CN112912088A - 用于轮状病毒引起的感染的具有非消化性寡糖的经发酵配方食品 - Google Patents

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Abstract

公开了一种在婴儿或幼儿中治疗和/或预防轮状病毒感染及其相关症状的方法，其包括给予至少部分地被产乳酸细菌发酵的并且包括非消化性寡糖的营养组合物。

Description

用于轮状病毒引起的感染的具有非消化性寡糖的经发酵配方 食品
发明领域
本发明为婴幼儿营养、婴儿配方食品领域，用于治疗或预防轮状病毒感染。
发明背景
病毒感染在各年龄段的人群中都很普遍，但似乎通常集中在婴儿和儿童中。许多病毒感染会导致发烧、身体酸痛或不适，而且不那么严重，多数患有病毒感染的儿童不用治疗就会好转。特别是在婴儿期，父母很难断定自己的婴儿是否患有潜在的严重感染并需要立即就医。轮状病毒(RV)是5岁以下儿童严重脱水性腹泻的全球性病原体。RV主要在小肠绒毛尖端附近的不发生细胞分裂的成熟肠上皮细胞中感染和复制。结果，婴儿腹泻、呕吐和发烧3天至1周，通常伴有再感染，再感染往往不如初次感染严重。最常见的治疗方法包括口服补液(ORS)。因为人类RV发病机理仍不清楚，并且RV疫苗尚未在全球范围内实施，所以对具有生物活性成分的营养干预措施的调节感兴趣。
人乳是婴儿的优选食品。人乳提供了多种有益于生命早期的新生儿的相对不成熟的免疫系统并可预防或降低轮状病毒感染的严重程度的生物活性因子，如乳铁蛋白和人乳寡糖。然而，并非总是可能或者希望母乳喂养婴儿。在这种情况下，婴儿配方食品或后续(follow on)配方食品是良好的选择。这些配方食品应具有最佳的成分，以便尽可能贴切地模拟人乳的有益作用。
近年来，已经研究了若干使用生物活性化合物的营养干预措施。在这些化合物中，益生菌由于其通常对小肠的已知的免疫调节效果和直接作用(而小肠是RV感染的重点)而被广泛研究。WO 00/53201公开了能够预防腹泻并预防轮状病毒感染的乳酸菌菌株。WO2004/2168公开了双歧杆菌治疗炎性疾病(包括与轮状病毒相关的腹泻)。WO 02/39834公开了用于预防或抑制腹泻轮状病毒的益生菌。EP 2407532公开了短双歧杆菌的益生菌菌株及其上清液在体外实验中阻止了轮状病毒的体外生长。在Rigo-Adrovers等人，2017，BritishJournal of Nutrition，117，209-217中，测试了两种不同的构思。第一种是经热灭活的经发酵的配方食品，而第二种是短链半乳寡糖、长链果寡糖和果胶衍生的酸性寡糖的特定混合物。两种营养构思均改善轮状病毒感染的临床症状。在Rigo-Adrover等人，2018，Frontiers in Immunology，doi：10.3389/fimmu.2018.01318中，描述了短链半乳寡糖和长链果寡糖以及益生短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)M-16V以及益生混合物和益生菌的组合的混合物在大鼠双-RV感染模型中的预防作用的研究。首次感染后，饮食干预可改善临床症状。
发明概述
发明人已经测试了经发酵的配方食品与非消化性寡糖混合物的结合对抗轮状病毒感染的作用。令人惊讶地，经发酵的配方食品与非消化性寡糖的结合所产生的对轮状病毒颗粒的束缚与经发酵的配方食品或非消化性寡糖这些单个组分的束缚相比要高得多。使用幼鼠模型研究了轮状病毒感染及其引起的症状。轮状病毒感染引起的体重减轻(主要是在腹泻期后观察到的)和轮状病毒引起的对器官重量的影响在接受了发酵配方食品与非消化性寡糖混合物的结合的组中得到改善。将经发酵的配方食品与非消化性寡糖一起给予可使得轮状病毒引起的腹泻的发病率降低、持续时间减少并且严重程度降低。另外，观察到病毒脱落减少。此外，由α1抗胰蛋白酶(antitrypsin)测定，在给予了经发酵的配方食品和非消化性寡糖的结合的组中，轮状病毒所感染的动物的肠道屏障通透性下降最多。
发明详述
因此，本发明涉及在婴儿或幼儿中治疗和/或预防轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻的方法，其包括将至少部分地被产乳酸细菌发酵的并且包括非消化性寡糖的营养组合物给予婴儿或幼儿。
本发明还可以表述为经发酵的组合物和非消化性寡糖用于制备至少部分地被产乳酸细菌发酵的并且包括非消化性寡糖的营养组合物的用途，所述营养组合物用于在婴儿和幼儿中治疗和/或预防轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻。
本发明还可以表述为至少部分地被产乳酸细菌发酵的并且包括非消化性寡糖的营养组合物，用于在婴儿或幼儿中治疗和/或预防轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻。
在一个实施方案，治疗和/或预防轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻是
a.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，
b.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，
c.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度，
d.预防轮状病毒引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，
e.提高轮状病毒颗粒的阻断，
f.降低轮状病毒载荷，和/或
g.提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能。
本发明还涉及在婴儿或幼儿中用于以下的方法：
a.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，
b.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，
c.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度，
d.预防轮状病毒-引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，
e.提高轮状病毒颗粒的阻断，
f.降低轮状病毒载荷，和/或
g.提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能，
该方法包括将至少部分地被产乳酸细菌发酵的并包括非消化性寡糖的营养组合物给予婴儿或幼儿。
本发明还可以表述为经发酵的组合物和非消化性寡糖用于制备至少部分地被产乳酸细菌发酵的并且包括非消化性寡糖的营养组合物的用途，所述营养组合物用于在婴儿或幼儿中
a.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，
b.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，
c.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度，
d.预防轮状病毒引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，
e.提高轮状病毒颗粒的阻断，
f.降低轮状病毒载荷，和/或
g.提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能。
本发明还可以表述为至少部分地被产乳酸细菌发酵的并且包括非消化性寡糖的营养组合物，用于在婴儿或幼儿中
a.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，
b.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，
c.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度，
d.预防轮状病毒引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，
e.提高轮状病毒颗粒的阻断，
f.降低轮状病毒载荷，和/或
g.提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能。
