JP2003503079A - 免疫刺激性ミルク製品の製造法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的変換を、ミルク基質上で、ビフィドバクテリウム培養物を用いて、ビフィドバクテリウムの発酵に関して不利な条件下に、該基質と該培養物との接触を維持することにより行うことを特徴とする免疫刺激性のミルク製品の製造法。本発明は上記の製造法で得られるミルク食品および製品にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、特に幼児食品用に適した免疫刺激性ミルク食品製造用のビフィドバ
クテリアの使用に関するものであり：該食品は液状または粉末化された形態であ
り得る。

【０００２】 ビフィドバクテリウム属はアクチノマイセタケアエ科に属する；それは、フル
クトース−６−ホスフェート・ホスホケトラーゼ経路により、厳密な嫌気性条件
下にグルコースを発酵するグラム陽性菌と共に一群を形成する。それらが生育す
るのに至適なｐHは６〜７の間であり、それらが生育するのに至適な温度は３７
〜４０℃の間である。

【０００３】 ビフィドバクテリアは正常なヒトの腸内細菌叢の一部であり、健康に良いいく
つかの効果を有していることが認められている。母乳で育てられた離乳前の幼児
は、ビフィドバクテリアが優勢な腸内細菌叢を有しており、感染に対してより抵
抗力があり、特にミルク工業製品で育てられた離乳前の幼児よりも下痢のリスク
が少ない。

【０００４】 感染症に対するこの増強された抵抗力におけるビフィドバクテリアの役割は、
まだ完全には明らかにされていない。種々の研究は、細菌壁に付随した、または
嫌気性発酵の間に細菌によって分泌されたポリサッカライド物質が関与する免疫
刺激力をビフィドバクテリアが有していることを示している。GOMEZら｛FEMS M
icrobiol．Lett．，56，47−52，（1988）｝は、ビフィドバクテリウム・アドレ
センティス（adolescentis）により産生されるポリサッカライドが豊富な細胞外
フラクションの免疫調整効果を記述している；Laboratoires OMの名前で第２６
５２５９０号として公開されたフランス特許出願は、ビフィドバクテリウム・イ
ンファンティス・ロングム（infantis longum）により産生されるポリサッカラ
イド性の免疫力を有するエキソポリマーを記述している；ホソノら［Biosci．Bi
otech．Biochem．，61，312−316 （1997）およびBioscience Microflora，17
，97−104，（1998）］は、種々のビフィドバクテリウム菌株により産生される
免疫賦活ポリサッカライドを記述している。ビフィドバクテリアの免疫調整作用
は、腸内細菌叢の調整によって、特に病原性細菌株の発生をなくして、それ自体
を証明してもいる。ROMONDら［Anaerobe，3，137−143，（1997）およびＪ．Dai
ry Sci．，81，1229−1235，（1998）］は、嫌気性発酵条件下でビフィドバク
テリウム・ブレヴェ（breve）により産生される、グリコプロテインが豊富なフ
ラクションン、およびイン・ビボでの腸内細菌叢に対する調整効果の誘発を記述
している。

【０００５】 ビフィドバクテリアの発酵によって産生される多くの製品は、他の乳酸菌と任
意に組み合わされて市場に存在し、それを摂取するとビフィドバクテリアおよび
その発酵製品の免疫刺激効果を得ることができる。

【０００６】 しかしながら、乳幼児の食物の場合、余りに酸っぱく、しかも粉末製品の場合
には発酵中に生じる酸性度によるミルクプロテインの凝集のために再調製後に外
観が不均一になるという不利がある。そのため、それらは子供や母親にしばしば
受け入れられ難い。

【０００７】 しかしながら、本発明者らは、免疫刺激性を有する物質のビフィドバクテリア
による生産を、発酵によらないで、したがって最終製品の酸性化を伴わないで行
い得ることを見出した。

【０００８】 本発明の課題は、生物学的変換を、ミルク基質上で、ビフィドバクテリウム培
養物の助けを借りて、ビフィドバクテリウムによる発酵に不利な条件下に、該基
質と該培養物との接触を維持することにより行うことを特徴とする免疫刺激性ミ
ルク製品の製造法である。

