación 35 que dirige un haz de luz de excitación al tubo de
muestra 2 mediante el divisor de haz 24 y la lente de enfoque 26.
Una serie de filtros de longitud de onda luminosa de excitación 36,
38 y 40 están montados en una rueda de filtros selectivamente
rotativa 42. El haz de luz de excitación es desviado por el divisor
de haz 24 hacia la lente de enfoque 26, y es enfocado en el tubo de
muestra 2 por la lente 26. Así, las dos ruedas de filtro 34 y 42
permiten controlar selectivamente y variar la longitud de onda de la
fuente de luz de excitación, así como la fuente de luz emitida. Un
controlador de microprocesador preprogramado 44 puede operar para
controlar selectivamente la rotación del tubo de muestra 2, la
rotación de las ruedas de filtro 34 y 42, y la operación de la
cámara CCD 22. El controlador 44 permite así una operación
completamente automática del conjunto de instrumento 12 sin
necesidad de intervención humana.
El conjunto de instrumento 12 opera de la
siguiente manera para capturar y registrar imágenes de los
resultados de la exploración de la muestra de sangre obtenida en el
tubo 2 para células sospechosas nucleadas, y también para confirmar
la naturaleza maligna o benigna de células sospechosas observadas
in situ en la muestra de sangre. Se aspira al conjunto de
tubo de muestra 2 e inserto 4 una muestra de sangre entera venosa o
capilar anticoagulada. La muestra de sangre se mezclará en el tubo
2, o antes de ser aspirada al tubo 2, con un colorante morfológico
fluorescente tal como naranja de acridina, de manera que se pueda
analizar las características morfológicas de las células nucleadas
que se observan en la muestra de sangre. La muestra de sangre
también se mezcla con un marcador específico de células epiteliales
que se utiliza para determinar si las células sospechosas observadas
en la muestra de sangre son de origen epitelial. Este procedimiento
de confirmación se eligió porque todas las células de tumores
cancerosos que se analizan son células epiteliales. Un antígeno
preferido que es altamente específico para un receptor superficial
en células epiteliales en E-cadherina. Para marcar
células epiteliales se prefiere utilizar Cy3 conjugado directamente
a E-cadherina. El Cy3 es un marcador que fluoresce a
una longitud de onda diferente de la de naranja de acridina. La
mezcla de sangre entera anticoagulada, naranja de acridina y
E-cadherina/Cy3 se centrifuga durante un período de
tiempo de aproximadamente cinco minutos en el conjunto de tubo de
muestra-inserto. La muestra centrifugada se coloca
después en los soportes 16 en la etapa 14, y se activa el
instrumento 12. La cámara CCD 22 grabará imágenes de la porción de
la muestra centrifugada de sangre cuando ésta última se haga girar y
alternar hacia adelante y hacia atrás mediante el plano focal de la
cámara 22. La cámara 22 producirá así una imagen de toda la
circunferencia de una zona deseada en la muestra de sangre. Se
realizarán exploraciones separadas, de las que registrará la imagen
de la muestra de sangre definida por una combinación apropiada de
los filtros 28, 30, 32, 36, 38 y 40 que se selecciona para que
fluoresca de forma diferencial el colorante de naranja de acridina
añadido a la muestra. Esta exploración producirá imágenes de todas
las células nucleadas en la zona de la muestra de sangre exploradas.
Otra exploración registrará la imagen de la muestra de sangre
definida por una segunda combinación apropiada de los filtros 28,
30, 32, 36, 38 y 40 que se seleccionan para que fluoresca de forma
diferencial la E-cadherina, Cy3 u otro marcador.
Esta exploración producirá imágenes de todas las células nucleadas
en la zona explorada de la muestra de sangre que sean células
epiteliales.