经发酵的组合物
根据本发明的方法或用途的营养组合物(下文也称为本营养组合物、或本发明营养组合物或最终营养组合物)是至少部分地被发酵的。部分发酵的营养组合物至少包括一部分被产乳酸细菌发酵的组合物。因此，在本发明的上下文中，至少部分发酵的营养组合物是指包括经产乳酸细菌发酵的乳基质的营养组合物。已表明，最终营养组合物中存在经发酵的组合物，其在给予时，对轮状病毒腹泻及其症状有效。
发酵优选在营养组合物的生产过程中进行。优选地，营养组合物在最终产物中不包含大量的活细菌，这可以通过发酵后的热灭活或通过其他手段灭活来实现。优选地，经发酵的组合物是乳来源的产品，其是经产乳酸细菌发酵的乳基质，其中乳基质包含选自以下的至少一种：乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物或其混合物。合适地，在WO 2009/151330、WO 2009/151331和WO 2013/187764中记载了包括经发酵的组合物和非消化性寡糖的营养组合物及其生产方法。
经发酵的组合物优选包括细菌细胞碎片，如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂蛋白酸(LTA)、脂蛋白、核苷酸和/或荚膜多糖。直接使用包括经灭活的细菌和/或细胞碎片的经发酵的组合物作为最终营养产品的一部分是有利的，因为这将产生更高浓度的细菌细胞碎片。当使用产乳酸细菌的商业制剂时，通常将其洗涤，并且将材料从包括细菌细胞碎片的水性生长培养基分离，从而减少或消除细菌细胞碎片的存在。此外，在发酵和/或产乳酸细菌与乳基质的其他相互作用时，可以形成其他生物活性化合物，例如短链脂肪酸、生物活性肽和/或寡糖，以及其他代谢物，这也会产生与母乳喂养婴儿的肠道菌群功能更相似的肠道菌群功能。在发酵期间由产乳酸细菌产生的这种生物活性化合物也可称为后生元(post-biotics)。包括这种后生元的组合物被认为是有利地更接近母乳，因为母乳不是清洁的合成配方食品，而是包含代谢产物、细菌细胞、细胞碎片等。因此，与不具有或仅具有产乳酸细菌的非发酵乳来源产品相比，在抗轮状病毒作用上，经发酵的组合物，特别是经发酵的乳来源产品被认为具有改善的作用。
优选地，基于干重计，最终营养组合物包括5至97.5重量％的经发酵的组合物，更优选10至90重量％，更优选20至80重量％，甚至更优选25至60重量％。作为表明最终营养组合物包括至少部分经发酵的组合物并表明发酵程度的方式，可以采用最终营养组合物中的乳酸和乳酸盐含量总和的水平，因为这是发酵时产乳酸细菌所产生的代谢终产物。基于组合物的干重计，本最终营养组合物优选包括乳酸和乳酸盐总和为0.02至1.5重量％，更优选0.05至1.0重量％，甚至更优选0.2至0.5重量％。优选至少50重量％，甚至更优选至少90重量％的乳酸和乳酸盐的总和是L(+)-异构体的形式。因此，在一个实施方案中，基于乳酸和乳酸的总和，L(+)-乳酸和L(+)-乳酸盐的总和大于50重量％，更优选大于90重量％。在本文中，L(+)-乳酸盐和L(+)-乳酸也称为L-乳酸盐和L-乳酸。
用于制备经发酵的组合物的产乳酸细菌
优选提供用于制备经发酵的组合物，特别是用于发酵乳基质的产乳酸细菌，作为单一或混合培养基。产乳酸细菌由双歧杆菌(Bigidobacterium)属、乳酸菌(Lactobacillus)属、肉杆菌(Carnobacterium)属、肠球菌(Enterococcus)属、乳球菌(Lactococcus)属、明串球菌(Leuconostoc)属、酒球菌(Oenococcus)属、片球菌(Pediococcus)属、链球菌(Streptococcus)属、四链球菌(Tetragenococcus)属、漫游球菌(Vagococcus)属和魏斯氏菌(Weissella)属组成。优选地，用于发酵的产乳酸细菌包括双歧杆菌属和/或链球菌属的细菌。
优选地，链球菌是嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株。EP 778885的实施例2和FR2723960的实施例1中描述了合适的嗜热链球菌菌株的选择。在根据本发明的另一个优选实施方案中，营养组合物包括102-105cfu的嗜热链球菌的活菌/g最终营养组合物干重，优选最终营养组合物包括103-104嗜热链球菌的活菌/g干重。
制备用于本发明目的的经发酵的组合物的嗜热链球菌的优选菌株已由CompagnieGervais Danone于1995年8月23日以登录号I-1620以及于1994年8月25日以登录号I-1470保藏在由巴斯德研究所(Institut Pasteur)，25rue du Docteur Roux，Paris，France管理的国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationable de Cultures deMicroorganixmes，CNCM)。其他嗜热链球菌菌株可商购获得。
双歧杆菌(Bifidobacteria)是革兰氏阳性厌氧棒状细菌。当与各个双歧杆菌种的模式菌株相比时，用于制备本发明目的的发酵组合物的优选双歧杆菌种优选与16S rRNA序列具有至少95％的同一性，更优选地，如关于该问题的手册(例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor(N.Y.)Laboratory Press)中所定义的，具有至少97％的同一性。Scardovi，V.Genus Bifidobacterium，p.1418-1434.In：Bergey’s manual of systematicBacteriology.Vol.2.Sneath，P.H.A.，N.S.Mair，M.E.Sharpe和J.G.Holt(ed.).Baltimore：Williams&Wilkins.1986.635p.也记载了优选使用的双歧杆菌。优选地，用于发酵的产乳酸细菌包括或者为至少一种选自以下的双歧杆菌：短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两岐双岐杆菌(B.bifidum)、儿茶双歧杆菌(B.catenulatum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、嗜热性双歧杆菌(B.thermophilum)、没食子酸双歧杆菌(B.gallicum)、动物双歧杆菌(B.animalis)或乳双歧杆菌(B.lactis)、角双岐杆菌(B.angulatum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、嗜酸嗜热菌双歧杆菌(B.thermacidophilum)和长双歧杆菌(B.longum)，更优选短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两岐双岐杆菌、儿茶双歧杆菌、长双歧杆菌，更优选长双歧杆菌和短双歧杆菌，甚至更优选短双歧杆菌，更优选选自保藏于法国巴黎CNCM的短双歧杆菌Bb-03(Rhodia/Danisco)、短双歧杆菌M-16V(Morinaga)、短双歧杆菌R0070(Institute Rosell，Lallemand)、短双歧杆菌BR03(Probiotical)、短双歧杆菌BR92(Cell Biotech)DSM20091、LMG 11613和短双歧杆菌I-2219。最优选地，短双歧杆菌是短双歧杆菌M-16V(Morinaga)或短双歧杆菌I-2219，甚至更优选短双歧杆菌I-2219。
最优选地，本发明的营养组合物包括被产乳酸细菌发酵的组合物，该产乳酸细菌包括短双歧杆菌和嗜热链球菌两者。在一个实施方案中，由产乳酸细菌进行的发酵是由嗜热链球菌和短双歧杆菌进行的发酵。在一个实施方案中，最终营养组合物包括经发酵的组合物，其中产乳酸细菌在发酵后被灭活。
优选地，经发酵的组合物不由保加利亚乳酸菌(Lactobacillus bulgaricus)发酵。认为保加利亚乳酸菌发酵的产品不适合于婴儿，因为在小婴儿中，将D-乳酸盐转化为丙酮酸盐的特定脱氢酶的活性远低于转化L-乳酸盐的脱氢酶的活性。
