ES2220857T3

ES2220857T3 - Utilizacion de modificantes alostericos de hemoglobina para la disminucion de la afinidad del oxigeno en la sangre.

Info

Publication number: ES2220857T3
Application number: ES02012781T
Authority: ES
Inventors: Donald J. Abraham; Mona Mahran; Ahmed Mehanna; Ramnarayan Randad
Original assignee: Virginia Commonwealth University; Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation
Current assignee: Virginia Commonwealth University; Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation
Priority date: 1991-05-20
Filing date: 1992-05-19
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2012-05-19
Also published as: EP1236711A3; ATE265208T1; EP1468680A2; DK0585366T3; EP0585366A4; EP1468680A3; EP0585366B1; EP0585366A1; DK1236711T3; DE69233320D1; ES2223042T3; WO1992020335A1; US5248785A; ATE260886T1; DE69233348D1; CA2109575C; DE69233348T2; CA2109575A1; JP3023423B2; EP1236711A2

Abstract

Un compuesto con la fórmula estructural general (I), en la que X, Y, y Z son CH2, NH, CO, O, o N con la advertencia de que los restos X, Y, y Z son diferentes uno del otro, en la que R1 tiene la fórmula en la que R1 puede estar conectado a cualquier posición del anillo fenilo, y R3 y R4 son hidrógeno, halógeno, grupos metilo o etilo y estos restos podrían ser los mismos o diferentes, o restos alquílicos como parte de un anillo alifático conectando R3 y R4, y en la que R5 es un hidrógeno, halógeno, alquilo inferior C1- 3, o un catión salino, caracterizado porque R2 es un resto aromático que tiene la fórmula

Description

Utilización de modificantes alostéricos de hemoglobina para la disminución de la afinidad del oxígeno en la sangre.

Campo de la presente invención

La presente invención se refiere en general al uso de una familia de compuestos para el ajuste del equilibrio alostérico de hemoglobina hacia un estado de baja afinidad hacia el oxígeno. Además, la presente invención contempla usar la familia de compuestos para uso en el tratamiento de enfermedades que involucren deficiencia de oxígeno, en curación de heridas, y en restitución de la afinidad hacia el oxígeno de la sangre almacenada.

Descripción del estado anterior de la técnica

La hemoglobina es una proteína tetramérica que entrega oxígeno vía un mecanismo alostérico. El oxígeno se une a los cuatro hemes de la molécula de hemoglobina. Cada heme contiene porfirina e hierro en estado ferroso. El enlace hierro ferroso - oxígeno es fácilmente reversible. La unión del primer oxígeno a un heme requiere mucha mayor energía que la segunda molécula de oxígeno, la unión del tercer oxígeno requiere aún menos energía, y el cuarto oxígeno requiere la menor energía para el enlace. La hemoglobina tiene dos subunidades \alpha y \beta organizadas por una simetría doble. Los dímeros \alpha y \beta rotan durante la liberación de oxígeno para abrir una gran cavidad central de agua. La transición alostérico que involucra el movimiento del dímero \alpha - \beta tiene lugar entre la unión del tercero y cuarto oxígenos. La unión de la interfaz \alpha_{1}\beta_{1} es más estrecha que la interfaz \alpha_{1}\alpha_{2}, o la \alpha_{1}\beta_{2}.

En sangre, la hemoglobina es un equilibrio entre dos estructuras alostéricas. En el estado "T" (por tenso), la hemoglobina se desoxigena. En el estado "R" (por relajado), la hemoglobina se oxigena. Puede ser escaneada una curva de equilibrio de oxígeno, usando un equipo bien conocido como AMINCO^{TM} HEM-O-SCAN, para observar la afinidad y el grado de cooperatividad (acción alostérica) de la hemoglobina. En el escaneado, el eje Y representa por ciento de oxigenación de la hemoglobina y el eje X representan la presión parcial de oxígeno en milímetros de mercurio (mm Hg). Si se dibuja una línea horizontal desde el punto de saturación con oxígeno a 50% hacia la curva escaneada, y se dibuja una línea vertical desde el punto de intersección de la línea horizontal con la curva al eje X de presiones parciales, se determinará un valor comúnmente conocido como P_{50} (esto es, la presión en mm Hg cuando la muestra de hemoglobina escaneada está saturada a un 50% con oxígeno). Bajo condiciones fisiológicas (esto es, 37ºC, pH = 7,4 y presión parcial de dióxido de carbono de 40 mm Hg), el valor P_{50} para hemoglobina adulta normal (HbA) es alrededor 26,5 mm Hg. Si se obtiene un valor de P_{50} menor que el normal en el ensayo de la hemoglobina en cuestión, la curva escaneada se considera "desplazada a la Izquierda" y se indica presencia de hemoglobina de alta afinidad. Si se obtiene un valor de P_{50} mayor que el normal en el ensayo de la hemoglobina en cuestión, la curva escaneada se considera "desplazada a la derecha" y se indica presencia de hemoglobina de baja afinidad.