Se puede usar combinaciones de filtros
adicionales para exploraciones adicionales dependiendo de la
información celular adicional que se busque. Tal información útil
adicional podría incluir epitopos específicos de células cancerosas
adicionales que permitirán al citopatólogo identificar el origen de
las células cancerosas, es decir, si son células cancerosas
prostáticas, células cancerosas de mama, células cancerosas de
pulmón, células cancerosas ováricas, o análogos, información
epitópica de la que se dispone actualmente, o que se conozca en el
futuro. Dicho análisis de la muestra de sangre se puede realizar
automáticamente con el instrumento representado en la figura 2, o se
puede realizar explorando visualmente la muestra. Los pasos de
exploración y el análisis de los resultados de los pasos de
exploración se pueden realizar por orden. La exploración de las
células iluminadas con naranja de acridina permite identificar todas
las células nucleadas en la zona explorada, y también permite
analizar la morfología de las células nucleadas para identificar
células que parecen tener una morfología que sugiere malignidad. La
exploración de las células iluminadas con
E-cadherina/Cy3 permite identificar cuáles de las
células nucleadas en la zona explorada son células epiteliales. La
confirmación de la presencia de una célula epitelial (iluminada con
E-cadherina/Cy3) que tiene morfología celular
anormal (iluminada con naranja de acridina) en la muestra
centrifugada de sangre alerta al citopatólogo de la fuerte
probabilidad de un tumor canceroso en el donante de la muestra de
sangre. Se puede emplear un protocolo similar para determinar si las
células nucleadas sospechosas son células progenitoras
hematológicas.
Con referencia ahora a las figuras
3-14, se ilustran los resultados de la formación
fotométrica de imágenes de exploraciones de muestras de sangre
tomadas con la parafernalia "QBC", y usando dicha
tecnología.
Hemos realizado experimentos donde se añadieron
células cancerosas tumorales cultivadas a muestras de sangre, para
verificar tanto los límites de la detección de células tumorales
como para verificar la morfología diferencial, y para determinar la
posición de las células tumorales en el gradiente de densidad de
constituyentes sanguíneos formado graviméticamente. Estos
experimentos confirmaron la veracidad del procedimiento antes
descrito para aislar, analizar y confirmar la presencia de células
cancerosas tumorales circulantes en muestras de sangre entera
anticoaguladas.
Las figuras 3 y 4 muestran imágenes grabadas del
aspecto morfológico de una línea de células cancerosas de mama
cultivadas teñidas con naranja de acridina,
MDA-MB-468, (figura 3) y una línea
de células cancerosas de colon cultivadas teñidas con naranja de
acridina, HT-29, (figura 4), líneas de células
cancerosas cultivadas que se añadieron a respectivas muestras de 100
\mul de sangre entera anticoagulada. Las muestras de sangre
espiciformes se analizaron después según esta invención. El análisis
de las muestras de sangre identificaron de forma fiable y
reproducible las células cancerosas cultivadas de mama y colon en
las muestras de sangre. Las células se observaron en general en la
capa de plaquetas cerca de la interface
plaqueta-plasma. El análisis visual de las células
iluminadas realizado in situ en la muestra confirmó que eran
malignas.
La figura 5 es una imagen grabada de una sola
célula cancerosa de colon HT-29, bastante grande,
teñida con naranja de acridina que se aisló en una muestra de sangre
de 100 \mul que había sido dopada con una pequeña concentración de
células cancerosas HT-29 cultivadas. La capa
brillante a la derecha de la célula cancerosa es una interface de la
capa centrifugada de plaquetas en la muestra de sangre. Esta imagen
se grabó a una ampliación 500X. El análisis visual de las células
iluminadas realizado in situ en la muestra confirmó que eran
malignas.
La figura 6 es una vista similar a la figura 5,
pero mostrando la célula cancerosa de colon HT-29
aislada tal como aparece cuando se observa mediante el conjunto de
filtros de E-cadherina/Cy3. Se notará que las otras
células en el campo no están iluminadas, mientras que la célula
cancerosa de colon HT-29 es claramente visible,
confirmando así el hecho de que la célula grande es una célula
epitelial. El análisis visual de la célula iluminada realizado in
situ en la muestra confirmó que era maligna.
La figura 7 ilustra las imágenes grabadas de
células cancerosas de colon HT-29 cultivadas teñidas
con naranja de acridina tomadas a una ampliación 200X, cuando se
añadieron poblaciones más grandes de las células cancerosas
cultivadas a la muestra de sangre. Con la población más grande de
células cancerosas de colon, se observó que las células cancerosas
estaban distribuidas más ampliamente por toda la capa de plaquetas y
se concentraron en varias posiciones, una en la interface
linfocito-plaqueta, y otra en la interface
plaqueta-plasma. El análisis visual de las células
iluminadas realizado in situ en la muestra confirmó que eran
malignas.
La figura 8 es una vista similar a la figura 7
pero mostrando las imágenes grabadas de células cancerosas de colon
teñidas con E-cadherina/Cy3 que confirma el origen
epitelial de las células iluminadas. El análisis visual de las
células iluminadas realizado in situ en la muestra confirmó
que eran malignas.