优选地，本发明的营养组合物包括：基于最终组合物干重计，等价于每克大于1x104cfu，更优选1x105cfu，甚至更优选1x106cfu的产乳酸细菌的灭活的产乳酸细菌和/或由产乳酸细菌衍生的细菌碎片。优选地，基于最终组合物的干重计，灭活的细菌或细菌碎片等价于每克小于1x1013cfu，更优选1x1011cfu，甚至更优选1x1010cfu的产乳酸细菌。可以通过本领域已知的分子技术或通过检查生产过程来确定灭活的乳酸细菌与cfu当量的相关性。
发酵方法
优选地，经发酵的组合物是乳来源的产品，其是通过产乳酸细菌发酵的乳基质，所述乳基质包括选自乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解物、酪蛋白、酪蛋白水解产物或其混合物的至少一种。待发酵的乳衍生产品或乳基质适当地存在于含水介质中。待发酵的乳基质包括选自乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物或其混合物中的至少一种。乳可以是全脂乳、半脱脂乳和/或脱脂乳。优选地，待发酵的乳基质包括脱脂乳。乳清可以是甜乳清和/或酸性乳清。优选地，乳清以3至80g干重每升含有乳基质的含水介质的浓度存在，更优选40至60g每升。优选地，乳清蛋白水解物以2至80g干重每升含有乳基质的含水介质存在，更优选5至15g/l。优选地，乳糖以5至50g干重每升含水基质存在，更优选1至30g/l。优选地，含有乳基质的含水介质包括缓冲盐以便将pH保持在期望的范围内。优选地，将磷酸二氢钠或磷酸二氢钾用作缓冲盐，优选0.5至5g/l，更优选1.5至3g/l。优选地，含有乳基质的含水介质以0.1至0.5g每升含水基质的量包括半胱氨酸，更优选0.2至0.4g/l。半胱氨酸的存在导致基质的氧化还原电势低，这对于产乳酸细菌，特别是双歧杆菌的活性是有利的。优选地，含有乳基质的含水介质以0.5至5g/l，更优选地为1.5至3g/l的量包括酵母提取物。酵母提取物是产乳酸细菌的酶辅因子和生长因子的丰富来源。酵母提取物的存在将提高由产乳酸细菌进行的发酵。
适当地，在发酵步骤之前将乳基质，特别是含有乳基质的含水介质巴氏杀菌，以消除有害活菌的存在。适当地，在发酵后将产品巴氏杀菌，以使酶失活。适当地，酶灭活是在75℃下进行3分钟。适当地，在发酵前将含有乳基质的含水介质均质化，和/或在发酵后将入来源的产品均质化。均质化会产生更稳定的基质和/或发酵产品，尤其是在存在脂肪的情况下。
接种密度优选为1x102至5x1010，优选1x104至5x109cfu产乳酸细菌/ml含有乳基质的含水介质，更优选1x107至1x109cfu产乳酸细菌/ml含有乳基质的含水介质。发酵后，最终细菌密度优选为1x103至1x1010，更优选1x104至1x109cfu/ml含有乳基质的含水介质。
发酵优选在约20℃至50℃，更优选30℃至45℃，甚至更优选约37℃至42℃的温度下进行。产乳酸细菌(尤其是乳杆菌和/或双歧杆菌)生长和/或活化的最佳温度为37到42℃。
温育优选在4至8，更优选6至7.5的pH下进行。此pH值不会引起蛋白质沉淀和/或不良味道，而同时产乳酸细菌如乳杆菌和/或双歧杆菌能够发酵乳基质。
孵育时间优选为10分钟至48小时，优选为2小时至24小时，更优选为4小时至12小时。足够长的时间使发酵和免疫原性细胞碎片(例如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂蛋白酸(LTA)、鞭毛、脂蛋白、DNA和/或荚膜多糖)和代谢产物(后生元)的伴随产生能够以足够或更高的程度进行，而出于经济原因，孵育时间不需要太长。
优选地，将乳来源的产品或乳基质(优选脱脂乳)进行巴氏杀菌、冷却并用一种或多种产生乳酸的菌株(优选嗜热链球菌菌株)发酵到一定酸度，在该酸度时将经发酵的产品冷却和储存。优选地，使用一种或多种双歧杆菌种发酵以类似方式制备第二乳来源的产品。随后，优选将两种经发酵的产品混合在一起，并与构成婴儿配方食品的其他组分(脂肪组分除外)混合。优选地，将混合物预热，然后将脂肪在线加入，均质化，巴氏杀菌并干燥。或者，在发酵罐中同时具有双歧杆菌(优选短双歧杆菌)和嗜热链球菌进行发酵。
制备适合于本发明目的的经发酵的组合物的方法本身是已知的。EP 778885(通过引用并入本文)特别在实施例7中公开了制备经发酵的组合物的合适方法。FR 2723960(通过引用并入本文)特别在实施例6中公开了制备经发酵的组合物的合适方法。简言之，将含乳糖和任选的其他大量营养素(如脂肪(优选植物脂肪)、酪蛋白、乳清蛋白、维生素和/或矿物质等)的乳基质(优选经巴氏杀菌)浓缩至例如15％至50％的干物质，然后接种嗜热链球菌，例如含106至1010个细菌/ml的5％的培养基。优选地，该乳基质包括乳蛋白肽。发酵的温度和持续时间如上所述。适当地，在发酵之后，可以将经发酵的组合物巴氏杀菌或灭菌，并且例如进行喷雾干燥或冻干，以提供适于在最终产品中进行配制的形式。
制备用于本发明营养组合物的经发酵的组合物的优选方法公开于WO 01/01785中，更特别是在实施例1和2中。制备用于本发明营养组合物的经发酵的组合物的优选方法公开于WO 2004/093899中，更特别是在实施例1中。
发酵后，优选将经发酵的组合物中的产乳酸细菌的活细胞例如通过灭活和/或物理去除而消除。细胞优选为经灭活的。优选地，在乳基质发酵之后将产乳酸细菌热杀死。优选的热杀死方法是(瞬间)巴氏杀菌、灭菌、超高温处理、高温/短时热处理和/或在细菌无法存活的温度下喷雾干燥。细胞碎片优选通过热处理获得。通过这种热处理，优选至少90％的活微生物是经灭活的，更优选至少95％，甚至更优选至少99％。优选地，经发酵的营养组合物包括少于1x105菌落形成单位(cfu)的活乳酸细菌/克干重。热处理优选在70至180℃、优选80至150℃下进行优选约3分钟至2小时，热处理优选在80至140℃的温度下进行5分钟至40分钟。乳酸细菌的灭活有利地使后酸化更少且产品更安全。在营养组合物要给予婴儿或幼儿时这是特别有利的，使用包括经灭活的乳酸细菌的发酵组合物仍然观察到对轮状病毒感染的有益作用。适当地，在发酵后，可将经发酵的组合物巴氏杀菌或灭菌，并例如喷雾干燥或冻干，以提供适于在最终产品中配制的形式。
非消化性寡糖
本营养组合物包括非消化性寡糖，并且优选包括至少两种不同的非消化性寡糖，特别是两种不同来源的非消化性寡糖。需要非消化性寡糖来改善对轮状病毒感染的作用。非消化性寡糖和至少部分经发酵的组合物(特别是通过产乳酸细菌发酵获得的乳来源产品)这两者的存在，是改善抗轮状病毒作用、特别是对轮状病毒颗粒的束缚或使颗粒从肠道上皮细胞粘附位点上阻断所需要的。
本文所用的术语“寡糖”是指聚合度(DP)为2至250，优选DP为2至100，更优选为2至60，甚至更优选为2至10的糖。本营养组合物包括DP为2到100的寡糖，这会产生可包含DP为2到5，DP为50到70和DP为7到60的寡糖的组合物。本发明中使用的“非消化性寡糖”是指不会在人的上消化道(例如，小肠和胃)中存在的酸或消化酶的作用下，在肠中被消化的寡糖，但该寡糖优选被人肠微生物群发酵。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糊精被认为是可消化的。
优选地，本发明的非消化性寡糖是可溶的。本文所用的术语“可溶的”，在涉及多糖、纤维或寡糖时，意为根据L.Prosky等人，J.Assoc.Off.Anal.Chem.71，1017-1023(1988)所述的方法，该物质至少是可溶的。
在本发明的方法或用途中，本营养组合物中包括的非消化性寡糖优选包括不同非消化性寡糖的混合物。非消化性寡糖优选选自：果寡糖(如，菊粉)、非消化性糊精、半乳寡糖(如反式半乳寡糖)、木寡糖、阿拉伯寡糖、阿拉伯半乳寡糖、葡寡糖、龙胆寡糖(gentio-oligosaccharide)、葡甘露寡糖、半乳甘露寡糖、甘露寡糖、异麦芽寡糖、黑曲霉寡糖(nigero-oligosaccharide)、葡甘露寡糖、壳寡糖、大豆寡糖、岩藻寡糖、唾液酸寡糖及其混合物。这样的寡糖具有许多共同的生化特性，并具有类似的功能优势，包括改善肠道微生物功能。还应理解，一些非消化性寡糖和优选地一些混合物具有甚至进一步改善的效果。因此，更优选地，非消化性寡糖选自果寡糖(如菊粉)和半乳寡糖(如β半乳寡糖)，及其混合物，甚至更优选地，β半乳寡糖和/或菊粉，最优选β半乳寡糖。在一个实施方案中，在本发明的营养组合物中，非消化性寡糖选自半乳寡糖、果寡糖及其混合物，更优选β半乳寡糖、果寡糖及其混合物。
非消化性寡糖优选选自β半乳寡糖、α半乳寡糖和半乳聚糖。根据更优选的实施方案，非消化性寡糖是β半乳寡糖。优选地，非消化性寡糖包括具有β(1，4)、β(1，3)和/或β(1，6)糖苷键和末端葡萄糖的半乳寡糖。反式半乳寡糖是例如以商品名
