KR100462192B1

KR100462192B1 - 로타바이러스 감염 억제효과를 갖는 락토바실러스 카제이에이치와이7201 및 그 용도

Info

Publication number: KR100462192B1
Application number: KR10-2003-0019253A
Authority: KR
Inventors: 허철성; 이정준; 심재중
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2003-03-27
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2004-12-18
Also published as: KR20040084285A

Abstract

본 발명은 유아의 급성 장염 및 설사의 원인으로 알려진 로타바이러스에 대하여 감염 억제효과가 있는 락토바실러스 카제이 HY7201과 이를 이용한 유산균 제제, 발효유에 관한 것이다.

본 발명에 따른 락토바실러스 카제이 HY7201은 유아 설사 및 위장염의 원인으로 알려진 로타바이러스 감염 억제에 효과가 있으며, 나아가 이를 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 제품으로 제조하여 섭취할 경우 로타바이러스 감염에 의한 설사 및 위장염의 예방 효과를 갖는다.

Description

로타바이러스 감염 억제효과를 갖는 락토바실러스 카제이 에이치와이7201 및 그 용도{Lactobacillus casei HY7201 and the products thereof}

호주의 bishop에 의해 1973년에 처음 발견된 로타바이러스(Rotavirus)는 레오비리데(Reoviridae)과에 속하는 바이러스로서, 영유아에게 발생하는 급성 설사증과 위장염을 일으키는 주요 원인이며 선진국이나 개발도상국 모두에서 지속으로 발병하고 있다. 특히 6개월에서 2세 미만의 소아에게서 발병율이 높고 신생아 또는 성인에게는 가볍거나 증상이 없는 것으로 나타나지만 세계적으로 년간 100만 여명의 영유아 사망을 초래하는 것으로 추정되고 있다[참고문헌: Kapikian , A. Z., in Fields Virology 3rd ed. 1657~1708 (1996)]. 로타바이러스는 envelope이 없고, outer capsid와 core를 갖고 있다. 로타바이러스의 몸체에는 3겹의 단백질 껍질 내에 11개의 ds RNA 절편 genome이 있다. 제일 바깥쪽 껍질은 당단백질인 VP7(37kDa)과 트립신에 의해서 활성화되는 VP4(88kDa)로 구성된다. 중간 껍질은 두꺼운 층의 VP6이며 core내에 구조단백질인 VP2, RNA polymerase 및 guanylytransferase를 표지하는 것으로 추정되는 VP1과 VP3 그리고 11개의 genome 단편들이 포함되어있다. 로타바이러스 strain 들간에 이들 RNA 단편들의 잦은 교환으로 유전적 다양성이 나타난다[참고문헌: Estes, M. K., Microbiol. Rev. 53(4):410-449. (1989)].

로타바이러스는 소장의 융모세포에 감염되어 이들 세포의 세포질에서 증식하여 수송기전에 장애를 일으킨다. 손상된 세포는 장관으로 떨어지고 다량의 바이러스를 방출하여 분변에서 바이러스가 발견된다. 로타바이러스에 의한 설사는 융모의 손상된 세포가 흡수능력이 없는 미숙한 선와세포(crypt cell)로 대체됨으로써 발생하는 나트륨과 포도당의 흡수 기능 손상에서 기인하는 것이다. 구토 및 설사에 의해 소실된 수분과 전해질을 보충해줌으로써 로타바이러스에 의한 장염의 치료는 가능하지만[참고문헌: Santosham, M., J. Pediatr. 118:S44-S51. (1991)], 현재까지효과적인 로타바이러스 백신은 개발되어 있지 않은 상태다.