Ha sido propuesto que el influir sobre el equilibrio alostérico de hemoglobina es un camino viable de ataque en el tratamiento de enfermedades. La conversión de hemoglobina a un estado de alta afinidad en general es reconocida como beneficiosa en la resolución de los problemas con la deoxi S-hemoglobina (anemia de celda de hoz). La conversión de hemoglobina a un estado de baja afinidad se considera que tiene utilidad general en una variedad de enfermedades, donde los tejidos sufren de tensión baja de oxígeno, como isquemia y radio sensibilización de tumores. Algunos compuestos sintéticos han sido identificados con utilidad en la regulación alostérica de la hemoglobina y otras proteínas. Por ejemplo, algunos nuevos compuestos y métodos para tratar la anemia de la celda de hoz que involucran la regulación alostérica de la hemoglobina son informados en la patente de los EE.UU. Nº 4.699.926 otorgada a Abraham et al.., patente de los EE.UU. Nº 4.731.381 otorgada a Abraham et al.., la patente de los EE.UU. Nº 4.731.473 otorgada a Abraham et al.., la patente de los EE.UU. Nº 4.751.244 otorgada a Abraham et al.., la patente de los EE.UU. Nº 4.887,995 otorgada a Abraham et al. Además, en ambos artículos, Perutz, "Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins", Quarterly Reviews of Biophysics 22, 2 (1989), pp. 163-164; y en Lalezari et al. "LR16, a compound with potent effects on the oxygen affinity of hemoglobin, on blood cholesterol, and on low density lipoprotein", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85 (1988), pp. 6117-6121; se discuten compuestos que son eficaces modificadores alostéricos de la hemoglobina Adicionalmente, Perutz et al. han demostrado que un conocido fármaco anti hiperlipoproteinemía, Bezafibrato, es capaz de bajar la afinidad de la hemoglobina hacia el oxígeno (véase "Bezafibrato lowers oxygen affinity of hemoglobin", Lancet 1983, 881.

Las solicitudes de patente alemanes, 2.149.070 y 2.432.560, ambas otorgada a Witte et al., revelan compuestos que son estructuralmente similares a algunos de los compuestos pertenecientes a la familia de compuestos definidos por la presente invención. Sin embargo, las solicitudes de patentes de Witte et al. consideran el uso de los compuestos para reducción de los niveles de lípidos en suero. Las solicitudes de patentes de Witte et al. no suministran indicación alguna sobre el uso potencial de los compuestos para la modificación alostérica de la hemoglobina.

Sumario de la presente invención

Es por tanto un objeto de la presente invención proveer un método de uso de una familia de compuestos para la modificación alostérica de la hemoglobina de forma que la hemoglobina esté presente en la sangre en un estado de inferior afinidad al oxígeno.

Es todavía otro objeto de la presente invención proveer un método de prolongar el plazo de almacenamiento de la sangre, añadiendo compuestos a la sangre pertenecientes a una familia especial de compuestos.

De acuerdo con la presente invención, se define una familia de compuestos para la modificación alostérica de la hemoglobina por la fórmula:

1

en el que R_{2} es un aromático sustituido o no sustituido, como fenilo, naftilo, o indanilo, o un aromático heterocíclico, o un compuesto de anillo alquílico, sustituido o no sustituido, como ciclohexilo o adamantilo, y en el que X, Y, y Z son CH_{2}, NH, CO, O, o N con la advertencia de que los restos X, Y, y Z son cada uno diferentes entre sí, y en el que R_{1} tiene la fórmula:

2

en el que R_{1} puede estar conectado a cualquier posición sobre el anillo fenilo y R_{3} y R_{4} son hidrógeno, halógeno, metilo, o grupos etilo y estos restos podrían ser los mismos o diferentes, o ser restos alquílicos cuando parte de un anillo de alifáticos que conecta R_{3} y R_{4}, y R_{5} es un hidrógeno, alquilo inferior como metilo, etilo o propilo, o un catión salino como sodio, potasio o amonio. Se han sintetizado muchos compuestos dentro de esta familia y se ha determinado su efecto sobre el valor P_{50} de la hemoglobina. Cada uno de los compuestos analizados demostró ser capaz de incrementar el valor P_{50} de la hemoglobina; por lo tanto, los compuestos son capaces de desplazar el equilibrio alostérico de la hemoglobina hacia una condición que favorezca el estado de baja afinidad hacia el oxígeno. Además, se encontró que los compuestos estabilizan el grado de la disociación del oxígeno de la hemoglobina en la sangre almacenada durante períodos prolongados de tiempo. Además, los compuestos demostraron ser bien tolerados por ratones cuando se administraban como una dosis intraperitoneal. Debido a que los compuestos, dentro de la familia definida por la presente invención, son capaces de desplazar el equilibrio alostérico de la hemoglobina hacia el estado "T" de baja afinidad, éstos tienen la habilidad de provocar que la hemoglobina reparta más oxígeno a los tejidos. Así, los compuestos de la presente invención deben ser valiosos como agentes de antiisquémicos, como sensibilizadores para irradiación de la radiografía en la terapia de cáncer, como agentes de curación de heridas, al tratar los trastornos relacionados con baja entrega de oxígeno en el cerebro como Alzheimer, depresión y esquizofrenia, en la preparación de sustitutos de sangre, y en el almacenamiento de la sangre.