Figure BDA0003025100180000112
GOS(DomoFrieslandCampina Ingredients)、Bi2muno(Clasado)、Cup-oligo(Nissin Sugar)和Oligomate55(Yakult)购得的。
非消化性寡糖优选包括果寡糖。果寡糖在其他情况下可具有如果多糖、低聚果糖、多聚果糖、聚果聚糖、菊粉、左聚糖和果聚糖的名称，并且可指包括β-连接的果糖单元的寡糖，其优选通过β(2，1)和/或β(2，6)糖苷键，并且优选DP为2至200。优选地，果寡糖包含末端β(2，1)糖苷键合的葡萄糖。优选地，果寡糖包含至少7个β-连接的果糖单元。在另一个优选的实施方案中，使用菊粉。菊粉是一类果寡糖，其中至少75％的糖苷键是β(2，1)键。通常，菊粉的平均链长为8至60个单糖单元。用于本发明组合物中的合适的果寡糖可以商品名
Figure BDA0003025100180000111
HP(Orafti)商购获得。其他合适的来源是Raftilose(Orafti)、Fibrulose和Fibruline(Cosucra)以及Frutafit和Frutalose(Sensus)。
优选地，本营养组合物包括半乳寡糖和果寡糖的混合物。优选地，半乳寡糖和果寡糖的混合物以1/99至99/1，更优选1/19至19/1，更优选1/1至19/1，更优选2/1至15/1，更优选5/1至12/1，甚至更优选8/1至10/1，甚至更优选以9/1的重量比存在。在半乳寡糖的平均DP值低而果寡糖的DP值高时，该重量比特别有利。最优选的是平均DP低于10，优选低于6的半乳寡糖和平均DP高于7，优选高于11，甚至更优选高于20的果寡糖的混合物。
优选地，本营养组合物包括短链果寡糖和长链果寡糖的混合物。优选地，短链果寡糖和长链果寡糖的混合物以1/99至99/1，更优选为1/19至19/1，甚至更优选为1/10至19/1，更优选1/5至15/1，更优选1/1至10/1的重量比存在。优选的是平均DP低于10，优选低于6的短链果寡糖和平均DP高于7，优选高于11，甚至更优选高于20的果寡糖的混合物。
优选地，本营养组合物包括短链果寡糖和短链半乳寡糖的混合物。优选地，短链果寡糖和短链半乳寡糖的混合物以1/99至99/1，更优选为1/19至19/1，甚至更优选为1/10至19/1，更优选1/5至15/1，更优选1/1至10/1的重量比存在。优选的是平均DP低于10，优选低于6的短链果寡糖和半乳寡糖的混合物。
优选地，营养组合物不包括果胶衍生的酸性寡糖。这样的寡糖富含半乳糖醛酸寡糖。在本发明的上下文中，果胶衍生的酸性寡糖的特征在于，其是聚合度为2-30的半乳糖醛酸的低聚物的混合物。因此，优选地，本组合物不包括半乳糖醛酸寡糖。这些寡糖以其阻断病原体粘附于肠内受体的能力而闻名。然而令人惊奇的是，当非消化性寡糖与发酵的营养组合物结合时，不需要它存在即可实现对轮状病毒颗粒的最大阻断作用。
本营养组合物优选包括，基于营养组合物的干重计，2.5至20重量％的总非消化性寡糖，更优选2.5至15重量％，甚至更优选3.0至10重量％，最优选5.0至7.5重量％。基于100毫升的营养组合物计，本营养组合物优选包括0.35至2.5重量％的总非消化性寡糖，更优选0.35至2.0重量％，甚至更优选0.4至1.5重量％。更少量的非消化性寡糖在改善抗轮状病毒作用方面效果较差，而含量过多会导致腹胀和腹部不适的副作用。
营养组合物
根据本发明使用的营养组合物也可以被认为是药物组合物，并且适合于对婴儿给予。本营养组合物优选用于肠内给予，更优选用于口服给予。
本营养组合物优选是婴儿配方食品、后续配方食品、幼儿乳品或幼儿配方食品，或用于幼儿或幼儿配方食品的成长型(growing up)乳品。更优选地，营养组合物是婴儿配方食品或后续配方食品。本营养组合物可以有利地作为婴儿完全营养。优选地，本营养组合物是婴儿配方食品。婴儿配方食品被定义为用于婴儿的配方食品，并且例如可以是旨在用于0至6或0至4个月大的婴儿的起始配方食品。后续配方食品适用于4或6个月至12个月大的婴儿。在这个年龄段，婴儿开始断奶而吃其他食物。幼儿乳品或成长型乳品或幼儿配方食品适用于12到36个月大的儿童。本组合物优选包括脂质组分、蛋白质组分和碳水化合物组分，并且优选以液体形式给予。本营养组合物还可为干食品形式的，优选为粉末形式，其伴随有关于将所述干食品(优选粉末)与合适的液体(优选水)混合的说明书。根据本发明使用的营养组合物优选包括其他部分，如维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养物，以使其成为完整的营养组合物。优选地，根据国际标准，婴儿配方食品包括维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养素。
本营养组合物优选包括脂质、蛋白质和可消化性碳水化合物，其中脂质提供了总卡路里的5％至50％，蛋白质提供了总卡路里的5％至50％，而可消化性碳水化合物提供了总卡路里的15％至90％。优选地，在本营养组合物中，脂质提供了总卡路里的35％至50％，蛋白质提供了总卡路里的7.0％至12.5％，而可消化性碳水化合物提供了总卡路里的40％至55％。为了计算蛋白质的总卡路里％，需要考虑蛋白质、肽和氨基酸所提供的总能量。优选地，脂质提供3至7g脂质/100kcal，优选4至6g/100kcal，蛋白质提供1.6至4g/100kcal，优选1.7至2.5g/100kcal，可消化性碳水化合物提供5至20g/100kcal，优选8至15g/100kcal的营养组合物。优选地，本营养组合物包括提供4至6g/100kcal的脂质，提供1.6至2.0g/100kcal，更优选1.7至1.9g/100kcal的蛋白质，以及提供8至15g/100kcal营养组合物的可消化性碳水化合物。在一个实施方案中，脂质提供3至7g/100kcal，优选4至6g/100kcal，蛋白质提供1.6至2.1g/100kcal，优选1.6至2.0g/100kcal，碳水化合物提供5至20g/100kcal，优选8至15g/100kcal的营养组合物，并且其中，优选地，可消化性碳水化合物组分包括，基于总可消化碳水化合物计，至少60重量％的乳糖，更优选至少75重量％，甚至更优选基于总可消化性碳水化合物计，至少90重量％的乳糖。总卡路里的量由蛋白质、脂质、可消化性碳水化合物和非消化性寡糖产生的卡路里总和来确定。
本营养组合物优选包括可消化性碳水化合物组分。优选的可消化性碳水化合物组分是乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉和麦芽糊精。乳糖是人乳中存在的主要可消化性碳水化合物。本营养组合物优选包括乳糖。由于本营养组合物包括通过产乳酸细菌发酵而获得的经发酵的组合物，因此，由于发酵将乳糖转化为乳酸盐和/或乳酸，乳糖的量与其来源相比有所减少。因此，在本营养组合物的制备中，优选添加乳糖。优选地，除乳糖以外，本营养组合物不包括大量碳水化合物。与可消化性碳水化合物(如麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和其他血糖指数高的可消化性碳水化合物)相比，乳糖具有较低的血糖指数，因此是优选的。本营养组合物优选包括可消化性碳水化合物，其中至少35重量％，更优选至少50重量％，更优选至少60重量％，更优选至少75重量％，甚至更优选至少90重量％，最优选至少95重量％的可消化性碳水化合物是乳糖。基于干重计，本营养组合物优选包括至少25重量％的乳糖，优选至少40重量％，更优选至少50重量％的乳糖。
本营养组合物优选地包括至少一种选自动物脂质(不包括人类脂质)和植物脂质的脂质。优选地，本组合物包括植物脂质与选自鱼油、动物油、藻类油、真菌油和细菌油中的至少一种油的结合。本营养组合物的脂质优选提供3至7g/100kcal的营养组合物，优选脂质提供4至6g/100kcal。当为液体形式时，例如，作为即食(ready-to-feed)液体，营养组合物优选包括2.1至6.5g脂质/100ml，更优选3.0至4.0g/100ml。基于干重计，本营养组合物优选包括12.5至40重量％的脂质，更优选19至30重量％。优选地，脂质包括必需脂肪酸：α-亚麻酸(ALA)、亚油酸(LA)和/或长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。LC-PUFA、LA和/或ALA可以游离脂肪酸的形式，以甘油三酸酯形式，以甘油二酸酯形式，以甘油单酸酯形式，以磷脂形式，或作为以上述一者或多者的混合物形式提供。优选地，本营养组合物包括至少一种，优选至少两种脂质来源，其选自菜籽油(如菜油(colza oil)、低芥酸菜籽油和芥花油(canolaoil))、高油酸向日葵油、高油酸红花油、橄榄油、海洋生物油(marine oil)、微生物油、椰子油、棕榈仁油。本营养组合物不是人乳。