【０００９】 「ビフィドバクテリウムによる発酵に不利な条件」という表現は、ビフィドバ
クテリウムによる培地の酸性化が、最初の１〜５×１０⁷CFU／ml接種について、
８時間培養の間に０．５ｐH単位を超えないという条件を意味する。それらは、
特に培地のエアレーション、その浸透圧および／または培養温度を変えて、培養
の最初と最後のｐHを測定することにより、簡単な試験で、当業者により容易に
測定され得る。

【００１０】 多数のビフィドバクテリウム菌株について、そのような条件は、特に： −例えば攪拌して通気条件下に保つことにより； −培地を０．９３〜０．９７の水分活性に相当する浸透圧に保つことにより、 −４０℃〜４８℃の温度に保つことにより； ならびにこれら種々の条件の組合せによって得られる。

【００１１】 ミルク基質とビフィドバクテリウムとをミルク基質のｍｌ当たり１×１０⁷〜
１×１０⁹ CFUの割合で接触させ、生物学的変換反応の最後におけるビフィドバ
クテリウムの最終濃度は生成物のｍｌ当たり１×１０⁵〜１×１０⁹ CFUである。

【００１２】 バクテリアと接触させる間のミルク基質のｐHは、好ましくは６．３〜７であ
り、生物学的変換反応の最後における生成物のｐHは、好ましくは６〜７である
。 採用される条件によるが、ミルク基質とバクテリアとの接触時間は６〜２４時
間である。

【００１３】 ミルク基質はミルク、またはミルクをベースとした媒体であり；これは例えば
濃縮ミルク、幼児ミルク食品用のベース、ヨーグルト用のベースなどであり得る
。

【００１４】 即席の製品を製造するのに必要な、摂取するのが望ましい材料を、ミルクをベ
ースとした媒体に加えることができる。もし、例えば、離乳前の乳幼児にとって
ミルク食品をとるのが望ましいならば、ラクトース、マルトデキストリン、ミネ
ラル類、ビタミン類、脂肪、および母乳の組成を再構成できる材料が加えられる
だろう。所望により、脂肪が加えられ、次いで安定なエマルジョンが得られるよ
うに溶液と均質化される。

【００１５】 本発明を実施するのに特に適したビフィドバクテリウム・ブレヴェ菌株は、ブ
ダペスト条約に従って、１９９９年５月３１日に、Ｉ−２２１９という番号で、
パリのパスツール研究所（25 rue du Docteur Roux）に保有されているCNCM
（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）に寄託された。

【００１６】 この菌株は次の特性を有している： 形態学：稀にYおよびV形を有する短い桿菌 代謝：嫌気生活；L‐（＋）−乳酸および酢酸の産生 糖の発酵：グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、スクロー
ス、ラクトース、エスクリン、リボース、マンニトール、ソルビトール、D‐ラ
フィノース、メリビオース。

【００１７】 本発明の課題は、本発明の方法を用いて得られることを特徴とする液状のミル
ク製品でもある。 この製品は、好ましくは生物学的変換反応の最後において６〜７のｐHを有す
る。 比較として、ビフィドバクテリウムの発酵により得られる先行技術の製品は、
発酵の最後の段階で４〜４．６のｐHを有する。

【００１８】 この製品は、そのまま消費され得るし、あるいは摂取するのが望ましい即席製
品に従ってその性質が変わる種々の処理に付され得る。例えば、繊維化剤、香辛
料、ビタミンもしくはミネラル補強剤、脂肪などが、もしこれらがもとの媒体に
加えられていなければ、補充され得る。それは濃縮されても、希釈されてもよい
。

