ES2221664T3 - Peptidos derivados de gp21 de htlv-i y htlv-ii para uso en diagnostico. - Google Patents
Peptidos derivados de gp21 de htlv-i y htlv-ii para uso en diagnostico.Info
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Abstract
SE HAN DESCUBIERTO NUEVOS PEPTIDOS DEL HTLV-I Y DEL HTLV-II PARA SU USO EN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA DETECTAR Y CONFIRMAR INFECCIONES POR HTLV-I Y POR HTLV-II EN EL SUERO HUMANO. LOS PEPTIDOS SE DERIVAN DE REGIONES ANALOGAS DE LA PROTEINA DE LA CUBIERTA DEL HTLV-I Y DEL HTLV-II GP21, Y SON PRUEBAS DE DIAGNOSTICO DE LA INFECCION POR HTLV-I O POR HTLV-II. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYE UN EQUIPO DE ENSAYO Y UN METODO PARA DETECTAR Y DISCRIMINAR ENTRE LA INFECCION POR HTLV-I Y POR EL HTLV-II EN LOS HUAMANOS.
Description
Péptidos derivados de gp21 de
HTLV-I y HTLV-II para uso en
diagnóstico.
Esta solicitud es una continuación en parte de la
solicitud de patente en Estados Unidos co-pendiente
por "Antígenos peptídicos de HTLV-I y
HTLV-II y métodos", número de serie 07/653,091,
presentada el 8 de febrero de 1991, que a la vez es una continuación
en parte de la solicitud de patente en Estados Unidos "Antígeno
peptídico de HTLV-I y métodos", número de serie
366,313, presentada el 13 de junio de 1989, ahora patente en Estados
Unidos nº 5,066,579, concedida el 19 de noviembre de 1991, que a la
vez es una continuación de la solicitud de patente en Estados Unidos
por "Antígeno peptídico de HTLV-I y métodos"
número de serie 948,270, presentada el 31 de diciembre de 1986,
ahora abandonada.
La presente invención se refiere péptido
específico de HTLV y a métodos de preparar y usar el antígeno.
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Los virus de la leucemia humana de células T
representan una familia de retrovirus de células T con tres miembros
conocidos. El HTLV tipo I (HTLV-I) presenta
actividad transformadora in vitro y está etiológicamente
relacionado con la leucemia de células T del adulto, la cual es
conocida por ser endémica en algunas partes del mundo. El
HTLV-II es otro retrovirus que presenta capacidad
transformadora in vitro y ha sido aislado a partir de un
paciente con una variante de células T de la leucemia de células
peludas (hairy cell leukemia) (para una revisión de
HTLV-I y II ver Cann y Chen). El
HTLV-III, que también ha sido denominado virus
asociado a linfoadenopatía y ahora es conocido como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), es lítico para ciertos tipos de
células T y ha sido relacionado con la etiología del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
A diferencia de los virus HTLV-I
y -II, no es conocido que el HTLV-III tenga
actividad transformadora in vitro.
El diagnóstico de la infección por
HTLV-I se basa normalmente en la respuesta de los
anticuerpos del suero a los antígenos peptídicos del
HTLV-I.
Esto implica normalmente un ensayo de cribado
inicial para identificar los anticuerpos del HTLV-I,
basado en un ensayo inmunoenzimático (EIA) con péptidos del virión
HTLV-I. Los ensayos que se usan actualmente para el
cribado de la sangre detectan alrededor de 0.5 a 0.05%
HTLV-I y HTLV-II positivos en
donantes de sangre en los Estados Unidos; de estos, alrededor de 4
de cada 5 son falsos positivos. Por lo tanto, los sueros positivos
deben ser analizados posteriormente en un ensayo de confirmación
utilizando lisado viral de HTLV-I por Western blot.
Los procedimientos actuales de análisis de sangre requieren que los
individuos posean anticuerpos para cada una de las proteínas gag p24
de HTLV-I y al menos una de las proteínas de la
cubierta gp46 y gp68 (Public health service working group). Sin
embargo, se ha demostrado que es técnicamente difícil detectar
proteínas gp46 o gp68 mediante un ensayo Western blot. Por lo tanto,
a menudo debe realizarse una segunda ronda de ensayos de
radioinmunoprecipitación confirmatorios para detectar la reacción de
los anticuerpos a las proteínas de la cubierta del
HTLV-I.
Una solución parcial a este problema fue aportada
por la clonación molecular de una porción de 134 aminoácidos de la
glicoproteína de transmembrana gp21 (Samuel et al.).
La proteína recombinante, conocida como proteína
p21E, es reactiva con los sueros de individuos infectados tanto con
HTLV-I como con HTLV-II y ha sido
incorporada con éxito en los ensayos de Western blot para la
confirmación de la infección por HTLV (Lillehoj et al., Lipka
et al. 1991).
Sin embargo, también se ha encontrado que la
proteína p21E es reactiva con un 0.6% de donantes de sangre
negativos para HTLV (Lal, et al.).
Además, se han observado grados de reactividad
con p21E mucho más altos (aproximadamente 5% de los donantes de
sangre en Estados Unidos) en individuos que son reactivos en ensayos
EIA de cribado de HTLV, pero que no poseen anticuerpos contra
ninguno de los productos de los genes gag y env de
HTLV-I cuando se analizaron por ensayos de
confirmación de HTLV y por lo tanto no cumplían los criterios
establecidos para ser infectados por HTLV (Lal, et al.;
Lipka, et al., 1991). Adicionalmente en el estudio de Lipka
et al. (Lipka et al. 1991) todos los individuos
indeterminados para HTLV reactivos a p21E fueron negativos para la
presencia de ácidos nucleicos de HTLV-I y
HTLV-II cuando se analizaron por PCR utilizando
sondas y cebadores específicos para HTLV-I y
HTLV-II. Por lo tanto, algunos individuos que no
están infectados con HTLV-I o
HTLV-II poseen anticuerpos que reaccionan con el
antígeno p21E. Este hecho ha limitado el uso de la proteína
recombinante p21E, particularmente en los ensayos de cribado de HTLV
en los que un alto grado de falsos positivos con sueros negativos
para HTLV resultaría en la eliminación innecesaria de sangre
donada.
Sería por lo tanto deseable proporcionar un
método mejorado para detectar sueros positivos para
HTLV-I y HTLV-II. En particular, el
análisis mejorado debería ser capaz de detectar todos los sueros
positivos para HTLV-I y HTLV-II con
un número mínimo de falsos positivos y también ser capaz de
distinguir los sueros infectados por HTLV-I de los
infectados por HTLV-II.
Esta invención incluye, en un aspecto, un péptido
que tiene una región antigénica específica de HTLV que consiste
esencialmente en la secuencia de aminoácidos identificada por SEQ ID
NO: 1. El péptido se caracteriza por (i) inmunoreactividad con
sueros de sujetos humanos infectados con HTLV-I o
HTLV-II y (ii) no inmunoreactividad con sueros que
sean (1) obtenidos de humanos que no estén infectados con
HTLV-I o HTLV-II, pero (2)
inmunoreactivos con el antígeno p21E de HTLV-1.
También se describe un kit para detectar la
presencia de infección por HTLV-I o
HTLV-II en un suero humano. El kit incluye (a) un
soporte sólido, (b) el anterior péptido específico de HTLV unido al
soporte y (c) un reactivo indicador para detectar la presencia de
los anticuerpos humanos unidos a dicho soporte.
En una realización, para el uso en la detección
de la infección por HTLV-I o
HTLV-II, el soporte sólido incluye dos zonas de
reacción, una recubierta con el anterior péptido específico de HTLV
y una segunda zona recubierta con una región antigénica específica
de HTLV que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos
identificada por SEQ ID NO: 2. Este péptido se caracteriza por la
inmunoreactividad con los sueros que es (1) obtenido a partir de
humanos que no están infectados por HTLV-I o
HTLV-II, pero (2) inmunoreactivo con antígeno
HTLV-1 p21E.
El kit puede también contener una o más zonas de
reacción diseñadas para permitir la discriminación entre infección
por HTLV-I y HTLV-II. Un péptido
preferido para uso en este kit es un péptido que tiene una región
antigénica específica de HTLV-I que consiste
esencialmente en la secuencia identificada por SEQ ID NO: 3.
Alternativamente, o además, el kit puede incluir un péptido que
tiene una región antigénica específica de HTLV-II
que consiste esencialmente en la secuencia identificada por SEQ ID
NO: 4.
En otro aspecto, la invención incluye un método
de identificar positivamente la infección por HTLV-I
o HTLV-II en un sujeto humano. El test incluye hacer
reaccionar suero del sujeto con un péptido que contiene una región
antigénica específica de HTLV que consiste esencialmente en la
secuencia de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1, para formar
un complejo inmune el péptido y los anticuerpos en suero de un
sujeto que tenga infección por HTLV-I o
HTLV-II.
El péptido es entonces examinado para la
presencia del complejo inmune.
También se describe una composición de vacuna
para inmunizar un individuo contra la infección por
HTLV-I y HTLV-II. La composición
incluye un péptido que contiene una región antigénica específica de
HTLV que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos
identificada por SEQ ID NO: 1. El péptido está acoplado a una
proteína transportadora.
Aún en otro aspecto, la invención incluye una
vacuna pasiva de tratamiento y profilaxis de HTLV y un método de
vacunación pasiva empleando un anticuerpo monoclonal humano o un
anticuerpo recombinante humano específico contra el péptido
2B3A.
Estos y otros objetos y características de la
presente invención serán más plenamente aparentes cuando la
siguiente descripción detallada de la invención sea leída en
conjunción con los dibujos acompañantes.
La Fig. 1 muestra, en la parte superior, el
genoma de HTLV-I, en la parte del medio una porción
expandida del genoma que contiene las regiones codificantes para las
proteínas de la cápside gp46 y gp21 y en la parte inferior de la
figura, las regiones codificantes correspondientes a los péptidos
recombinantes p21E, 2A2B, 2B3A y 3A3B de HTLV-I en
la región codificante de gp21 y los péptidos MTA-1,
MTA-4 y MTA-5 de
HTLV-I en la región codificante de gp46.
Las Figs. 2A y 2B muestran la secuencia
polinucleotídica codificante (SEQ ID NO: 5) y la correspondiente
secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) para la proteína env p21E de
HTLV-I (Fig. 2A) y la secuencia polinucleotídica
codificante (SEQ ID NO: 7) y la correspondiente secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO: 8) para la región p21E de la proteína env
gp21 de HTLV-II (Fig. 2B). Se indican los extremos
5' de las secuencias específicas de HTLV-I de los
cebadores oligonucleotídicos utilizados en la construcción de los
péptidos recombinantes de HTLV-I.
