ES2225186T3 - Procedimiento de preparacion de un producto lacteo imunoestimulante y sus aplicaciones. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de un producto lacteo imunoestimulante y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Cepa de Bifidobacterium breve, depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), el 31 de mayo de 1999, con el número I-2219.
Description
Procedimiento de preparación de un producto
lácteo inmunoestimulante y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a la utilización
de bifidobacterias para la preparación de alimentos lácteos
inmunoestimulantes especialmente aptos para la alimentación
infantil: alimentos que pueden presentarse en forma de líquido o
polvo.
El género Bifidobacterium forma parte de
la familia de las Actinomycetaceae; reúne bacilos Gram
positivos, anaerobios estrictos, que fermentan la glucosa por la
vía de la fructosa 6-fosfato fosfocetolasa. Su pH
óptimo de crecimiento se encuentra entre 6 y 7, y su temperatura
óptima de crecimiento se encuentra entre 37 y 40ºC.
Las bifidobacterias forman parte de la flora
intestinal humana normal, y se les reconocen numerosos efectos
beneficiosos para la salud.
Por ejemplo, se ha propuesto la utilización de
las bifidobacterias que producen una ureasa para reducir la
concentración de urea en los líquidos fisiológicos en el caso de
enfermedades renales (Solicitud FR 2 560 046, a nombre de SCHULER
R. y SCHULER A.).
Asimismo, se sabe que los lactantes alimentados
con el pecho, que poseen una flora intestinal en la que predominan
las bifidobacterias, resisten mejor las infecciones y presentan,
especialmente, un menor riesgo de diarrea que los lactantes
alimentados mediante preparados lácteos industriales.
No se ha esclarecido totalmente el papel de las
bifidobacterias en esta mayor resistencia a las infecciones. Se ha
publicado que dichos efectos beneficiosos estaban asociados a la
presencia de bifidobacterias viables y capaces de implantarse en el
tubo digestivo, por lo que se ha propuesto utilizar bifidobacterias
vivas en compuestos antidiarreicos (Patente US 5 902 578, a nombre
de Laboratorios Abbott), especialmente bifidobacterias seleccionadas
sobre la base de su capacidad de supervivencia durante su
conservación y tras la ingesta (Patente US 5 711 977, a nombre del
Instituto para el Desarrollo y la Investigación en la Industria
Alimenticia (Taiwán)), así como sobre la base de su capacidad de
implantarse en la flora intestinal, en detrimento de las bacterias
patógenas (Solicitud EP 0 577 904, a nombre de la Sociedad de
Productos NESTLE).
Otros estudios indican que algunas
bifidobacterias podrían tener un poder inmunoestimulante, que
implicaría a sustancias polisacarídicas asociadas a la pared
bacteriana o segregadas por las bacterias en el transcurso de la
fermentación anaeróbica. GOMEZ y otros [FEMS Microbiol. Lelt., 56,
47-52, (1988)] describen el efecto inmunomodulador
de fracciones exocelulares ricas en polisacáridos producidos por
Bifidobacterium adolescentis; la Solicitud FR 22 652 590, a
nombre de Laboratorios OM, describe un exopolímero
inmunopotenciador de naturaleza polisacarídica producido por
Bifidobacterium infantis longum; HOSONO y otros [Biosci,
Biotech, Biochem, 61, 312-316 (1977) y Bioscience
Microflora, 17, 97-104, (1998)], describen unos
polisacáridos inmunopotenciadores producidos por distintas especies
de Bifidobacterium. La acción inmunomoduladora de las
bifidobacterias se manifiesta asimismo mediante la regulación de la
microflora intestinal, especialmente en detrimento del desarrollo
de especies bacterianas patógenas. ROMOND y otros [Anaerobe, 3,
137-143, (1997), y J. Dairy Sci., 81,
1229-1235, (1998)] describen, de este modo,
fracciones ricas en glicoproteínas, producidas por
Bifidobacterium breve en condiciones de fermentación
anaeróbica, induciendo un efecto regulador in vivo de la
microflora intestinal.
En el mercado se encuentran numerosos productos
fermentados mediante bifidobacterias, asociadas posiblemente a otras
bacterias lácticas, cuya ingesta permite beneficiarse de los
efectos inmunoestimulantes de las bifidobacterias y sus productos
de fermentación.
