CN1147730C - 全血循环癌和/或血液祖细胞的检测、识别、计数和确认方法 - Google Patents
全血循环癌和/或血液祖细胞的检测、识别、计数和确认方法Info
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Abstract
一种分析血液以在一定放大倍数下分离、检测、计数和确认已知在血液里循环的癌细胞和/或血液祖靶细胞是否存在的方法。该分析是在取样管中离心抗凝处理的全血样本里进行的，包括形态和表位检测。把荧光剂与抗靶表位的抗体偶联。用显示胞内细胞结构的胞内染色剂例如吖啶橙将血样中的细胞染色，可以进行形态分析。两类分析都优选在离心血样内血小板层上或附近进行。在一定放大率下目测和/或光度测定来进行形态和/或表位分析。
Description
发明领域
本发明涉及到一种对装在一种透明取样管装置内的抗凝处理过的全血样本中循环癌和/或血液祖细胞的检测、识别、计数和确认的方法和装置。在该取样管装置内能够操作检测、识别、计数和确认的全部步骤。更具体地说，本发明的方法包括采用这样一种方式对血样成分按离心密度分离，该方式能够确保由于循环癌和/或血液祖细胞的密度将血样内的循环癌和/或血液祖细胞以物理方式置于血样和取样管装置中预定的轴向位置，也进入到取样管装置中与取样管壁邻接的限制性光学面，最后进入到该光学面的一个明确的区域。
发明背景
细胞学是涉及哺乳动物细胞形态特征的科学和技术。在人类医学和兽医学上细胞学都具有临床实用性。细胞学最常用于诊断在脱落细胞或收获细胞中是否存在恶性肿瘤，那些脱落细胞或收获细胞一般：a)脱落在体腔里，例如胸膜间隙或腹膜；b)脱落在排出的体液里，例如分泌的唾液或排泄的尿液；c)通过刮或刷体表，例如子宫颈、子宫腔或支气管粘膜得到；或者d)通过直接从肿瘤，例如甲状腺、乳腺、肺或者类似器官的肿瘤中用针抽吸得到。然后一般将该脱落或收获的细胞固定、染色和目测研究，通常采用亮视野电子显微术，然后，如果需要的话，就采用免疫染色和/或其它的分子技术研究。
本年度美国有近560,000人会死于实体肿瘤(主要是癌)。本来通过对恶性肿瘤的早期诊断可以防止其中的许多人死亡。遗憾的是，除检测前列腺癌的前列腺特异抗原(PSA)试验可能是例外之外，还没有发现通过血液分析对实体肿瘤的早期检测有效的切实可行的常规方法。在美国，通过宫颈癌的早期检测，巴氏涂片已经把宫颈癌死亡率降低了70％以上。对其它实体肿瘤的类似试验的开发可能对总体癌症死亡率有相似的影响。
现已经证实了循环癌细胞的存在，该癌细胞由癌性肿瘤自然脱落到供给肿瘤氧气和营养物的循环血流中。由于癌性肿瘤以所谓的血液循环路线扩散并且在非常稀有的病例中在血液标本中已被观测到，所以几十年前有人就推断血流中存在这种细胞。最近采用逆转录酶结合聚合酶链反应(PCR)的复杂技术，借助于肿瘤的分子标记在许多癌症病人(在原位癌时和其扩散之后)中已经能够检测到肿瘤细胞的存在。
另一种检测循环癌细胞的方法是采用一种公知的技术如荧光激活细胞分选法(FACS)，例如Becton Dickinson和Franklin Lakes，NewJersey公司制造的分选仪。对循环癌细胞的FACS检测包括通过检测有荧光标记的抗体和/或通过检测表位的组合或者结合这两种方法来测定癌细胞，其中抗体对抗并结合存在于癌细胞表面或内部而在正常血细胞表面或内部不存在的一种或多种表位，其中组合表位是存在于循环的正常血细胞表面或者内部的表位和可能存在于或不存在于癌细胞表面或者内部的表位。
因而FACS技术是以细胞检测为基础，也就是说，它是光度测定并利用了抗体-表位的特异性，但在FACS仪器中不能就地从形态上分析细胞。为了选择特异的分子种类或免疫-表型信号，逆转录酶/PCR(分子技术)、FACS(免疫-表型法)，两者都需要所寻找的肿瘤起源是已知的。上述技术对证实癌细胞在血流中循环的理论有一定贡献，但是由于它们的费用和/或性质，就临床应用而言这些技术对于检测血流中循环的肿瘤癌细胞是否存在并非特别实用。因而，不考虑癌患者细胞的根源，用于循环癌细胞恶性本质的检测和确认的常规和普通的血液分析方法是不存在的。此外，上述的分子或免疫-表型方法均不能原地使用，即在一封闭的采样系统中，使用细胞病理学的分析以确认循环细胞的形态学特征，而这些特征就可识别和证实癌细胞。
由于在起源上所有肿瘤细胞中大约82％是上皮细胞(其中72％的是致命的)，在循环血液中上皮癌细胞应该是能够检测的。虽然循环血流中上皮细胞的存在不能单独确认为恶性肿瘤，但是由于在循环血流中很少见到上皮细胞，它警告细胞学家有极大的可能性是恶性肿瘤。然而，在某些情况下，例如外科手术后；或者由于身体创伤；或者由于牙线，或者在前列腺炎的情况下，例如，在循环血流中也会发现非恶性上皮细胞，这是有可能的。目前细胞的目测形态分析是在循环血样中区分良性上皮细胞和癌上皮细胞的最可靠的方法。试图通过形态分析检测血液中循环癌细胞的问题之一是，只采用细胞学分析方法一般是不可能将循环的血液祖细胞、或胚细胞与循环的癌细胞区分的。