Las Figs. 3A-3C muestran las
secuencias polinucleotídicas de los cebadores delanteros (Fig. 3A)
identificados aquí como 1A (SEQ ID NO: 9), 2A (SEQ ID NO: 10), MF1
(SEQ ID NO: 11), MF2 (SEQ ID NO: 12) y 3A (SEQ ID NO: 13) y los
cebadores reversos (Fig. 3B) identificados aquí como 1B (SEQ ID NO:
14), 2B (SEQ ID NO: 15), MR1 (SEQ ID NO: 16), MR2 (SEQ ID NO: 17) y
3B (SEQ ID NO: 18), donde se han subrayado las secuencias de
reconocimiento de los enzimas de restricción situados en los
cebadores. Las dianas de los enzimas de restricción en el plásmido
pGEX modificado pGEX-GLI también están presentes
(SEQ ID NO: 44) (Fig. 3C).
La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de
los péptidos recombinantes de HTLV-I identificados
como p21E (SEQ ID NO: 6), lAlB (SEQ ID NO: 19), 2A2B (SEQ ID NO:
20), 2A3B (SEQ ID NO: 21), 2B3A (SEQ ID NO: 22), 3A3B (SEQ ID NO:
30), MF1R2 (SEQ ID NO: 24) y MF2R1 (SEQ ID NO: 25).
La Fig. 5 muestra las secuencias de aminoácidos
del péptido 2B3A que fue realmente construido (SEQ ID NO: 22) y la
secuencia correspondiente de tres cepas diferentes de
HTLV-I (SEQ ID NOS: 26, 27 y 28), un péptido
correspondiente 2B3A de HTLV-II (SEQ ID NO: 29) y
la secuencia de consenso para el péptido 2B3A (SEQ ID NO: 1).
La Fig. 6 muestra las secuencias de aminoácidos
del péptido 3A3B que fue realmente construido (SEQ ID NO: 23) y la
secuencia correspondiente de tres cepas diferentes de
HTLV-I (SEQ ID NOS: 31, 32 y 2), un péptido
correspondiente 3A3B de HTLV-II (SEQ ID NO: 34) y la
secuencia de consenso para el péptido 3A3B (SEQ ID NO: 2).
La Fig. 7 muestra una comparación de las
secuencias codificantes polinucleotídicas para el péptido 2B3A de
HTLV-I (SEQ ID NO: 35) y el péptido homólogo
2B3A(II) de HTLV-II (SEQ ID NO: 36).
La Fig. 8 muestra una comparación de las
secuencias codificantes polinucleotídicas para el péptido 3A3B de
HTLV-I (SEQ ID NO: 37) y el péptido homólogo
3A3B(II) de HTLV-II (SEQ ID NO: 38).
La Fig. 9 muestra la secuencia de aminoácidos de
regiones homólogas de la proteína gp46 de HTLV-I y
HTLV-II en la región de los péptidos gp46
identificados en la Fig. 1 como MTA-1 (SEQ ID NO:
3), MTA-4 (SEQ ID NO: 39) y MTA-5
(SEQ ID NO: 40), el péptido adicional K163 de HTLV-I
(SEQ ID NO: 41) y los péptidos análogos de HTLV-II
identificados aquí como K15 (SEQ ID NO: 42) y 4 (SEQ ID NO: 4).
Las Figs.10A-10D ilustran una
placa de ensayo de fase sólida de 4 zonas para utilizarla en un
método de ensayo para la detección de infección con
HTLV-I o HTLV-II en sueros humanos
(10A), mostrando un típico resultado del ensayo para un individuo
positivo para HTLV-I (Fig. 10B), para un individuo
positivo para HTLV-II (Fig. 10C) y para un falso
positivo (Fig. 10D).
A menos que se indique otra cosa, los términos
indicados a continuación tienen los siguientes significados:
"Secuencia env compuesta de HTLV" está
formada por la alineación de secuencias de aminoácidos homólogas de
regiones de la proteína de transmembrana env de diferentes cepas de
HTLV-I y HTLV-II y seleccionar, en
cada posición (i) el aminoácido de consenso en esa posición, o (ii)
si los aminoácidos en esa posición son distintos entre las
secuencias de HTLV-I y HTLV-II,
todas las variaciones de aminoácidos en esa posición. Por ejemplo,
la secuencia de compuesto de HTLV 2B3A que se muestra en Fig. 5
contiene variaciones de aminoácido en las secuencias de aminoácido
del péptido 2B3A para tres cepas diferentes de
HTLV-I (SEQ ID Nos: 26, 27 y 28), el péptido 2B3A
correspondiente de HTLV-II (SEQ ID NO: 29) y la
secuencia de consenso para el péptido 2B3A (SEQ ID NO: 1).
Péptido "específico de HTLV " significa un
péptido que tiene una secuencia compuesta de HTLV, es decir, tanto
una secuencia de aminoácidos de HTLV-I y una
secuencia de aminoácidos de HTLV-II, o una de las
secuencias compuestas de HTLV.
"Individuos no infectados" se refiere a
humanos cuyo suero puede contener anticuerpos que presenten reacción
cruzada con algunas proteínas de HTLV-I o
HTLV-II, por ejemplo, la proteína p21E, pero cuyo
suero no presente ninguna evidencia de infección por
HTLV-I o HTLV-II, tal como se juzga
por 1.> Falta de detección de anticuerpos contra las proteínas
gag y env de HTLV en un ensayo de confirmación y/o 2.> falta de
detección de secuencias específicas de HTLV mediante amplificación
de la secuencia con cebadores específicos de HTLV utilizando la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Kwok et al., Lipka
et al. 1991).
La Fig. 1, marco superior, representa una porción
de un genoma de HTLV-I que se expresa en las
glicoproteínas env de transmembrana gp46 y gp21. La región
codificante se extiende desde la base 5180 a 6116 para gp46 y entre
6117 y 6644 para la proteína gp21 (porción expandida del genoma en
Fig. 1).
La región codificante entre las bases 6096 y 6497
codifica una proteína recombinante, designada por p21E, que es
conocida por reaccionar con sueros de individuos infectados por
HTLV-I o HTLV-II, pero que también
es reactiva con un pequeño porcentaje de individuos que no están
infectados con ninguno de los virus (Lal et al., Lipka et
al., 1991). Contenidas en la región codificante p21E y mostrada
en la parte inferior derecha de la figura, están las regiones
codificantes para tres péptidos de HTLV-I
identificados aquí como 2A2B, 2B3A y 3A3B. La presente invención
incluye el péptido 2B3A y un kit de ensayo de diagnóstico y un
método que incluye el péptido 2B3A. El kit y el método pueden
incluir también el péptido 3A3B. Las propiedades de los péptidos
2B3A y 3A3B que están relacionados con el kit de ensayo y método
para detectar los sueros humanos infectados con
HTLV-I o HTLV-II se discuten
más
adelante.
adelante.
La región codificante 5565 a 5895, mostrada en la
parte inferior izquierda de la figura contiene regiones codificantes
para tres péptidos MTA descritos en la solicitud de patente en
Estados Unidos pendiente para "Antígenos peptídicos de
HTLV-I y HTLV-II y métodos",
número de serie 07/653,091, presentada el 8 de febrero de 1991, e
identificados en la solicitud pendiente y aquí como
MTA-1, MTA-4 y
MTA-5. Estos péptidos pueden también ser usados, en
combinación con el péptido 2B3A, o el péptido 2B3A más el péptido
3A3B, en un kit de ensayo y método para ensayar sueros humanos
infectados por HTLV- I o HTLV-II. Las propiedades de
los péptidos MTA que son pertinentes para el uso en este kit y
método se describen más adelante.
La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos del
péptido 2B3A de HTLV-I (SEQ ID NO: 22). Como se verá
más adelante, el péptido fue expresado por amplificación por PCR de
un virus HTLV-I, cepa MT2, utilizando cebadores los
cuales contribuyen en 7 codones en cada extremo de la región
codificante amplificada diseñados a partir de la secuencia de
nucleótidos codificante del HTLV-I variante ATK
aislado por Seiki et al. Así, los siete aminoácidos en cada
uno de los extremos del péptido corresponden en secuencia al péptido
2B3A de HTLV-I cepa ATK y que los aminoácidos
restantes interiores corresponden en secuencia al péptido 2B3A de
HTLV-I, cepa MT2. Los códigos de aminoácidos de una
sola letra o de tres letras en la figura están de acuerdo con las
convenciones estándar (por ej., Maniatis).
De acuerdo con un aspecto importante de la
invención y como se detalla más adelante, el péptido es (i)
inmunoreactivo con sueros de sujetos humanos infectados con
HTLV-I o HTLV-II, pero (ii) no
inmunoreactivo con sueros que son inmunoreactivos con antígeno p21E
de HTLV-1, pero que no muestran ninguna evidencia de
infección con HTLV-I o HTLV-II, por
ejemplo, por análisis por PCR de secuencias virales en la muestra de
suero, tal como se discute más adelante.
La Fig. 5 muestra las secuencias de aminoácidos
de péptidos que contienen el 2B3A para tres cepas diferentes de
HTLV-I, identificados aquí como ATK, MT2 y B41281 y
un péptido de HTLV-II, identificado aquí como cepa
MO. Estas secuencias de nucleótidos y aminoácidos de estas variantes
de HTLV fueron obtenidas de la base de datos de secuencias Genbank.
Los nombres de los locus de las cepas que pueden usarse para obtener
las secuencias de la base de datos de secuencias Genbank son los
siguientes; HTLV1A = región env de lacvariante ATK de
HTLV-I, HTVENVAA = región env de la variante MT2 de
HTLV-I, B41281 = otro aislado HTLV-I
más divergente y HL3V2CG = cepa MoT de HTLV-II. La
figura también muestra la secuencia de aminoácidos coincidentes
entre la secuencia superior 2B3A y las correspondientes regiones de
las tres cepas de HTLV-I y de la cepa de
HTLV-II. La homología de secuencia entre el péptido
2B3A y la porción correspondiente de la proteína gp21 de la cepa
individual se muestra directamente sobre la secuencia de aminoácidos
de cada cepa. El grado de homología está indicado por ":" para
secuencias idénticas y por un espacio en blanco para aminoácidos no
coincidentes.
Las secuencias 2B3A (es decir, las porciones de
las secuencias de aminoácidos de gp21 correspondientes al antígeno
peptídico 2B3A de HTLV-I) están identificadas en la
figura como sigue: SEQ ID NO: 26 = variante ATK de
HTLV-I; SEQ ID NO: 28 = variante MT2 de
HTLV-I y SEQ ID NO: 28 = la variante de HTLV
identificada por el nombre de locus B41281. El correspondiente
péptido 2B3A de HTLV-II de la cepa Mo se identifica
aquí por SEQ ID NO: 29. Las cepas mostradas en figura 5 y figura 6
más adelante son representativas de las diferentes secuencias de
aminoácidos obtenidas de aproximadamente 30 variantes separadas de
HTLV-I, STLV y HTLV-II (las
secuencias de aminoácidos y nucleótidos de todas las variantes
pueden obtenerse a partir de la base de datos Genbank).