Breve descripción de los dibujos

Los precedentes y otros objetos, aspectos y ventajas serán comprendidos mejor de la siguiente descripción detallada de una realización preferente de la presente invención con referencia a los dibujos, en la cual:

La Figura 1a es una estructura química que define un grupo particularmente preferente dentro de la familia de compuestos usados en la presente invención.

Las Figuras 1b y 1c son estructuras químicas que definen dos subconjuntos de la familia definida en la Figura 1a.

Las Figuras 2a-b reproducen las estructuras químicas de compuestos precursores, organizados en esquemas de reacción, para preparar compuestos que sean útiles como intermediarios para sintetizar compuestos dentro de un primer grupo de la familia de compuestos.

La Figura 2c reproduce las estructuras químicas, incluyendo intermediarios producidos mostrados en las Figuras 2a-b, organizados en un esquema de reacción, para preparar el primer grupo de compuestos preferentes.

La Figura 3 reproduce estructuras químicas, organizadas en un esquema de reacción, para producir un segundo grupo de la familia de compuestos preferentes.

La Figura 4 reproduce estructuras químicas, organizadas en un esquema de reacción, para producir un tercer grupo de la familia de compuestos preferentes.

Las Figuras 5a-b reproducen estructuras químicas de compuestos precursores, organizados en esquemas de reacción, para preparar compuestos que son útiles como intermediario para sintetizar compuestos dentro de un cuarto grupo de la familia de compuestos preferentes.

La Figura 5c reproduce estructuras químicas, incluidas las de los mediadores producidos en las Figuras 5a-b, organizadas en un esquema de reacción para producir el cuarto grupo de compuestos.

La Figura 6a reproduce estructuras químicas, organizadas en un esquema de reacción, que es una alternativa a la mostrada en la Figura 4, para producir compuestos dentro de un tercer grupo de la familia de compuestos preferentes.

La Figura 6b reproduce estructuras químicas, organizadas en un esquema de reacción similar al mostrado en la Figura 6a, excepto que el compuestos precursor utilizado es escogido de forma que el compuesto producido tenga una sustitución meta en lugar de una sustitución para en un anillo fenilo, y con el propósito de que grupos etílicos, en lugar de metílicos, estén presentes en el resto sustituyente del anillo fenilo meta - sustituido.

La Figuras 7a y 7b muestran estructuras químicas, organizadas en un esquema de reacción, para producir compuestos dentro de un quinto grupo de la familia de compuestos preferentes.

La Figura 8 es una tabla que presenta los valores P_{50}, medidos para la hemoglobina en solución, donde la adición de cada uno de los compuestos, dentro de la familia preferente, se mostró capaz de modificación alostérica de la hemoglobina hacia un estado de baja afinidad al oxígeno.

La Figura 9 es una tabla similar a la de la Figura 8ª, excepto que los valores son los medidos para hematíes humanos intactos (en contraposición a la hemobglobina en solución), expuestos a algunos de los compuestos de la familila definida por la presente invención.

La Figura 10 es un gráfico que ilustra curvas de disociación del oxígeno producida cuando una solución 5,4 millimolar de hemoglobina en presencia y ausencia de compuestos seleccionados se ensayó a pH 7,4, utilizando HEPES como búfer en un analizador Hem-O-Scan de disociación de oxígeno.

La Figura 11 es un gráfico similar al de la Figura 10, que ilustra curvas de disociación de oxígeno para sangre humana entera en presencia y ausencia de los compuestos seleccionados.

La Figura 12 es un gráfico similar al de la Figura 10 en la que las curvas de disociación del oxígeno, producida cuando una solución 5,4 millimolar de hemoglobina en presencia y ausencia de compuesos especiales, incluyendo 2,3-difosfoglicerato que es un efector alostérico natural de la hemoglobina, son evaluadas a pH 7,4 usando HEPES como búfer en un analizador Hem-O-Scan de disociación de oxígeno.

La Figura 13 es una tabla que indica el efecto del ácido 2-[4 -((((3,5-Dimetil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}) sobre glóbulos rojos humanos almacenados en la formulación adsol.

La Figura 14 es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de oxígeno suministrado por células almacenadas, recién almacenas y en presencia de 2-[4 -((((3,5-Dimetil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}), respectivamente.

La Figura 15 es una tabla que muestra que el cambio en los valores de P_{50} de glóbulos rojos caducos almacenados en el tratamiento con el ácido 2-[4-((((3,5-dimetil-fenil) amino) carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (denominado RSR-13).