로타바이러스는 다양한 혈청형에 의해 발병하기 때문에 백신개발에 어려움이 있다[참고문헌: Conner, M. E. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 105:253. (1994)]. 지금까지의 백신 개발에 관한 연구는 생독 백신에 초점이 맞추어져 있었다. 능동 점막 면역을 유도시키기 위한 십 수년의 연구결과, 로타바이러스 백신이 개발되어, 1997년 12월 미국 식품의약청은 Wyeth Laboratories의 경구용 4가 생독 백신을 허가하였고, 1998년 최종 허가를 획득함으로써 시중 판매가 시작되었다. 이 백신은 원숭이 로타바이러스와 사람 로타바이러스를 감염시킴으로써 G타입을 방지하고자 한 생독 백신이었다. 경구 투여한 생독 백신은 소장 점막에 도달한 후 점막세포에서 증식함으로써 소장 점막 내에 IgA 항체를 형성시켜 이 IgA 항체로 하여금 침입하는 바이러스를 중화시켜 감염을 방지하고자한 것이다. 그러나 이 백신은 판매가 시작된 지 불과 3개월만에 판매를 중지하게 되는데, 이 백신을 투여한 유아 15명에게서 장 중첩 현상이 일어나 Wyeth Laboratories는 결국 허가 획득 11개월 만인 1999년 7월 철수함으로써 현재 로타바이러스 백신은 없는 상태이다[참고문헌: MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 48(43):1007. (1999)].

백신제조가 어려움에 따라 유전자 재조합 기술을 이용하여 로타바이러스 구성체의 일부를 대장균이나 베큘로바이러스 등의 발현시스템에서 생산하는 백신 제조가 시도되고 있으며 최근에는 천연물이나 유산균을 이용한 로타바이러스 감염 억제가 시도되고 있다. 초유, 난황, 녹차추출물, 락토페린 및 감초산 등 식품성분으로 로타바이러스의 감염을 방어하는 여러 연구가 보고되고 있다. 또한 건강에 유익한 것으로 알려져 있는 유산균 또는 유산균 발효유의 음용으로 로타바이러스 감염에 의한 유아의 급성 설사 예방 또는 치료에 효과적이라는 보고가 있었다.Streptococcus thermophilus와Bifidobacterium bifidum을 섭취한 유아에게서 설사 횟수와 분변으로 배출되는 로타바이러스가 감소되었다[참고문헌: Saavedra, J. M. Lancet. 344:1046-1049. (1994)]. 또한Lactobacillus reuteri[참고문헌: Shornikova, A. V.,J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 24(4), :399-404. (1997)] 또는Lactobacillusstrain GG를 섭취한 유아에서 설사 증상이 호전되는 것이 관찰되었고[참고문헌: Isolauri, E. Pediatrics. 88(1):90-97. (1991)],Lactobacillus casei발효유를 젖먹이 레트(rat)에 음용시킨 결과, mucoasa integrity를 강화하고 로타바이러스가 villi에 감염되는 것을 감소시켜 설사로부터 보호하는 것으로 보고되었다[참고문헌: Guerin-Danan, C., J. Nutr. 131(1):111-117. (2001)]. 그리고Bifidobacterium breveK-110은 로타바이러tm 감염을 저해한다고 보고되었다[참고문헌: Bae, E. A., J. Microbiol. Biotechnol. 12(4):553-556. (2002)].

본 발명은 유아의 설사, 급성 장염의 원인으로 알려진 로타바이러스에 대한 감염 억제 능력을 가진 유산균을 제공하고 이를 유효성분으로 하는 유아 설사 및 급성 장염 예방제를 제공하는 데 있다.

도 1a 및 1b는 각각 로타바이러스를 감염한 MA-104 세포와 락토바실러스 카제이 HY7201을 혼합하여 로타바이러스를 감염한 MA-104 세포를 염색한 그림.

도 2는 락토바실러스 카제이 HY7201의 환원탈지유 배양액 첨가량에 따른 로타바이러스 억제 효과를 도시한 그래프

도 3은 락토바실러스 카제이 HY7201의 배양액 또는 균체의 로타바이러스 억제 효과를 도시한 그래프

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 사람으로부터 분리하여 보존하고 있던 락토바실러스 속의 유산균 중에서 국내 유아의 설사 분변에서 분리한 로타바이러스에 대한 항 감염 활성을 갖는 유산균을 선발하여, 이를 락토바실러스 카제이 (Lactobacilus casei) HY7201로 명명하였다. 본 발명의 신규한 미생물은 2003. 3. 10.자 한국농업생명공학연구원에 기탁번호 KACC 91036호로 기탁하였다.

