ES2227830T3 - Cepa del microorganismo penicillium oxalicum var. armeniaca y su aplicacion. - Google Patents

Cepa del microorganismo penicillium oxalicum var. armeniaca y su aplicacion.

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Abstract

Cepa del microorganismo Penicillium oxalicum var. Armeniaca y su aplicación. La invención se refiere a una nueva cepa de un hongo, que tiene la propiedad de producir un colorante rojo que se puede aplicar como colorante en la industria alimentaria y cosmética. Al cultivar en un caldo la cepa descrita, perteneciente a la especie Penicillium oxalicum, ya sea líquido o sólido, se observó ya el segundo día de la incubación un incremento en la síntesis de un colorante rojo que se liberaba dentro del caldo. El rendimiento del colorante rojo purificado es del orden 1, 5 a 2 g a partir de 1 litro del caldo nutriente. En el caldo mineral de Czapek, la cepa suele formar colonias crecientes que alcanzan de 2 a 2, 5 cm el tercer día de incubación, y hasta 4, 5 cm del quinto al sexto día. Las colonias son no unciformes, aterciopeladas, las hifas son cortas, esporulantes, con una superficie frágil y se disgregan. Si se agita en un recipiente con un cultivo maduro, lo característico de los conidios es quese separen en bloque. No aparece ningún efecto de zona. El micelio es corto, de color verde claro, que se vuelve verde oscuro a medida que va creciendo el cultivo. El color blanco del borde de la colonia creciente tiene una anchura de 1 a 2 mm. El lado contrario de la colonia se vuelve rojo, y dicho color rojo se vuelve más intenso durante el crecimiento del cultivo y se difunde en agar, que se colorea intensamente mostrando un color rojo llamativo.