Descripción detallada de las realizaciones preferentes de la presente invención

Refiriéndonos ahora a los dibujos y, más particularmente, a las Figuras 1a-c que ilustran la fórmula estructural general de los compuestos particularmente preferentes, contemplados para uso actualmente en la presente invención, y los primero y segundo subconjuntos, respectivamente, de la fórmula estructural general. Con referencia a la fórmula estructural general de la Figura 1a, los restos X y Z podrían ser CH_{2}, CO, NH o O, y el resto Y podría ser CO o NH, con la advertencia de que los restos X, Y, y Z son cada uno diferentes entre sí. Además, R_{6-10} es tanto hidrógeno, halógeno, un grupo alquilo sustituido o no sustituido C_{1-3} (hasta tres carbonos en longitud), o un éster C_{1-3} o éter, y estos restos podrían ser los mismos o diferentes, o restos de alquilos alifáticos o anillos aromáticos que incluyen dos sitios R_{6-10} adyacentes. Los puestos R_{3-4} son hidrógeno, halógeno, grupos metilo o etilo, y estos restos podrían ser los mismos o diferentes., o restos alquílicos como parte del anillo alifático (p. ej, del ciclobutilo) que conecte R_{3} y R_{4}. La posición R_{5} es hidrógeno, halógeno, grupos metilo o etilo.

En el primer subconjunto de compuestos definido en la Figura 1b, cada X y Z podrían ser CH_{2}, NH, o O, con la advertencia de que cuando X es CH_{2}, Z es NH o O, cuando X es NH, Z sea CH_{2} o O, y cuando X es O, Z es NH o CH_{2}. El primer subconjunto de compuestos se puede convenientemente clasificar en cuatro grupos como sigue:

: Grupo I: compuestos del ácido 2-[4-((aril)acetamido)fenoxi]-2-metil propiónico que tienen la fórmula estructural general ilustrada en la Figura 2C.

: Grupo II: compuestos del ácido 2-[4-(((aril)oxi)carbonil)amino)fenoxi]-2-metil propiónico que tienen la fórmula estructural general ilustrada en la Figura 3.

: Grupo III: compuestos del ácido 2-[4-((((aril)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico que tienen la fórmula estructural general ilustrada en las Figuras 4 y 6ª.

: Grupo IV: compuestos del ácido 2-[4-(((aril)amino)carbonil)oxi)fenoxi]-2-metil propiónico que tienen la fórmula estructural general ilustrada en la Figura 5C.

En el segundo subconjunto de compuestos definido en la Figura 1c, X y Z podrían cada uno ser CO o CH_{2}, con la advertencia de que cuando X es CO, Z es CH_{2}, y cuando X es CH_{2}, Z es CO. El segundo subconjunto de compuestos puede ser dividido en dos agrupaciones convenientemente de la siguiente manera:

: Grupo V: compuestos del ácido 2-[4-((amino (ariloíl)) metil)fenoxi]2 metilo-propiónico que tienen la fórmula estructural general ilustrada en la Figura 7b.

: Grupo VI: compuestos del ácido 2-[4-((((aril))metil)amino)carbonil)fenoxi]-2-metil propiónico, los cuales son objeto de la solicitud pendiente de las EE.UU. Nº 07/623.346 a nombre de Abraham et. al, presentada el 7 de diciembre, 1990.

Los sustituyentes de R_{3-10} en la Figura 1b-c son los mismos como los definidos en referencia a la Figura 1a. La síntesis de compuestos químicos específicos dentro de los primeros cinco grupos de compuestos se brinda en los siguientes ejemplos en relación a las Figuras 2-7. La síntesis de compuestos químicos específicos en el sexto grupo se explica en detalle en la solicitud pendiente de los EE.UU. Nº 07/623.346 a nombre de Abraham et. al, la que ha sido incluida como referencia. Todos compuestos que fueron preparados fueron verificados por cromatografía de capa fina (TLC, por las siglas de su expresión inglesa, Thin Layer Chromatography) para su pureza y la elucidación de estructura se realizó sobre la base de la espectroscopía NMR e ir, y análisis elemental.

Ejemplo 1

La Figura 2A ilustra un esquema de reacción para preparar ácido 2-(4-amino-fenoxi)-2-metil-propiónico, un compuesto que es útil como un precursor en la preparación de los compuestos del grupo. De conformidad con el esquema de la Figura 2A, se añaden 8 gramos (0,2 mol) de hidróxido de sodio pulverizado a una suspensión de 5,28 g (0,035 mol) de p-acetamino-fenol en 23 g (0,4 mol) de acetona. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1/2 hora. Posteriormente, 3,58 g (0,03 mol) de cloroformo se gotearon durante 30 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y la acetona es retirada con vacío. El residuo es disuelto en agua (10 ml), seguido por acidificación con ácido clorhídrico (HCl) al 37% para producir un precipitado amarillo pálido de ácido 2-(4-acetamino-fenoxi)-2-metil propiónico (5 g, rendimiento 60%), cristalizado a partir de metanol, punto de fusión 69-71ºC.

^{1}H NMR: (CD3OD) \delta 7,1 (m, 4H), ArH 2,05 (s, 3H), CH_{3}, 1,45, (s, 6H) 2CH_{3}.

Fueron hervidos 1,18 g (0,005 mol) de ácido 2-(4-acetamino-fenoxi)-2-metil propiónico en KOH al 10% (60 ml) durante 1/2 hora. La disolución luego es enfriada y acidificada con ácido acético para producir 0,6 g (rendimiento 62%) de ácido de 2-(4-amino-fenoxi)-2-metil propiónico), como un polvo blanco amarillento, punto de fusión 214-16ºC.