균주 특성

락토바실러스 카제이 HY7201을 앰알에스(MRS) 배지에서 37℃, 18시간 배양하였을 때의 생리학적 특성을 이하의 표 1에 나타내었다.

락토바실러스 카제이 HY7201의 생리학적 특성

생리학적 특성	결과
세포의 형태	간균
그람 염색	양성
집락 형태크기색조	원형직경 0.5∼2.0mm유백색
우유 응고성카탈라제베타-갈락토오스 분해효소알라-글루코오스 분해효소산소의 영향	+-+-통성혐기성
당이용성
당	반응	당	반응
에리스리톨리보스아도니톨갈락토오스글루코오스프럭토오스만노스소르보스람노스만니톨솔비톨아세틸글루코사민아미그달린알부틴에스큘린	-+-+++++-++++++	살리신세로비오스말토오스락토오스멜리비오스수크로오스트레할로스이눌린멜레지토스라피노스아미돈투라노오스타가토오스아라비톨	++-+--+-+--++-

로타바이러스 감염억제 효과

락토바실러스 카제이 HY7201을 10% 환원탈지유에 0.2% 접종하고 37℃에서 18시간 배양한 후, 로타바이러스 감염 억제 활성을 측정하였다. 그 결과 락토바실러스 카제이 HY7201은 85∼92%의 감염 억제 효과를 보여 다른 유산균에 비해 로타바이러스 감염 억제 활성이 높았다. (후술하는 실시예 1참조)

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명이 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 당업자에 의해 통상적인 변화가 가능함은 물론이다.

실시예 1

로타바이러스 감염 억제 활성을 갖는 유산균의 선발

발효유에 사용 가능한 유산균을 대상으로 한국인 유아로부터 분리한 로타바이러스 Wa strain(ATCC VR-2018)과 KRV01(KFCC 11313호)에 대한 감염 억제 활성을 비교하였다.

유산균은 10% 환원탈지유 또는 MRS 배지에 18시간 배양한 후 시험에 사용하였다. 로타바이러스를 준비하기 위해 로타바이러스 용액에 트립신을 5㎍/㎖의 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 활성화한 후 MA-104 (Marcus monkey kidney cell)단층세포에 접종하고 1시간 동안 흡착하였다.

트립신이 함유된 최소배지(Eagle's minimum essential medium, MEM)를 첨가하고 37℃에서 배양하면서 세포변성효과(cytopathic effects, CPE)가 90%이상일 때 회수하여 액체질소에서 냉동과 해동을 3회 반복한 후 냉동보관하면서 실험에 사용하였다.

6공(6-well) 세포배양 플레이트에 MA-104 단층세포를 준비하고 인산 완충액(phosphate buffered saline: PBS)으로 2회 세척하였다. 최종 역가가 1×10⁵pfu/ml이 되도록 준비한 로타바이러스와 최종 첨가량이 5%가 되도록 준비한 유산균 배양액들을 혼합하여 30분 동안 정치한 다음 MA-104 세포에 감염하고 18시간 동안 37℃, CO₂배양기에서 배양하고 두 차례 PBS로 세척하였다. 10% 포르말린을 30분 동안 처리하여 고정시키고 다시 PBS로 세척한다.

다음에는 0.5% Triton X-100을 5분간 처리하고 세척한 다음 PBS에 1% BSA(bovine serum albumin)를 첨가한 PBA에 1:250의 비율로 항 로타바이러스 항체를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 정치하였다.

PBA로 3회 세척하고 1:500의 비율로 페록시데이즈(peroxidase)가 융합된 당나귀 항 고트 IgG(donkey anti-goat IgG)를 첨가된 PBA를 첨가한 후 37℃에서 30분간 정치하였다. PBS로 3회 세척한 후 N,N-dimethylformamide ㎖당 3-amino-9-ethylcarbazole 4㎎을 용해한 액과 0.05M sodium acetate buffer, 그리고 과산화수소를 각각 1.5 ㎖, 3.5 ㎖, 5 ㎕의 비율로 혼합한 발색 용액을 고정된 세포에 첨가하고 15분간 반응하였다. 발색 용액을 제거하고 PBS로 세척한 후 역상 현미경으로 감염된 세포를 계수하였다. 저해율은 시료에 의해 감소된 감염 세포 수와 로타바이러스만을 접종한 대조구의 감염세포수의 비로 측정하였다.