Las secuencias consenso de las cinco secuencias
2B3A, es decir, la secuencia compuesta de HTLV para esta región, se
muestra en la parte inferior de la figura y es identificada aquí por
SEQ ID NO: 1. Esta secuencia es construida a partir de los
aminoácidos de consenso, donde hay consenso completo entre los cinco
péptidos y por las variaciones en los aminoácidos conocidas, en las
seis posiciones (X_{1}-X_{6}) donde tienen lugar
las variaciones de aminoácidos. En esta secuencia X_{1} es K o Q,
X_{2} es L o I, X_{3} es K o R, X_{4} es I o V, X_{5} es R o
C y X_{6} es P o L. La SEQ ID NO: 1 incluye por lo tanto las cinco
secuencias identificadas anteriormente como SEQ ID NO: 22, SEQ ID
NOS: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29. Es de esperar
que aquellas sustituciones de aminoácidos distintas de aquellas
específicamente incluidas en SEQ ID NO: 1 puedan también ser
permitidas, siempre y cuando no afecten sustancialmente la
inmunoreactividad del péptido 2B3A tal como se describe más
adelante. Más generalmente, el péptido 2B3A de la invención incluye
un péptido específico de HTLV que consiste esencialmente en la
secuencia de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1, donde el
péptido se caracteriza por:
(i) inmunoreactividad frente a sueros de sujetos
humanos infectados con HTLV-I o
HTLV-II y
(ii) no-inmunoreactividad con
sueros que son (1) inmunoreactivos con el antígeno p21E de
HTLV-1, pero (2) obtenidos de humanos que no están
infectados con HTLV-I o HTLV-II.
El péptido 3A3B de HTLV-I
presenta la secuencia de aminoácidos superior mostrada en la Fig. 4
y es identificada por SEQ ID NO: 30. El péptido está pensado, en
combinación con el péptido 2B3A, para ser usado en un kit de ensayo
y un método de cribado de sueros humanos para la infección con
HTLV-I o HTLV-II.
Tal como se ha indicado anteriormente, los sueros
obtenidos de pacientes infectados con HTLV-I o
HTLV-II contienen anticuerpos que son
inmunoreactivos con la proteína gp21 de HTLV-I y la
proteína recombinante p21E derivada de gp21.
En consecuencia, estos péptidos han sido
empleados de forma rutinaria en métodos de inmunoensayo y kits para
detectar la infección con HTLV (I o II) en humanos. Los péptidos,
sin embargo, también presentan reactividad cruzada con anticuerpos
contenidos en el suero de un cierto porcentaje de individuos no
infectados, dando falsos positivos en el ensayo. La frecuencia de
reacción cruzada parece ser de alrededor del 1% de donantes de
sangre negativos para HTLV, al menos en lugares particulares de
Estados Unidos en los que hay estadísticas disponibles.
El péptido 2B3A descrito anteriormente es
inmunoreactivo con sueros de individuos infectados con HTLV, pero no
es inmunoreactivo con individuos no infectados, tal como se ha
discutido anteriormente. Este péptido por lo tanto proporciona un
antígeno útil para detectar la infección por HTLV sin los falsos
positivos generados por la proteína p21E. Sería más útil, en un
ensayo para HTLV, proporcionar una proteína que detectase los
individuos positivos para no infectados p21E, pero no individuos
infectados con HTLV, como una confirmación de que el suero analizado
no está infectado, incluso aunque haya reactividad cruzada con la
proteína p21E.
El péptido 3A3B descrito aquí tiene las
propiedades deseadas, en que el péptido se caracteriza por la
inmunoreactividad con sueros que son (1) obtenidos de humanos que no
están infectados con HTLV-I o
HTLV-II, pero (2) inmunoreactivos con el antígeno
p21E de HTLV-I.
Este péptido fue expresado por una secuencia de
una región codificante por amplificación por PCR de un virus
HTLV-I, cepa MT2, utilizando cebadores (los cuales
contribuyen en 7 codones sobre cada extremo de la región codificante
amplificada) de la variante ATK de HTLV-I. Así, los
siete aminoácidos a cada extremo del péptido corresponden en
secuencia al péptido 3A3B de la variante ATK de
HTLV-I y los aminoácidos interiores restantes
corresponden en secuencia al péptido 3A3B de HTLV-I,
cepa MT2. El correspondiente péptido de HTLV-II,
designado aquí como SEQ ID NO: 34 tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la parte superior de la Fig. 6 y es identificado aquí
como SEQ ID NO: 34.
La Fig. 6 muestra las secuencias de aminoácidos
de péptidos que contienen el 3A3B para tres cepas de
HTLV-I distintas.
Las secuencias de 3A3B son identificadas en la
figura de la siguiente forma: SEQ ID NOS: 31 = variante ATK de
HTLV-I; SEQ ID NO: 32 = variante MT2 de
HTLV-I y SEQ ID NO: 33 = la variante de HTLV
identificada por el nombre de locus HTVENVCH. El péptido 3A3B
correspondiente de HTLV-II de la cepa Mo es
identificado aquí como SEQ ID NO: 34. Estas secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de las cepas fueron obtenidas de la base
de datos Genbank tal como se ha descrito anteriormente.
La figura también muestra la secuencia de
aminoácidos coincidente entre la secuencia 3A3B superior y las
correspondientes regiones de las tres cepas de
HTLV-I y la cepa de HTLV-II. La
homología de secuencia entre el péptido 3A3B superior y la
correspondiente porción de la proteína gp21 de cada cepa individual
se muestra directamente sobre la secuencia de aminoácidos de cada
cepa.
El grado de homología se indica por ":" para
secuencias idénticas y un espacio en blanco para residuos de
aminoácidos no coincidentes.
La secuencia consenso de las cinco secuencias
3A3B, es decir, la secuencia compuesta de HTLV para esta región, se
muestra en la parte inferior de la figura y es identificada aquí
como SEQ ID NO: 2. Como anteriormente, esta secuencia se construye a
partir de los aminoácidos de consenso, donde hay consenso completo
entre los cinco péptidos y por las variaciones conocidas en
aminoácidos, en las ocho posiciones
(X_{1}-X_{8}) en las que tienen lugar
variaciones de aminoácido.
En esta secuencia X_{1} es R o C, X_{2} es P
o L, X_{3} es T o S, X_{4} es S o T, X_{5} es S o P, X_{6}
es I, M, o V, X_{7} es N o K y X_{8} es L o I. La SEQ ID NO: 2
por lo tanto incluye las cinco secuencias identificadas más adelante
como SEQ ID NO: 30, SEQ ID NOS: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y
SEQ ID NO: 34. Se anticipa que las sustituciones de aminoácidos
distintos de aquellos incluidos en la SEQ ID NO: 2 también pueden
ser permitidos, siempre y cuando no afecten sustancialmente la
inmunoreactividad del péptido 3A3B como se describe
posteriormente.
Más generalmente, el péptido 3A3B incluye un
péptido específico de HTLV que consiste esencialmente en la
secuencia de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 2, donde los
péptidos se caracterizan por inmunoreactividad con sueros que son
(1) inmunoreactivos con el antígeno p21E de HTLV-I,
pero (2) obtenidos de humanos que no han sido infectados con
HTLV-I o HTLV-II.
El péptido 2B3A y la combinación de los péptidos
2B3A y 3A3Bs descritos anteriormente están diseñados para ser usados
en un método de inmunoensayo y un kit para detectar sueros humanos
infectados con HTLV-I o HTLV-II. Los
péptidos MTA de HTLV-I y los correspondientes
péptidos gp46 de HTLV-II descritos en esta sección
son útiles para este tipo de ensayo y kit para distinguir entre
infección por HTLV-I y infección por
HTLV-II.
La preparación y propiedades de los péptidos MTA
y los correspondientes péptidos de HTLV-II han sido
descritos en la solicitud de patente copendiente en Estados Unidos
para "Antígenos peptídicos de HTLV-I y
HTLV-II y métodos", nº de serie. 07/653,091,
presentada el 8 de febrero de 1991 y la correspondiente solicitud
PCT nº PCT/US92/00823, publicada el 20 de agosto de 1992, ambas
incorporadas aquí como referencia. Las regiones codificantes de los
péptidos MTA identificadas como MTA-1,
MTA-4 y MTA-5 se dan en la Fig. 1 y
comprende la región entre las bases 5565 y 5895.
La Fig. 9 muestra la secuencia de aminoácidos de
MTA-1 (SEQ ID NO: 3), MTA-4 (SEQ ID
NO: 39) y MTA-5 (SEQ ID NO: 40). Los tres péptidos
son específicamente inmunoreactivos con sueros infectados con
HTLV-I, es decir, no son inmunoreactivos con sueros
infectados con HTLV-II. Un péptido
HTLV-I más pequeño, identificado en Fig. 10 como
K163 (SEQ ID NO: 41) también es específicamente inmunoreactivo con
sueros infectados con HTLV-I.
La parte inferior de la Fig. 9 muestra las
secuencias de HTLV-II correspondientes que son
específicamente inmunoreactivas con sueros de
HTLV-II, es decir, no muestran inmunoreactividad con
sueros de pacientes infectados sólo con HTLV-I.
Éstas incluyen K15 (SEQ ID NO: 42), K34 (SEQ ID
NO: 43) y 4 (SEQ ID NO: 4). Se ha mostrado que el antígeno peptídico
más pequeño K34 tiene esencialmente la misma inmunoreactividad para
los sueros infectados de HTLV-II como lo hacen los
antígenos peptídicos mayores K15 y K55.
Los péptidos específicos de
HTLV-I y HTLV-II descritos
anteriormente pueden ser preparados por los métodos recombinantes
descritos en la antes citada solicitud PCT nº PCT/US92/00823.
La secuencia polinucleotídica codificante de
p21E, identificada aquí como SEQ ID NO: 5, se muestra en la Fig. 2 y
que se extiende desde la base 6096 hasta la base 6497 fue derivada
de un vector de clonación p21E (Samuel et al.). Se probaron
varios péptidos de esta región para su inmunoreactividad con sueros
infectados con HTLV-I y HTLV-II y
con sueros no infectados que son inmunoreactivos con péptido
p21E.
Los péptidos que se construyeron se muestran en
la Fig. 4. Estos incluyen los péptidos recombinantes identificados
como p21E (SEQ ID NO: 6), 1A1B (SEQ ID NO: 19), 2A2B (SEQ ID NO:
20), 2A3B (SEQ ID NO: 21), 2B3A (SEQ ID NO: 22), 3A3B (SEQ ID NO:
30), MF1R2 (SEQ ID NO: 24) y MF2R1 (SEQ ID NO: 25)
Los péptidos fueron preparados por (i)
amplificación por PCR de la región codificante seleccionada de la
cepa MT2 de HTLV-I, inserción de la secuencia
codificante amplificada en un vector de expresión
pGEX-GLI y transformación de células huésped E.
coli competentes con el vector de expresión, como se detalla en
el Ejemplo 1A.