Sin embargo, en el caso de la alimentación
infantil, estos productos fermentados tienen el inconveniente de
ser demasiado ácidos y presentar, especialmente en el caso de los
productos en polvo, un aspecto no homogéneo tras su reconstitución,
debido a la coagulación de las proteínas de la leche por medio de
la acidez generada durante la fermentación. Por ello, no suelen
gozar de gran aceptación por los niños y las madres.
Pero, los Inventores han descubierto
recientemente un cepa de bifidobacterias capaz de producir
sustancias dotadas de propiedades inmunoestimulantes, efectuando
dicha producción sin fermentación y, por ello, sin acidificación
del producto final.
Esta cepa de Bifidobacterium breve, objeto
de la presente invención, ha sido depositada, según el Tratado de
Budapest, el 31 de mayo de 1999, con el número
I-2219 en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos), gestionada por el Instituto Pasteur, 25 rue du
Docteur Roux, en París.
Dicha cepa posee las siguientes
características:
- Morfología: bacilos cortos con raras formas en Y y V
- Metabolismo: anaeróbico; producción de ácido acético y láctico L(+)
- Fermentación de azúcares: glucosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa, lactosa, esculina, ribosa, manitol, sorbitol, D-rafinosa, melibiosa.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento de preparación de un producto lácteo
inmunoestimulante, caracterizado porque se efectúa la bioconversión
de un substrato lácteo por medio de un cultivo de la cepa de
Bifidobacterium breve I-2219, mediante
mantenimiento de dicho substrato en contacto con dicho cultivo, en
condiciones desfavorables para la fermentación mediante dicha
cepa.
Se entiende por "condiciones desfavorables para
la fermentación" aquellas condiciones en las que la
acidificación del medio por dicha cepa no excede 0,5 unidades pH en
8 horas de incubación, para un sembrado inicial 1 al 5 x 10^{7}
UFC por ml. Éstas pueden determinarse fácilmente por parte del
especialista del oficio mediante simples pruebas, variando
especialmente la ventilación del medio de cultivo, su presión
osmótica y/o la temperatura de cultivo, y midiendo el pH al inicio
y al final del cultivo.
Tales condiciones pueden obtenerse, en
particular, mediante:
- -
- el mantenimiento en condiciones aeróbicas, por ejemplo mediante agitación;
- -
- el mantenimiento del medio a una presión osmótica correspondiente a entre 0,93 y 0,97 de actividad del agua (AW);
- -
- el mantenimiento a una temperatura de 40 a 48ºC;
así como combinaciones de estas distintas
condiciones.
La puesta en contacto del substrato lácteo con
las Bifidobacterium puede efectuarse a razón de 1 x 10^{7}
a 1 x 10^{9} UFC por ml de substrato lácteo, siendo la población
final de Bifidobacterium al término de la reacción de
bioconversión de entre 1 x 10^{5} y 1 x 10^{9} UFC por ml de
producto.
El pH del substrato lácteo en el momento de su
puesta en contacto con las bacterias es preferiblemente de 6,3 a 7,
y el pH del producto al término de la reacción de bioconversión es
preferiblemente de 6 a 7.
Según las condiciones utilizadas, el tiempo de
contacto entre el substrato lácteo y las bacterias será de entre 6
y 24 horas.
El substrato lácteo puede ser leche o cualquier
medio a base de leche, pudiendo tratarse, por ejemplo, de un
concentrado de leche, una base para alimento lácteo infantil, una
base para yogur, etc.
Se puede añadir al medio a base de leche los
ingredientes necesarios para la realización del producto listo para
consumir que se desea obtener. Si, por ejemplo, se desea obtener un
alimento lácteo para lactantes, se añade lactosa, maltodextrina,
minerales, vitaminas, materias grasas, ingredientes que permiten
reconstituir la composición de la leche materna. Si se desea, las
materias grasas se incorporan y homogeneizan con la solución, para
obtener una emulsión estable.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un producto lácteo líquido caracterizado porque puede obtenerse
aplicando un procedimiento de conformidad con la invención.
Este producto presenta preferiblemente, al
término de la reacción de bioconversión, un pH de entre 6 y 7.