本营养组合物优选包括蛋白质。营养组合物中使用的蛋白质优选选自非人类动物蛋白质，优选乳蛋白质，植物蛋白质，如优选大豆蛋白质和/或稻米蛋白质，及其混合物。本营养组合物优选包含酪蛋白和/或乳清蛋白，更优选牛乳清蛋白和/或牛酪蛋白。因此，在一个实施方案中，本营养组合物中的蛋白质包括选自乳清蛋白和酪蛋白的蛋白质，优选乳清蛋白和酪蛋白，优选地，乳清蛋白和/或酪蛋白来自牛奶。优选地，基于游离氨基酸、二肽、三肽或水解蛋白质的总蛋白质，蛋白质构成小于5重量％。本营养组合物优选包括酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白∶乳清蛋白的重量比为10∶90至90∶10，更优选20∶80至80∶20，甚至更优选35∶65至55∶45。
根据凯氏定氮法(Kjeldahl-method)，通过测量总氮并在酪蛋白的情况下使用6.38的换算因数，或在酪蛋白以外的其他蛋白质的情况下使用6.25的换算因数，来计算蛋白质重量％，基于本营养组合物干重计。本发明中使用的术语“蛋白质”或“蛋白质组分”是指蛋白质、肽和游离氨基酸的总和。
本营养组合物优选包括提供1.6至4.0g蛋白质/100kcal营养组合物的蛋白质，优选提供1.6至3.5g/100kcal营养组合物，甚至更优选1.75至2.5g/100kcal营养组合物。在一个实施方案中，本营养组合物包括提供1.6至2.1g蛋白质/100kcal营养组合物的蛋白质，优选提供1.6至2.0g，更优选1.7至2.1g，甚至更优选1.75至2.0g/100kcal营养组合物。在一个实施方案中，本营养组合物包括含量为少于2.0g/100kcal的蛋白质，优选提供1.6到1.9g，甚至更优选1.75到1.85g/100kcal营养组合物。基于总卡路里计，蛋白质含量太低将导致婴儿和幼儿的生长发育不足。量太高会增加例如婴儿和幼儿肾脏的新陈代谢负担。当为液体形式时，例如作为即食液体，营养组合物优选包括0.5至6.0g，更优选1.0至3.0g，甚至更优选1.0至1.5g蛋白质/100ml，最优选1.0至1.3g蛋白质/100ml。基于干重计，本营养组合物优选包括5至20重量％的蛋白质，优选至少8重量％的蛋白质，基于总营养组合物的干重计，更优选8至14重量％，甚至更优选8至9.5重量％的蛋白质，基于总营养组合物干重计。
为了满足婴儿或幼儿的热量需求，营养组合物优选包括45至200kcal/100ml液体。对于婴儿而言，营养组合物更优选具有60至90kcal/100ml液体，甚至更优选65至75kcal/100ml液体。这种热量密度确保水和热量消耗之间的最佳比例。对于幼儿——年龄在12至36个月之间的人类受试者，营养组合物更优选地具有在45至65，甚至更优选地在50至60kcal/100ml的热量密度。本组合物的渗透压(osmolarity)优选为150至420mOsmol/l，更优选为260至320mOsmol/l。低渗透压的目的是进一步降低胃肠道压力，这可能会影响轮状病毒感染。
当营养组合物为即食液体形式时，每天给予的优选体积为每天约80至2500ml，更优选约200至1200ml。优选地，每天的喂食次数为1至10，优选为3至8。在一个实施方案中，营养组合物以液体形式每日给予，持续至少2天，优选至少4周，优选至少8周，更优选至少12周，其中，每日给予总体积为200ml至1200ml，并且其中每天的喂食次数为1到10。
当为液体形式时，本营养组合物优选具有1至60mPa.s的粘度，优选1至20mPa.s，更优选1至10mPa.s，最优选1至60mPa.s。低粘度确保液体的适当给予，例如，适当地通过整个奶嘴。而且，该粘度与人乳的粘度非常相似。此外，低粘度导致正常的胃排空和更好的能量吸收，这对于需要能量以实现最佳生长和发育的婴儿至关重要。或者，本营养组合物为粉末形式，适合于用水重构为即饮液体。本营养组合物优选通过将粉末状组合物与水混合来制备。通常，婴儿配方食品是以这种方式制备的。因此，本发明还涉及一种包装的粉末组合物，其中所述包装同时提供说明书——将粉末与适量的液体混合，从而得到粘度为1至60mPa.s的液体组合物。使用Physica Rheometer MCR 300(Physica Messtechnik GmbH，Ostfilden，Germany)在20℃下以95s-1的剪切速率测定液体的粘度。
应用
包括给予本营养组合物的本发明的方法或用途，也称为向需要此治疗的受试者，优选婴儿或幼儿，给予有效量的营养组合物。
发明人发现，经发酵的配方食品(提供后生元化合物)与非消化性寡糖混合物的组合，显示出改善轮状病毒感染和轮状病毒引起的腹泻的能力。富含非消化性寡糖的经发酵配方食品降低了腹泻过程的发病率、持续时间和严重程度。此外，该组合能够直接与病毒相互作用并增强宿主免疫系统。当测定轮状病毒颗粒的直接阻断时，与不包括非消化性寡糖的经发酵配方食品或非消化性寡糖相比，观察到具有非消化性寡糖的经发酵配方食品的出乎意料的改善效果。这表明胃肠道中的轮状病毒载荷降低。病毒载荷，也称为病毒负荷或病毒滴度，是每毫升中感染性病毒颗粒数量的数值表达。较高的病毒负荷、滴度或载荷通常与严重程度或感染相关。
此外，在同时给予非消化性寡糖和经发酵配方食品两者的组中，观察到对于持续时间、发病率和严重程度的最大抗轮状病毒作用。尤其是，仅在这一组中观察到了缩短持续时间的作用，而这不能通过单独的非消化性寡糖或经发酵配方食品的作用来解释。有趣的是，经发酵配方食品与非消化性寡糖的结合，最大程度地提高了轮状病毒感染期间的肠屏障功能，如由使用α1抗胰蛋白酶试验的肠屏障通透性所评估的。不希望被理论所束缚，所观察到的肠屏障功能的改善可由肠中丁酸的出乎意料的增加来解释。已知丁酸盐作为肠道上皮细胞的养料并改善肠屏障。丁酸水平的增加超过了基于单独喂食非消化性寡糖或经发酵配方食品的组所见水平所能预期的水平。
不希望受到理论的束缚，干预后较低的病毒脱落表明所分析的组分可能对与病毒的绑缚有影响。非消化性寡糖和经发酵配方食品的结合的这种与微生物无关的抗感染作用可能涉及与病原体的直接相互作用，并且可能与受体拟态有关。因此，所给予的混合物的一些组分可充当宿主中病毒可与之粘附的特定分子的可溶性受体类似物。因此，病原体与经发酵配方食品和非消化性寡糖的组合之间的这种相互作用可能会使粘附的病原体从小肠上皮细胞中移出，从而降低感染载荷或轮状病毒的传染性，从而降低腹泻的发病率、持续时间和/或严重程度。另外，观察到减少的病毒脱落和不同的全身和肠道免疫应答。同样重要的是，发现轮状病毒感染引起了体重增加减少，主要是在腹泻期之后观察到的，并且这种轮状病毒感染引起的对体重增加的影响在接受经发酵配方食品和非消化性寡糖混合物的结合的组中得到了改善。在该组中，不仅观察到对生长特别是体重的影响，而且还观察到对器官相对重量的影响。在与对照组相比时，RV组的脾、肝、小肠和大肠的重量均减少，即使相对重量(占总体重的重量％)也是如此。这表明在轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻之后，不仅生长受到影响，发育也受到影响。但是，在接受经发酵配方食品和非消化性寡糖混合物的结合的组中，这些作用得到了改善，并且与未感染的对照组更为相似。预防体重减轻或预防生长速度下降或生长不良(特别是体重增加)，或预防器官(如肝、脾、小肠和/或大肠)发育迟缓，对生长和发育中的婴儿或幼儿至关重要。这些观察表明，当给予了本发明的营养组合物时，在轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻之后，婴儿或幼儿的生长(特别是体重增加)和发育两者均得到改善。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于在婴儿或幼儿中预防轮状病毒感染引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或不良减少(更优选地，减少体重增加，或体重减轻)的方法或用途。