少量可能存在于循环血液中的癌细胞需要细胞病理学家去仔细地检查大约一千万有核血细胞以便发现一个癌细胞，并且那一个癌细胞可能会随机地存在于一千万有核血细胞里，这些有核细胞自身又均匀分散至五十亿无核细胞的血液组分的海洋里，即，红血球，加上二亿五千万血小板，上述这一切在一亳升的血液中均会发现。这样一项作业会是非常耗时的，因而不实用于分析癌细胞是否存在的病人血液。
血样中可能发现的另一类型极少的循环有核细胞是血液祖细胞(HPC)，它包括胚细胞、干细胞和其它正常循环细胞的祖细胞，其通常在循环血液样中的水平使用目前可得到的血细胞仪器如阻抗计数器和检测染色的外周血是不能检测到的。在接受化疗和接受人粒细胞集落刺激因子(HGCSF)、和其它细胞因子治疗的病人里，HPC更有可能存在，但是通常数量很少，即，每毫升样本大约1-1000个，或者更少。因而，血样中低浓度的HPC致使用常规的方法检测不到。
检测和对HPC的计数是很重要的，这是因为HPC的计数能够使得HPC的收获更有效，并用于临床上重要的干细胞移植治疗。类似地，在收获HPC细胞的病人里循环的癌细胞的检测也很重要，从而使得向病人再输注所收获循环癌细胞的可能减少到最小。
已经研制出一种技术，该技术是通过离心有插入物一般是漂浮物的毛细管或其它管中的混合物样品来测量复杂混合物中的组份层。该漂浮物优选是柱状的，并且具有一个特殊的比重，该比重能够使它置入离心混合物内到一定程度，在管中产生一个环形自由体积，待测层将落在其中。这样该待测层被物理延长，并且因而能被更容易地和更精确地测量。1977年6月7日授权的美国专利4,027,660、1978年4月4日授权的美国专利4,082,085、1979年5月29日授权的美国专利4,156,570，和其它的专利描述了上述技术。目前Becton Dickinson and Company以注册商标“QBC”销售这项技术。“QBC”技术适用于血样的微丝蚴感染的分离和识别，如在1980年2月26日授权的美国专利4,190,328中阐述的。1995年4月4日授权的美国专利5,403,714、1996年3月5日授权的美国专利5,496,704、1996年4月9日授权的美国专利5,506,145，和其它的专利描述了上述“QBC”技术检测抗凝处理的全血中各种分析物的用途；并且该技术也涉及到为确认癌肿瘤细胞是否存在而化验组织样本，其中在分析之前将组织样本与一种盐水缓冲液混合。
显然目前迫切需求一种简单的方法和实施该方法的系统，其中通过快速、准确地分析毛细血管血液或静脉血样本来判断循环癌细胞和/或血液祖细胞是否存在。此外，该方法应当能够使人在血液取样装置里就地区分血液祖细胞和癌细胞；并且也能使人原地确认所检测细胞的性质。
发明内容
本发明涉及到一种以目测或光度计检测装在一个透明取样试管中抗凝处理过的全血样内的循环癌和/或血液祖细胞的方法和仪器。通过利用这样一种事实能够在几分钟内实现循环癌细胞和/或血液祖细胞的检测和确认，即上皮起源的循环癌细胞，和血液祖细胞，当存在于循环血流中时，具有与其他的血液有核成分不同的密度并且，以比重分析法分离时，该上皮癌细胞和/或血液祖细胞将在，或者靠近，离心血样的血小板层处分层。我们已经确认在离心血样中循环上皮癌细胞和/或血液祖细胞通过沉淀按大小并不能分层，而是在离心血样中由密度分层。血小板层是一种通常不含有核细胞的血液成分层，并且不含对DNA染色剂敏感的物质，因而可以快速识别在血小板层附近的有核细胞。本发明允许原地，即在取样装置中，进行目测形态的分析和表位标记分析以及识别在离心血样中发现的可疑的有核细胞即比重低的大细胞。本发明也允许在取样管式组件中原地分析可疑细胞。这些分析能够确认个别的可疑细胞是否是恶性上皮细胞、良性上皮细胞或者非上皮起源还是血液祖细胞，而都无需从取样试管中移出血样。采用“QBC”装置在抗凝处理的全血中分离和识别循环癌细胞和/或血液祖细胞的一个显著优点是，“QBC”装置提供了一个不被其他样本交叉污染的封闭系统。在一种可靠的稀有事件检测系统中这个优点是非常重要的。
当在适当的放大倍数下检测血样时，在已经于上述“QBC”管和插入装置中离心的血样中发现讨论中的这种癌细胞和/或血液祖细胞在血小板层附近。本发明的方法因而包括两个步骤，这两个步骤每一步都是原地进行的，而血样保留在取样管中。
一个步骤包括细胞上特征表位的检测以确认试管中标记的有核细胞是上皮起源还是血液起源。本步骤可以称为“表位”分析。在进行该表位步骤中，可以采用上皮特异性抗原，例如E-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白11、上皮膜抗原(EMA)、癌胚抗原(CEA)、整联蛋白、EP-CAM、MUC3、CD-44，生长因子受体，例如表皮生长因子(EGF)受体、肝细胞生长因子(HGF)受体，及其它的可用于上皮起源细胞检测的物质。
为了检测HPC起源的细胞，可以采用例如抗CD-33、CD-34的HPC表位特异性标记的抗体。上述HPC专一抗体不能识别上皮细胞，已标记的上皮特异性抗体或其它结合粒子也不能识别HPC细胞。为了增加信噪比，和/或改变目标细胞的密度，可采用标记物的脂质体包囊化。1997年1月14日授权给R。A.Levine等人的美国专利5,593,848描述了脂质体中染料的包囊、用粘合剂对脂质体的修饰和样本中目标分析物上标记脂质体的附着，在此引用该专利的全部内容。
