CN115044642B - 一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用，所述评价方法包括如下步骤制备铁牛奶培养基、培养纯种的产气荚膜梭菌、在铁牛奶培养基中接种产气荚膜梭菌纯种培养液和待评价的抑菌剂，置于46‑48℃水浴培养5h，产生暴烈发酵现象的评价为无抑菌效果，暴烈发酵现象被抑制的评价为有抑菌效果；所述铁牛奶培养基的制备方法为将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，加入七水硫酸亚铁，混合混匀，分装于大试管中，每管10mL，分装完成，给大试管盖上硅胶塞，用牛皮纸包裹，然后100℃沸水浴10min灭菌。本发明的暴烈发酵法可以用于产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果评价，为饲粮禁抗环境下饲料企业快速筛选可以大规模商用的产气荚膜梭菌抑菌剂提供了有力的保障。

Description

一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用。

技术背景

饲粮禁止使用抗生素以后，畜禽养殖上问题频发，肠炎等问题更为突出，不仅严重影响畜禽肠道健康，而且造成巨大的经济损失，因此禁抗后畜禽养殖最重要的就是关注肠道健康问题。目前，坏死性肠炎是畜禽肠道健康面临的巨大挑战，而产气荚膜梭菌是导致坏死性肠炎的最主要因素之一。

目前各大养殖终端一般采取添加益生菌、中草药提取物等添加剂对产气荚膜梭菌进行抑制以防控坏死性肠炎。但是这些添加剂对产气荚膜梭菌的抑菌效果究竟怎么样，需要进行评价，有确定的效果才能引入规模化饲料生产中，目前对于产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法一般有两种方式：动物试验评价和实验室体外评价。所述动物试验评价一般通过动物的采食量、死淘率、肠道病理切片、肠道菌群的变化来评价，试验周期较长，对成本、场地要求较高，不确定因素较多。所述实验室体外评价一般采用牛津杯平板法，该方法通过添加剂抑制产气荚膜梭菌的生长在平板上形成透明圈，通过透明圈的直径来评判抑菌效果。这种方法受限于产气荚膜梭菌的菌种特性（厌氧培养，产气），实验周期长。在目前有关产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果评价的文献中，大多采用这种方法。

牛津杯平板法的原理是平板培养基用胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸盐琼脂基础（TSC）,其中含有的柠檬酸铁铵与偏重亚硫酸钠吸收产气荚膜梭菌生长过程中产生的硫化氢，使得平板变黑；添加抑菌剂抑制了菌体硫化氢的生长，形成透明圈。但在实践中发现，牛津杯法的试验效果不稳定，随着产气荚膜梭菌的产气量的变化，平板经常全部变黑，需要经过日光脱色来进行抑菌圈直径的测量，而脱色时间不好把控，一旦时间过长，平板完全脱色，无法比对抑菌效果。

基于对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果准确评价的需求，饲料企业引入暴烈发酵法进行评价。所暴烈发酵法引自国标GB4789-2012产气荚膜梭菌检验，其原理：培养基中含全脂牛奶和硫酸亚铁，其中全脂牛奶中含有乳糖，硫酸亚铁提供低的氧化还原电势，产气荚膜梭菌生长过程中发酵乳糖、凝固酪蛋白并大量产气，乳凝结物破碎快速形成海绵样物质，产生暴烈发酵现象。可以推知，当存在抑菌因子时，可以抑制产气荚膜梭菌生长，不会出现“暴烈发酵”现象，因此用暴烈发酵法操作简单、设备要求低、实验周期短，可以对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果进行快速评估。

但是该方法在实际对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果进行评价时遇到了许多问题，主要是培养基的试验效果不稳定。不管是自制培养基还是商品化培养基，常见的问题就是培养基在使用前就出现少量结块（凝乳现象）、产气荚膜梭菌在培养基中不生长导致对抑菌效果的误判等等。在目前饲料禁抗的背景下，对各类产气荚膜梭菌抑菌剂的准确评价就非常重要，现有技术的误判率高，对饲料企业转型造成非常不利的影响，因此急需对现有的对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法进行改进。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提出一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用。