Las Figs. 3A y 3B muestran las secuencias de los
cuatro cebadores delanteros y los cuatro reversos, respectivamente,
utilizados en la construcción de las regiones codificantes del
péptido. Estas incluyen los cebadores delanteros identificados como
FP-1A (SEQ ID NO: 9), FP2A (SEQ ID NO: 10),
FP-MF1 (SEQ ID NO: 11) y FP-3A (SEQ
ID NO: 13) y los cedbadores reversos identificados aquí como
RP-1B (SEQ ID NO: 14), RP-2B (SEQ ID
NO: 15),RP-MR1 (SEQ ID NO: 16) y
RP-3B (SEQ ID NO: 18). Los extremos 5' de los
cebadores están equipados con secuencias de reconocimiento para uno
o más de los siguientes enzimas de restricción: NcoI, BamHI y EcoRI.
Los DNAs amplificados pueden entonces cortarse con el enzima de
restricción adecuado para la ligación en un vector de expresión
pGEX-GLI cortado de forma similar. El sitio de
clonación de pGEX-GLI también se representa en la
Fig. 3C.
Cada región codificante del péptido seleccionada
se construye por amplificación por PCR con un cebador delantero y un
cebador reverso seleccionados. Por ejemplo, para construir la región
codificante del péptido 1A1B, se usaron el cebador delantero
FP-1A y el cebador reverso RP-1B
para amplificar la secuencia codificante p21. Para construir la
región codificante del péptido 2B3A, se emplearon el cebador
delantero MF1 y el cebador reverso MR1 en la amplificación por PCR
de la secuencia.
Los péptidos recombinantes anteriores fueron
cribados en un ensayo Western blot descrito en el Ejemplo 1C.
Brevemente, los lisados de bacterias
transformadas con un vector de expresión seleccionado fueron
fraccionados mediante SDS/PAGE (Laemmli), electrotransferidos en
nitrocelulosa y examinados para su inmunoreactividad con (i)
anticuerpos anti-HTLV-I obtenidos de
linfocitos EBV-activados a partir de individuos
infectados con HTLV-I (Ejemplo 1B) y (ii) sueros
control e infectados con HTLV. Los detalles se dan en el Ejemplo 1C
más adelante.
Los resultados se muestran en la Tabla 1 a
continuación. En la tabla "ND" significa "no hecho";
"I" indica sueros de un individuo infectado con
HTLV-I; "II" indica sueros de un individuo
infectado con HTLV-I, donde el diagnóstico de
HTLV-I y HTLV-II fue confirmado por
PCR; "UnInf" indica sueros de un individuo no infectado.
"Sup" indica sobrenadantes del cultivo celular (diluidos 1:2) a
partir de un cultivo de células B periféricas
EBV-activadas de un donante positivo para
HTLV-I; e "Ind" indica sueros que son reactivos
con la proteína recombinante p21E, pero que son negativos para la
presencia de infección con HTLV-I o
HTLV-II por PCR utilizando cebadores y sondas
específicos de HTLV-I y HTLV-II.
El total de los 10 sueros de los 10 individuos
infectados con HTLV-I/II probados reaccionaron
fuertemente con la relativamente grande proteína recombinante 2A3B
de p21E. Sin embargo, sólo 2 de los 10 antisueros
HTLV-I/II probados reaccionó con las dos proteínas
recombinantes 2A2B o 3A3B.
De forma similar, cuando se analizaron los
sobrenadantes del cultivo del tejido de la línea de células B
anti-p21E activadas con EBV, aquellos reaccionaron
con la proteína recombinante 2A3B pero no con 2A2B o 3A3B. Esto
sugiere que la porción central de 2A3B contiene el epítopo
inmunodominante de gp21 de HTLV-I.
Esto se confirmó cuando la proteína recombinante
2B3A, que contiene 44 aminoácidos de la porción central de 2A3B fue
analizada. Diez de los 10 sueros HTLV-I/II
analizados reaccionaron con la proteína recombinante 2B3A. Además,
los sueros anti-p21E EBV I/II analizados
reaccionaron con la proteína recombinante 2B3A. Además, las células
B EBV-activadas anti-p21E analizadas
producían anticuerpos que reconocían la 2B3A.
La localización del epítopo reconocido por los
sueros que reaccionan con la proteína recombinante p21E, pero son
negativos para los ácidos nucleicos HTLV-I o
HTLV-II por PCR también fue determinada. Siete de 7
sueros indeterminados de p21E reaccionaron con las proteínas
recombinantes 2A3B y 3A3B.
Ninguno de los 7 sueros indeterminados de p21E
reaccionaron con la proteína recombinante 2B3A. Así, los epítopos
reconocidos por los sueros de individuos infectados con
HTLV-I e individuos que no están infectados, pero
poseen un anticuerpo que reconoce p21E son diferenciables.
Con referencia de nuevo a la Fig. 4, se observa
que el péptido 2B3A está dividido aproximadamente por la mitad por
los péptidos MFlRl y MF2R2. Estudios preliminares llevados a cabo en
apoyo de la invención indicaron que ningún péptido es inmunoreactivo
con 2 sueros HTLV-I y 2 HTLV-II que
reaccionaron fuertemente con el péptido 2B3A. Esto indica que la
mayoría de secuencias del péptido 2B3A son requeridas para la
inmunoreactividad con sueros positivos para HTLV.
Se prepararon los péptidos recombinantes 2A2B,
2B3A y 3A3B a partir de lisados bacterianos de bacterias
transformadas, como se detalla en el Ejemplo 1D. Brevemente, las
células fueron crecidas bajo condiciones que inducían la expresión
de la proteína recombinante, se precipitaron por centrifugación y se
lisaron mediante varios ciclos de congelación y descongelación.
Después de la lisis, las proteínas fueron solubilizadas mediante la
adición de Triton-X100™ y los restos celulares
insolubles fueron precipitados por centrifugación.
La fracción sobrenadante se pasó a través de una
columna de glutatión agarosa y las proteínas ligadas fueron eluidas
con 5 mM de glutatión. El análisis del contenido de proteína de las
fracciones de proteína.
Se apreciará que los péptidos 2B3A y 3A3B pueden
ser preparados directamente, mediante métodos de síntesis de
péptidos en fase sólida, por ejemplo, como describe Mitchell et
al., o mediante sistemas recombinantes alternativos.
Los péptidos purificados 2A2B, 2B3A y 3A3Bs
anteriores fueron examinados en un Western blot para la
inmunoreactividad con 56 sueros de individuos positivos para HTLV, 7
sueros de individuos negativos para HTLV y 18 sueros de individuos
indeterminados para HTLV reactivos a p21E, tal como se indica en la
Tabla 2 posterior. Como se puede observar, el péptido 2B3A fue
inmunoreactivo con todos los sueros positivos para
HTLV-I y HTLV-II, pero no presentó
reacción cruzada con sueros no infectados. Por contra, el péptido
3A3B fue reactivo con algunos de los sueros positivos para HTLV,
pero reaccionó con todos los 18 de los sueros no infectados (que
también eran inmunoreactivos con el péptido p21E).
Se describirán cuatro tipos básicos de
aplicaciones de diagnóstico del péptido 2B3A (definido para incluir
el péptido compuesto 2B3A) de la invención.
El primer tipo general de ensayo es un ensayo
inmunoenzimático para el cribaje de sueros humanos para infección
con HTLV-I o HTLV-II. En este
formato de ensayo, un reactivo de fase sólida.
El primer tipo general de ensayo es un ensayo
inmunoenzimático para el cribaje de sueros humanos para infección
con HTLV-I o HTLV-II. En este
formato de ensayo, un reactivo de fase sólida que tiene unido el
péptido 2B3A en la superficie se hace reaccionar con el suero
analito, bajo unas condiciones que permitan la unión del anticuerpo
al péptido en el reactivo. El ensayo puede utilizar también péptidos
HTLV adicionales, tanto recombinantes como derivados de lisado viral
de HTLV, unidos a la fase sólida. Tras lavar el reactivo para
eliminar componentes del suero no unidos, el reactivo se hace
reaccionar con un anticuerpo anti-humano indicador
marcado, para unir el indicador al reactivo en proporción a la
cantidad de anticuerpo específico
anti-HTLV-I o
HTLV-II unido al péptido 2B3A y cualquier otro
péptido HTLV también unido al soporte sólido. El reactivo se lava
de nuevo para eliminar el anticuerpo no unido y se determina la
cantidad de indicador asociado con el reactivo. El anticuerpo
marcado con indicador y los reactivos adicionales que puedan ser
requeridos para la detección del indicador también son referidos
aquí medios indicadores para detectar la presencia de anticuerpo
humano unido al antígeno peptídico sobre el soporte
sólido.
sólido.
El segundo tipo de ensayo es un ensayo
inmunoenzimático para detectar anticuerpos de HTLV-I
y HTLV-II y diferenciar individuos infectados con
HTLV-I y HTLV-II. En este formato de
ensayo, los antígenos peptídicos recombinantes capaces de detectar
específicamente anticuerpos contra HTLV-I, o
HTLV-II, o ambos HTLV-I y
HTLV-II se unen a un reactivo de fase sólida en
diferentes lugares. Se añaden muestras duplicadas del suero a
analizar a las regiones apropiadas del reactivo de fase sólida,
después de lo cual el ensayo se lleva a cabo esencialmente como se
ha descrito anteriormente.
La Fig. 10A ilustra una realización específica de
un reactivo de fase sólida de este tipo. El reactivo incluye un
soporte sólido 10 que forma parte de un kit para ser usado en la
detección de infección con HTLV-I o
HTLV-II en muestras de suero humano. El soporte
presenta zonas de reacción primera, segunda, tercera y cuarta,
indicadas por 12, 14, 16 y 18, respectivamente. La zona de reacción
12 presenta moléculas de péptido 2B3A unidas en la superficie. Esta
zona es inmunoreactiva con anticuerpos de muestras de suero
positivas para HTLV (infección con HTLV-I o
HTLV-II), pero no con "falsos positivos" que
son inmunoreactivos con el péptido p21E pero no muestran ninguna
evidencia de infección con HTLV-I o
HTLV-II.
La zona de reacción 14 presenta moléculas del
péptido 3A3B unidas a la superficie. Esta zona es inmunoreactiva con
anticuerpos que tienen reacción cruzada con el péptido p21E de
HTLV-I, pero en el que el suero mismo no muestra
ninguna evidencia de infección con HTLV-I o
HTLV-II, por ejemplo, mediante la detección por PCR
de secuencias específicas de HTLV.
La zona de reacción 16 presenta moléculas del
péptido unidas a la superficie que son específicamente
inmunoreactivas con anticuerpos del suero de individuos infectados
con HTLV-I. Un péptido preferido de
HTLV-I es el péptido MTA-1
identificado anteriormente (SEQ ID NO: 3). También pueden emplearse
una variedad de péptidos relacionados con gp46, incluyendo
MTA-4, MTA-5 y K163 (todos mostrados
en la Fig. 11).
La zona de reacción 18 presenta moléculas del
péptido unidas a la superficie que son específicamente
inmunoreactivas con anticuerpos del suero de individuos infectados
con HTLV-II.
Un péptido de HTLV-I preferido es
el péptido K55 identificado anteriormente (SEQ ID NO: 4). Otros
péptidos preferidos de HTLV-II son los péptidos K15
y K34 identificados anteriormente (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:
43).