优选地，用于预防婴儿或幼儿中轮状病毒感染引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良的方法或用途，是预防轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻之后的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良。该方法或用途可以通过给予营养组合物来实现，该营养组合物由产乳酸细菌至少部分地发酵并包括非消化性寡糖。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻的方法或用途。更具体地，在不同的实施方案中，对轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻的作用是降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，或降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，或降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度。在进一步的实施方案中，对轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻的作用是预防轮状病毒引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，或提高对轮状病毒颗粒的阻断，或降低轮状病毒载荷或提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能。在一个实施方案中，本发明涉及用于阻断轮状病毒颗粒、降低轮状病毒载荷和/或降低轮状病毒脱落的方法或用途。这通过向婴儿或幼儿给予上述营养组合物来实现，该营养组合物经产乳酸细菌至少部分地发酵并包括非消化性寡糖，特别是scGOS和lcFOS。
在进一步的实施方案中，本发明涉及：通过向婴儿或幼儿给予上述营养组合物，来降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，或降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，或降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度，或预防的轮状病毒引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，或提高对轮状病毒颗粒的阻断，或降低轮状病毒载荷，或提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能的方法，上述营养组合物经产乳酸细菌至少部分地发酵并包括非消化性寡糖，特别是scGOS和lcFOS。
对于所有方法和用途，所声称的有利效果是与不给予本发明的营养组合物的婴儿相比，换言之，是与给予了不是至少部分地经发酵的并且不包括非消化性寡糖的营养组合物的婴儿相比。
本营养组合物给予年龄为0到36个月的婴儿或幼儿。优选地，将营养组合物给予婴儿，即，年龄为0至12个月的人类受试者，更优选地，年龄为0至6个月的婴儿。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变式以其非限制性意义使用，意为包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。另外，不定冠词“一”(“a”或“an”)所指的要素不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅有一个要素。因此，不定冠词“一”(“a”或“an”)通常是指“至少一个”。重量％(wt.％)是指重量百分比。除非另有说明，否则一天是指24小时(于午夜开始和结束)。
实施例
实施例1：经发酵配方食品与非消化性寡糖对大鼠轮状病毒感染的作用
材料和方法
Pérez-Cano F J等人，2007，Pediatr.Res.2007；62：658-663中记载了制备了用于感染的轮状病毒(RV)菌株(simian SA-11)。简言之，病毒的增殖是在胎儿非洲绿猴肾细胞(MA-104)中进行的，并以TCID50/mL(TCID，组织培养物感染剂量)进行滴定。病毒是按照GoodLaboratory Practices的当前原则制备的。
从Janvier(Le-Genest-Saint-Isle，France)获得G14怀孕Lewis大鼠，并单独饲养在笼子(2184L Eurostandard Type II L，Tecniplast，West Chester，PA，USA)中，该笼子具有大纤维颗粒垫层和薄棉纸作为充实物(enrichment)。每天对其进行监测，并使之足月分娩。出生日期被登记为生命第一天。一窝幼崽被分成七只幼崽/母鼠，其中每窝中的雌雄数量相似。幼崽可以自由获取乳头和大鼠饲料。母鼠可获取对应于美国营养学会(AmericanInstitute of Nutrition，AIN)-93G diet ad libitum的水和市售饲料(Teklad GlobalDiet 2014，Envigo，Indianapolis，IN，USA)。每个母鼠和它的一窝幼崽单独地在受控的温度和湿度条件下，以12h：12h的光照：黑暗周期饲养。此外，这些动物被安置在一个专门的安全隔离室中，该隔离室经过特别设计并被批准可在2级生物安全性条件下工作。
所测试的实验营养物或营养组分为：
1)经热处理的经发酵婴儿配方食品。经发酵的乳是通过在制造过程中用短双歧杆菌C50和嗜热链球菌065对婴儿配方食品进行发酵而获得的。此过程为配方食品的组合物增加了活性细菌代谢物和细胞碎片(后生元化合物)。它是在法国市场上以名称Calisma和Apaisia，作为Bledina的产品而出售的。在WO 2004/093899的实施例1中描述了如何获得该婴儿配方食品的合适方法。
2)非消化性寡糖scGOS(来源：
Figure BDA0003025100180000201
GOS，Borculo Domo FrieslandCampina)和lcFOS(来源：
Figure BDA0003025100180000202
HP，Orafti)以9∶1的重量/重量(wt./wt.)比例的混合物。
3)赋形剂：营养组合物或成分在1和2中的赋形剂是矿泉水。
新生的哺乳期G14 Lewis大鼠被分为几个不同的实验组：
1)参照(REF)组，即未感染轮状病毒且未接受饮食干预的对照组
2)轮状病毒(RV)组)，即感染了轮状病毒且未接受饮食干预的对照组
3)研究组(FM+G/F)，即，感染了轮状病毒并补充了上述经发酵乳(FM)和非消化性寡糖scGOS/lcFOS(G/F)的混合物。FM和G/F的给予量分别为3g/100g体重/天和0.8g/100g体重/天。
每组由三窝幼崽组成，其中每窝有七个幼崽(n＝21/组)。REF和RV组得到与FM+G/F组同样数量的赋形剂至实验最后一天。在生命的第7天进行RV接种。
RV和FM+G/F组中的乳鼠在生命的第7天接种SA-11(2x108TCID50/大鼠，100μL磷酸盐缓冲液(PBS)中)。为了避免RV和乳成分之间的干扰，在与其母鼠分离1小时后进行RV接种。REF组在相同条件下接受了相同体积的PBS。
SA-11感染在第8-21天通过生长速率和来自粪便样品的临床指标进行评估。每日通过轻压并按摩腹部来进行粪便采样。试样立即被进行打分、称重并在-20℃冷冻以进行进一步分析。
在两个不同的时间点对动物实施安乐死：每窝有三只动物在RV接种后一周——第14天实施安乐死(n＝9/组)，而每窝的另外四只动物继续接受饲料直至哺乳期结束——第21天(n＝12/组)。处死之日，通过心脏穿刺收集血液来测定血细胞比容(HCT)并获得血清，并将其保存在-20℃下直至进一步分析。将肝、脾、大肠和小肠称重。另外，将小肠切成5毫米的小段，在摇床上于PBS中于37℃孵育10分钟，以得到肠道清洗液(GW)。离心后，将上清液储存在-20℃直至分析。
通过粪便重量和对粪便评分来评估腹泻的严重程度。根据颜色、质地和量，按照以下标准对粪便试样进行1-4分(腹泻指数，DI)的评分：正常(腹泻指数＝1)，松散黄绿色(腹泻指数＝2)，完全松散黄绿色(腹泻指数＝3)，大量水样(腹泻指数＝4)粪便。腹泻评分≥2表示腹泻的粪便，而腹泻指数＜2则表示不存在腹泻。另外，为了找到腹泻严重程度的总体值，对腹泻期间(第7-13天)的严重程度曲线下面积(AUC)进行了分析。最高腹泻指数被定义为腹泻期间的最高分。