다음의 표 2에서 보는 바와 같이 락토바실러스 균주별로 다양한 로타바이러스 감염 억제율을 보였으며, 이 같은 억제율은 로타바이러스 Wa strain과 KRV01에서 비슷하게 나타났다. 락토바실러스 카제이 HY7201의 경우는 Wa strain 85%, KRV01 92%의 감염 억제율을 보여 로타바이러스 감염 억제능이 가장 우수한 것으로 나타났다(도면 1a, 1b).

유산균의 로타바이러스 감염 억제 효과

Strains	로타바이러스 감염 억제율(%)
Strains	Wa strain	KRV01
Lactobacillus acidophilusHY7121	25	17
Lactobacillus acidophilusHY7141	27	22
Lactobacillus acidophilusHY7155	11	20
Lactobacillus caseiHY7201	85	92
Lactobacillus caseiHY7244	12	5
Lactobacillus rhamnosusHY7321	8	15
Lactobacillus bulgaricusHY7403	45	33
Lactobacillus plantarumHY7244	37	30
Lactobacillus plantarumHY7207	42	28
Lactobacillus fermentumHY7255	10	16
Lactobacillus brevisHY7505	15	23

실시예 2

락토바실러스 카제이 HY7201 농도별 로타바이러스 감염 억제 효과

락토바실러스 카제이 HY7201을 10% 환원탈지유에 0.2% 접종한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 발효액의 생균수는 5×10⁸cfu/ml이었으며 발효액 첨가량을 0.5%, 1%, 2.5% 5%, 10%로 에 따른 로타바이러스 감염 억제 효과를 실시예 1에 따라 수행한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 락토바실러스 카제이 HY7201로 배양한 환원 탈지유 배양액의 농도가 5% 이상일 때 가장 높은 로타바이러스 감염 억제효과를 보였다.

실시예 3

락토바실러스 카제이 HY7201 균체의 로타바이러스 감염 억제 효과

MRS 배지에 락토바실러스 카제이 HY7201을 0.2% 접종한 후 37℃에서 18시간 배양하였다. MRS 배양액을 6,000×g에서 원심분리하여 얻은 상등액, 균체와 상기MRS 배양액의 로타바이러스 억제 효과를 실시예 1에 따라 시험하였다. 그 결과 도 3에서처럼 배양 상등액, 균체의 로타바이러스 감염억제 효과를 측정한 결과 균체의 억제 효과가 61%로 더 높게 나타났다.

실시예 4

마우스에서 락토바실러스 카제이 HY7201의 로타바이러스성 설사 억제 효과

5일령된 balb/c 마우스를 각 실험군마다 12마리씩 배정하였다. 감염군과 투여군에는 로타바이러스 SA11을, 대조군에는 MEM배지를 경구 투여하였다. 로타바이러스의 감염은 마리당 0.5ml (1.5×10⁷PFU/마리)의 로타바이러스를 1일 1회 투여하여 2일간 감염시켰다. 대조군에는 로타바이러스를 감염시키지 않고 대신 동일 량의 MEM배지를 투여하였다. 이와 함께 한 투여군에는 10% 환원 탈지유에서 37℃, 18시간 배양한 락토바실러스 카제이 HY7201 배양액(5×10⁸cfu/ml)을, 다른 투여군에는 10% 환원탈지유를 2일령부터 7일령까지 매일 0.1 ㎖ 투여하였다. 설사유발의 판정은 마우스의 배를 가볍게 눌러서 황록색의 변이 확인된 경우에 설사가 유발된 것으로 결정하였으며, 설사유발 정도는 설사지수(Diarrhea score, DS)로 계수하였다. 설사가 심한 것은 2점, 약한 것은 1점, 증상이 없는 것은 0점으로 하여 합산한 후 총 마우스의 수로 나누었다.