另一步骤包括识别可疑细胞，或确认该细胞的恶性本质的形态检查。因此本步骤可称为“形态测定法”或“形态”分析。一种通用形态测定染色剂例如吖啶橙、DAPI、Hoechst、或“SYTO”商标的染色剂等在该步骤中均可以使用。可按任何一个顺序进行这两个步骤，即，一个用于识别血样中的可疑细胞，另一个用于确认任何可疑细胞的恶性或良性本质。是依赖于表位分析或形态测定分析，还是这两者来确定细胞的恶性性质，这取决于所遇到的肿瘤的类型。在某些情况下，仅仅形态测定法方面的特征就足够了而不需要任何额外的验证实验。在其它的情况下，单用表位分析或许就足够了。在化验血样中一般最好并谨慎地使用表位和形态测定两种分析法。
通过细胞学家在试管里原地目测分析血样，或者通过细胞学家目测分析可疑细胞的图像、或一系列图像完成离心血样中在血小板层附近检测到的可疑有核细胞形态测定分析，试管中该细胞的图像或者采用一种专家操作的摄像机手动捕获或者采用一种自动成像仪器自动地原地捕获。在离心血样仍留在取样管中的情况下，本发明的血液分析法的目测和图像分析或者捕获步骤与离心血样的光学放大一起进行。从血样中捕获的有核细胞的图像的形态测定分析可在这些被捕获的图像上远程进行。
由于已知在多数上皮细胞和/或在大多数上皮癌细胞和/或血液祖细胞上存在和/或缺少，并且也已知在正常循环的有核细胞和无核血细胞或它们的前身上缺少某表面表位，所以在血小板层附近的离心血样中发现的怀疑是癌或血液祖起源的有核细胞的检测可基于这些可疑细胞的差别染色。如上述的美国专利5,593,848所描述的，荧光团或其他的可检测的染色剂或带有区别发射的标志物，例如罗丹明、荧光素、Cy3、Cy5、德克萨斯红、Bodipy、或类似的均可以直接地或者在脂质体里包囊之后与抗体或抗原偶合在一起。
另一种检测血样中有核细胞的方法包括向血样中加入一种通用的有核细胞染色剂，例如吖啶橙、Hoescht、DAPI、或“SYTO”商标的染色剂，这些染色剂适于区别染色血样中发现的所有有核细胞以便区别显示血样中一切有核细胞的形态。
表位染色剂和通用染色剂在不同的波长下发出最大荧光，因而允许目测或采用一种自动化仪器检测可疑细胞。例如，通过一种合适的仪器扫描离心血样以便识别感兴趣区域中的一切有核细胞，然后以一种不同的滤光器重复扫描以便识别出血样中的一切上皮细胞。通过这种方法，就能识别细胞，该方法对异常形态需要目测。目测形态检测可作为一种初步实验，或者作为继后的可疑细胞本质的验证实验。
在血样的扩展血沉淀黄层的血小板层附近进行初步目测形态分析，或者光度计表位分析。在抗凝处理的全血离心样品中无需外来的密度梯度就能够在血小板层附近发现上皮起源的循环癌细胞，例如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠/结肠癌、卵巢癌和肾癌，并且能在血液取样管中原地在形态上和以比色法识别为癌性的，这种情况在文献中没有描述。此外，在抗凝处理的全血的离心样品中不需要外来的密度梯度，就能够在血小板层附近发现并且能够表位识别起源于骨髓并且是白血病先兆的循环血液祖细胞，这种情况在文献中同样没有描述。
因此本发明的一个目的是提供一种适于检测、识别和确认在透明取样管装置内的离心抗凝处理的全血样本中是否存在循环癌细胞和/或血液祖细胞的方法和装置。
本发明的另一个目的是提供一种具有上述特征的方法和装置，其中将循环癌细胞和/或血液祖细胞与血样里的绝大部分非癌性的和非血液祖细胞的有核血细胞分离。
本发明又一个目的是提供一种具有上述特征的方法和装置，其中以目测或者采用合适仪器的表位测定进行初步检测步骤，并以目测或者表位分析进行随后的确认步骤。
本发明一个附加的目的是提供一种方法和装置，其中离心血样里被分离的有核细胞在管中被原地确认为恶性的或良性的(阴性)，或者被确认为血液祖细胞。
本发明另一个的目的是提供一种具有上述特征的方法和装置，其能够对血样中检测到的循环癌和/或血液祖细胞计数。
本发明的又一个目的是提供一种具有上述特征的方法和装置，其中在可防止来自周围环境的污染的封闭系统中原地实行血样分析，因此减小了假阳性结果的可能性。
附图说明
当结合附图一起考虑时，从本发明的下列详细描述中将会更容易显示出本发明的这些和其它的目的和优点，在这些附图里：
图1是用于进行本发明方法的管和浮动装置的侧视图；
图2是适用于和图1的装置一起进行本发明方法的自动显微镜仪器装置示意图；
图3是在合适的成形显微镜仪器装置中采用10X物镜时拍摄的、被添加至吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里的培养乳腺癌细胞(MDA-MB-468)的显微照片的图解，并且该癌细胞在离心血样里被分离、目测识别和目测确认；