A título de comparación, los productos de la
técnica anterior obtenidos mediante fermentación con
Bifidobacterium tienen, al final de la fermentación, un pH
de entre 4 a 4,6.
Este producto puede consumirse tal cual, o
recibir distintos tratamientos, cuya naturaleza varia según el
producto listo para consumir que se desea obtener. Por ejemplo, se
pueden añadir agentes de textura, sabor, suplementos vitamínicos o
minerales, materias grasas, etc., si no se han añadido ya en el
medio inicial. También puede concentrarse o diluirse.
Un producto lácteo de conformidad con la
invención puede servir como base para la preparación de alimentos
lácteos frescos.
Ventajosamente, también puede utilizarse para la
preparación, mediante esterilización y/o deshidratación, de
alimentos de larga conservación. En efecto, conserva sus
propiedades inmunoestimulantes incluso en la ausencia de bacterias
vivas, por ejemplo mediante desecación y esterilización UHT.
La presente invención incluye asimismo los
alimentos lácteos frescos, esterilizados o deshidratados obtenidos
a partir de un producto lácteo de conformidad con la invención.
\newpage
Asimismo, incluye los alimentos lácteos
reconstituidos obtenidos mediante adición de agua a los alimentos
lácteos deshidratados, de conformidad con la invención.
Los alimentos lácteos (frescos, esterilizados o
reconstituidos) conformes a la invención tienen generalmente un pH
de entre 6 y 7,5, preferiblemente entre 6,5 y 6,9.
Al contrario que los alimentos resultantes de la
fermentación mediante Bifidobacterium conocidos en la técnica
anterior, los alimentos lácteos de la invención no son ácidos y
contienen las proteínas de la leche en forma soluble, no coagulada.
Mediante adición de agua a los alimentos lácteos deshidratados de
la invención se puede obtener un producto homogéneo, sin
precipitación o separación de fase.
Los alimentos lácteos de la invención, debido a
su efecto inmunoestimulante, proporcionan una protección contra las
infecciones microbianas y víricas comparable a la de los alimentos
resultantes de la fermentación mediante Bifidobacterium
conocidos en la técnica anterior, sin presentar los inconvenientes
de estos últimos en términos de modificación del sabor y el aspecto
del producto. Están especialmente bien adaptados a la alimentación
infantil, en particular la alimentación de los lactantes, pudiendo
también utilizarse para la alimentación de sujetos de cualquier
edad.
La presente invención se entenderá mejor gracias
a la siguiente descripción adicional, que se refiere a ejemplos de
preparación de productos lácteos según la invención.
Se prepara un concentrado de leche cuya
composición, expresada en g por 100 g de extracto seco, es la
siguiente:
Proteínas de la leche (80% de caseína y 20% de proteínas de suero) | 13 |
Materia grasa vegetal | 25,5 |
Lactosa | 42,25 |
Maltodextrinas | 16 |
Minerales | 3 |
Vitaminas | 0,25 |
Se añade la materia grasa vegetal a leche de vaca
desnatada, calentada a 75ºC. Se homogeneiza a la misma temperatura
en 2 etapas, la primera a 200 kg/cm^{2}, y la segunda a 50
kg/cm^{2}. A continuación, se añade la lactosa y las
maltodextrinas, previamente disueltas en agua, y las soluciones de
vitaminas y minerales.
La mezcla final se pasteuriza a 115ºC, y se
concentra mediante evaporación al 48% de extracto seco.
A continuación, el concentrado enfriado a 37ºC se
siembra a razón de un 5% con un cultivo de B. breve
I-2219, con un contenido de 10^{9} bacterias/ml.
El pH inicial es de 6,15 y la presión osmótica es de 0,96.
Tras incubación durante 8 h a 37ºC, en un tanque
con aire con agitación periódica de 10 minutos cada 2 horas, el pH
es de 6,1 y la población de B. breve es de 10^{6}
bacterias/ml. La acidez Dornic es de 48ºD.
El concentrado se seca mediante atomización. El
polvo obtenido, añadido a agua a razón de 140 g por litro de agua,
permite obtener una leche reconstituida que posee las siguientes
características: pH 6,6, acidez Dornic 12ºD; aspecto de leche
líquida sin presencia de cuajado.