다음의 표 3에서 보는 바와 같이 로타바이러스 감염군은 12마리 중 10마리의 마우스에서 심한 설사증상이 있었으며, 2마리에서도 약한 설사현상이 보여 설사지수 1.75를 나타냈다. 그리고 환원 탈지유를 투여한 경우에도 설사지수가 1.83을 보여 환원탈지유에 의한 로타바이러스 억제효과는 확인할 수 없었다. 이에 비하여 10% 환원탈지유에 배양한 락토바실러스 카제이 HY7201을 투여한 군에서는 경증의 설사가 2마리에서만 발생되어 설사지수가 0.17로 크게 낮아짐을 확인하였다. 따라서 락토바실러스 카제이 HY7201의 로타바이러스 감염 억제효과를 확인할 수 있었다.

락토바실러스 카제이 HY7201의 로타바이러스성 설사 억제 효과

treatment	실험 마우스 수(마리)	설사가 유발된 마우스 수(마리)	설사지수(D.S.)
대조군	12	0	0
로타바이러스 감염군	12	12	1.75
환원 탈지유 투여군	12	12	1.83
Lb. casei HY7201 투여군	12	2	0.17

실시예 5

발효유 제조

탈지 분유를 사용하여 무지고형분의 함량을 8~20%로 조정한 원료유를 72~75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 냉각시킨 후 락토바실러스 카제이 7201을 10⁶cfu/㎖의 농도로 접종한 후 pH 4.5 수준까지 배양하였다. 과즙 농축액 0.1~50%, 식이 섬유 0.1~20%, 포도당 0.5~30%, 올리고당 0.1~15%, 칼슘 0.001~10%, 비타민 0.0001~5% 등을 녹에 만든 시럽을 제조하였다. 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하고 상기 배양액과 일정 비율로 혼합, 교반하여 균질한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 이렇게 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에 있어 양호한 결과를 보였다.

실시예 6

유산균 분말의 제조

락토바실러스 카제이 HY7201을 MRS 브로스(broth)에 10⁶cfu/㎖의 농도로 접종하고 37℃에서 30시간 동안 pH 조절 발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. pH 조절은 암모니아 가스를 중화제로 하여 pH 5.7±0.2로 실시하였다. 배양 종료 후 6,000×g로 원심분리하여 균체를 회수하였다.

회수된 균체는 5% 환원탈지유에 2.5% 유청(whey), 5% 수크로오스(sucrose)가 함유된 보호제와 동량으로 혼합한 후 동결 건조기를 사용해 분말로 제조하였다. 이렇게 제조된 락토바실러스 카제이 HY7201의 건조분말은 모두 1×10¹¹cfu/g 이상의 생균수를 나타내었다.

실시예 7

유산균 제제 제조

상기 실시예 4에서 제조함 유산균 분말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 락토바실러스 카제이 HY7201을 건조 유산균 분말 20중량%에 올리고당 10중량%, 무수포도당 20중량%, 결정과당 5중량%, 비타민C 2중량%, 과일분말향 5중량%, 알로에 5중량%, 식이 섬유 15중량%를 혼합하여 스틱 또는 병, 캔에 일정량 분주하여 포장하였다.

이렇게 제조된 유산균 제제는 5×10⁸cfu/g의 생균수를 유지하였으며, 관능검사 결과 이미, 이취 등에 영향이 없었으며 전체적인 맛에 있어서도 양호한 결과를 가져왔다.

상기 실시 예로부터 알 수 있는 것과 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이 HY7201은 유아 설사 및 위장염의 원인으로 알려진 로타바이러스 감염 억제에 효과가 있으며, 나아가 이를 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 제품으로 제조하여 섭취할 경우 로타바이러스 감염에 의한 설사 및 위장염의 예방 효과를 갖는다.

Claims

로타바이러스 감염 억제 효능을 갖는 신규한 락토바실러스 카제이(Lactobacilus casei) HY7201 균주 (KACC 91036).
제 1항의 락토바실러스 카제이 HY7201 균주를 유효성분으로 하여 로타바이러스 감염 억제에 효능이 있는 발효유.
제 1항의 락토바실러스 카제이 HY7201 균주를 유효성분으로 하여 로타바이러스 감염 억제에 효능이 있는 유산균 분말.
제 1 항의 락토바실러스 카제이 HY7201 균주를 유효성분으로 하여 로타바이러스 감염 억제에 효능이 있는 유산균 제제.