El reactivo de superficie sólida en el anterior
ensayo se prepara mediante técnicas conocidas para unir el material
de la proteína al material de soporte sólido, tal como soporte de
polímero o similar. El soporte puede estar provisto con grupos de
superficie reactivos, tales como grupos amina, aldehído, carboxilo,
alcohol o sulfhidrilo. Los métodos de unión de péptidos generalmente
incluyen adsorción no específica de la proteína al soporte, o unión
covalente de la proteína, típicamente a través de un grupo amino
libre, a un grupo químicamente reactivo sobre el soporte sólido, tal
como un grupo activado carboxilo, hidroxilo o aldehído. Los métodos
para unir los péptidos a la superficie del soporte sólido, tanto por
adsorción no específica como por derivación química también son
bien
conocidos.
conocidos.
En un método de ensayo típico, una dilución
adecuada de una muestra de suero se pone en contacto con cada una de
las cuatro zonas de reacción en el reactivo de fase sólida.
Generalmente, la muestra de suero se coloca sobre
cada zona en una cantidad suficiente para cubrir la zona, por
ejemplo, 50-200 \mu1 de muestra de suero. El suero
es incubado con el reactivo bajo condiciones suficientes para
permitir la inmunoreacción de los anticuerpos del suero con los
péptidos unidos al soporte.
Típicamente las condiciones de reacción son a
37ºC durante 30-60 minutos.
Siguiendo la incubación, el reactivo se lava con
tampón fisiológico del similar para eliminar el material de suero no
unido y unido no específicamente. A cada una de las zonas lavadas se
le añade entonces una gota de reactivo(s) de detección, tal
como anticuerpo anti-humano marcado con enzima,
para unir el enzima al reactivo en proporción a la cantidad de
anticuerpo anti-HTLV-I unido sobre
el soporte sólido. El reactivo es lavado de nuevo, para eliminar el
anticuerpo no unido y se determina la cantidad de enzima asociada
con el reactivo.
La Fig. 10B ilustra el patrón de zonas de
reacción que puede observarse en una muestra de suero de un
individuo infectado con HTLV-I, donde la zona rayada
indica una inmunoreacción detectable. En el presente caso, no ha
tenido lugar reacción con la segunda zona, a pesar de que algunas
muestras de HTLV-I pueden ser inmunoreactivas con
los péptidos 3A3B en la segunda zona (Tabla 2 anterior). La reacción
con la tercera, pero no con la cuarta zona, indica infección sólo
con HTLV-I.
La Fig. 10C ilustra el patrón de zonas de
reacción que puede observarse en una muestra de suero de un
individuo infectado con HTLV-II. En este caso, los
anticuerpos del suero son inmunoreactivos con el péptido 3A3B así
como con el péptido 2B3A (Tabla 2 anterior). La reacción con la
cuarta, pero no con la tercera zona, indica infección solamente con
HTLV-II.
Finalmente, la Fig. 10D ilustra el patrón de
zonas de reacción que puede observarse en una muestra de suero de un
suero no infectado pero con reacción cruzada. La ausencia de
reacción con la primera zona indica que no hay infección con
HTLV-I o HTLV-II, aún cuando el
suero contiene un anticuerpo con reacción cruzada que reconoce el
péptido 3A3B. La ausencia de reacción tanto con la tercera como con
la cuarta zonas confirma la ausencia de infección con
HTLV-I o HTLV-II en el suero
analizado.
Un tercer tipo general de ensayo es un ensayo
Western blot para uso en la confirmación de antisueros
HTLV-I o HTLV-II. Este formato de
ensayo incluye, además de uno de los antígenos peptídicos de g21
descritos en esta invención, uno o más péptidos recombinantes de
gp46, descritos en la patente de Estados Unidos nº 5,614,366 y en la
solicitud internacional PCT/US92/00823 que son efectivos en la
detección y diferenciación de los anticuerpos del suero contra
HTLV-I y HTLV-II.
En un formato preferido, los péptidos
confirmatorios incluyen la proteína gag p24 de lisado viral de
HTLV-I y la proteína de la cápside recombinante p21E
que contiene una porción grande de la proteína de la cápside gp21 de
HTLV-I. El lisado viral de HTLV-I
detecta casi todos los sueros que contienen anticuerpos contra las
proteínas gag de HTLV-I y/o
HTLV-II.
Los anticuerpos contra la región env de
HTLV-I y HTLV-II son detectados por
la proteína recombinante p21E, sin embargo, algunos sueros de
individuos no infectados también reaccionarán con la proteína p21E
(Lal, et al.; Lipka, et al., 1991).
El suero es diagnosticado como estando infectado
con HTLV-I o HTLV-II por la
reactividad que muestra hacia el antígeno peptídico de gp46 de
HTLV-I MTA1 y el antígeno peptídico de gp46 de
HTLV-II K55. Así, si un suero particular infectado
reacciona con MTA1 y no con K55 el individuo está infectado con
HTLV-I. Si lo contrario es verdad el individuo puede
ser diagnosticado como que está infectado con
HTLV-II. Las evaluaciones de este ensayo Western
blot confirmatorio han sido descritos por los solicitantes y
colaboradores (Roberts, et al.; Lipka, et al., 1992b).
En estos estudios el ensayo descrito tenía una especificidad del 99%
y una sensibilidad del 99% para la detección de individuos
infectados con HTLV-I y HTLV-II. Los
detalles del procedimiento del blot están descritos en el Ejemplo 2B
y en las publicaciones citadas.
En otra realización del ensayo Western blot la
proteína recombinante p21E es reemplazada por el péptido 2B3A de
gp21 descrito en esta invención. En este formato cualquiera de las
dos versiones del péptido 2B3A de HTLV-I o
HTLV-II detecta anticuerpos contra la proteína gp21
tanto de HTLV-I o HTLV-II. Debido a
la falta de reactividad del péptido 2B3A con sueros de individuos no
infectados que presentan reacción cruzada con la proteína
recombinante p21E, sería de esperar que este ensayo tuviese una
especificidad mucho mayor para los individuos infectados con HTLV
con esencialmente la misma sensibilidad exhibida actualmente
mediante tests utilizando la proteína p21E
recombinante.
recombinante.
Una realización final podría incluir ambos
péptidos, 2B3A y 3A3B. Los individuos verdaderamente infectados con
HTLV reaccionarían con los péptidos 2B3A y posiblemente con
3A3B.
Los individuos que no estén infectados con
HTLV-I o HTLV-II pero que poseen
anticuerpos que tienen reacción cruzada con la proteína recombinante
p21E y por lo tanto pueden ser positivos en ensayos de cribado de
HTLV, reaccionarán sólo con la proteína 3A3B. Esta realización
tendría la ventaja de proporcionar un antígeno que dará una señal
positiva tanto para los individuos verdaderamente infectados con
HTLV y los individuos no infectados indeterminados para HTLV. Esto
permite una determinación más precisa de la seroreactividad de un
individuo dado.
También está incluida en la invención una
composición de vacuna que contiene el portador del péptido
inmunogénico del péptido 2B3A al cual el péptido está unido. Más
específicamente, la vacuna contiene un péptido que tiene una región
antigénica específica de HTLV que consiste esencialmente en la
secuencia de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 22, en
combinación con un portador del péptido inmunogénico.
Portadores inmunogénicos particularmente útiles
para los péptidos incluyen hemocianina de lapa de cerradura (KLH),
anatoxina del tétanos, poli-l-(Lis:Glu), aglutinina
de cacahuete, poli-D-lisina,
anatoxina de la difteria, ovalbumina, aglutinina de haba de soja,
albúmina sérica bovina (BSA), albúmina sérica humana y
similares.
El péptido 2B3A puede estar conjugado al portador
por una variedad de métodos conocidos, incluyendo la derivación
química y por técnicas de ingeniería genética.
Estas últimas técnicas son descritas en más
detalle por Gerald Quinnan, "Proceedings of a Workshop,"
13-14 Noviembre, 1984. Las vacunas y los inóculos de
la presente invención pueden ser administrados por inyección,
normalmente intramuscularmente o subcutáneamente, oralmente mediante
una cápsula entérica o tableta, como un supositorio, como un spray
nasal y por otras rutas adecuadas de administración. Para un
paciente humano, una dosis adecuada del polipéptido depende, en
parte, de la ruta de administración elegida y de varios otros
factores.
Incluidos entre estos factores están el peso
corporal del mamífero a inmunizar, el portador cuando se utiliza, el
adyuvante cuando se utiliza y el número de inoculaciones que se
desea utilizar.
Las inoculaciones individuales para un paciente
humano típicamente contienen dosis unitarias de alrededor de 10
microgramos a alrededor de 100 miligramos de polipéptido, exclusivo
de cualquier portador al cual el polipéptido pueda estar unido. Si
se desea, pueden administrarse una serie de dosis durante un periodo
de tiempo para una inmunidad óptima. Las formas de las dosis
unitarias de la vacuna pueden también proporcionarse, si se desea,
conteniendo las cantidades antes mencionadas del polipéptido.
En cualquier caso, el inmunógeno contenido en una
vacuna o un inóculo está presente en una "cantidad efectiva"
que depende de una variedad de factores como es bien conocido en
inmunología, por ejemplo, el peso corporal del mamífero a immunizar,
el medio portador utilizado, el adyuvante utilizado, la duración
buscada de la protección y el protocolo de inmunización deseado.
Esta sección describe la preparación de
anticuerpos monoclonales humanos (Mabs) específicos contra el
péptido 2B3A, la preparación de anticuerpos recombinantes humanos
(Rabs) específicos contra el péptido 2B3A y usos de los anticuerpos
como una vacuna pasiva contra la infección viral con
HTLV-I.
Los hibridomas que producen anticuerpos
anti-2B3A pueden ser generados fusionando un
linfocito productor de anticuerpos anti-2B3A aislado
de linfocitos B de un humano infectado con HTLV-I o
HTLV-II, con una célula de mieloma compañera de
fusión, utilizando técnicas de producción de hibridomas conocidas
(Harlow).
En un método ejemplar de producción de
hibridomas, linfocitos B aislados a partir de sangre periférica de
un individuo infectado con HTLV-I asintomático son
activados con virus Epstein-Barr (EBV) y a
continuación son seleccionados según los anticuerpos que son
inmunoreactivos con el péptido 2B3A, como se describe en el Ejemplo
1B.
Los cultivos de células que muestran actividad
anti-2B3A positiva son expandidos y fusionados con
un compañero de fusión de mieloma humano o
ratón-humano adecuado, tal como las células
compañeras de mieloma GLI-H7 descritas en la sección
de materiales más adelante, utilizando polietilenglicol (PEG) como
fusógeno. Los hibridomas son entonces seleccionados por crecimiento
en un medio que contiene hipoxantina, aminopterina, timidina y
cuabaina, de acuerdo con criterios bien establecidos (Mitchell).