Las figuras 9 y 10 son ilustrativas de imágenes
grabadas de células cancerosas de colon HT-29
cultivadas teñidas con naranja de acridina que se añadieron a una
muestra de sangre, y que se tomaron a una ampliación 10X. Se observó
que las células cancerosas se concentraban cerca de la interface
plaqueta-plasma.
La figura 9 muestra las células cancerosas
morfológicamente iluminadas con naranja de acridina; y la figura 10
muestra las células cancerosas iluminadas epitópicamente con
E-cadherina/Cy3. Así la figura 9 confirma la
presencia de células nucleadas en la capa de plasma junto a la capa
de plaquetas de la muestra centrifugada de sangre; y la figura 10
confirma que algunas de las células nucleadas detectadas son células
epiteliales. El análisis visual de las células iluminadas realizado
in situ en la muestra confirmó que eran malignas.
Las figuras 11 y 12 son ilustrativas de imágenes
grabadas de células cancerosas de mama circulantes teñidas con
naranja de acridina en una muestra de sangre tomada de una paciente
de la que se sabía que padecía cáncer metastásico de mama. Se
observó que las células cancerosas se concentraban cerca de la
interface plaqueta-plasma. La figura 11 muestra las
células cancerosas morfológicamente iluminadas con naranja de
acridina; y la figura 12 muestra las células cancerosas iluminadas
epitópicamente con E-cadherina/Cy3. Así, la figura
11 confirma la presencia de células nucleadas en la capa de plasma
junto a la capa de plaquetas de la muestra centrifugada de sangre; y
la figura 12 confirma que algunas de las células nucleadas
detectadas son células epiteliales. El análisis visual de las
células iluminadas realizado in situ en la muestra confirmó
que eran malignas.
Las figuras 13 y 14 son ilustrativas de imágenes
grabadas de células cancerosas circulantes teñidas con naranja de
acridina prostáticas en una muestra de sangre tomada de un paciente
del que se sabía que padecía cáncer de próstata. Se observó que las
células cancerosas se concentraban cerca de la interface
plaqueta-plasma. La figura 13 muestra las células
cancerosas morfológicamente iluminadas con naranja de acridina; y la
figura 14 muestra las células cancerosas iluminadas epitópicamente
con E-cadherina/Cy3. Así, la figura 13 confirma la
presencia de células nucleadas en la capa de plasma junto a la capa
de plaquetas de la muestra de sangre centrifugada; y la figura 14
confirma que algunas de las células nucleadas detectadas son células
epiteliales. El análisis visual de las células iluminadas realizado
in situ en la muestra confirmó que eran malignas. El hecho de
que no todas las células se iluminan con marcadores Cy3 proporciona
un control interno negativo que confirma que las células
epitópicamente iluminadas son de origen epitelial. Las células no
epitópicamente iluminadas nucleadas son linfocitos.
Asimismo, se realizaron experimentos para
determinar la sensibilidad de dicho ensayo. El tubo capilar
"QBC" estándar contiene 100 \mul de sangre que contiene
1x10^{9} de glóbulos rojos (RBCs) y 1x10^{6} de células
nucleadas (granulocitos, linfocitos, etc). Así, sin cambiar la
escala de la prueba, el límite teórico de sensibilidad sería 1
célula en 1x10^{6} de células nucleadas. Se utilizó diluciones en
serie de células cancerosas de colon HT-29 para
obtener múltiples alícuotas pareadas de 10 \mul conteniendo entre
1 y 10 células, o pares conteniendo entre 10 y 100 células. La
primera alícuota del par se añadió a los tubos "QBC" y la
segunda se contó con un hemocitómetro estándar. Estos experimentos
condujeron a la conclusión de que el límite de sensibilidad de este
ensayo se aproxima al límite teórico de 1 célula en 1x10^{6} de
células nucleadas usando un tubo de 110 \mul. Teóricamente, la
sensibilidad de la prueba se puede incrementar hasta diez veces
realizando el análisis en un tubo de 1 ml de muestra de sangre.
Aunque el análisis morfométrico puede ser
suficiente para la identificación de células cancerosas, también
pueden ser necesarios otros métodos de verificación. El ensayo de
esta invención aprovecha el hecho de que puede detectar la
morfología celular anormal, y también puede, al mismo tiempo,
verificar el origen epitelial o de progenitor hematológico de
células nucleadas anormales observadas en la muestra de sangre.