本发明提供了一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法，所述评价方法包括如下步骤：

步骤1）、制备铁牛奶培养基：所述铁牛奶培养基组分为脱脂奶粉100.0g、七水硫酸亚铁1.0g、蒸馏水1050.0ml，制备方法为将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，不断搅拌，加入七水硫酸亚铁，混合混匀，分装于大试管中，每管10mL，分装完成，给大试管盖上硅胶塞，用牛皮纸包裹，然后100℃沸水浴10min灭菌；所述铁牛奶培养基须新鲜配制；

步骤2）、培养纯种的产气荚膜梭菌：将产气荚膜梭菌模式菌株冻存液接种入液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃静置培养2d后，得到产气荚膜梭菌的纯种培养液；

步骤3）、在步骤1）获得的铁牛奶培养基中接种步骤2）获得的产气荚膜梭菌纯种培养液1ml和待评价的抑菌剂1ml，置于46-48℃水浴培养5h，即可观察试验结果，产生暴烈发酵现象的评价为无抑菌效果，暴烈发酵现象被抑制的评价为有抑菌效果。

优选地，所述步骤1）中100℃沸水浴10min灭菌。

本发明提供的产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法应用在饲料生产和畜禽养殖生产上。

本发明的有益效果如下：

国标GB4789-2012产气荚膜梭菌检验中的暴烈发酵法是针对食品中是否含有产气荚膜梭菌的检测方法，但在饲料和养殖企业快速评价产气荚膜梭菌抑菌剂抑菌效果的生产实践上却并不适用。本发明在暴烈发酵法的基础上，确定了100℃沸水浴10-25min灭菌制备铁牛奶培养基，然后进行水浴5h后即可有效辨别产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果，实现快速高效筛选气荚膜梭菌抑菌剂。本发明的方法操作简单、设备要求低、实验周期短，可以对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果进行快速评估。

采用本发明优化的暴烈发酵法后，结果显示抗生素组和益菌健组都可以有效抑制产气荚膜梭菌的暴烈发酵现象，而无抗对照组产气荚膜梭菌组暴烈发酵现象明显，同时竞品组没能有效抑制产气荚膜梭菌的暴烈发酵现象，证明该方法可以用于产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果评价，快速筛选可替代抗生素的产气荚膜梭菌抑菌剂，为饲粮禁抗环境下饲料企业和养殖企业快速筛选可以大规模商用的产气荚膜梭菌抑菌剂提供了有力的保障。

附图说明

图1为实施例1中A组制备的铁牛奶培养基；

图2为实施例1中D组制备的铁牛奶培养基；

图3为实施例1中D组进行暴烈发酵实验的状态对比图；其中1为无抗对照组、2为抗生素组、3为益菌健组；

图4为实施例3中100℃水浴不同时间的培养基灭菌后的状态对比图；

图5为实施例5对不同产气荚膜梭菌抑菌剂进行暴烈发酵实验的状态对比图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 新鲜牛奶和脱脂奶粉分别使用118℃高压灭菌方式和水浴灭菌方式进行除菌和暴烈发酵对比实验。

A组：新鲜全脂牛奶1000.0ml、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1.0g、蒸馏水50.0ml；制备方法为：将1.0g硫酸亚铁溶于50.0ml蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入1000.0ml新鲜全脂牛奶中，混匀，分装大试管（规格18×180mm），每管10mL，118℃高压灭菌12min，时间到后，立刻冷却至室温。（见图1）。

B组：脱脂奶粉100.0g、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1.0g、蒸馏水1050.0ml；制备方法为：将100.0g脱脂奶粉溶于1050.0ml蒸馏水中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管（规格18×180mm），每管10mL，118℃高压灭菌12min，时间到后，立刻冷却至室温。

C组：新鲜全脂牛奶1000.0ml、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1.0g、蒸馏水50.0ml，制备方法为：将1.0g硫酸亚铁溶于50.0ml蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入1000.0mL新鲜全脂牛奶中，混匀，分装大试管（规格18×180mm）），每管10mL，盖上硅胶塞，牛皮纸包裹后，100℃沸水浴10min灭菌，时间到后，立刻冷却至室温。