腹泻的发病率用腹泻动物％(％DA)(就每组中的动物数量而言)和腹泻粪便％(％DF)(考虑到每组中每天收集的总样本量)来表达。计算第7-13天中腹泻动物％和腹泻粪便％的AUC，作为发病率的总体值。腹泻动物和腹泻粪便的最大百分比定义为腹泻期的最高值。针对每只动物计算腹泻期，其为腹泻的第一天和最后一天之间的间隔。腹泻期间内腹泻的实际天数也被计数在内。
在所有情况下，均应考虑每种治疗的固有方面的基础值，来计算严重程度、DA和DF的平均值和AUC；大体上就是由于每种治疗的固有方面(标准化结果)，要减去接种轮状病毒前一天的基础值。由于固有的粪便软化作用，该作用在食用G/F的组中尤为突出。
UV-经灭活的SA-11颗粒以105/mL用于盖覆96孔板(Nunc MaxiSorp，Wiesbaden，Germany)。用PBS-1％牛血清白蛋白(BSA，1小时，室温[RT])阻断后，加入适当的稀释血清或肠清洗液样品(3小时，室温)。洗涤后，加入购自Dako(Barcelona，Spain)的过氧化物酶偶联的兔抗大鼠Ig或购自BD Biosciences(Heidelberg，Germany)的小鼠生物素化抗大鼠IgA(A93-2)，IgG1/2a(R19-15)或IgM(G53-238)单克隆抗体(MAb)。之后，加入过氧化物酶结合的extravidin(Sigma-Aldrich，Madrid，Spain)和底物。来自先前研究的被RV感染的动物的合并血清被用作每个平板中的对照阳性。使用二次多项式调整。RV组的总抗RV Ab和抗RVIgG、IgA和IgM Abs的浓度为100个任意单位(AU)/mL，并且FM+P组和第21天的结果关于该给定值来表达。
将病毒接种后最多至10天(7-16天龄)的粪便样品用PBS中以20mg/mL的浓度稀释，并使用Polytron(Kinematica，Luzern，Switzerland)进行均质化。将粪便匀浆离心(200g，5min，4℃)，并将上清液冷冻在-20℃直至使用。粪便匀浆中的病毒颗粒通过上述ELISA技术进行定量。
为了进行统计学分析，使用了PASW Statistics 20软件包(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)。Komolgorov-Smirnov和Levene检验分别用于评估正态分布和方差相等。常规的单向ANOVA是将实验组视为自变量进行的。当SA-11接种/治疗对因变量产生重大影响时，用Scheffé事后检验。当发现非正态分布或不同方差时，使用Kruskal-Wallis和Mann-WhitneyU检验。最后，卡方检验用于比较腹泻发病率。P值＜0·05时，差异被认为是显著的。所有结果均表示为动物数的平均值和SEM。
结杲
对生长的作用：
记录所有动物的体重，饮食和病毒感染均未影响其生长。接种后直至第1天(第14天)均未观察到差异。这意味着可以忽略由于感染或饮食影响引起的体重减轻。但是，在实验结束——第21天(n＝9/组)，观察到一些差异。与REF和FM+G/F组相比，RV组的体重显著下降。如果考虑到总体体重增加(从第2天到第21天的％)，则仍观察到RV组中出现的这种体重减轻诱导(p＜0.05)，和FM+G/F干预的保护作用(参见表1)。
表1：研究期间，第7天病毒接种之前和之后的体重(g)。结果表示为平均值和SEM(n＝21只动物/组)。
年龄 BW(g)
REF RV FM+G/F
日 平均 SEM 平均 SEM 平均 SEM
2 6.45 0.10 6.92 0.24 6.22 0.10
7 11.66 0.24 11.83 0.22 11.10 0.20
14 23.32 0.37 23.17 0.41 22.96 0.48
21 34.6 0.66 28.76＊ 0.42 36.11 0.40
＊p＜0.05相较于REF
在REF组中，观察到相对体重增加411.11％。在RV组中，该值明显更低(p＜0.05)且为310.45％；在FM+G/F组中，没观察到这样的体重增加降低，且相对增加为439.90％。
对器官的作用
在第14天和第21天，轮状病毒感染也引起器官重量的某些变化。具体而言，在感染后7天(生命的第14天)，RV感染引起脾脏相对重量降低和肝脏相对重量升高(p＜0.05vs.REF)。在FM+G/F组中也观察到了对肝脏重量的影响，但在FM+G/F组中对脾脏的影响得到了改善。第21天的结果证明，与REF组相比，对RV组有显著影响(p＜0.05)，其中脾、肝和小肠(SI)相对重量较低。大肠的相对重量也较低。但是，补充FM+G/F混合物防止了RV感染对这些变量的影响(p＜0.05vs RV)，并且相对体重较高且与参考组无统计学差异。
腹泻的发病率
使用两种不同的方法评估腹泻的发病率：腹泻动物％(％DA)和腹泻粪便％(％DF)。
％DA表明，几乎所有RV接种的动物(95％至100％)在某个时间都表现出腹泻。如预期的那样，REF组(无RV接种)中只有不到5％的动物出现腹泻。在接种SA-11后的最初4天内(生命的第8天到第11天)，RV组的％DA高于80％。此后，该百分比下降，并且在第13天，RV组中没有动物有腹泻样粪便。FM+G/F组的动物在腹泻期间表现出一些改善。具体而言，该组相对于RV组显示出％DA降低的趋势，该趋势始于感染诱导后两天(第8-11天)。在生命的第9天和第10天，观察到腹泻发病率的改善，这明显低于RV组(p＜0.05)。
腹泻发病率以％DF计算，这只考虑了关于所获得的粪便样本的腹泻粪便数量，所有组均显示出与上述结果相同的模式，并且在FM+G/F组中观察到更高的有益效果；在第8、9、10、11和12天显示出较低的腹泻粪便％。
RV组的腹泻过程在接种后1-2天开始，并在生命的第11天左右结束。腹泻期和腹泻天数都在3到4天之间。在FM+G/F组中，这些时期的长度稍短，尤其是在查看腹泻粪便(DF)％时。在这种情况下，腹泻的持续时间缩短，并且在第11天已经观察不到腹泻粪便。在任何情况下，RV组在RV诱导后第3天(第10天)具有最大发病率(％DA和DF％)，而FM+G/F组在感染后第一天(第8天)显示最高值。
当计算％DA-AUC(曲线下的面积)和％DF-AUC时，RV组的值分别为328.57和362.06任意单位，而REF动物没发生腹泻且AUC值约为0。FM+G/F组观察到明显的总体降低。％DA-AUC降至207.14(与RV组相比为63％)，％DF-AUC降至107.87(RV组的30％)。
腹泻的严重程度
RV组的腹泻指数(DI)从第8天到第10天高于2.5，此后平均得分在第11天下降到大约2，之后甚至更低，这表明大多数动物都没有腹泻。在FM+G/F组中，观察到显著降低，并且在所有感染后的日子里，除第一天外，DI均低于2。
RV组的严重程度模式(sAUC)的AUC为5.99。观察到FM+G/F组的sAUC显著降低至3.27(约55％)(p＜0.05)，表明该过程的严重程度总体降低。
病毒脱落
接种后(第7-16天)评估病毒脱落。在所有接种RV的动物中，最大的病毒清除(p＜0.054vs REF)发生在接种后的第一天(第8天)，而之后，REF和RV组之间未观察到差异。接种后的第一天，FM+G/F干预部分避免了这种脱落增加，表明病毒载荷低于RV组(约35％；p＜0.05)，与REF动物更为相似。
免疫应答
在生命的第14天和第21天评估了血清特异性抗RV抗体(总量、IgG、IgM和IgA)以及肠道IgA和IgM。与REF组相比，RV组甚至在生命的第14天，血清和肠中的抗RV总量、IgA、IgG和IgM均具有可测量水平。
饮食中补充FM+G/F能够改变针对RV的特异性体液免疫应答。在第14天，尽管总血清抗RV抗体似乎不受饮食影响，但观察到IgM呈增加趋势，IgG显著升高(p＜0.05vs RV)，而IgA显著降低(p＜0.05vs RV)。
对于肠腔，由于FM+G/F饮食，在第14天存在诱导较高水平的IgA但在第21天诱导较低水平的趋势。就血清抗RV IgG和肠道抗RV IgA而言，FM+G/F混合物似乎增强了早期应答(第14天)。
实施例2：轮状病毒阻断实验