图4是在合适的成形显微镜仪器装置中采用10X物镜时拍摄的、被添加至吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里的HT-29结肠癌细胞显微照片的图解，该癌细胞在装有离心血样的试管里被原地分离、目测识别和目测确认；
图5是在合适的成形显微镜装置中采用50X油镜时拍摄的、被添加至吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里的单个培养HT-29结肠癌细胞显微照片的图解，该癌细胞在装有离心血样的试管里被原地分离、目测识别和目测确认；
图6是在合适的成形显微镜仪器装置中采用50X油镜时在取样管中原地拍摄的、在吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里单个培养HT-29结肠癌细胞的类似于图5的显微照片的图解，其中通过Cy3标记的E-钙粘着蛋白显示离心血样中的癌细胞；
图7是在合适的成形显微镜仪器装置中采用200X油镜时，被添加至吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里的培养的HT-29结肠癌细胞的取样管里原地拍摄的显微照片的图解，该癌细胞在装有离心血样的试管里被分离、目测识别和目测确认；
图8是在合适的成形显微镜仪器装置中采用200X油镜时，被添加至吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里的、培养的HT-29结肠癌细胞的取样管中拍摄的类似于图7的显微照片的图解，其中通过Cy3标记的E-钙粘着蛋白显示离心血样中的癌细胞；
图9是拍摄的被添加至吖啶橙染色的抗凝处理的全血中的培养的HT-29结肠癌细胞的显微照片的图解，并且血样中的该癌细胞在200X的放大倍数下分离、目测识别和目测确认；
图10是在200X的放大倍数下拍摄的吖啶橙染色的抗凝处理的全血样本里培养的HT-29结肠癌细胞的显微照片的、类似于图9的图解，其中通过Cy3-标记的E-钙粘着蛋白显示离心血样中的癌细胞；
图11是在吖啶橙染色的抗凝处理的血样本中检测到的、从已知患有转移性乳腺癌的病人处获得的循环乳腺癌细胞的显微照片的图解，该癌细胞在装有离心血样的试管中采用具有50X物镜的显微镜装置原地分离、目测识别和目测确认；
图12是类似于图11的图解，但显示通过Cy3-标记的E-钙粘着蛋白显现的离心血样中的循环乳腺癌细胞；
图13是拍摄的从已知患有转移性乳腺癌的病人处获得的循环乳腺癌细胞的显微照片图解，并且该癌细胞在装有离心血样的试管中在500X的放大倍数下原地分离、目测识别和目测确认；
图14是类似于图13的图解，但显示通过Cy3-标记的E-钙粘着蛋白显现的离心血样中的循环乳腺癌细胞。
具体实施方式
参见附图，图1是取样管和浮动装置的侧视图，在下文中一般称为“装置”，包括容纳有拉长的塑料插入物或者漂浮物4的透明取样管2。管2具有一以封盖10封闭的下末端6。管2可以是一种毛细管，或者它也可是如1992年2月11日授权的美国专利5,086,784所描述的一种稍大的管。管壁和插入物4之间的缝隙至少有大约十微米以便目标细胞能够进入。
图2是一种自动比色显微镜的仪器装置的示意图，该装置一般以数字12标记，它能够用于扫描装在如图1所示的装置中的离心血样，并且，无需人工干预，它能够在受扫描层里将不同类型的细胞比色(colorometrically)区分，以及形成、存储和传送受扫描细胞层的图像。仪器装置12包括一个台14，台14至少包含一个可旋转的支架16，支架16衔接着取样管2的末端并且在扫描取样管2的内容物时使取样管2能够绕着它的轴旋转。可逆的电动马达18在相反的方向选择性地旋转传动螺杆20，以便在一个方向轴向地移动管2，然后当在台14逐步地旋转管2时以相反方向移动。照这样，管2中整个内容物都能被扫描到。该仪器装置的自动化配备包括一个使用分光镜24和透镜26的CCD摄像机22，该摄像机在试管装置2内环形的样品容纳间隙上聚焦，这里的间隙定位在试管内壁和插入物4的外表面之间，形成一个界限明确的自由体积，其中所述的界限明确的自由体积具有一个基本等于预定功率下显微镜仪器的聚焦工作范围的横向厚度。透镜26的工作范围至少等于试管和试管2内插入物4之间的间隙的厚度，这是可以理解的，该横向厚度范围大约是10至100微米。CCD摄像机22通过一种复杂的、安装在一个选择性地旋转滤光轮上的各种发射光波滤光器28、30和32，来观察和记录样本的图像。仪器装置12也包括一种激发光源35，该光源产生一种通过分光镜24和聚焦透镜26的激发光束至取样管2上。一系列的激发光波滤光器36、38和40安装在一个选择性地旋转滤光轮上42上。分光镜24使激发光束朝透镜26偏转，并且透镜26将其聚焦到取样管2上。因而，像发射光源一样，34和42这两个滤光轮允许选择性地控制和改变激发光源的波长。一种预编程的微处理机控制器44对选择性地控制取样管2的旋转、滤光轮34和32的旋转以及CCD摄像机22的运行是切实可行的。这样，该控制器44使仪器装置12不需要人工干预就能够完全自动地运行。