^{1}H NMR: (DMSOd6 + TMS) \delta 6,6 (m, 4H)ArH, 1,35 (s, 6H, 2 CH_{3}).

Ejemplo 2

La Figura 2B ilustra otro esquema de reacción para preparar ácido 2-(4-amino-fenoxi)-2-metil propiónico). De conformidad con el esquema de la Figura 2B, 8 gramos de hidróxido de potasio son disueltos en 32 ml de agua y la solución resultante de KOH es unida y mezclada con 280 ml de peróxido de hidrógeno al 3%. Son añadidos 11,3 g (0,058 mol) de ácido 2-(4-ciano-fenoxi)-2-metil propiónico a KOH/H_{2}O_{2} para que la disolución y la mezcla de reacción sean removidos despacio aproximadamente durante una hora hasta que el efecto exotérmico y el desprendimiento de gas hayan cesado. La mezcla luego es enfriada y acidificada con ácido clorhídrico concentrado. El producto, ácido 2-(4-carboxi-fenoxi)-2-metil propiónico), es obtenido como un sólido blanco (9,8 g, rendimiento 79%). El producto es cristalizado a partir de etanol para producir cristales blancos puros, punto de fusión 202-4ºC.

El ácido 2-(4-carboxi-fenoxi)-2-metil propiónico), 5,57 g (0,025 mol), es añadido gradualmente bajo agitación a 100 ml de una solución acuosa fría que contenía 4,4 g (0,025 mol) de bromo y 11 g (0,25 mol) de hidróxido de sodio. La solución así obtenida es calentada a 75ºC durante 1/2 hora. Después de enfriarse, la disolución es acidificada con ácido acético para dar el producto deseado, ácido 2-(4-amino-fenoxi)-2-metil propiónico), en 4,0 g (rendimiento 81%) de un precipitado blanco, de punto de fusión 214-16ºC. El compuesto es idéntico al producto preparado en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

La Figura 2C ilustra un esquema de reacción general para preparar los ácidos 2-(4-[arilacetamido]-fenoxi)-2-metil propiónico) del Grupo I. De conformidad con el esquema ilustrado, es disuelto 1 g (0,005 mol) de 2-(4-amino-fenoxi)-2-metil propiónico) con agitación en 10 ml de agua que contenía 0,41 g (0,1 mol) de NaOH. A esta solución, es añadido gradualmente 0,79 g (0,005 mol) de cloruro de acetil-fenilo en 5 ml de tetrahidrofurano (THF) durante un período de aproximadamente 15 minutos. Después de que la adición se completase, el pH de la mezcla de reacción debiera ser alcalino (si no, son añadidas algunas gotas de NaOH 2N para que garanticen la alcalinidad). La mezcla de reacción se agitó constantemente durante 1 hora. De allí en adelante, el THF es evaporado al vacío, y la disolución es diluida con 5 ml de agua, luego fue acidificada con ácido clorhídrico concentrado. El producto es extraído con éter etílico (2 X, 20 ml), lavado con agua (3 X, 20 ml), y luego secado sobre MgSO_{4} anhidro. Luego de la adición de éter de petróleo a la solución de éter, se obtuvo 0,9 g (rendimiento 56%) de un precipitado de ácido 2-[4-(fenil-acetamido)fenoxi]-2-metil propiónico como un sólido marrón pálido, de punto de fusión 173-175ºC.

^{1}H NMR: (DMSOd6) 10 (s, ^{1}H, COOH), 7,5 - 6,7 (m, 9H, ArH), 3,55 (s, 2H, CH_{2}), 1,4 (s, 6H, 2CH_{3}). Anal: C_{18}H_{19}NO_{4}.

Calculado: C 69,00 H 6,07 N 4,47 Encontrado: C 68,86 H 6,14 N 4,42

Ejemplo 4

El procedimiento del Ejemplo 3 es seguido como se explicó anteriormente, excepto que el cloruro de acetil-fenilo es sustituido por 0,005 mol de cloruro de 4-cloro-fenil acetilo. En este caso, el producto (rendimiento 57%) fue el ácido 2-[4-(p-clroro-fenil-acetamido)fenoxi]-2-metil propiónico, punto de fusión 168-71ºC.

^{1}H NMR: (DMSOd6) 10 \delta (s, 1H, COOH), 7,6 - 6,7 (m, 8H, ArH), 3,6 (s, 2H, CH_{2}), 1,4 (s, 6H, 2 CH_{3}) Anal: C_{18}H_{19}NO_{4}Cl.

Calcul.: C 62,15 H 5,17 N 4,02 Cl 10,12 Encontrado: C 62,16 H 5,25 N 3,98 Cl 10,25.

El cloruro de 4-cloro-fenil acetilo para la síntesis precedente es preparado a reflujo en una suspensión de 1 g (0,006 mol) de ácido 4-cloro-fenil acético en 1,07 g (0,009 mol) de cloruro de tionilo, removiendo durante 1 hora con calentamiento. Después de enfriarse el cloruro de tionilo en exceso es evaporado a vacío para presentar el producto de cloruro de 4-cloro-fenil acetilo como un aceite amarillo (1 g, rendimiento 83%).