Description

Cepa del microorganismo Penicillium oxalicum var. Armeniaca y su aplicación.
La invención se refiere a una nueva cepa de un hongo, que tiene la propiedad de producir un colorante rojo que se puede aplicar como colorante en la industria alimentaria y cosmética.
En la industria alimentaria y cosmética existe la necesidad de colorantes que se puedan disolver bien en los componentes de los productos respectivos, cuyo color no presente un efecto batocrómico y que sean estables al hervir.
La invención consiste en la cepa Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242.
Al cultivar en un caldo la cepa descrita, perteneciente a la especie Penicillium oxalicum, ya sea líquido o sólido, se observó ya el segundo día de la incubación un incremento en la síntesis de un colorante rojo que se liberaba dentro del caldo. El rendimiento del colorante rojo purificado es del orden 1,5 a 2 g a partir de 1 litro del caldo nutriente.
La cepa se depositó en International Depositary Autority CCM - Czech Collection of Microorganisms of the Masaryk University, Tvrdého 14, 602 00 Brmo, República Checa (Autoridad Depositaria Internacional CCM - Colección Checa de Microorganismos de la Universidad Masaryk), el 19 de Marzo de 1998 con el número de acceso CCM 8242.
Esta cepa forma conidióforos cortos, de dimensiones iguales a 60-70 veces 5 a 6 \mum. Cada palo de escoba (broomstick) comprende de 2 a 7 conidios. Los conidios son de forma redonda, tienen un diámetro de 15 a 20 \mum, con una superficie lisa dorada y se desintegran fácilmente durante el examen microscópico.
En el caldo mineral de Czapek, la cepa suele formar colonias crecientes que alcanzan de 2 a 2,5 cm el tercer día de incubación, y hasta 4,5 cm del quinto al sexto día. Las colonias son no unciformes, aterciopeladas, las hifas son cortas, esporulantes, con una superficie frágil y se disgregan. Si se agita en un recipiente con un cultivo maduro, lo característico de los conidios es que se separen en bloque. No aparece ningún efecto de zona. El micelio es corto, de color verde claro, que se vuelve verde oscuro a medida que va creciendo el cultivo. El color blanco del borde de la colonia creciente tiene una anchura de 1 a 2 mm. El lado contrario de la colonia se vuelve rojo, y dicho color rojo se vuelve más intenso durante el crecimiento del cultivo y se difunde en agar, que se colorea intensamente mostrando un color rojo llamativo.
En el agar de malta como caldo orgánico, las colonias son grandes con un micelio corto de color verde claro. Durante el crecimiento de la cepa no aparece biosíntesis de color rojo o se produce únicamente de forma leve.
En un caldo orgánico representado por agar-infusión de col o agar-infusión de patata, se forman rápidamente colonias crecientes que tienen un diámetro de 5 a 7 cm. El micelio es frágil, verde. Aparece una mayor producción de conidios de color amarillo-dorado. Durante el crecimiento del cultivo, el lado contrario de la colonia adquiere una coloración roja y el colorante se difunde en el agar, que adquiere entonces un color rojo intenso.
La pigmentación del lado contrario de la colonia comienza el segundo día de la incubación de la cepa y llega a su máximo en un cultivo de 7 días. Con un valor de pH del caldo inferior a 3 y superior a 9, con un crecimiento standard del cultivo, se detiene la biosíntesis del colorante rojo o se produce de forma muy ligera. El valor óptimo del pH para la producción del colorante rojo es de 5,6 a 6,2. No se aprecia olor ni exudado.
La cepa hidroliza almidón intensamente; no diluye la gelatina y no peptoniza la leche.
Absorbe el nitrógeno orgánico en forma de amino ácidos: asparagina, valina, serina y tirosina.
Son fuentes excelentes de nutrición sacardica: L-(+)- maltosa, L-(+)-arabinosa, D-(+)-sor-bitol y D-(+)-manitol.
En cuanto a los ácidos orgánicos, absorbe los ácidos succínicos, lácticos y maléicos.
La temperatura óptima para cultivar hongos y para la biosíntesis del colorante es de 27 a 29ºC. La cepa de producción se multiplica también a la temperatura de 37 a 38ºC y no pierde la propiedad de formar el pigmento. La cepa del hongo de producción se mantiene por medio de un método de reinoculaciones periódicas en probetas en paquetes de caldo agarizado de col en un frigorífico a la temperatura de +4 a +5ºC. El período de reinoculación es de 2 a 3 meses.
Otro aspecto de la invención consiste en un método para el cultivo de la cepa del microorganismo Penicillium oxalicum var. Armeniaca, en el que la cepa de producción antes citada se cultiva a una temperatura de 25 a 30ºC, de preferencia 27 a 29ºC, a una presión manométrica de 50 a 80 kPa (0,5 a 0,8 atmósferas), ventajosamente con mezcla continua a 280 rpm, con aire suministrado en una proporción de 1,2 volúmenes de aire para 1,0 volumen de caldo, en un caldo de pH 3 a 9, de preferencia pH 5,8 a 6, 2, que contiene carbohidratos, de preferencia de 1,5 a 1,8% en peso y nitrógeno amoniacal, de preferencia de 0,66 a 0,69% en peso, durante 60-72 horas, de preferencia durante 64 a 68 horas y posteriormente se quita el líquido del caldo nutriente y se aisla el colorante rojo resultante de dicho líquido.
El colorante obtenido se puede utilizar como colorante para alimentos o colorante cosmético.
El colorante es un polvo cristalino de color rojo oscuro, de color rojo frambuesa en solución acuosa. No se aprecia olor ni sabor en forma cristalina o en solución.
Su punto de fusión es de 127ºC (descomposición). No es soluble en agua, es soluble en una solución alcalina (pH 9,0 a 9,5) y en alcohol etílico. Se disuelve bien en clara de huevo, en grasas y en ácido acético concentrado. El color del colorante no cambia con el valor del pH, lo cual significa que no existe efecto batocrómico. Tiene una elevada estabilidad a la luz y resistencia con respecto a la temperatura. No se produce ningún cambio de color mientras se hierve en soluciones durante 5 horas a 100ºC. Absorbe la luz dentro del espectro visible (X_{max} = 435 mm y 502 mm). La proporción de picos es de 1,0 a 1,5.
Los resultados analíticos por espectroscopia de masas revelaron que el colorante rojo producido comprende derivados de antraquinona, por ejemplo un derivado de fórmula
1
que tiene como fórmula empírica C_{25}H_{26}O_{14} y un peso molecular de aproximadamente 550. Los espectros ultravioleta, infrarrojo y de masa han confirmado una estructura de antraquinona.