为了捕捉和记录试管2内血样的扫描结果的图像以发现可疑的细胞、并且原地确认血样里观察到的可疑细胞的恶性或良性本质，扫描仪器装置12按下面的方式运行。取静脉的或毛细血管的抗凝处理的全血加入到取样管2和插入物4的装置里。在试管2里混合血样，或者在加入到试管2之前与荧光形态染色剂例如吖啶橙混合，以便可以分析在血样中观察到的有核细胞的形态特征。该血样也可与上皮细胞特异性的标记物混合，该标记物是用于判定血样里任何注意到的可疑细胞是否上皮起源的。由于所有化验的肿瘤癌细胞均是上皮细胞，所以选择此确认方法。对上皮细胞上的表面受体高度专一的抗原优选地是E-钙粘着蛋白。为了标记任何上皮细胞，我们优选使用与E-钙粘着蛋白直接偶联的Cy3。Cy3是一种在与吖啶橙不同的波长下发出荧光的标记物。将抗凝处理的全血、吖啶橙和E-钙粘着蛋白/Cy3的混合物在取样管插入装置里离心大约五分钟的时间。然后将离心过的样本放置到台14上的支架16上，并且开启仪器12。当样本通过摄像机22的聚焦平面旋转和前后往复运动时，CCD摄像机22将记录下离心全血样本部分的图像。这样通过摄像机22就拍摄了血样里目标区域的四周整个的图像。可以进行几种不同的扫描，这些扫描中的一种将能记录由滤光器28、30、32、36、38和40适当的组合所给定范围的血样图像，这里选择滤光器组合是为了使加入样本的吖啶橙染色剂发不同的荧光。该扫描拍摄在受扫描的血样区域里一切有核细胞的图像。另一种扫描将记录由滤光器28、30、32、36、38和40二次组合所给定范围的血样图像，这里选择滤光组合是为了使E-钙粘着蛋白、Cy3或者其它的标记物发不同的荧光。该扫描能拍摄在受扫描的血样区域里一切上皮细胞性有核细胞的图像。
为了进行取决于所寻求的额外细胞信息的额外扫描，可以采用额外的滤光器组合。这些额外的有用信息可包括额外的癌细胞特异性表位，该表位使细胞学家能够识别癌细胞的起源，即，它们是否是前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞，或其他癌细胞，这些癌细胞的表位信息目前是可以得到的，或者在将来会知道。上述的血样分析可以通过图2所示的仪器自动地进行，或者通过目测扫描样本完成。可以按任何顺序进行扫描步骤和扫描步骤的结果分析。扫描吖啶橙显现的细胞可让人识别扫描区内的一切有核细胞，并且也可让人分析该有核细胞的形态以识别任何看来似乎具有恶性形态的细胞。扫描E-钙粘着蛋白/Cy3显现细胞可让人识别扫描区内上皮细胞性有核细胞。确认离心血样内具有异常细胞形态(吖啶橙显现的)的上皮细胞(E-钙粘着蛋白/Cy3显现的)的存在，警告细胞学家血样捐献者癌性肿瘤可能性很强。为判定可疑的有核细胞是否血液祖细胞可以采用相似的方案。
参见图3-14，描述了以“QBC”装置、并且采用上述的技术获得的扫描血样光测图像的结果。
我们进行了一些实验，将培养的癌肿瘤细胞加入到血样里，以测试肿瘤细胞检测的上下限，验证区别性形态，和判定比量分析形成的血液组分的密度梯度内癌细胞的位置。这些实验证实了用于分离、分析和确认抗凝处理的全血血样里循环肿瘤癌细胞的存在的上述方法的准确性。
图3和4表示的记录图像是一种吖啶橙染色的培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-468(图3)和一种吖啶橙染色的培养结肠癌细胞系HT-29(图4)的形态外形，这里将培养的癌细胞系加入相应的100μl抗凝处理的全血样本中。然后按照本发明分析加料血样。该血样分析能可靠地和可重复地识别血样里培养的乳腺癌和结肠癌细胞。在靠近血小板-血浆分界面的血小板层里通常能看见这些细胞。在样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图5是单个的、相当大的吖啶橙染色的HT-29结肠癌细胞的记录图像，该细胞是从掺杂了低浓度的培养HT-29癌细胞的100μl血液样本里分离出的。在癌细胞右边的明亮层是血样里离心血小板层的分界面。该图是在500X的放大倍数下记录的。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图6类似于图5，但是表示的是通过E-钙粘着蛋白/Cy3滤光装置所观察到的分离的HT-29结肠癌细胞。值得注意的是，HT-29细胞清晰可见时，视野里一切其它的细胞均没有被显现，这样就确认了此大细胞是一种上皮细胞。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图7是较大群体的结肠癌细胞加到血样内时，在200X的放大倍数下拍摄的吖啶橙染色的培养HT-29结肠癌细胞记录图像的图解。用较大群体的结肠癌细胞，癌细胞看起来更广泛地、到处分布在血小板层里并且集中在几个位置，一个是在淋巴细胞-血小板分界面，另一个是在血小板-血浆分界面。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图8类似于图7，但是表示的是E-钙粘着蛋白/Cy3染色的结肠癌细胞的记录图像，该图可确认显现细胞是上皮起源。