Se prepara una mezcla cuya composición (en
g/litro) es la siguiente:
Proteínas | 21 |
Materia grasa | 24 |
Carbohidratos | 83 |
Minerales | 5 |
Vitaminas | 0,45 |
Esta mezcla se prepara a partir de los siguientes
ingredientes (para 100 litros de producto acabado):
- 58 litros de leche desnatada,
- 2,4 kg de materia grasa,
- 4,7 kg de lactosa,
- 0,7 kg de maltodextrinas,
- 0,3 kg de vitaminas,
- 0,05 kg de un complejo mineral.
Previamente, se trata la leche térmicamente en un
sistema UHT, a una temperatura de entre 115 y 120ºC.
A la leche enfriada a 70ºC, se incorpora la
materia grasa y se procede a una homogeneización en 2 etapas, 200
kg durante la 1ª etapa, y 50 kg en la 2ª etapa.
Se enfría la mezcla hasta los 37 - 38ºC, y se
siembra al 1,5% con un cultivo de CNCM I-2219, con
entre 1 y 5 x 10^{9} bacterias/ml.
Se incuba a 37ºC durante 8 horas, en las
condiciones indicadas en el ejemplo 1 anterior, y se procede al
enfriamiento hasta los 5ºC.
El pH del producto es de 6,3 y la población de
B. breve es de 3 x 10^{7} bacterias/ml. La acidez Dornic
es de 23ºD.
El resto de ingredientes se disuelve en alrededor
de 50 litros de agua, y se añade al producto obtenido al término de
la incubación.
La mezcla así realizada se somete a un
tratamiento UHT a 140ºC durante 6 a 7 segundos, antes de
acondicionarse asépticamente.
Se ha estudiado el efecto inmunoestimulante de
los preparados lácteos de la invención, de la siguiente manera:
- -
- mediante la flora fecal en ratones con flora humana;
- -
- mediante la regulación del fenómeno de translocación en ratones monogénicos con Clostridium perfringens.
Los ratones son del linaje C3H con flora humana
adulta.
Se trata de la generación G1, siendo la
generación G0 ratones agénicos asociados, en la edad adulta, a la
flora humana.
- Número de ratones por lote: 6
- Número de pruebas: 2 por producto.
Los ratones se mantienen durante 1 semana en una
misma jaula, y se reparten a razón de 6 por jaula.
La edad de los ratones al inicio de las pruebas
es de entre un mínimo de 8 semanas y un máximo de 11 semanas.
En la flora fecal, se efectuará un seguimiento
sobre:
- las Bifidobacterias,
- los Bacteroides Fragilis,
- las esporas de Clostridia,
- las posibles esporas de Cl.
perfringens.
La muestra fecal se extrae extemporáneamente, se
pesa asépticamente y se diluye en solución
pre-reducida de RINGER (diluida a la cuarta parte y
con adición de clorhidrato de cisteína a 0,3 g/l).
Recuento de las bifidobacterias y los
bacteroides fragilis en medios pre-reducidos
de BEERENS y BBE, sembrados directamente e incubados en
anaerobiosis.
Para la búsqueda de las esporas de
Clostridium:
- -
- se calientan las suspensiones durante 10 minutos a 75ºC y se siembran sobre gelosa Columbia con adición de glucosa (5 g/l) y clorhidrato de cisteína (0,3 g/l), y se incuban durante 5 días,
- -
- las colonias de Clostridium se detectan por su morfología y una reacción negativa a la catalasa. La morfología celular se determina tras coloración Gram 3.
Los resultados obtenidos con un preparado lácteo
testigo sembrado con el fermento CNCM I-2219 y
administrado inmediatamente se ilustran en la Tabla I siguiente
(tiempo de contacto = 0).
T 0 | T 7 días | T 15 días | |
Bifidobacterias | 8,2 \pm 0,3 | 9,3 \pm 0,1 | 8,6 \pm 0,1 |
Bacteroides fragilis | 7,2 \pm 0,5 | 9,3 \pm 0,1 | 9,2 \pm 0,1 |
Clostridium | 4,3 \pm 0,1 | 5,1 \pm 0,5 | 6,7 \pm 0,3 |
Los resultados se expresan en logaritmo y las
cifras representan la media de los resultados de los 6 ratones; se
observa un incremento significativo de Bacteroides fragilis y
de Clostridia, por lo que existe un riesgo infeccioso.