进行体外阻断测定法以测试FM+G/F、FM或G/F绑缚SA11轮状病毒的能力。将96孔板与5x104颗粒/ml的SA-11在1重量％的PBS-Tween中与不同稀释度的营养物或营养组分(用矿泉水稀释)共同孵育，并孵育30分钟。未结合的病毒颗粒通过ELISA进行定量(Pérez-CanoF J等人，2007，Pediatr Res 2007；62：658-663)。用SA-11病毒颗粒(105至103/ml)作为每个平板中的标准。该试验允许将接种后用多个稀释液的产物检测的SA-11颗粒数以及抑制百分比定量。未稀释形式的FM+G/F为267mg/ml，其中211mg/ml FM和56mg G/F。对于FM和G/F，储备溶液分别为211mg/ml和56mg/ml。选择这些量，因为它们对应于实施例1中每天的摄入量。
结果示于表2。实施例1中使用的营养物或营养组分的所有稀释液均具有抑制活性。特别地，FM+G/F显示出高结合活性，表明该混合物具有高阻断潜能。
表2：用在营养物和/或营养组分的不同稀释度下的G/F、FM和FM+G/F孵育后，对RV颗粒检测的抑制百分比。结果用其来自三个独立实验的重复样品的SEM表示。
Figure BDA0003025100180000261
＊p＜0.05vs没添加产品的％抑制作用。Nd：未测定
#p＜0.05vs单独地具有G/F或FM的产品的抑制％
轮状病毒颗粒的绑缚被认为是有益的。由直接相互作用引起的它们的阻断将避免或减少轮状病毒进入肠细胞以及在小肠中复制。基于单独的G/F和FM的数据，FM+G/F与轮状病毒颗粒的绑缚远超预期。这些结果表明食用包括部分发酵的组合物和非消化性寡糖的结合的组合物，对预防和/或治疗轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻具有出乎意料的改善效果。特别是，在与无经发酵组合物或无非消化性寡糖的情况相比时，可以预期对预防、减少轮状病毒感染的病毒载荷具有效果，并且这可以使得轮状病毒腹泻严重程度降低、发病率降低和持续时间降低，和/或病毒脱落减少。
实施例3：经发酵配方食品与非消化性寡糖对大鼠轮状病毒感染的作用
进行类似于实施例1的实验，除了是在第5天进行RV的接种。如本领域中已知的，测量了额外的肠通透性并且测量了盲肠短链脂肪酸。
所测试的实验营养物或营养组分为：
1)经热处理的经发酵婴儿配方食品。经发酵乳是通过在制造过程中使用短双歧杆菌C50和嗜热链球菌065对婴儿配方食品进行发酵而获得的。此过程为配方食品组合物增加了活性细菌代谢物和细胞碎片(后生元化合物)。它在法国市场上以名称Lactofidus或Lactofidia，作为Bledina的产品出售。发酵步骤(10分钟，90℃)后，采用另外的加热步骤以杀死产乳酸细菌。与实施例1中的配方食品的区别在于，发酵和乳酸产生略有增加。L-乳酸的量为约1.1g/100g。
2)非消化性寡糖scGOS(来源：
Figure BDA0003025100180000271
GOS，Borculo Domo FrieslandCampina)和lcFOS(来源：
Figure BDA0003025100180000272
HP，Orafti)以9∶1重量/重量的比例的混合物。
3)赋形剂：营养组合物或成分1和2中的赋形剂是矿泉水。
新生的哺乳期G14 Lewis大鼠被分为几个不同的实验组：
1)参照(REF)组，即未感染轮状病毒且未接受饮食干预的对照组
2)轮状病毒(RV)组)，即被轮状病毒感染且未接受饮食干预的对照组
3)研究组(G/F)，即该小组感染了轮状病毒，并补充了非消化性寡糖scGOS/lcFOS(G/F)的混合物。G/F分别以0.8g/100g体重/天的量给予。
4)研究组(FM)，即感染了轮状病毒，并补充了经发酵乳(FM)。FM以3g/100g体重/天的量给予。
5)研究组(FM+G/F)，即感染了轮状病毒，并补充了上述经发酵乳(FM)和非消化性寡糖scGOS/lcFOS混合物(G/F)。FM和G/F的给予量分别为3g/100g体重/天和0.8g/100g体重/天。
作为对照组，还包括了3组喂食了相同的第3、4和5组的补充剂但没感染轮状病毒的大鼠。用这些组中获得的针对腹泻的值作为基线来标准化腹泻指数DI和腹泻发病率(％DA)。
结果：
根据腹泻指数(DI)，在RV组2中，腹泻发作从第6天(RV接种后1天)一直持续到第9天。在第10天，所有组的腹泻均已停止。在第3组和第4组中，由DI确定的腹泻持续时间相同。在第2组中观察到腹泻期(第6-9天)的最大DI。在第5组中，基于DI的腹泻在第9天时已明显低于RV组2。在腹泻的所有天中，第5组的DI最低。这表明实验组5中腹泻的持续时间较短。
在第5组中，腹泻发病率(基于总动物中腹泻的动物数，％DA)是最低的。在第9天，仅第5组中已无腹泻发病率，而第2、3和4组中仍有，这表明给予FM和NDO的组合时，缩短了持续时间或轮状病毒感染。
表3：归一化的腹泻发病率指标]
Figure BDA0003025100180000281
MDA，最大腹泻动物(％)，DA-AUC：％DA模式曲线下的面积。
与第2组相比，第5组的最大腹泻发病率(MDA)——峰值发病率——显著降低(使用卡方检验)。与第2组相比，第3和第4组的MDA也降低了。实验过程中腹泻指数曲线下的面积，第5组最小(8.33)，而第2组最大(166.66)。在第3组该值为29.52，第4组为86.23。同样地，第5组的低值比基于单独的第3组和第4组的效果作出的预期更低。这表明食用FM和G/F两者的组的严重程度有所降低。
肠道通透性是通过第8天时肠清洗液中的α-1抗胰蛋白酶水平确定的。有趣的是，FM和G/F的组合最大程度地增加了轮状病毒感染期间的肠屏障功能。
观察到的肠屏障功能的改善可以用第5组中肠丁酸的意外增加来解释。丁酸盐是肠上皮细胞的养料，并改善肠屏障。第2组的盲肠丁酸盐水平为239.21μmol/g盲肠物质。第5组中丁酸增加的水平(484.39μmol/g盲肠材料)超出了基于单独的第3组(164.75；μmol/g盲肠材料，即丁酸酯的减少)和第4组(309.72μmol/g盲肠物质)所发现的水平可作出的预期。

Claims (11)

1.一种营养组合物，其包括经产乳酸细菌发酵的乳基质，并且包括非消化性寡糖，用于在婴儿或幼儿中治疗和/或预防轮状病毒感染或轮状病毒引起的腹泻。
2.一种营养组合物，其包括经产乳酸细菌发酵的乳基质，并且包括非消化性寡糖，用于在婴儿或幼儿中
a.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的发病率，
b.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的持续时间，
c.降低轮状病毒引起的腹泻或轮状病毒感染的严重程度，
d.预防轮状病毒引起的生长迟缓或生长不良和/或发育迟缓或发育不良，
e.提高轮状病毒颗粒的阻断，
f.降低轮状病毒载荷，和/或
g.提高轮状病毒感染期间的肠屏障功能。
3.根据权利要求2使用的营养组合物，其中所述降低、预防或提高在与给予了未经至少部分发酵并且不包括非消化性寡糖的营养组合物的婴儿或幼儿比较时被观察到。
4.根据前述权利要求中任一项使用的营养组合物，其中所述营养组合物包括基于所述组合物干重计，总和为0.1至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，并且优选其中基于全部乳酸和乳酸盐的总和计，L-乳酸和L-乳酸盐的总和多于50重量％。
5.根据前述权利要求中任一项使用的营养组合物，其中所述营养组合物包括产乳酸细菌，优选选自双歧杆菌和链球菌，优选两者兼有。
6.根据权利要求1-4中任一项使用的营养组合物，其中所述营养组合物包括经灭活的产乳酸细菌。
7.根据前述权利要求中任一项使用的营养组合物，其中所述营养组合物包括2.5至15重量％非消化性寡糖，基于所述营养组合物的干重计。
8.根据前述权利要求中任一项使用的营养组合物，其中所述非消化性寡糖选自果寡糖、非消化性糊精、半乳寡糖、木寡糖、阿拉伯寡糖、阿拉伯半乳寡糖、葡寡糖、龙胆寡糖、葡甘露寡糖、半乳甘露寡糖、甘露寡糖、异麦芽寡糖、黑曲霉寡糖、葡甘露寡糖、壳寡糖、大豆寡糖、唾液酸寡糖和岩藻寡糖，及其混合物。
9.根据权利要求7使用的营养组合物，其中所述非消化性寡糖选自半乳寡糖和果寡糖，优选两者兼有。
10.根据前述权利要求中任一项使用的营养组合物，其中所述营养组合物不包括果胶衍生的酸性寡糖，特别是半乳糖醛酸寡糖。
11.根据前述权利要求中任一项使用的营养组合物，其中所述营养组合物是婴儿配方食品或后续配方食品。
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