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图9和10是10X的放大倍数下拍摄的、添加到血样里的吖啶橙染色的培养HT-29结肠癌细胞的记录图像的图解。该癌细胞看起来集中在血小板-血浆分界面附近。图9表示经吖啶橙形态显现的癌细胞；图10表示经E-钙粘着蛋白/Cy3表位显现的癌细胞。这样图9可确认邻近离心血样血小板层的血浆层内有核细胞的存在；图10确认了检测到的有核细胞中的某些是上皮细胞。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图11和12是从已知患有转移性乳腺癌的病人处获得的血样里吖啶橙染色的循环乳腺癌细胞的记录图像的图解。该癌细胞看来集中在血小板-血浆分界面。图11表示表示经吖啶橙形态显现的癌细胞；图12表示经E-钙粘着蛋白/Cy3表位显现的癌细胞。这样图11可确认邻近离心血样血小板层的血浆层内有核细胞的存在；图12确认了检测到的有核细胞中的某些是上皮细胞。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。
图13和图14是从已知患有转移性乳腺癌的病人处获得的血样里吖啶橙染色的循环前列腺癌细胞的记录图像的图解。该癌细胞看来集中在血小板-血浆分界面。图13表示表示经吖啶橙形态显现的癌细胞；图14表示经E-钙粘着蛋白/Cy3表位显现的癌细胞。这样图13可确认邻近离心血样血小板层的血浆层内有核细胞的存在；图14确认了检测到的有核细胞中的某些是上皮细胞。样本里原地进行的显现细胞的目测分析确认这些细胞是恶性的。并非所有的细胞都被Cy3标记物显现的事实提供了一种内部的阴性对照，该阴性对照可确认表位显现细胞是上皮起源的。非表位显现的有核细胞是淋巴细胞。
还进行了测定上述检验的灵敏度的实验。标准的“ QBC”毛细管可容纳100μl的含有1×109个红细胞(RBC)和1×106个有核细胞(粒性白细胞、淋巴细胞，等等)的血液。这样，不必改变测试的规模，理论灵敏度是1×106个有核细胞中有一个癌细胞就可检测到。连续稀释HT-29结肠癌细胞以得到多对10μl含1和10个细胞的等分试样，或者含10和100个细胞的等分试样对。第一等分试样的一对加至“QBC”试管并且以标准血球计对第二等分试样计数。采用110μl的试管时，这些实验可得出这种结论，即该检验灵敏度接近1×106个有核细胞中有一个癌细胞就可检测到的理论灵敏度。通过在1ml的血液取样管中进行该分析可以将测试的理论灵敏度提高十倍。
尽管形态测定法的分析对癌细胞的识别或许是足够的，但其它的校验方法也可能是必需的。本发明的检验法利用这样的事实，即它能够检测到异常的细胞形态，并且也能够同时检验血样里任何注意到的有核细胞的是上皮或血液祖细胞起源的。由于本发明的分析方法对细胞是非破坏性的，为了附加的采用其它方法的分析，可以将该细胞从取样管中取出，例如以前技术里描述的PCR法，或者生化检验法。
例如我们选择E-钙粘着蛋白，因为该抗原对上皮细胞高度专一并且在细胞膜的外表面上显示。为了这些研究，我们使用Cy3，Cy3是一种氰氨荧光团，其直接与E-钙粘着蛋白单克隆抗体偶联以使染色细胞在一定波长下显现，该波长不同于采用吖啶橙产生荧光的形态测定法检测中使用的波长。
采用本发明的技术，我们已经确认可以以形态测定法识别抗凝处理的全血的离心血样里的恶性有核上皮细胞。可在试管装置里血样中原地目测的合适的形态测定标准包括：胞内核/细胞质比例；胞内核的大小和形态；胞内染色质的态式；核膜的厚度和大小；以及核仁的数目和大小及其它。我们也已经确认按照密度，上皮癌细胞和血液祖细胞在离心抗凝处理的全血样里分层，而根据大小在血样里沉积不分层。这个确认使得在离心血样里的一预定和已知的区域内，即，在血小板分层的离心血样的区域内，能够检测循环癌细胞和/或血液祖细胞。如果血样里的循环癌细胞和/或血液祖细胞根据大小沉积，人们将不能够确定一个可望发现癌和/血液学祖细胞的“目标区”。癌和/或血液祖细胞主要见于血小板/血浆分界面附近、淋巴细胞/血小板分界面附近的血小板层里，或者在人工过载的情形下的淋巴层里，而这一切取决于血样里癌和/或血液祖细胞的浓度。当采用一个100μl的含1×106个有核细胞的毛细管时，本发明技术的理论灵敏度是在100μl样本内的1×106个细胞里可检测到癌和/或血液祖细胞，该灵敏度是可以达到的。如上所述，如果提高该血样体积的十倍，到1毫升，将理论灵敏度提高十倍也是可行的。通过免疫荧光标记可疑细胞，在容器内原地识别所述自由体积中所有个别标记上皮细胞的一定百分比，可以确认血样中癌和/或血液祖细胞的检验。这样细胞的目测检测能确认它们是否显现出癌的形态测定特征，并且免疫荧光检验法能检验受检测的可疑细胞的起源。
为确认癌细胞的存在与否，上述方法和装置可用于筛查病人；可用于估计恶性肿瘤的发展阶段；可以用于评定癌症病人化疗的效力；以及可以用于血样里血液祖细胞的识别和计数，这些都是值得重视的。对于干细胞的收获和来自收获干细胞的癌细胞的清除，血液祖细胞和癌细胞的检测及计数具有重要的临床意义。用本发明作为一种评定化疗效力的工具，提供了一种具有比CAT扫描、X射线或类似的目前用于监控肿瘤大小的方法更高灵敏度和更加快速的疗效评价方法。通过计数血样中癌细胞的数目可以评定化疗的效力。可在试管明确区域的四周围进行该计数方法，或者在试管的上述区域中的一部分进行。采用后面一种方法时，可通过解下面的方程式推算出样本中癌细胞的数目：