Ejemplo 5

La Figura 3 ilustra un esquema de reacción general para preparar ácidos del Grupo II 2-[4-(((ariloxi)carbonil)amino)fenoxi]-2-metil propiónico. De conformidad con el esquema ilustrado, una solución que consta de 0,15 g (0,001 mol) de cloroformato de fenilo en 3 ml de THF es añadida gradualmente a una solución helada conteniendo 0,3 g (0,001 mol) de ácido 2-(4-amino-fenoxi)-2-metil propiónico y 0,17 g (0,002 mol) de bicarbonato de sodio en 10 ml de agua (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1/2 hora a 0ºC, seguido por agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. El THF es retirado al vacío y son añadidos 10 ml de agua. Luego, la mezcla de reacción es acidificada con ácido clorhídrico concentrado y extraída con éter etílico (2 X 20 ml). La solución de éter es lavada con agua (3 X 20 ml) y secada sobre MgSO_{4} anhidro. El producto deseado, ácido 2-[4-((((fenil)oxi)carbonil)amino)fenoxi]-2-metil propiónico, es precipitado de la solución de éter por adición de éter de petróleo, obteniéndolo como un sólido blanco, 0,15 g (rendimiento 31%), punto de fusión 183-5ºC.

^{1}H NMR: (DMSOd6) 10 \delta (s, ^{1}H, COOH), 7,55 - 6,75 (m, 9H, ArH), 1,4 (s, 6H, 2 CH_{3}).

Anal: C_{17}H_{17}O_{5}N.

Calculado: C 64,76 N 5,39 H 4,44 Encontrado: C 64,65 N 5,45 H 4,43.

Ejemplo 6

Es seguido el procedimiento como el usado en el ejemplo 5, excepto que 0,001 mol de 4-cloro-fenil cloroformato sustituyen al fenil cloroformato. En este caso el producto ácido 2-[4-((((p-clorofenil))oxi)carbonil)amino)fenoxi]-2-metil propiónico es obtenido como un precipitado blanco, 0,15 g (rendimiento 28%), punto de fusión 179-82ºC.

^{1}H NMR: (DMSOd6 + TMS) \delta 7,6 - 6,8 (m, 8H, ArH), 1,4 (s, 6H, 2 CH_{3}).

Anal: C_{17}H_{16}O_{5}NCl Calculado: C 58,36 H 4,57 Cl 10,15 Encontrado: C 58,16 H 4,68 Cl 10,35.

Ejemplo 7

La Figura 4 ilustra un esquema general de reacción para preparar los compuestos del Grupo III de la presente invención. De conformidad con el esquema ilustrado, 5,2 g (34 mmol) de ácido 4-hidroxi-fenil-acético (HPAA) son calentados a reflujo con un exceso de cloruro de tionilo(SOCl_{2}) durante 1/2 hora. La mezcla de reacción es enfriada luego y el SOCl_{2} en exceso es retirado a vacío. El residuo se hace reaccionar durante 2 horas con 6,3 g (68 mmol) de anilina en 50 ml de xileno a reflujo. La mezcla de reacción es enfriada luego, lavada con HCl diluido, agua y salmuera, y es extraída con NaOH acuoso 2N. La capa de álcali combinada es lavada con éter, enfriada y acidificada para suministrar 7 g de amida de N-fenil-4-hidroxi-bencil amina(C_{14}H_{12}NO_{2}) como producto intermedio (rendimiento 90%), punto de fusión 138ºC. El producto intermedio es recristalizado a una mezcla de acetona y éter de petróleo, relación 1:2, y una porción de 1,13 g (5 mmol) es O-alquilada durante 12 horas usando el procedimiento del Ejemplo 1 con 20 ml de acetona, 2,75 g de NaOH y 1,25 ml de CHCl_{3}. El producto final es el ácido 2-[4-((((fenil))oxi)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{19}O_{5}NO_{4}), 1,2 g (rendimiento 76%), punto de fusión 198ºC.

Ejemplo 8

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 8,6 g (68 mmol) de 4-cloro-anilina en lugar de anilina. En este caso, el producto intermedio es de N-(4-clorofenil)-4-hidroxi-bencil-amida (C_{14}H_{12}ClNO_{2}), 7,5 g (rendimiento 84%), punto de fusión 163ºC. 1,3 g del producto intermedio es O-alquilado para producir ácido 2-[4-((((4-clorofenil)amino-)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{18}ClNO_{4}), 0,86 g (rendimiento 50%), punto de fusión 196ºC.

Ejemplo 9

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 2,6 g (17 mmol) de HPAA y usando 5,67 g (35 mmol) de 3,4-dicloro-anilina en lugar de anilina. En este caso, el producto intermedio es N-(3,4-dicloro-fenil-4-hidroxi-bencil-amida (C_{14}H_{11}Cl_{2}NO_{2}). 1,48 g (5 mmol) del intermediario es O-alquilado para producir ácido 2-[4-((((3,4-dicloro-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}NO_{4}), 0,76 g (rendimiento 40%), punto de fusión 174ºC.