Se analiza la presencia de inmunoglobulinas que
sean inmunoreactivas con el péptido 2B3A en los sobrenadantes de los
cultivos de hibridomas, por ejemplo utilizando métodos descritos en
el Ejemplo 2.
Los cultivos de hibridoma positivos identificados
por los pasos anteriores son subclonados mediante dilución limitante
y se analiza de nuevo la inmunoreactividad con el péptido 2B3A.
Los subclones positivos son expandidos y son
posteriormente analizados para el isotipo de inmunoglobulina y para
la inmunoreactividad del péptido 2B3A.
Se preparan cultivos de hibridomas que producen
Mabs anti-2B3A como se ha descrito anteriormente. El
RNA mensajero (mRNA) se aísla de las células y el mRNA es usado para
producir los cDNA correspondientes de acuerdo con métodos bien
conocidos (Maniatis).
Las secuencias codificantes para la cadena ligera
y para las regiones variables de la cadena pesada de los genes de
inmunoglobulina son amplificadas por métodos de PCR empleando
cebadores de PCR conocidos para las regiones variables de las
cadenas ligera y pesada de IgG (Larrick et al., 1989, 1991,
1992). El fragmento de la secuencia codificante amplificada para la
región variable de la cadena ligera se purifica, se corta entre
enzimas de restricción apropiados y se inserta en un vector de
expresión adecuado para la expresión de la cadena ligera de IgG,
siguiendo procedimientos publicados (Larrick et al., 1989,
1991, 1992). La construcción de un vector de expresión adecuado,
identificado aquí como pSXRD.kappa-IgG se da en el
Ejemplo 3.
El fragmento de la secuencia codificante
amplificada para la región variable de la cadena pesada se purifica
de forma similar, se corta con los enzimas de restricción apropiados
y se inserta en un vector de expresión adecuado para la expresión de
la cadena pesada de IgG, siguiendo procedimientos publicados
(Larrick, 1989, 1991). Un vector de expresión adecuado para expresar
la región variable de la cadena pesada es el vector pcDNAl/neo.IgG1.
El vector puede ser construido modificando un vector pcDNAl
(Invitrogen, San Diego, CA)) mediante la adición de una región
codificante constante de la cadena pesada de IgG (Larrick, 1992).
Los dos plásmidos son entonces cotransfectados en células CHO o
GLI-H7 utilizando lipofección o electroporación. La
selección para el plásmido pesado se llevó a cabo utilizando el
antibiótico GENETICINA™ (G418, BRL #860-1811I). Se
analizó la producción de IgG de las células y se subclonaron. Se
analizó la unión de los subclones al péptido 2B3A. Los clones
positivos fueron subclonados varias veces para garantizar la
pureza.
Alternativamente, se puede utilizar un método de
selección de clones, tal como ha sido descrito (Huse, McCafferty)
para generar anticuerpos recombinantes anti-2B3A,
empleando como fuente de regiones codificantes de regiones variables
de linfocitos B, cDNAs preparados a partir de linfocitos B aislados
de un humano infectado con HTLV-I o
HTLV-II.
Los cDNAs se insertan en vectores de fago, los
vectores se expresan en un huésped bacteriano E. coli
adecuado y los fagos liberados se seleccionan mediante unión por
afinidad a un soporte sólido que contiene el antígeno. Los fagos
capturados son entonces utilizados para reinfectar un huésped
bacteriano.
Los Mabs o Rabs anti-2B3A humano
preparados como se ha descrito anteriormente son empleados en una
composición de vacuna para uso en el tratamiento y/o profilaxis de
infección con HTLV-I y/o HTLV-II. En
esta aproximación los Mabs o Rabs que reconocen el péptido 2B3A son
administrados a individuos que pueden haber estado expuestos a y/o
infectados con HTLV-I o HTLV-II. La
unión de estos anticuerpos a las células infectadas con
HTLV-I proporciona entonces una respuesta inmune
humoral en la que los macrófagos destruyen los linfocitos B que han
unido anticuerpos anti-HTLV-I.
Los anticuerpos
anti-HTLV-I son formulados en una
solución adecuada para la inyección, típicamente por ruta
parenteral, para formar la composición de vacuna. La composición es
administrada en una cantidad efectiva para bloquear la infección con
HTLV, en un individuo no infectado, o para inhibir la replicación
viral en un paciente infectado.
La dosis de anticuerpo preferida está en el rango
entre alrededor de 0.5 a 5 mg anticuerpo/kg peso corporal. La
composición puede ser administrada a intervalos espaciados,
preferiblemente intervalos de alrededor de 1 a 4 semanas, para el
tratamiento de un individuo infectado. La vacunación puede ser
anterior a una infección prevista, o en el tratamiento de una
infección con HTLV-I existente.
En una aplicación general los niños a cuyas
madres se les diagnostica que tienen HTLV-I son
inyectados con la composición de anticuerpo para prevenir el
desarrollo de la infección viral, particularmente cuando el niño es
alimentado con el pecho por un periodo extenso. Los anticuerpos
pueden ser administrados parenteralmente, por ejemplo,
intramuscularmente, subcutáneamente o intravenosamente, o en el caso
de niños, también por administración oral, en un método para tratar
o prevenir HTLV-I por profilaxis inmune.
La identificación del epítopo 3A3B de HTLV que
presenta reacción cruzada específicamente con humanos no infectados
con HTLV puede usarse, de acuerdo con los procedimientos descritos
en esta sección, para identificar la proteína(s) que es
responsable de inducir el anticuerpo con reacción cruzada.
Anticuerpos policlonales o monoclonales
específicos contra los péptidos 3A3B pueden ser utilizados para
aislar y identificar los péptidos con reacción cruzada presentes en
el suero de individuos con reacción cruzada, es decir, individuos
que son negativos para la presencia de virus HTLV, pero cuyo suero
presenta reacción cruzada con el antígeno p21E de HTLV.
El anticuerpo anti-3A3B puede ser
un anticuerpo policlonal o monoclonal hecho de acuerdo con técnicas
convencionales, utilizando el péptido 3A3B como antígeno
(Harlow).
El antígeno peptídico está preferiblemente
conjugado a una proteína portadora adecuada, tal como hemocianina de
lapa de cerradura e inyectada en un animal adecuado, tal como un
conejo, para generar anticuerpos policlonales, o un ratón, o
producir Mabs.
Alternativamente, el anticuerpo puede ser
purificado por purificación por afinidad uniendo el péptido 3A3B a
un soporte sólido y capturando los anticuerpos de los individuos con
reacción cruzada, empleando métodos de purificación por afinidad
conocidos (Harlow).
Para aislar la proteína con reacción cruzada de
un individuo con reacción cruzada, se une el anticuerpo
anti-3A3B anterior a un soporte sólido, por métodos
estándar de derivación y se pasa una muestra de plasma o de lisado
celular completo aislado del individuo con reacción cruzada 3A3B a
través del lecho de soporte para capturar las proteínas con reacción
cruzada sobre el soporte. Las proteínas atrapadas pueden liberarse
de la columna, las proteínas candidatas pueden purificarse mediante
un SDS-PAGE preparativo o por cromatografía y las
proteínas purificadas pueden ser secuenciadas utilizando métodos
estándar.
Una vez se ha obtenido una secuencia parcial de
la proteína, es posible identificar la secuencia codificante
responsable del péptido utilizando métodos bien conocidos en el arte
(Maniatis et al., patente SISPA). Uno de estos métodos
conlleva aislar ácidos nucleicos de un suero y/o una muestra PBMC de
un individuo con reacción cruzada 3A3B seguido por la construcción
de una librería \lambdagtl0. La librería resultante sería probada
con cebadores degenerados marcados para identificar los clones que
contienen secuencias hibridadoras en el suero que pueden codificar
la proteína con reacción cruzada 3A3B aislada. También pueden
emplearse otras metodologías, que están más allá del alcance de esta
solicitud.
Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos
de la invención, pero no pretenden de ninguna forma limitar su
alcance.
Los materiales utilizados en los siguientes
ejemplos fueron como sigue:
Enzimas: DNAasa I y fosfatasa alcalina fueron
obtenidas de Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB, Indianapolis,
IN); EcoRI, EcoRI metilasa, DNA ligasa y Polimerasa I, de New
England Biolabs (NEB, Beverly, MA); y RNasa fue obtenida de Sigma
(St. Louis, MO).
Otros reactivos: los enlaces EcoRI fueron
obtenidos de NEB; y azul de nitrotetrazolio (NBT),
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP),
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido
(X-gal) y isopropil
\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) fueron obtenidos de Sigma.
La línea celular GLI-H7 es una
línea celular de compañero de fusión de heteromieloma de
ratón-humano, construida a partir de la fusión de un
mieloma NS-1 de ratón con un linfocito B activado
humano, como ha sido descrito por Carroll. La línea celular
HEp-2 es una línea celular de un carcinoma
epidermoide (de laringe humana), obtenida de la Colección de
Cultivos Tipo Americana (ATCC), Rockville, MD
(ATCC-CCL-23).
Las células de ovario de hámster chino
(DUX-B11) fueron obtenidas de L.A. Chasin
(Urlaub).
Los medios de cultivo celular (PFHM, RPMI, IMDM)
fueron obtenidos de Gibco Laboratories.
Se obtuvo un plásmido que contenía una copia
completa de un inserto de DNA derivado del genoma de
HTLV-I de los Drs. R.C. Gallo y F.
Wong-Staal del Laboratorio de Biología de Células
Tumorales, Institutos Nacionales de Salud (Bethesda, MD).
La región codificante de gp21 (Fig. 2) fue
derivada de la región codificante de gp21 presente en el clon sp65
MT-2 de HTLV-I obtenido del Dr.
Wong-Stahl. Se sintetizaron cebadores
oligonucleotídicos designados para amplificar porciones
seleccionadas de gp21 de HTLV-I (Figura 3) en un
sintetizador automático (Applied Biosystems, Foster City, CA),
siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los cebadores
contenían una diana BamHI, NcoI y/o EcoRI situada en sus extremos 5'
para facilitar el clonaje de los DNAs amplificados como inserción en
marco en el sistema de expresión pGEX-GLI.
Se llevó a cabo una PCR de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Perkin-Elmer/Cetus,
Norwalk, CT) y todas las reacciones de PCR contenían 2 ng del clon
sp65 MT-2 de HTLV-I (generosamente
proporcionado por el Dr. F. Wong-Staal) como molde y
1.0 \muM de los cebadores oligonucleotídicos adecuados. La
amplificación por PCR se llevó a cabo con 25 ciclos de
desnaturalización del molde (1 minuto a 94ºC), hibridación de los
cebadores (2 minutos a 50ºC) y extensión del cebador (2 minutos a
72ºC). Los DNAs amplificados fueron purificados, digeridos durante 2
horas con los enzimas de restricción apropiados y ligados en el
vector de expresión pGEX-GLI, que es una versión
modificada del vector disponible comercialmente
pGEX-2 (Pharmacia, Piscataway, NJ), que había sido
previamente digerido con los mismos enzimas de restricción.