【００１９】 本発明によるミルク製品は、新鮮なミルク食品を製造するためのベースとして
役立つ。 それはまた、滅菌および／または乾燥により、長期保存食品の製造にも使用さ
れ得る。事実、それは、生菌がなくても、例えば乾燥およびUHT滅菌の後でも、
免疫刺激性を維持している。 本発明は、本発明によるミルク製品から得られる、新鮮な、滅菌されたまたは
乾燥されたミルク食品をもカバーする。 それは、本発明による乾燥されたミルク食品に水を加えて得られる再構成され
たミルク食品をもカバーする。 本発明による（新鮮な、滅菌されたまたは再構成された）ミルク食品は、一般
に６〜７．５のｐH、好ましくは６．５〜６．９のｐHを有する。

【００２０】 従来技術として知られていたビフィドバクテリウムの発酵により得られる食品
と違って、本発明によるミルク食品は、酸性でなく、凝集しないで溶解している
ミルクプロテインを含んでいる。本発明による乾燥ミルク食品に水を加えると、
沈殿とか相分離のない均質な製品を得ることができる。本発明によるミルク食品
は、味が変わるとか製品の外観が変わるとかいった不都合を伴わないで、それら
の免疫刺激効果により、従来技術で知られていたビフィドバクテリウムの発酵に
より得られる食品に匹敵するほどの、細菌およびビールスに対する保護をもたら
す。

【００２１】 それらは乳幼児の食品として、特に離乳前の乳児の食品として使用するのに適
しているが、あらゆる年齢層用の食品としても使用され得る。 本発明は、本発明のミルク製品の製造例を参照する以下の追加的な記載によっ
て、よりはっきりと理解されるだろう。

【００２２】 実施例１：免疫刺激活性を有する、離乳前の乳児用の栄養ミルク粉末製剤の製造 乾燥物１００ｇ当たりのｇで表したときの組成が次のとおりであるミルク濃縮
物が製造される： ミルクプロテイン（８０％カゼインおよび２０％血清プロテイン） 13 食用脂肪 25.5 ラクトース 42.25 マルトデキストリン 16 ミネラル類 3 ビタミン類 0.25

【００２３】 食用脂肪を牛のスキムミルクに加え、７５℃に加熱する。同じ温度で、第１段
階２００ｋｇｓ／ｃｍ²、第２段階５０ｋｇｓ／ｃｍ²の２段階で、ホモゲナイズ
する。次いで、予め水に溶解したラクトースおよびマルトデキストリンを加え、
ビタミンとミネラルの溶液を加える。 最終的な混合物を１１５℃で滅菌し、次いで蒸発により濃縮して４８％の濃縮
物を得る。

【００２４】 この濃縮物を３７℃に冷やし、１０⁹バクテリア／ｍｌを含むＢ．ブレヴェ
Ｉ−２２１９培養物を５％の割合で接種する。最初のｐＨは６．１５であり、浸
透圧は０．９６である。２時間ごとに１０分間間欠的に攪拌して通気したタンク
中で、３７℃で８時間インキュベートした後、ｐＨは６．１であり、Ｂ．ブレヴ
ェの個体数は１０⁶バクテリア／ｍｌである。ドルニック（Dornic）酸性度は４
８゜Dである。 濃縮物を噴霧乾燥する。粉末が得られ、これを水１リットル当たり１４０ｇの
量で加えると、次の特性を有する再構成ミルクが得られる：ｐH６．６、ドルニ
ック酸性度１２゜D；凝固粒子のない液状のミルク外観。

【００２５】 実施例２：免疫刺激活性を有する、即席の、UHT滅菌され、無菌包装された、離
乳前の乳児用の栄養ミルク製剤の製造 組成（ｇ／リットル）が次のとおりである混合物を調製した： プロテイン ２１ 油脂 ２４ 炭水化物 ８３ ミネラル類 ５ ビタミン類 ０．４５ この混合物は次の材料（最終製品の１００リットル当たり）から調製される： −スキムミルク ５８リットル −脂肪 ２．４ｋｇ −ラクトース ４．７ｋｇ −マルトデキストリン ０．７ｋｇ −ビタミン類 ０．３ｋｇ −ミネラルコンプレックス ０．０５ｋｇ