Puesto que el análisis de esta invención es no destructivo de las
células, las células se pueden sacar del tubo de muestra para
análisis adicional por otros métodos tal como el método PCR descrito
en la técnica anterior, o por ensayo bioquímico.
Como ejemplo, se eligió
E-cadherina puesto que este antígeno es altamente
específico para células epiteliales y se visualiza en la superficie
exterior de la membrana celular. Para estos estudios usamos Cy3, que
es un fluoróforo a base de cianamina, y que se conjugó directamente
a anticuerpos monoclonales de E-cadherina para poder
visualizar la tinción de células a una longitud de onda distinta de
la usada para examen morfométrico usando fluorescencia inducida por
naranja de acridina.
Hemos confirmado que las células epiteliales
nucleadas malignas pueden ser identificadas morfométricamente en una
muestra de sangre entera anticoagulada centrifugada usando la
técnica de esta invención. Los criterios morfométricos adecuados que
se pueden visualizar en la muestra de sangre in situ en el
conjunto de tubo incluyen: relaciones nucleares/citoplásmicas
intracelulares; tamaño y forma nuclear intracelular; configuración
de cromatina nuclear intracelular; el grosor y tamaño de la membrana
nuclear; y el número y tamaño de nucleolos, entre otros. Asimismo,
hemos determinado que las células cancerosas epiteliales y las
células progenitoras hematológicas se disponen en la muestra de
sangre entera anticoagulada centrifugada por densidad, en vez de
sedimentar en la muestra de sangre por tamaño. Esta determinación
permite la detección de células cancerosas circulantes y/o células
progenitoras hematológicas en una zona predeterminada y conocida en
la muestra centrifugada de sangre, es decir, en la zona de la
muestra centrifugada de sangre donde se disponen las plaquetas. Si
las células cancerosas y/o progenitoras hematológicas circulantes
sedimentasen en la muestra de sangre por tamaño, seríamos incapaces
de definir una "zona de interés" donde cabría esperar que se
hallasen las células cancerosas y/o progenitoras hematológicas. Las
células cancerosas y/o progenitoras hematológicas se han hallado
predominantemente cerca de la interface
plaqueta-plasma; dentro de la capa de plaquetas
cerca de la interface linfocito/plaqueta; o en la capa de linfocitos
en los casos de sobrecarga artificial, dependiendo todo ello de la
concentración de células cancerosas y/o progenitoras hematológicas
que están en la muestra de sangre. Se puede alcanzar una
sensibilidad teórica de la técnica de esta invención, cuando se
emplea un tubo capilar de 100 \mul conteniendo 1x10^{6} células
nucleadas, es una célula cancerosa y/o progenitora hematológica
detectada en 1x10^{6} células sanguíneas nucleadas en una muestra
de sangre de 100 \mul. Como se ha indicado anteriormente, se
deberá alcanzar un aumento diez veces superior de la sensibilidad
teórica si el volumen de la muestra de sangre se incrementase diez
veces, a aproximadamente un mililitro. La verificación del origen de
células cancerosas y/o progenitoras hematológicas en la muestra de
sangre puede ser confirmada por marcado inmunofluorescente de
células sospechosas. Así, la inspección visual de las células
determinará si presentan características morfométricas cancerosas, y
la inmunofluorescencia verificará el origen de las células
sospechosas inspeccionadas.