Se aislaron células B periféricas de un individuo
infectado con HTLV-I asintomático y se activaron con
virus Epstein-Barr (EBV) a 10^{4} células por
pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos como se ha
descrito previamente (Perkins et al, 1989; Foung et
al, 1990). Después de 2 días en cultivo específico se determinó
la actividad IgG anti-HTLV-I
utilizando un inmunoensayo enzimático basado en un lisado viral de
HTLV-I (Diagnostic Biotechnology, Singapore). Se
detectó la actividad anti-HTLV-I y
las células B EMB inmortalizadas fueron entonces crecidas en cultivo
durante alrededor de un mes durante el cual se guardaron los
sobrenadantes usados de los
cultivos.
cultivos.
El subsiguiente análisis por Western blot
utilizando un ensayo confirmatorio de HTLV-I
(Diagnostic Biotechnology) determinó que 3 de las líneas de células
B activadas con EBV, designadas como 3E9, 5G4 y 6E9, reaccionaron
fuertemente con la proteína p21E env recombinante. Los sobrenadantes
fueron entonces diluidos 1/2 en BLOTTO y se usaron para cribar las
proteínas gp21 recombinantes aisladas. Tras la posterior fusión a
células de heteromieloma de ratón y humano, ninguna de las 3 líneas
de fueron fusionadas con éxito y la producción de anticuerpo de las
células B activadas con EBV finalmente cesó. Sin embargo, los
sobrenadantes de las células B activadas proporcionaron una
preparación de anticuerpo altamente específico que fue útil en el
procedimiento de cribado descrito más abajo. Además, el aislamiento
de anticuerpos contra 2B3A de 3 células B activadas con EBV
separadas confirma que los anticuerpos contra el antígeno peptídico
2B3A son un componente principal de la respuesta inmune de
individuos infectados con HTLV-I o
HTLV-II.
Las bacterias que contenían el plásmido fueron
analizadas para la producción de proteína por análisis Western blot
de lisados crudos preparados a partir de cultivos de 2 ml de las
E. coli transformadas. Un volumen de un décimo del lisado
celular total fue por carril y se electroforó en un gel de SDS
poliacrilamina al 12.0% (Laemmli). El gel resultante fue
electrotransferido a un papel de filtro de nitrocelulosa (Schleicher
y Schuell, Keene, NH) y los Western blots de HTLV-I
fueron incubados toda la noche a temperatura ambiente con los
sobrenadantes de los cultivos tisulares de células B activadas con
EBV diluidos ½ (Ejemplo 1B), o antisueros control o infectados con
HTLV diluidos 1/100. Todos los sueros y sobrenadantes fueron
diluidos en BLOTTO (10 mM TRIS-HC1, pH 7.4, 5% leche
en polvo desnatada, 2.5% suero normal de cabra y 0.5%
Tween-20).Los Western blots fueron lavados 3 veces
con tampón de lavado TTBS (10 mM TRIS-HCl pH 7.4,
150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) durante 5 minutos cada
uno.
La IgG humana unida fue detectada mediante
incubación durante 1 hora con IgG de cabra
anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina
(Promega, Madison, WI) durante 1 hora.
Esto fue seguido por 4 lavados de 5 minutos con
TTBS.
El anticuerpo secundario unido fue detectado
incubando las membranas en una solución de sustrato que contenía
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP) y azul de nitrotetrazolio (NBT) en 100 mM
TRIS-HCl, pH 9.5 y 50 mM MgCl_{2}. Los Western
blots resultantes fueron analizados con sueros de individuos no
infectados o infectados con HTLV-I.
Los resultados de estos análisis se presentan en
la Tabla 1.
Se secuenció el DNA de los clones recombinantes
2A3B, 2A2B, 2B3A y 3A3B por el procedimiento de la terminación
didesoxi (Maniatis et al.). La secuencia de los insertos de
DNA obtenidas fue consistente con las secuencias de DNA de los
cebadores y moldes utilizados en su construcción y permitiría la
producción de las proteínas recombinantes deseadas.
La purificación de la proteína de fusión
recombinante fue llevada a cabo esencialmente como se describe (20).
Brevemente, un cultivo de bacterias de 10 ml crecido toda la noche
que contenía el plásmido recombinante de interés fue diluido 1/100
en frascos que contenían 500 ml de medio NZYDT (Maniatis, et
al.) con 100 \mug/ml de ampicilina. La expresión de la
proteína de fusión fue inducida mediante la adición de IPTG
(concentración final 0.2 mM) a cultivos en fase de crecimiento. Los
cultivos fueron crecidos durante 3 a 4 horas adicionales a 37ºC
momento en el que las bacterias fueron precipitadas por
centrifugación a 5000 x g durante 10 minutos. Las células fueron
resuspendidas en 20 ml de MTBS frío y fueron lisadas mediante varios
ciclos de congelación y descongelación. Después de la lisis las
proteínas fueron solubilizadas mediante la adición de Triton X100
(Sigma, St.Louis, MO) a 1.0%, DNasa I a 1 \mug/ml y Aprotinina a
1.0%. Tras la incubación durante 5 minutos a 25ºC, los restos
celulares insolubles fueron precipitados por centrifugación 2 veces
a 10,000 x g durante 10 minutos y los sobrenadantes fueron
guardados. Se analizaron alícuotas tanto de la fracción sobrenadante
como del precipitado por SDS-PAGE (Laemmli) para
determinar si las proteínas recombinantes fueron solubilizadas por
el procedimiento anterior.
Las proteínas recombinantes 2A3B, 2A2B y 3A3B
estaban todas presentes en la fracción soluble. Para las 3 proteínas
recombinantes un cultivo de 1 litro dio como resultado la
purificación de 1-2 mg de proteína de fusión con una
pureza de aproximadamente el 50%. Los sobrenadantes fueron entonces
pasados a través de una columna que contenía 0.8 ml de glutation
agarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ), que fue pretratada tal como
recomendaba el fabricante.
La columna fue lavada con 10 ml de MTBS más 1% de
Triton y 1% de Aprotinina seguido por un lavado de 5 ml con MTBS
solo. Las proteínas unidas fueron eluidas con tampón que contenía 5
mM glutation en 50 mM Tris pH 8.0 y se recogieron 10 fracciones de 1
ml. La localización del pico de la proteína eluida se determinó
midiendo la absorbancia a 280 nm de las fracciones y por análisis
por SDS-PAGE de alícuotas de las fracciones. Las
fracciones que contenían cantidades significativas de proteína
fueron juntadas y se congelaron alícuotas de esta mezcla a -70ºC
para posterior análisis.
Los antisueros utilizados en estos análisis
incluían un panel bien caracterizado de sueros de 26 individuos
infectados con HTLV-I y 28 con
HTLV-II (Lipka et al. 1991; Hadlock et
al. 1992). Todos los sueros HTLV-I y
HTLV-II presentaban unos perfiles de anticuerpo que
cumplían con los criterios estándar para la infección con HTLV
(anticuerpos contra las proteínas p24 gag y gp46 y/o gp68 env).
Además, los sueros fueron tipados como estando infectados con
HTLV-I tanto en virtud de su reactividad positiva
hacia el antígeno recombinante MTA1 de HTLV-I y/o a
través de PCR utilizando sondas y cebadores oligonucleotídicos
específicos de HTLV-I (Lipka, et al. 1992b).
De forma similar, los 32 individuos infectados con
HTLV-II fueron identificados por su reactividad
hacia el antígeno recombinante K55 de HTLV-II y/o
por PCR usando sondas y cebadores específicos de
HTLV-II (Lipka et al. 1992b).
También se analizó la inmunoreactividad de los
antígenos peptídicos gp21 con sueros de 7 individuos negativos para
HTLV-I y sueros de 18 individuos cuyos sueros eran
reactivos con la proteína recombinante p21E pero que eran negativos
para la presencia de ácidos nucleicos de HTLV cuando se analizaron
por PCR utilizando sondas y cebadores específicos de
HTLV-I y HTLV-I. Además, estos 18
sueros reactivos con p21E no cumplieron los criterios serológicos
para ser infectados con HTLV. Los individuos infectados con
HTLV-I y HTLV-I eran todos del área
del norte de California, con la excepción del antisuero J103 que era
de un donante de sangre japonés infectado con
HTLV-I. Los sueros no infectados eran todos
procedentes de donantes de sangre del Banco de Sangre de la
Universidad de Stanford. Los 18 sueros reactivos con p21E -
negativos para HTLV eran de donantes de sangre del área del norte de
California o fueron proporcionados por el Centro de Control de
Enfermedades, Atlanta, Georgia.
Las proteínas recombinantes 2A2B, 2B3A y 3A3B
fueron preparadas como en el Ejemplo 1. Se separaron alícuotas de
las proteínas purificadas bajo condiciones reductoras sobre un gel
de poliacrilamida al 11.5% (Laemmlli). Las proteínas separadas
fueron electrotransferidas sobre una membrana de nitrocelulosa,
bloqueadas con BLOTTO, secadas al aire y cortadas en tiras de 3 mm
de ancho.
En el ensayo, las tiras de análisis anteriores
fueron primero rehidratadas en tampón TTBS y las tiras fueron
incubadas toda la noche con sueros humanos de prueba, diluidos 1:50
en BLOTTO. Las tiras fueron lavadas varias veces con tampón de
lavado, a continuación incubadas durante 1 hora con IgG
anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa
alcalina (BioRad, Hercules, CA). Después de lavar, se consiguió el
revelado de color incubando las tiras en una solución sustrato que
contenía NBT y BCIP en tampón 100 mM Tris-HCl, pH
9.5, 50 mM MgC1_{2}. El revelado de color se continuó hasta un
revelado de fondo uniforme sobre la tira y se detuvo lavando las
tiras dos veces con agua desionizada. Las proteínas recombinantes
2A2B, 2B3A y 3A3B fueron analizadas frente a los paneles de sueros
infectados con HTLV y negativos descritos en el Ejemplo 2A.
Los resultados de los inmunoensayos se dan en la
Tabla 2 anterior.
La construcción del vector de expresión de
mamífero pSXRD.kappa-Ig se llevó a cabo en varias
etapas. El vector de base es pUC18. En la diana BamHI de pUC18 se
insertó el fragmento de 585 bp BamHI-BglII del gen
del antígeno de superficie de HBV que comprendía la señal de
poliadenilación (Larrick, et al., 1992). La orientación era
tal que la diana BamHI del inserto de HBV estaba más cercana a la
diana EcoRI del vector. La región entre las dianas HindIII y HincII
del polilinker fue eliminada digiriendo el plásmido con estos dos
enzimas y a continuación haciendo la diana HindIII roma utilizando
el fragmento Klenow de la DNA polimerasa. Después de la ligación, el
plásmido resultante fue designado pUCHBV3'. Se insertó una diana
única SalI en la diana BamHI utilizando un cebador oligonucleotídico
sintético.