Ejemplo 10

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 2,6 (17 mmol) de HPAA y usando 5,7 g (35 mmol) de 3,5-dicloro-anilina en lugar de anilina. En este caso, el producto intermedio es N-(3,5-dicloro-fenil-4-hidroxi-bencil-amida (C_{14}H_{11}Cl_{2}NO_{2}). 1,48 g (5 mmol) del producto intermedio es O-alquilado para producir ácido 2-[4-((((3,5-dicloro-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}NO_{4}), 0,8 g (rendimiento 42%), punto de fusión 138ºC.

Ejemplo 11

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 0,95 g (6 mmol) de HPAA y usando 2,6 g (12 mmol) de 3,4,5-tricloro-anilina en lugar de anilina y 25 ml de xileno a reflujo. En este caso, el producto intermedio es N-(3,4,5-tricloro-fenil-4-hidroxi-bencil-amida. 0,50 g (1,5 mmol) del producto intermedio es O-alquilado usando 10 ml de acetona para producir ácido 2-[4-((((3,4,5-tricloro-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{16}Cl_{3}NO_{4}), 0,27 g (rendimiento 43%), punto de fusión 160ºC.

Ejemplo 12

El procedimiento de Ejemplo 7 es repetido usando 5,04 g (32 mmol) de HPAA, 6 ml (64 mmol) de 4-fluoro-anilina en lugar de anilina, y 25 ml de xileno a reflujo. En este caso, el producto intermedio es N-(4-fluoro-fenil)-4-hidroxi-bencilamida. 1,22 g (5 mmol) del producto intermedio son O - alquilados para producir ácido 2-[4-((((4 fluoro-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18} H_{18}FNO_{4}), 0.,4 g (rendimiento 45%), punto de fusión 198ºC.

Ejemplo 13

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 5,04 (32 mmol) de HPAA, 8,05 ml (64 mmol) de 4-trifluoro-metil-anilina en lugar de anilina, y 25 ml de xileno a reflujo. En este caso, el producto intermedio es N-(4-trifluoro-metil-fenil)-4 hidroxi bencilamida. 1,5 g (5 mmol) del producto intermedio son usados para producir ácido 2-[4-((((4 trifluoro-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{19}H_{18}F_{3}NO_{4}), 0,85 g (rendimiento 44%), punto de fusión 197ºC.

Ejemplo 14

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 5,04 (32 mmol) de HPAA, 8 g (65 mmol) de 4-metil anilina en lugar de anilina, y usando 25 ml de xileno a reflujo. En este caso el producto intermedio es N-(4-metil-fenil)-4-hidroxi bencil-amida 1,2 g (5 mmol) del producto intermedio se usaron para producir ácido 2-[4-((((4 metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{19}H_{21}N O_{4}), 0,98 g (rendimiento 65%), punto de fusión 164ºC.

Ejemplo 15

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 3,26 (21 mmol) de HPAA, 5,3 ml (42 mmol) de 3,5-dimetil-anilina en lugar de anilina, y 25 ml de xileno a reflujo. En este caso el producto intermedio es N-(3,5-dimetil-fenil)-4hidroxi-bencil-amida. 1,27 g (5 mmol) del producto intermedio se usaron para producir 2-[4-((((3,5 dimetil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}), 1,15 g (rendimiento 68%), punto de fusión 85ºC. Alternativamente, el procedimiento esbozado en la solicitud de patente alemana 2.432.560, que fue incorporado como referencia a la presente solicitud, puede ser seguido para producir el compuesto de este Ejemplo 15.

Ejemplo 16

El procedimiento del Ejemplo 7 es repetido usando 5,04 (32 mmol) de HPAA, 10 ml (64 mmol) de 4-isopropil-anilina en lugar de anilina, y usando 25 ml de xileno a reflujo. En este caso el producto intermedio es N-(4-iso-propil-fenil)-4-hidroxi-bencil-amida. 1,34 g (5 mmol) del producto intermedio, un líquido viscoso, semisólido y espeso, son usados para preparar ácido 2-[4-((((4-isopropil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{21}H_{25}NO_{4}), 1,1 g (rendimiento 61%), punto de fusión 141ºC.

Ejemplo 17

Con referencia a las Figuras 5A, 5B y 5C, se ilustra un esquema para preparar compuestos del Grupo IV. De conformidad con la Figura 5A, anilina o los derivados de anilina se pueden hacer reaccionar con fosgeno para obtener cloruro de carbamoílo. De acuerdo con la Figura 5B, la hidroquinona podría ser mono-acetilada usando anhídrido acético. El producto es luego O-alquilado usando acetona, CHCl_{3} y KOH y luego hidrolizada usando una base. Los productos de las reacciones de las Figuras 5A y 5B se pueden entonces hacer reaccionar de acuerdo con el esquema de reacción de la Figura 5C para producir los ácidos del Grupo IV 2-[4-((((arilamino)carbonil)oxi)fenoxi]-2-metil propiónicos.