C＝N(360°/d)÷V其中“C”是所得到的的细胞浓度；“N”是数过的目标细胞的数目；“d”是检测目标细胞的试管旋转角度，除以“V”的“V”是取样管体积。采用一种光度测定计数器或者目测可完成细胞的计数。该光度测定法可采用表位标记物的组合，该标记物可区别地显现癌细胞和/或血液祖细胞或者其它的非癌细胞。按这种方式，可以数出显现和/或非显现细胞。也可以用光度测定法进行形态测定分析。该目测法可以使用一种形态测定染色剂例如吖啶橙或者其他上面提到的形态测定染色剂。
诊断和计数循环血液里癌细胞的“QBC”技术和装置优于FACS和分子技术之处包括：1)进行血液分析所需的时间相对较短；2)该系统能与标准实验室设备配成一体，一切病理学家不需广泛的训练均能使用；3)在流动介质中可以检测非固定细胞以便消除固定的人工迹象；4)进行该分析仅仅需要比较少体积的血液；5)该技术与分子技术同样灵敏，因为在含106-107正常有核细胞的样本里的一个癌细胞都能被检测出；6)“QBC”技术采用了一种封闭取样和分析系统从而消除了交叉污染，这在分子方法里是一个大问题；7)消除了用于常规细胞学方法的固定化着色剂对浮动细胞的污染；8)由于进行该分析的技术人员不会暴露于待分析的血样，所以本发明的分析方法对他们更安全。
附图里的具体插入物和试管是圆柱形的；然而，它们也可以制成多边形的。对试管和插入横切面形状的唯一限制因素是它们彼此之间是互补的。采用显微镜仪器在合适的放大倍数下分析血样，优选装备了CCD摄像机的仪器。试管里管壁与插入物之间的横向间隙大小，要便于在间隙内能够分离、轻易地辨别、计数和形态分析单一的目标细胞。间隙的横向厚度也在用来分析间隙的显微镜仪器的焦点工作范围之内。
应认识到本发明的方法，就其更广泛的意义来说，包括检测装在试管内的抗凝处理的全血离心样本里个别循环目标有核细胞是否存在，该试管内也容纳一个一般为圆柱形的插入物，此插入物在试管内形成一个明确的环形区。把血液样本与一种或多种专一表位标记试剂结合，此试剂能在靶有核细胞上产生一种特征性信号，该结果可能包括完全没有信号，结果说明是否存在一种或多种位于目标有核细胞上的表位。也把血液样本与一种着色剂结合，该着色剂对显示血样里的一切有核细胞的细胞形态是可行的。这样通过细胞形态学可识别循环的有核细胞，并且由于其形态识别出的细胞可以作为目标细胞，对它们从表位上进一步鉴定，确定为目标或非目标细胞。作为进一步地解释，假定一个表位“A”和“B”的专一组合是目标细胞的特征，但不是血样里其它细胞的特征。这些表位中仅一个存在或不存在；或者两个表位一起存在或不存在都能是目标细胞的特征。这样，有A无B；有B无A；A和B都有；或者A和B都没有，四种不同的表位特异性标记物信号结果中的任何一种都可用于确认目标细胞的特征。识别和表征步骤能在试管里原地进行。显然，在目标细胞的表征中可采用比两个不同的表位更多，或者更少的表位。
由于在不脱离发明构思的情况下对本发明所公开的实施方案可以进行许多的变化和改进，所以其并不以附加权利要求之外的任何方式限制本发明。
Claims (12)
1.一种用于检测在抗凝处理的全血样品里个别循环上皮癌细胞是否存在的方法，所述的方法包括以下步骤：
a)提供一种含有一插入物的透明容器，所述容器和插入物的组合在插入物和容器的壁之间形成一个自由体积；
b)把血样与一种或多种表位特异性标记物结合以从血样里其他细胞中区分任何个别上皮癌细胞；
c)把血样与能显示血样内所有上皮癌细胞中的个别上皮癌细胞形态的着色剂结合；
d)把血样放置到容器中并且将容器中的血样离心以使血样里任何个别上皮癌细胞定位到容器中所述的自由体积；
e)对容器内自由体积里原地发现的任何区分出的上皮癌细胞计数；
f)在容器内自由体积里原地检测任何区分出的上皮癌细胞的细胞形态；
g)所述的结合步骤在放置血样到容器里之前或者之后进行；并且
h)在没有规定的次序下进行所述的计数和检测步骤。
2.一种用于检测容器内容纳的抗凝处理的全血离心血样中个别循环上皮癌细胞是否存在癌性细胞形态的方法，该容器也包含一个在容器内形成自由体积的插入物，所述的血样已与一种或多种对位于上皮细胞上的一种或多种表位专一的标记物结合，并且也已把所述的血样与能显示血样内上皮细胞中的个别上皮细胞形态的着色剂结合，所述的方法包括下列步骤：在容器内原地识别所述自由体积中所有个别标记上皮细胞的一定百分比，以及在容器内原地检测任何上述个别识别的上皮细胞的细胞形态以判定上述个别识别的任一上皮细胞是否呈现癌性细胞形态。