Se apreciará que dichos procedimientos y aparato
se pueden usar para verificar la presencia o ausencia de células
cancerosas en pacientes; se pueden usar para conocer la fase de un
tumor maligno; se pueden usar para conocer la efectividad de
quimioterapia en pacientes con cáncer tratados; y se pueden usar
para identificar y enumerar células progenitoras hematológicas en la
muestra de sangre. La detección y enumeración de células
progenitoras hematológicas y células cancerosas es de importancia
clínica para la recogida de células madre y la purga de células
cancerosas de las células madre recogidas. El uso de esta invención
como un medio de conocer la efectividad de la quimioterapia
proporciona una forma mucho más sensible y rápida de evaluar la
terapia que la exploración CAT, los rayos X, o análogos que se
utilizan actualmente para supervisar el tamaño de un tumor. La
efectividad de la quimioterapia puede ser evaluada contando el
número de células cancerosas en la muestra de sangre. El
procedimiento de recuento se puede realizar en toda la periferia
completa de la zona definida del tubo, o se puede realizar solamente
en una porción de la periferia de dicha zona del tubo. Cuando se
realiza este último acercamiento, el número de células cancerosas en
la muestra puede ser extrapolado resolviendo la fórmula:
C =
N(360º /d) \div
V:
donde "C" es la concentración
de células resultante; "N" es el número de células diana
contadas; "d" es el grado de rotación del tubo en el que se
examinaron las células diana dividido por "V" que es el volumen
del tubo de muestra. La enumeración de células se puede realizar por
medio de un contador fotométrico, o se puede hacer visualmente. El
acercamiento fotométrico puede utilizar una combinación de
marcadores epitópicos que iluminarán de forma diferencial células
cancerosas y/o progenitoras hematológicas u otras células no
cancerosas. De esta manera se contarán las células iluminadas y/o no
iluminadas. El análisis morfométrico también puede ser realizado
fotométricamente. El acercamiento visual puede utilizar un colorante
morfométrico tal como naranja de acridina o los otros colorantes
morfométricos identificados
anteriormente.
Las ventajas de la técnica y aparato "QBC"
para diagnosticar y enumerar células cancerosas en sangre circulante
sobre las técnicas FACS y molecular incluyen: 1) el período
relativamente corto de tiempo necesario para efectuar el análisis de
sangre; 2) el hecho de que el sistema se puede integrar en equipo de
laboratorio estándar que todos los patólogos son capaces de usar sin
amplio entrenamiento; 3) las células no fijadas se pueden examinar
en un medio fluido para eliminar artefactos de fijación; 4)
solamente se necesita un volumen de sangre relativamente pequeño
para efectuar el análisis; 5) la técnica tiene la misma sensibilidad
que la técnica molecular en la que una célula cancerosa puede ser
detectada en una muestra conteniendo
10^{6}-10^{7} células nucleadas normales; 6) el
hecho de que la técnica "QBC" utiliza un sistema cerrado de
muestreo y análisis para eliminar la contaminación cruzada, que es
un problema importante en el procedimiento molecular; 7) la
eliminación de contaminación celular debido a células flotantes
contaminantes en los colorantes de fijación que se utilizan en
procedimientos citológicos rutinarios; y 8) el análisis de esta
invención es más seguro para los técnicos que realizan el análisis
puesto que no estarán expuestos a la muestra de sangre que se
analiza.
El inserto y tubo específicos representados en
los dibujos son cilíndricos; sin embargo, también podrían ser
poligonales. El único factor limitador con respecto a las
configuraciones transversales del tubo e inserto es que son
complementarios entre sí. El análisis de la muestra de sangre se
hace bajo ampliación adecuada con un instrumento microscópico,
preferiblemente equipado con una cámara CCD. El intervalo formado en
el tubo entre el tubo y el inserto está dimensionado
transversalmente de manera que las células diana individuales puedan
ser aisladas y puedan ser discernidas fácilmente, enumeradas y
analizadas morfométricamente dentro del intervalo. El grosor
transversal del intervalo también está dentro del rango operativo
focal del instrumento microscópico que se usa para analizar el
intervalo.
Se apreciará que el método de esta invención, en
su sentido más amplio, implica detectar la presencia o ausencia de
células nucleadas diana circulantes individuales en una muestra de
sangre entera anticoagulada centrifugada contenida en un tubo que
también contiene un inserto generalmente cilíndrico. El inserto
forma una zona anular bien definida en el tubo. La muestra de sangre
se combina con uno o varios agentes marcadores específicos de
epitopo que son operativos para producir un resultado de señal
característico en células diana nucleadas, resultado que puede no
incluir ninguna señal, y que define la presencia o ausencia de uno o
varios epitopos en las células diana nucleadas. La muestra de sangre
también se combina con un colorante que puede operar para clarificar
la morfología celular de todas las células nucleadas en la muestra
de sangre. Las células circundantes nucleadas son identificadas así
por morfología celular, y todas las células nucleadas identificadas
que por razón de su morfología pueden ser células diana se
caracterizan además epitópicamente como células diana o no diana.