Entre la diana única EcoRI y la diana SalI se
insertaron los siguientes fragmentos en una serie de ligaciones: (a)
un promotor temprano SV40, unido por una diana EcoRI (creada por la
adición de un oligonucleótido sintético en la diana PvuII
inmediatamente precediendo el promotor SV40 y la diana HindIII
inmediatamente precediendo el codón de iniciación del antígeno T,
(b) un fragmento de relleno derivado de un cDNA irrelevante unido
por una diana HindIII y terminando en una diana XbaI, (c) un
fragmento XbaI-BglII de pcDNAl/neo que contenía la
señal de poliadenilación de SV40 y el promotor RSV.
La diana XbaI está incluida en el vector y la
diana BglII fue insertada utilizando clonaje por PCR para situarla
en la unión entre el promotor RSV y el marcador seleccionable Neo y
(d) el cDNA murino de DHRF, unido por una diana BglII al extremo 3'.
Las dianas de restricción fueron insertadas utilizando PCR.
Mientras que la invención ha sido descrita con
referencia a realizaciones particulares, métodos de construcción y
usos, será claro para aquellos en el área que varios otros usos,
formulaciones y métodos de práctica están dentro de la intención de
la presente invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Hadlock, Kenneth G.
\hskip4cmGoh, Chin-Joo
\hskip4cmFoung, Steven K.H.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método y ensayo para HTLV
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 46
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Law Offices de Peter Dehlinger
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 350 Cambridge Avenue, Suite 300
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD:Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94306
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISQUET
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release num;1.0, Version 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/014,153
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 05-FEB-1993
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/653,091
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 08-FEB-1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:US 07/366,313
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 13-JUN-1989
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 06/948,270
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 31-DEC-1986
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Fabian, Gary R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: 33,875
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE ARCHIVO/REFERENCIA: 4600-0106
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 324-0880
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 324-0960
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3AC, Fig. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es K o Q"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es L o I"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es K o R"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es I o V"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es L o I"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 41
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es R o C"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 43
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es P o L"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA:NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3BC, Fig. 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es R o C"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es P o L"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es T o S"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es S o T"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es S o P"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es I, M o V"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 25
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es N o K"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es L o I"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: MTA-1, Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: K55 o "4," Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 427 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:p21E(I)CS, Fig. 2A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 142 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA:NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:p21E(I), Fig. 2A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 480 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: p21E(II)CS, Fig. 2B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 160 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: p21E(II), Fig. 2B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:FP-1A, Fig. 3A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGAATTCT CCATGGGTTC CTTGTCACCT GTTCCCACC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: FP-2A, Fig. 3A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGAATTCG GATCCTGGCT TGTCTCCGCC CTGGCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:FP-MF1, Fig. 3A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:ll:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGAATTCGG ATCCATAGTC AAAAACCACA AAAATC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: MF2, Fig. 3A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAATTCGG ATCCCTCCTG TTCTGGGAGC AAGG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: FP-3A, Fig. 3A
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCGAATTCA CTAGTGGATC CCAAGAACAG TGCCGTTTTC CG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:RP-1B, Fig. 3B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCACTAGTA CCACCACCAC CGAATTCCAC CGGTACCGCT CGGCGGGA
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:l5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: RP-2B, Fig. 3B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGAATTCG TGGTTTTGA CTATTGCTTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:RP-MR1, Fig. 3B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAATTCG GAAAACGGCA CTGTTC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: MR2, Fig. 3B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAATTCC AGGAGATCAA GGCCTCGTCT G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: RP-3B, Fig. 3B
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGAATTCG TTAAGGCCCC AGCCAGTCAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:1A1B, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2A2B, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 86 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2A3B, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3A, Fig. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3B, Fig. 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:MF1R2, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: MF2R1, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA:NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3AS, Fig. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3AM, Fig. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3AB, Fig. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:2B3AMO, Fig. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3B, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA:NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3BS, Fig. 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3BM, Fig. 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3BCH, Fig. 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:3A3BMO, Fig. 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 133 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3A(I), Fig. 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 133 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 2B3A(II), Fig. 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3B(I), Fig. 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: 3A3B(II), Fig. 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA:NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: MTA-4, Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: MTA-5, Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: K163, Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: K15, Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA:NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: K34, Fig. 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: pGEX MODIFICADO, FIG. 3C
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..68
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 99 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL:p21E, Fig. 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Un péptido que tiene una región antigénica
específica de HTLV que consiste esencialmente en la secuencia de
aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1, dicho péptido estando
caracterizado por:
(i) inmunoreactividad a sueros de sujetos humanos
infectados con HTLV-I o HTLV-II,
y
(ii) no inmunoreactividad con sueros que son (1)
inmunoreactivos con el antígeno p21E de HTLV-1, pero
(2) obtenidos de humanos que no están infectados con
HLTV-I o HTLV-II.
2. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia del péptido es identificada por SEQ ID NO: 22 contenida en
SEQ ID NO: 1.
3. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia del péptido es identificada por SEQ ID NO: 29 contenida en
SEQ ID NO: 1.
4. El péptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para uso en un ensayo en fase sólida para
detectar la infección con HTLV-I o
HTLV-II en una muestra de suero humano, que se lleva
a cabo sobre un soporte sólido.
5. Un kit para detectar la presencia de infección
con HTLV-I o HTLV-II en un suero
humano, que comprende
(a) un soporte sólido;
(b) unido al soporte, en una primera zona de
reacción, un péptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3; y
(c) medios indicadores para detectar la presencia
de anticuerpos humanos unidos a dicho soporte.
6. El kit de la reivindicación 5, que además
incluye una segunda zona de reacción en el soporte sólido, y unida a
esta segunda zona, una segunda región antigénica específica de HTLV
que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos
identificada por SEQ ID NO: 2, y estando caracterizado por la
inmunoreactividad con los sueros que son (1) obtenidos de humanos
que no están infectados con HTLV-1 o
HTLV-II, pero (2) inmunoreactivos con el antígeno
p21E de HTLV-I
7. El kit de la reivindicación 6, donde dicha
segunda región antigénica es identificada por SEQ ID NO: 30
contenida en SEQ ID NO: 2.
8. El kit de la reivindicación 5, que además
incluye una tercera zona de reacción en el soporte sólido, y unida a
esta tercera zona, un tercer antígeno específico de HTLV capaz de
discriminar entre anticuerpos de suero específicos contra
HTLV-I y HTLV-II.
9. El kit de la reivindicación 8, donde el tercer
antígeno contiene una región antigénica específica de
HTLV-I que consiste esencialmente en la secuencia
identificada por SEQ ID NO: 3 o una región antigénica específica de
HTLV-II que consiste esencialmente en la secuencia
identificada por SEQ ID NO: 4.
10. Un kit para detectar la presencia de
infección con HTLV-I o HTLV-II en un
suero humano, que comprende
(a) un soporte sólido que tiene la primera y la
segunda, y la tercera zonas de reacción,
(b) inmovilizado en dicha primera zona de
reacción, un primer péptido que tiene una región antigénica
específica de HTLV que consiste esencialmente en la secuencia de
aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1, dicho péptido estando
caracterizado por:
(i) inmunoreactividad a sueros de sujetos humanos
infectados con HTLV-I o HTLV-II,
y
(ii) no inmunoreactividad con sueros que son (1)
inmunoreactivos con el antígeno p21E de HTLV-1, pero
(2) obtenidos de humanos que no están infectados con
HLTV-I o HTLV-II;
(c) inmovilizado en dicha segunda zona, un
segundo péptido que tiene una región antigénica específica de HTLV
que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos
identificada por SEQ ID NO: 2, y estando caracterizado por la
inmunoreactividad con sueros que son (1) inmunoreactivos con el
antígeno p21E de HTLV-1, pero (2) obtenidos de
humanos que no están infectados con HLTV-I o
HTLV-II;
(d) inmovilizado en dicha tercera zona, un tercer
antígeno específico de HTLV capaz de discriminar entre anticuerpos
de suero específicos contra HTLV-I y
HTLV-II; y
(e) medios indicadores para detectar la presencia
de anticuerpos humanos unidos a dicho soporte.
11. El kit de la reivindicación 10, donde dicha
primera secuencia peptídica es identificada por SEQ ID NO: 22
contenida en SEQ ID NO: 1, y dicha segunda secuencia peptídica es
identificada por SEQ ID NO: 30 contenida en SEQ ID NO: 2.
12. El kit de la reivindicación 10, donde dicho
tercer péptido tiene una región antigénica específica de
HTLV-I que consiste esencialmente en la secuencia de
aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 3, dicho péptido estando
caracterizado por:
(A) inmunoreactividad a sueros de sujetos humanos
infectados con HTLV-I, y
(ii) no inmunoreactividad a sueros de sujetos
humanos infectados solamente con HTLV-II.
13. El kit de la reivindicación 10, donde dicho
tercer péptido tiene una región antigénica específica de
HTLV-II que consiste esencialmente en la secuencia
de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 4, dicho péptido estando
caracterizado por:
(i) inmunoreactividad a sueros de sujetos humanos
infectados con HTLV-II, y
(ii) no reactividad a sueros de sujetos humanos
infectados solamente con HTLV-I.
14. Un método para identificar positivamente la
infección con HTLV-I o HTLV-II en un
sujeto humano, que comprende
reaccionar el suero del sujeto con un péptido que
contiene una región antigénica específica de HTLV que consiste
esencialmente de la secuencia de aminoácidos identificada por SEQ ID
NO: 1,
por dicha reacción, formar un complejo inmune
entre dicho péptido y anticuerpos en el suero de un sujeto que tiene
infección con HTLV-I o HTLV-II,
y
examinar el péptido para la presencia de
inmunocomplejo, evidenciando la presencia de anticuerpos de
HTLV-I o HTLV-II en el suero.
15. El método de la reivindicación 14, donde la
secuencia de la región antigénica está identificada por SEQ ID NO:
22 o SEQ ID NO: 29 contenida en SEQ ID NO: 1.
16. El método de la reivindicación 14, donde
dicha reacción incluye además hacer reaccionar el suero con un
péptido que contiene una segunda región antigénica específica de
HTLV, donde la secuencia de dicha segunda región es identificada por
SEQ ID NO: 2, está caracterizada por la inmunoreactividad con
sueros que son (1) obtenidos de humanos que no están infectados con
HTLV-I o HTLV-II, pero (2)
inmunoreactivos con el antígeno p21E de HTLV-I.
17. El método de la reivindicación 16, donde
dicha segunda región antigénica es identificada por SEQ ID NO: 30
contenida en SEQ ID NO: 2.
18. El método de la reivindicación 14, donde
dicha reacción incluye además hacer reaccionar el suero con un
péptido que contiene un tercer antígeno específico de HTLV capaz de
discriminar entre anticuerpos de suero específicos contra
HTLV-I y HTLV-II.
19. El método de la reivindicación 18, donde el
tercer antígeno contiene una región antigénica específica de
HTLV-I que consiste esencialmente en la secuencia
identificada por SEQ ID NO: 3.
20. El método de la reivindicación 18, donde el
tercer antígeno contiene una región antigénica específica de
HTLV-II que consiste esencialmente en la secuencia
identificada por SEQ ID NO: 4.
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