Los resultados obtenidos con un preparado lácteo
de conformidad con la invención, sembrado y con un contacto de 8
horas a 37ºC con CNCM I-2219 se ilustran en la Tabla
2 siguiente.
T 0 | T 7 días | T 15 días | |
Bifidobacterias | 7,1 \pm 0,1 | 11 \pm 0,5 | 10,3 \pm 0,8 |
Bacteroides Fragilis | 8 \pm 0,2 | 7,9 \pm 0,3 | nd < 4,7 log |
Clostridium | 3,9 \pm 0,3 | 4,4 \pm 0,2 | 4 (1 ratón) |
demás 5: ausencia | |||
C. perfringens | 3,7 \pm 0,9 | nd | nd |
nd: no determinado |
Se observa, con relación al testigo, un
incremento de las Bifidobacterias de 2,5 log, y una reducción muy
importante de los Bacteroides y las Clostridia,
especialmente tras 15 días de administración.
Objetivo: comprobar la influencia de los
productos de la invención sobre la diseminación de las bacterias
intestinales en distintos órganos.
Condición de experimentación: ratones
agénicos (edad = 8 semanas) mantenidos en aislador esterilizado,
alimentados sobre la base RO3 esterilizada mediante irradiación.
\newpage
Productos probados:
- -
- agua ultrapura esterilizada en autoclave,
- -
- agua ultrapura esterilizada en autoclave, con adición de un preparado conforme a la invención (PCI), a razón de 14 g (peso de polvo) por 100 ml de agua.
Estas soluciones se preparan estérilmente cada
día y se administran a voluntad a los ratones durante 6 días. Al
término de este período, se inocula la cepa LAB de C.
perfringens (origen humano intestinal) a razón de 3,5 a 4,5 log
UFC por ratón. Se mide la implantación y la diseminación de
Clostridium perfringens en los órganos linfoides mediante
sacrificio de dos ratones por lote, a las 24 horas, 48 horas, 4
días y 7 días de la inoculación. Los recuentos se efectúan mediante
el método del número más probable en tres tubos en medio LS
(incubación a 46ºC, 24-48 horas).
Los resultados se ilustran en la Tabla III
siguiente.
Se observa:
- -
- un retraso de 24 horas en la implantación de C. perfringens tras la administración del producto de la invención;
- -
- una diseminación escasa en los órganos linfoides, en los ratones que han absorbido el producto de la invención (PCI).
Estos resultados muestran que los preparados de
la invención regulan la diseminación de Clostridium
perfringens en los órganos linfoides.
Claims (9)
1. Cepa de Bifidobacterium breve,
depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos
(CNCM), el 31 de mayo de 1999, con el número
I-2219.
2. Procedimiento de preparación de un producto
lácteo inmunoestimulante, caracterizado porque se efectúa la
bioconversión de un substrato lácteo, por medio de un cultivo de la
cepa Bifidobacterium según la reivindicación 1, mediante
mantenimiento de dicho substrato en contacto con dicho cultivo, en
condiciones desfavorables para la fermentación mediante dicha
cepa.
3. Procedimiento, según la reivindicación 2,
caracterizado porque la puesta en contacto del substrato
lácteo y las Bifidobacterium se efectúa a razón de 1 x
10^{7} a 1 x 10^{9} UFC por ml de substrato lácteo, siendo la
población final de Bifidobacterium, al término de la reacción
de bioconversión, de 1 x 10^{5} a 1 x 10^{9} UFC pom ml de
producto.
4. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque el pH del
substrato lácteo durante la puesta en contacto con las
Bifidobacterium es de entre 6,3 y 7, y el pH del producto al
término de la reacción de bioconversión es de entre 6 y 7.
5. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el tiempo de
contacto entre el substrato lácteo y las bacterias es de entre 6 y
24 horas.
6. Producto lácteo caracterizado porque se
puede obtener mediante el procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5.
7. Producto lácteo, según la reivindicación 6,
caracterizado porque su pH es de entre 6 y 7.
8. Alimento lácteo obtenido a partir de un
producto según la reivindicación 7.
9. Alimento lácteo, según la reivindicación 8,
caracterizado porque su pH es de entre 6 y 7,5,
preferiblemente de entre 6,5 y 6,9.
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