【００２６】 UHTシステムを用いて、１１５〜１２０℃の温度でミルクを予め加熱処理する
。 ７０℃に冷やされたミルクに脂肪を加え、第１段階２００ｋｇｓ／ｃｍ²、第
２段階５０ｋｇｓ／ｃｍ²の２段階で、ホモゲナイズする。 混合物を３７〜３８℃に冷却し、１〜５×１０⁹バクテリア／ｍｌを含むCNCM Ｉ−２２１９培養物を１．５％で接種する。 上記の実施例１と同じ条件下に、３７℃で８時間培養した後、５℃に冷却する
。

【００２７】 製品のｐHは６．３であり、B．ブレヴェの個体数は３×１０⁷バクテリア／ｍ
ｌである。ドルニック酸性度は２３゜Dである。 材料の残りを約５０リットルの水に溶解し、次いでインキュベーションの最終
段階で得られた生成物に加える。 このようにして得られた混合物を、無菌包装する前に、１４０℃で６〜７秒間
UHT処理に付す。

【００２８】 実施例３：本発明のミルク製品の免疫刺激効果 本発明によるミルク製剤の免疫刺激効果を次のようにして試験した： −ヒト細菌叢をもったマウスにおける糞便細菌叢の生育による −クロストリジウム・パーフリンゲンスでの単宿主性マウスにおける移行現象
の規制による。

【００２９】 ヒト細菌叢をもったマウスにおける糞便細菌叢の生育試験： マウスはヒト細菌叢をもった、成長したC３Hラインである。 −１群当たりのマウスの数：６ −試験の回数：製品当たり２ マウスは１週間同じケージで飼育された後、１ケージ６匹に分けられる。 マウスの週齢は試験の開始時に最小で８週齢、最大で１１週齢である。 次の細菌が糞便細菌叢でモニターされる： −ビフィドバクテリア −バクテロイデス・フラギリス −クロストリジアの胞子 −任意にCl．パーフリンゲンスの胞子

【００３０】 生物学的テクニック 糞便試料を使用直前に集め、無菌的に秤量し、前還元のリンガー液（１／４に
希釈し、０．３ｇ／ｌの塩酸システインで補足）に溶解する。 前還元されたBEERENSおよびBBE媒体上のビフィドバクテリアおよびバクテロイ
デス・フラギリスの計数（enumeration）を直接接種し、嫌気性条件下で培養す
る。 クロストリジウム胞子に関する試験について： −懸濁液を７５℃で１０分間加熱し、グルコース（５ｇ／ｌ）および塩酸シス
テイン（０．３ｇ／ｌ）を加えたコロンビア寒天培地に接種し、５日間培養する
。 −クロストリジウムのコロニーをそれらの形態およびカタラーゼ反応陰性によ
り同定する。グラム染色３の後で細胞の形態を決定する。 得られた結果を、ファーメントCNCM I‐2219とともに接種し、直ちに処理さ
れた対照のミルク製剤とともに、次の表Ｉに示す。（接触時間＝０）

【００３１】

【表１】

【００３２】 結果はlogで表され、数字はマウス６匹についての結果の平均を表す；バクテ
ロイデス・フラギリスおよびクロストリジアの顕著な増加、すなわち感染症のリ
スクが観察される。 接種後、CNCM I‐2219と３７℃で8時間接触させて得られた、本発明のミルク
製剤での結果を次の表ＩＩに示す。

【００３３】

【表２】 ｎｄ：測定せず

【００３４】 対照に比べて、ビフィドバクテリアにおける２．５ logの増加、ならびにバ
クテロイデスおよびクロストリジアにおける極めて大きな減少が、特に１５日間
処理後に観察される。

【００３５】 クロストリジウム・パーフリンゲンスをもった一宿主性マウスでの試験 目的：種々の器官における腸内細菌の伝播に対する本発明の製品の影響を確認
すること 試験条件：滅菌された隔離ユニット中で、照射により滅菌されたＲ03ベース上
で、無菌飼育されたマウス（８週齢） 試験物質： −オートクレーブにより滅菌された超純水 −本発明の製剤（ＰＩＩ）が水１００ｍｌ当たり１４ｇ（粉末の重量）の割合
で加えられ、オートクレーブにより滅菌された超純水