Supóngase, como explicación adicional, que una combinación
específica de los epitopos "A" y "B" es característica de
una célula diana, pero no característica de otras células en la
muestra de sangre. La presencia o ausencia de solamente uno de estos
epitopos o la presencia o ausencia de estos dos epitopos podría ser
característica de la célula diana. Así, se podría usar cualquiera de
los cuatro resultados de señal de agentes marcadores específicos de
epitopo diferentes respectivos: A y no B; B y no A; A y B; o no A y
no B, para caracterizar la célula diana. Los pasos de identificación
y caracterización se pueden realizar in situ en el tubo.
Obviamente, se podría emplear más o menos de dos epitopos diferentes
en la caracterización de células diana.
Puesto que se puede hacer muchos cambios y
variaciones de la realización descrita de la invención sin apartarse
de la idea de la invención, no se pretende limitar la invención de
modo distinto al requerido por las reivindicaciones anexas.
Claims (10)
1. Un método para detectar células cancerosas y/o
células progenitoras hematológicas en una muestra de sangre entera
anticoagulada, incluyendo dicho método los pasos de:
a) obtener una muestra de sangre entera
anticoagulada conteniendo un agente marcador celular epitópico que
puede operar para diferenciar células cancerosas y/o células
progenitoras hematológicas de otras células nucleadas en la muestra,
conteniéndose dicha muestra en un tubo transparente que también
contiene un inserto que crea un intervalo bien definido entre el
tubo y el inserto;
b) centrifugar la muestra de sangre en el tubo
para separar gravimétricamente la muestra de sangre en sus
componentes constituyentes por densidad;
c) teniendo el inserto del paso (a) una gravedad
específica tal que haga que sedimente en la muestra centrifugada en
un grado tal que las células nucleadas a detectar se dispondrán en
dicho intervalo;
d) examinar dicho intervalo para determinar si
hay células cancerosas epitológicamente diferenciadas y/o células
progenitoras hematológicas en dicho intervalo.
2. El método de la reivindicación 1, donde
la muestra de sangre contiene además un colorante
que puede operar para clarificar la morfología celular en todas las
células nucleadas en la muestra de sangre, y
donde se examina la morfología celular de las
células nucleadas presentes en el intervalo después de su
centrifugación.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2,
donde
se enumeran las células cancerosas y/o células
progenitoras hematológicas que se hallan presentes en dicho
intervalo.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el intervalo que se examina, es la
zona donde las plaquetas de la muestra de sangre han gravitado
durante la centrifugación, o una zona adyacente a ella.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde
la muestra de sangre se combina con uno o varios
agentes marcadores específicos de epitoto que pueden operar para
diferenciar resaltando epitópicamente células epiteliales nucleadas
que pueden estar presentes en la muestra de sangre,
la muestra de sangre se combina con un colorante
que puede operar para clarificar la morfología celular en células
nucleadas en la muestra de sangre,
las células nucleadas epiteliales halladas en
dicho intervalo después de centrifugación son enumeradas in
situ,
la morfología celular de las células nucleadas
halladas en dicho intervalo después de la centrifugación es
examinada in situ,
realizándose dichos pasos de combinación antes o
después de colocar la muestra de sangre en el tubo, y no
realizándose dichos pasos de enumeración y examen en un orden
particular.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde
la muestra de sangre se combina con uno o varios
agentes marcadores específicos de epitoto que pueden operar para
diferenciar resaltando epitópicamente células progenitoras
hematológicas que pueden estar presentes en la muestra de
sangre,
la muestra de sangre se combina con un colorante
que puede operar para clarificar la morfología celular en células
nucleadas en la muestra de sangre,
las células progenitoras hematológicas halladas
en dicho intervalo después de la centrifugación son enumeradas in
situ,
la morfología celular de las células nucleadas
halladas en dicho intervalo después de la centrifugación es
examinada in situ,
realizándose dichos pasos de combinación antes o
después de colocar la muestra de sangre en el tubo, y
no realizándose dichos pasos de enumeración y
examen en un orden particular.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, donde dichos pasos de enumeración y examen
se realizan con un instrumento microscópico automático.
8. El método de la reivindicación 7, donde el
intervalo tiene un grosor transversal que es esencialmente igual a
un rango operativo focal del instrumento microscópico a una potencia
predeterminada.
9. El método de la reivindicación 8, donde dicho
grosor transversal está dentro de un rango de diez a cien
micras.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde se utiliza un tubo de muestra de
sangre que contiene un inserto generalmente cilíndrico, axialmente
alargado, que forma un intervalo anular entre el tubo y el
inserto.
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|---|---|---|---|
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