La multiplicación del cultivo de la cepa de producción se realiza en probetas con infusión de col agarizada como caldo utilizando el método de reinoculación periódica desde mazos (bunches) operativos.
El caldo anterior se puede preparar por ejemplo de la siguiente forma:
Se añaden 200 a 300 g de col finamente rallada a un litro de agua potable y se hierve durante 20 minutos. Después de enfriar hasta la temperatura de 50ºC, se filtra la solución. El filtro se completa hasta 1 litro y se añaden 20 g de agar-agar. La esterilización del caldo se realiza a 70-80 kPa (0,7 a 0,8 atmósferas) durante 20 minutos. El caldo preparado se divide en probetas estériles de 6 a 8 ml de 18 x 150 mm, a una temperatura de 50 a 55ºC y se esteriliza en autoclaves en las siguientes condiciones: temperatura 116ºC, presión de vapor 100 kPa (1,0 atmósferas), periodo de esterilización 20 minutos.
Después de haberlas esterilizado, las probeta se secan de antemano con el caldo agarizado en un termostato a una temperatura de 37ºC durante 1 día. Los mazos terminados se inoculan con el cultivo de la cepa de producción y se deja madurar a la temperatura de 27 a 29ºC. El período de incubación es de 5 días.
Las colonias activas de los microorganismos se recolectan por medio de reinoculaciones ulteriores de esporas en una placa de Petri con la infusión de col agarizada. Una base para la selección de las colonias activas es la intensidad de color de las colonias de un diámetro mínimo de 0,5 a 1 cm, con superficie lisa y una zona de crecimiento de como mínimo 0,1 a 0,2 cm. Las colonias activas se recolectan en la infusión de col agarizada.
Desde el punto de vista de sus propiedades morfológicas y culturales, la cepa de hongo recuperada se parece mucho a la especie Penicillium oxalicum (según I.M. Pidoplichko, 1972).
Es posible realizar el cultivo de la cepa de producción de la invención en fermentadores, en caldos líquidos, mediante el método sumergido. La cantidad de material inoculado es de 3 a 7% en peso. Después de la inoculación, se utilizan mazos operativos con un cultivo de 5 días incubado en una infusión de col.
El cultivo del material de siembra se realiza a la temperatura de 27 a 29ºC dentro de las 64 a las 68 horas.
Las condiciones óptimas para realizar el procedimiento de la síntesis microbiológica incluye la temperatura de 27 a 29ºC, la mezcla continua con velocidad periférica de aproximadamente 280 min^{-1}, el suministro de aire en una proporción de 1,2 volúmenes de aire para 1,0 volumen de cultivo, una presión manométrica en el fermentador operativo de 50 a 80 kPa (0,5 a 0,8 atmósferas).
Ya después de fermentar el microorganismo de producción durante 30 a 35 horas, el líquido por encima del cultivo se vuelve rojo y la intensidad del color rojo se encuentra en su máximo -fuerte color de cereza- tras un periodo de incubación de 68 a 72 horas.
Como componentes del caldo se utilizan carbohidratos, varios sacáridos, alcoholes polifuncionales e hidrocarburos y también residuos de la producción de azúcar -melaza- en cantidades de 10 a 20 g por cada litro de agua.
Para suministrar nitrógeno se puede utilizar extractos de maíz, autolizado o extracto de levadura y también compuestos que contiene nitrógeno en diversas formas (como amino ácidos) en una cantidad de nitrógeno de 0,5 a 0,7% en peso.
Los valores óptimos del caldo son los siguientes: pH 5,8 a 6,2, contenido de carbohidratos 1,5 a 1,8% en peso, contenido de nitrógeno amoniacal 0,66 a 0,69% en peso.
Ejemplos Composición del caldo Ejemplo 1
Azúcar granulado 12 a 20 g/l
Extracto de maíz 5 a 10 g/l
Sulfato de zinc 0,0002 g/l
Sulfato de magnesio 0,001 g/l
Ejemplo 2
Azúcar granulado 12 a 20 g/l
Extracto de levadura 5 a 10 g/l
Sulfato de zinc 0,0002 g/l
Sulfato de magnesio 0,001 g/l
Ejemplo 3
Melaza 12 a 20 g/l
Extracto de maíz o de levadura o autolizado 5 a 10 g/l
Sulfato de zinc 0,0002 g/l
Sulfato de magnesio 0,001 g/l
El caldo en el fermentador operativo se inocula con un cultivo de dos días de Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, que se ha cultivado en un dispositivo de inoculación. La cantidad del material de inoculación asciende de 3 a 7% en volumen del caldo.
Separación del sobrenadante del cultivo de la biomasa del hongo.
Una vez terminada la biosíntesis del colorante rojo, se filtra el líquido del caldo o se centrifuga para separarlo de la biomasa. Para precipitar el colorante, se acidifica el líquido hasta un pH de 3,0 a 2,5. La acidificación se puede realizar utilizando cualquier ácido orgánico o inorgánico. La precipitación se puede realizar con sulfato potásico de aluminio AlK_{2} (SO_{4})_{3}. Se obtiene por lo tanto un colorante insoluble en bases y alcoholes. Es soluble en una solución alcalina, a un pH de 9,0 a 10,0. Tras la precipitación, se separa el colorante del líquido por centrifugación.
Ejemplo 4
El precipitado se disuelve en etilalcohol y se filtra. Se quita el alcohol y se obtiene el colorante en forma cristalina.
Ejemplo 5
Se disuelve el precipitado en solución de amoniaco a un pH de 9,0 a 10, 0. Se obtiene una solución acuosa al 5-50% de un colorante rojo.
Posibilidad de aplicación industrial
El producto final de la tecnología según la invención es un colorante rojo, de origen microbiológico destinado a las industrias alimentaría y cosmética.

Claims (3)

1. La cepa Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242.
2. Método para el cultivo de la cepa según la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza a la temperatura de 25 a 30ºC, a una presión manométrica de 50 a 80 kPa (0,5 a 0,8 atmósfera), en un caldo de pH 3 a 9, que contiene carbohidratos y nitrógeno amoniacal, durante 60 a 72 horas, y el colorante rojo así producido se aisla del caldo nutriente.
3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque el cultivo se realiza a la temperatura de 27 a 29ºC, a una presión manométrica de 50 a 80 kPa (0,5 a 0,8 atmósfera), con mezcla continua a una velocidad periférica de 280 rpm, con una aportación de aire en una proporción de 1,2 volúmenes de aire por 1,0 volumen de caldo, que tiene un pH de 5,8 a 6,2 y contiene de 1,5 a 1,8% en peso de carbohidratos y de 0,66 a 0,69% en peso de nitrógeno amoniacal, durante 64 a 68 horas.
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