D组：脱脂奶粉100.0g、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1.0g、蒸馏水1050.0ml；制备方法为：将脱脂奶粉100.0g溶于蒸馏水1050ml中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管，每管10mL，盖上硅胶塞，牛皮纸包裹后，100℃沸水浴10min灭菌，时间到后，立刻冷却至室温。（见图2）。

产气荚膜梭菌的纯种培养：产气荚膜梭菌模式菌株冻存液接种入液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃静置培养2d后，得到产气荚膜梭菌的纯种培养液。所述液体硫乙醇酸盐培养基为新鲜配制，接种后产气荚膜梭菌在液体硫乙醇酸盐培养基中成条状生长，有气泡产生，有产气荚膜梭菌的特殊气味。

益菌健（一种产气荚膜梭菌抑菌剂，市售）样品准备：称取样品，以无菌水将益菌健样品稀释至1%；

抗生素样品准备：称取青霉素钾，无菌水溶解后，过滤，制备100μL/mL的抗生素液备用。

接种实验：在上述A-D组培养基中接种产气荚膜梭菌纯种培养液1ml。每组培养基分为3个小组，分别是无抗对照组、抗生素组和试验组，其中抗生素组加入抗生素样品1ml，试验组加入益菌健样品1ml，无抗对照组不加任何抑菌剂。以未接种产气荚膜梭菌的培养基为阴性对照组，将上述培养基试管置入46℃水浴5h后进行观察。

实验结果：以118℃，12min高温高压灭菌方式制备的AB两组培养基，产气荚膜梭菌均不能产生暴烈发酵现象。（见表1、表2）。

实验结论：1)无论采用全脂牛奶还是奶粉作为铁牛奶培养基的原料，采用118℃高压灭菌12min的灭菌方式对培养基的成分造成了破坏，导致培养基制备失败（絮状沉淀）不可用于作为暴烈发酵实验的培养基；

2）采用全脂牛奶或者奶粉作为铁牛奶培养基的原料，按照配方，采用100℃沸水浴处理10min的灭菌方式进行培养基的制备时，除菌后培养基流动性较好，无抗对照组后经孵育出现了产气荚膜梭菌的暴烈发酵反应，抗生素对照组没有菌体生长，证明在本发明提供的制备方法下，无论采用全脂牛奶或者奶粉制备的铁牛奶培养基均可进行正常进行暴烈实验。鉴于全脂牛奶的储存稳定性（全脂牛奶储存期较短，脱脂奶粉储存期较长），为了保证实验数据的稳定性，建议后续的试验采用脱脂奶粉进行实验。图3为采用D组铁牛奶培养基的无抗对照组1、抗生素组2、益菌健组3暴烈发酵反应的状态，可见无抗对照组1产生凝乳和产气，产生暴烈发酵现象；抗生素组2的暴烈发酵现象被抑制；益菌健是对产气荚膜梭菌有抑制效果的益生菌，益菌健组3的暴烈发酵现象也被抑制。

实施例2 使用脱脂奶粉以水浴灭菌法进行制备铁牛奶培养基，验证不同的水浴温度对灭菌效果的影响。

制备铁牛奶培养基：将脱脂奶粉100.0g溶于蒸馏水1050ml中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管，每管10mL，盖上硅胶塞，牛皮纸包裹后，分别置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃进行水浴处理，分别进行计时（60℃水浴30min，70℃、80℃、90℃、100℃分别水浴10min），水浴时间到后，立刻冷却至室温，灭菌后各组培养基状态均为乳白色均一液体（略带浅绿色）。

产气荚膜梭菌纯种培养液：同实施例1；

益菌健样品：同实施例1；

抗生素样品：同实施例1；

接种实验：在各处理组的铁牛奶培养基中分别接种产气荚膜梭菌纯种培养液1ml。每组培养基分为3个小组，分别是无抗对照组、抗生素组和试验组，其中抗生素组加入抗生素样品1ml，试验组加入益菌健样品1ml，无抗对照组不加任何抑菌剂。以未接种产气荚膜梭菌的培养基为阴性对照组，将上述培养基试管置入46℃水浴5h后进行观察。