【００３６】 これらの溶液を滅菌的手法で毎日調製し、マウスに６日間不断給餌する。期間
の終わりに、Ｃ．パーフリンゲンス菌株LAB（ヒト腸内由来）をマウス当たり３
．５〜４．５logCFUの割合で接種する。リンパ器官におけるクロストリジウム・
パーフリンゲンスの移植および伝播を、接種後24時間、48時間、4日および7日に
、グループ当たり2匹のマウスを殺して測定する。計数は、LS媒体中、3つのチュ
ーブを用いた最も普通の計数方法により行う（４６℃で２４〜４８時間培養）。 結果を次の表ＩＩＩに示す：

【００３７】

【表３】

【００３８】 表ＩＩＩの凡例： ０＝低い移植／伝播 １＝平均的な移植／伝播 ２＝高い移植／伝播

【００３９】 次のことが観察される： −本発明の製品投与後、Ｃ．パーフリンゲンス移植の２４時間遅延 −本発明の製品（ＰＩＩ）を消費したマウスのリンパ器官における低い伝播 これらの結果は、本発明の製剤がリンパ器官におけるクロストリジウム・パー
フリンゲンスの伝播を規制していることを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月１３日（２００２．３．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１０】 １９９９年５月３１日に、番号Ｉ−２２１９の下に、ＣＮ
ＣＭに寄託されたビフィドバクテリウム・ブレヴェ株。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロモン，マリ−ベネディクト フランス、エフ−59800 リール、パルク サン モール、レジダンス デ ザンデ リ、13−14 (72)発明者 ロモン，シャルル フランス、エフ−59100 ラ マドレーヌ、 アヴェニュ デュ マレシャル レクレー ル、21 (72)発明者 ルクロワ，フランシス フランス、エフ−59270 ゴドヴァルスヴ ェルド、リュ アンリ ベイヨ、244 (72)発明者 ゴンティエ，シャルル フランス、エフ−19360 マルモール−シ ュル−コレーズ、リュ アリエノール ダ キテーヌ、８ ビス Ｆターム(参考） 4B001 AC30 BC01 BC14 BC99 EC05 4B018 LB07 LE05 MD87 ME07 MF07

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物学的変換を、ミルク基質上で、ビフィドバクテリウム培養
   物を用いて、ビフィドバクテリウムの発酵にとって不利な条件下に、該基質と該
   培養物との接触を維持することにより行うことを特徴とする免疫刺激性ミルク製
   品の製造法。
2. 【請求項２】ミルク基質およびビフィドバクテリウムを、ミルク基質のｍｌ
   当たり１×１０⁷〜１×１０⁹ＣＦＵの割合で接触させ、生物学的変換反応の終わ
   りの段階でビフィドバクテリウムの最終個体数が生成物のｍｌ当たり１×１０⁵
   〜１×１０⁹ＣＦＵであることを特徴とする請求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】ビフィドバクテリウムと接触させる間のミルク基質のｐＨが好
   ましくは６．３〜７であり、生物学的変換反応の終わりの段階で生成物のｐＨが
   好ましくは６〜７であることを特徴とする請求項１および２のいずれかに記載の
   製造法。
4. 【請求項４】ミルク基質とバクテリアとの接触時間が６〜２４時間であるこ
   とを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
5. 【請求項５】１９９９年５月３１日に、番号Ｉ−２２１９の下に、ＣＮＣＭ
   に寄託されたビフィドバクテリウム・ブレヴェ株を含むビフィドバクテリウム培
   養物を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の製造法により得られることを
   特徴とするミルク製品。
7. 【請求項７】ｐＨが６〜７であることを特徴とする請求項６に記載のミルク
   製品。
8. 【請求項８】請求項７に記載の製品から得られるミルク食品。
9. 【請求項９】ｐＨが６〜７．５、好ましくは６．５〜６．９であることを特
   徴とする請求項８に記載のミルク食品。