3.一种用于识别透明容器内容纳的抗凝处理的全血离心血样中个别循环癌性上皮细胞的方法，该容器也包括一个插入物，已把该血样与至少一种对至少一种上皮细胞表位专一的标记物结合，并且也已把该血样与一种能显示血样内一切有核细胞的细胞形态的着色剂结合，所述的方法包括下列步骤：检测容器中位于所述插入物和容器之间的自由体积，其中经过离心血样里的黄层成分已经沉降至此，以及在容器里原地对任何标记的具有癌性形态的个别上皮细胞计数，这些标记的上皮细胞在离心期间已沉降到容器里所述自由体积中。
4.一种用于在抗凝处理的全血样品里区分个别癌细胞与个别血液祖细胞及其它的有核细胞的方法，所述的方法包含以下步骤：
a)提供一种含表位细胞标记物的抗凝处理的全血样品，该标记物能将癌细胞与血液祖细胞和与样品里的其它有核细胞区分开，所述样品容纳在一个透明容器里，该容器还包含一个可在容器内形成一个界限明确的自由体积的插入物；
b)离心容器里的血液样品以便将血样按比重分离成它的组成成分并把任何作为非常规血细胞的有核细胞定位在容器里的所述界限明确的自由体积内，
c)检测容器内所述的界限明确的自由体积以判定是否有任何癌或造血祖细胞存在于容器里的所述界限明确的自由体积内。
5.一种用于对抗凝处理的全血样品内个别癌细胞和/或个别血液祖细胞计数的方法，所述的方法包含以下步骤：
a)提供一种含表位细胞标记物的抗凝处理的全血样品，该标记物能将癌细胞和/或血液祖细胞从样品里的其它有核细胞中区分开，所述样品容纳在一个透明容器里，该容器还包括一个可在容器内形成界限明确的自由体积的插入物；
b)离心容器里的血液样品以便将血样按比重分离成它的组成成分并把任何有核细胞定位在容器里的所述界限明确的自由体积内；
c)检测容器内所述的界限明确的自由体积以判定是否有任何区分出的表位标记的有核细胞存在于容器里的所述界限明确的自由体积内；和
d)对在容器内所述的自由体积里发现的任何个别癌细胞和/或个别造血祖细胞计数。
6.一种用于识别透明容器内容纳的抗凝处理的全血离心血样里的个别循环上皮癌细胞的方法，该容器还包含一个在所述容器内形成界限明确的自由体积的插入物，该血样已经与至少一种对至少一种上皮癌细胞表位专一的标记物结合，所述的方法包括下列步骤：检测容器中的所述界限明确的自由体积，其中在离心期间血样里的白细胞和血小板已经沉降至此，以及在容器里原地识别任何标记的个别上皮癌细胞，这些标记的细胞在离心期间已定位到容器里所述界限明确的自由体积中。
7.一种用于检测抗凝处理的血样里个别循环有核细胞是否存在的方法，所述的方法包括下列步骤：
a)提供一种容器中含有插入物的孔的透明容器，所述的容器和插入物的组合在容器的孔内形成一界限明确的自由体积；
b)把血样与一种或多种表位特异性标记物结合以便差异性地显现血样里个别有核上皮细胞；
c)把血样与可显示血样内一切个别有核细胞的细胞形态的着色剂结合；
d)把血样放置到容器里并且将容器里的血样离心以便使血样里任何个别有核上皮细胞聚集到所述容器里的自由体积中；
e)对容器内自由体积里原地发现的任何标记的个别上皮细胞计数；
f)在容器内自由体积里原地检查任何个别标记细胞的细胞形态；
g)所述的结合步骤在把血样放置到容器里之前或者在其之后进行；并且
h)在没有规定的次序下进行所述的计数和检查步骤。
8.权利要求7的方法，其中用一种显微镜仪器进行所述的计数和检查步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述的界限明确的自由体积具有一个基本等于预定功率下显微镜仪器的聚焦工作范围的横向厚度。
10.权利要求9的方法，其中所述的横向厚度范围大约是10至100微米。
11.一种用于检测抗凝处理的血样里个别循环有核造血祖细胞是否存在的方法，所述的方法包括下列步骤：
a)提供一种容器内含插入物的孔的透明容器，所述容器和插入物的组合在所述插入物和容器孔的壁之间形成一个自由体积，该自由体积具有至少10微米的横向厚度；
b)把血样与一种或多种对造血祖细胞的表面受体专一的标记物结合以便从血样中其他形成成分中区分出个别造血祖细胞；
c)把血样与能显现血样内一切有核细胞的细胞形态的着色剂结合；
d)把血样放置到容器里并且将容器里的血样离心以便使血样里个别造血祖细胞聚集到所述的容器里的自由体积中；
e)在一定放大率下对容器内自由体积里原地发现的个别区别出的造血祖细胞检查和计数；
f)在一定放大率下于容器内自由体积里原地检查个别区别出的细胞的细胞形态；
g)所述的结合步骤在放置血样到容器里之前或者之后进行；并且
h)在没有规定的次序下进行所述的计数和检查步骤。
12.一种用于检测容器内容纳的抗凝处理的全血离心血样里的个别循环癌细胞是否存在的方法，该容器也包括一个在容器内形成界限明确自由体积的插入物，所述的血样已与一种或者多种能在个别癌细胞上发生特征性信号结果的表位特异性标记物结合，该结果是由个别癌细胞上的一种或多种表位是否存在所构成，并且已把所述的血样与能显现血样内一切有核细胞的细胞形态的着色剂结合，所述的方法包括下列步骤：通过细胞形态识别位于所述明确环形自由体积中的一切有核细胞，并且进一步用表位表征所有识别的个别有核细胞为癌细胞或者非癌细胞，所述的识别和表征步骤均在容器里原地进行。
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