实验结果：60℃～90℃进行水浴灭菌的培养基均不能产生暴烈发酵现象，100℃水浴10min进行水浴灭菌的培养基产生了暴烈发酵现象。（见表3）

实验结论：1）阴性对照组在孵育时无产气现象，说明采用60-100℃水浴灭菌方式均可以对培养基中的微生物起到杀灭作用；

2）基于产气荚膜梭菌是一种严格厌氧菌，低温水浴（小于100℃）不能有效去除培养基中的氧气，所以实验时产气荚膜梭菌不能生长，因此仅100℃水浴灭菌的培养基能产生暴烈发酵反应。

实施例3 使用脱脂奶粉以100℃水浴灭菌法制备铁牛奶培养基，验证不同的水浴时间对灭菌和发酵效果的影响。

制备铁牛奶培养基：将脱脂奶粉100.0g溶于蒸馏水1050ml中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管，每管10mL，盖上硅胶塞，牛皮纸包裹后，置于100℃进行水浴灭菌处理，分别进行计时（5min、10min、15min、20min、25min、30min）水浴时间到后，立刻冷却至室温。灭菌后各组培养基状态见表4和图4。

产气荚膜梭菌纯种培养液：同实施例1；

益菌健样品：同实施例1；

抗生素样品：同实施例1；

接种实验：在各处理组的铁牛奶培养基中分别接种产气荚膜梭菌纯种培养液1ml。每组培养基分为3个小组，分别是无抗对照组、抗生素组和试验组，其中抗生素组加入抗生素样品1ml，试验组加入益菌健样品1ml，无抗对照组不加任何抑菌剂。以未接种产气荚膜梭菌的培养基为阴性对照组，将上述培养基试管置入46℃水浴5h后进行观察。

实验结果：水浴5min组产气荚膜梭菌不能正常生长，水浴10min-25min组产气荚膜梭菌产生暴烈发酵现象，水浴30min组培养基制备失败，不能使用。（见图4、表4、表5）。

实验结论：1）100℃水浴10-25min时制备的铁牛奶培养基可以用于暴烈发酵实验，水浴时间过短，液体中的氧气不能有效去除，产气荚膜梭菌不能生长；水浴时间延长至30min牛奶蛋白质变性，培养基不可用，所以本发明的100℃水浴法制备培养基时间应控制在10-25min以内。

2）益菌健对产气荚膜梭菌的抑菌作用与抗生素相当，可以用于替代抗生素。

实施例4 本发明的方法与牛津杯法对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果评价的对比实验

1、本发明的方法

制备铁牛奶培养基：将脱脂奶粉100.0g溶于蒸馏水1050ml中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管，每管10mL，盖上硅胶塞，牛皮纸包裹后，置于100℃进行水浴灭菌处理，计时10min，水浴时间到后，立刻冷却至室温。

产气荚膜梭菌纯种培养液：同实施例1；

益菌健样品：同实施例1；

竞品样品：取某竞品公司生产的益生菌产品，以无菌水将其稀释至1%，混匀，备用。

接种实验：将上述的铁牛奶培养基分为3个小组，分别接种产气荚膜梭菌纯种培养液1ml；3个小组分别是无抗对照组、益菌健组和竞品组，其中竞品组加入竞品样品1ml，益菌健组加入益菌健样品1ml，无抗对照组不加任何抑菌剂。以未接种产气荚膜梭菌的培养基为阴性对照组，将上述培养基试管置入46℃水浴5h后进行观察。

实验结果：见表6，无抗对照组和竞品组的产气荚膜梭菌有暴烈发酵，益菌健组的暴烈发酵被抑制。

2、牛津杯法

LB平板制备：LB（每升）:胰蛋白胨 10g、酵母浸粉 5g、氯化钠 10g、琼脂 17.0g，25℃调节pH至7.2±0.1，121℃保压20min灭菌，超净台倒平板（直径90cm），每板15~20ml培养基，静置30min待琼脂凝固后备用。吸取0.1ml产气荚膜梭菌指示菌培养液加入无菌LB培养基平板，涂布均匀。

在上述产气荚膜梭菌指示菌平板上点种牛津杯，做标记；将保温45-55℃上层培养基（亚硫酸铁琼脂）倒入准备好的底层；待上层培养基凝固，取出牛津杯，牛津杯孔制备完成。用微量移液枪分别移取100μL益菌健样品和竞品样品加入牛津杯孔。待平板液体吸收完全后，装入厌氧盒，加产气袋，密封后移入37℃培养箱，培养16h。培养结束后，观察各平板上抑菌圈并测量直径，见表7。

3、实验结果

实验结论：

1）采用本发明的暴烈发酵法，可以在水浴5h后即可有效辨别益菌健对产气荚膜梭菌的抑菌效果与抗生素相当，而竞品益生菌对产气荚膜梭菌无显著的抑菌效果；

2）采用传统的牛津杯法，需要培养16h后才能观察，且平板上的透明圈需要在短时间内进行观察，如果在室温放置2h-3h后，平板颜色褪去就无法进行观察评价；从表7可见，采用牛津杯法显示益菌健对产气荚膜梭菌的抑菌效果不如竞品，说明如果用传统的牛津杯法来筛选产气荚膜梭菌抑菌剂，会造成误判，对规模化饲料企业或者养殖企业来说，这种误判会造成严重的后果；

3）本发明的方法操作简单成本低廉，牛津杯法操作复杂且需要制备厌氧盒+厌氧产气袋等设备耗材投入，成本较高。

实施例5 使用本发明的方法对不同产气荚膜梭菌抑菌剂进行抑菌效果评价

制备铁牛奶培养基：将脱脂奶粉100.0g溶于蒸馏水1050ml中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管，每管10mL，盖上硅胶塞，牛皮纸包裹后，置于100℃进行水浴灭菌处理，计时10min，水浴时间到后，立刻冷却至室温。本培养基必须新鲜配制。

产气荚膜梭菌纯种培养液：同实施例1；

益菌健样品：同实施例1；同时准备稀释到0.1%的益菌健样品；

抗生素样品：同实施例1；

竞品样品：同实施例4；同时准备稀释到0.1%的竞品样品；

接种实验：将上述铁牛奶培养基分为6个小组，分别接种产气荚膜梭菌纯种培养液1ml。6个小组分别是1为加入1ml的1%益菌健样品、2为加入1ml的0.1%益菌健样品、3为加入1ml的1%竞品样品、4为加入1ml的0.1%竞品样品，5为空白对照组加入1ml无菌水、6为加入1ml的抗生素样品，将上述培养基试管置入46℃水浴5h后进行观察。

实验结果：见图5，无抗对照组5有产气荚膜梭菌暴烈发酵现象，抗生素组6的产气荚膜梭菌暴烈发酵现象被抑制；添加1%和0.1%益菌健样品的1-2组的产气荚膜梭菌暴烈发酵现象均被抑制；添加1%和0.1%竞品样品的3-4组均有产气荚膜梭菌暴烈发酵现象，说明本发明的方法比较灵敏，对浓度为0.1%-1%的益菌健都能验证出来对产气荚膜梭菌有抑菌效果，同时能快速验证浓度为0.1%-1%的竞品对产气荚膜梭菌实际并没有抑菌效果。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法在饲料生产和畜禽养殖生产上的应用，其特征在于，所述评价方法包括如下步骤：

步骤1）、制备铁牛奶培养基：所述铁牛奶培养基组分为脱脂奶粉100.0g、七水硫酸亚铁1.0g、蒸馏水1050.0ml，制备方法为将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，不断搅拌，加入七水硫酸亚铁，混合混匀，分装于大试管中，每管10mL，分装完成，给大试管盖上硅胶塞，用牛皮纸包裹，然后100℃沸水浴10-25min灭菌；所述铁牛奶培养基须新鲜配制；

步骤2）、培养纯种的产气荚膜梭菌：将产气荚膜梭菌模式菌株冻存液接种入液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃静置培养2d后，得到产气荚膜梭菌的纯种培养液；

步骤3）、在步骤1）获得的铁牛奶培养基中接种步骤2）获得的产气荚膜梭菌纯种培养液1ml和待评价的抑菌剂1ml，置于46-48℃水浴培养5h，即可观察试验结果，产生暴烈发酵现象的评价为无抑菌效果，未产生暴烈发酵现象的评价为有抑菌效果。

2.根据权利要求1所述对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法在饲料生产和畜禽养殖生产上的应用，其特征在于，所述评价方法的步骤1）中100℃沸水浴10min灭菌。

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