Ejemplo 18

Como una alternativa al esquema de reacción descrito en el Ejemplo 7 y mostrado en la Figura 4, los compuestos del Grupo III pueden ser preparados de acuerdo con el esquema indicado en la Figura 6a. 5,2 g (32 mmol) de HPAA, 6,3 g (68 mmol) de anilina, y 25 ml de mesitileno son calentados a reflujo. 0,74 g (8 mmol) de pentacloruro de fósforo son añadidos a la mezcla del reflujo, y el reflujo es continuado durante unas dos horas adicionales. La mezcla de reacción es enfriada posteriormente, lavada con HCl diluido, agua y salmuera, y extraída con hidróxido de sodio acuoso, 2N NaOH. La capa de álcali combinada es lavada con éter, enfriada y acidificada para suministrar 7 g (rendimiento 90%) de amida de N-fenil-4-hidroxi-bencil-amida (C_{14}H_{12}NO_{2}) como producto intermedio, punto de fusión 138ºC. El producto intermedio es recristalizado de una mezcla 1:2 de acetona: éter de petróleo y una porción de 1,13 g (5 mmol) es O-alquilada. Son añadidos 1,6 g (30 mmol) de hidróxido de sodio pulverizado a una solución de N-fenil-4-hidroxi-benzamida (1,13 g, 5 mmol) en 20 ml de acetona. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y la acetona es retirada al vacío. El residuo es disuelto en 10 ml de agua y acidificado con HCl 2N para producir un sólido amarillo pálido. El sólido es separado, se disolvió en metanol, se pasó por carbón activado, y el disolvente se evaporó para proporcionar ácido 2[4-((((fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{19}NO_{4}), 1,2 g (un rendimiento de 76%), punto de fusión 198ºC. El último paso del procedimiento mostrado en la Figura 6a es la conversión del ácido a la sal sódica vía su reacción con bicarbonato de sodio. También pueden ser llevadas a cabo reacciones similares con otros cationes salino, como potasio y amonio, o reacciones para formar ésteres.

Ejemplo 19

La Figura 6b presenta un esquema de reacción similar al de la Figura 6a, excepto que es usado ácido 3-, en lugar de 4-, hidroxi-fenil-acético (HPAA) como material precursor, es por eso que el compuesto final tiene más bien una sustitución meta, en vez de una para. Además, más que hacerlo reaccionar con acetona (dimetil-cetona) se emplea una dietil-cetona para posiciones etilo, en lugar de metilo, con lo cual son estos restos los grupos de sustitución en uno de los anillos fenilos. Por ejemplo, 15 g (10 mmol) de 3-HPAA y 2,6 g (20 mmol) de 4-cloro-anilina en 20 ml de mesitileno fueron calentados a reflujo. Luego, 0,33 g (2,55 mmol) de solución de PCl_{5} fueron entonces añadidos despacio a la anterior solución del reflujo, y el reflujo fue continuado durante dos horas. La mezcla de reacción luego fue enfriada y entonces se trabajó como se describe más arriba para producir 2,2 g (un rendimiento de 90%) de 3-[((4 cloro-anilin)carbonil)metil]fenol. Como se describe arriba, bajo agitación fue añadido cloroformo (0,8 ml) a una mezcla enfriada con hielo de 1,23 gramo de 3-[((4 cloro-anilin)carbonil)metil]fenol y 1,6 g de NaOH en 15 ml de acetona. La mezcla de reacción se dejó calentarse hasta la temperatura ambiente y se continuó agitando durante 10 horas adicionales. La elaboración usual produjo ácido 2-[3-(((4-cloro-anilin)carbonil)metil)]fenoxi]-2-metil propiónico como un sólido pegajoso que funde a bajas temperatura, el análisis elemental C, H, Cl, N produjo (C_{18}H_{18}ClNO_{4}); NMR \delta PPM: 1,42 (6H, s, CH_{3}), 3,61 (2H, s, CH_{2} bencílico), y 6,6 - 7,75 (8H, m, H aromático). Sin embargo, en lugar de usar acetona como disolvente de reacción, puede ser usada dietil-cetona de la misma manera como se describió anteriormente para obtener la estructura de ácido butanoico (a diferencia de la del ácido propanoico) mostrada en la Figura 6b.

Ejemplo 20

Con referencia a la Figura 7a, es presentado un esquema de reacción general para preparar ácido 2-[-4-(amino-metil)fenoxi]-2-metil propiónico, un compuesto que es útil como precursor en la preparación de los compuestos del Grupo V. De conformidad con el esquema ilustrado, ácido (2 g, 9 mmol) 2-[4-ciano-fenoxi]-2-metil propiónico, preparado como se describe en el Ejemplo 2, y 75 ml de etanol fueron puestos en una botella Parr de hidrogenación de 250 ml. La solución fue luego acidificada con ácido clorhídrico concentrado (3 ml), fue añadido 10% paladio sobre carbón activado (0,2 g 10% p.) a la mezcla. La mezcla de reacción fue puesta en un aparato Parr de hidrogenación a 45 psi de presión de hidrógeno y agitada durante un período de dos horas. La mezcla fue filtrada para retirar el catalizador, y el filtrado se concentró al vacío. La adición de éter precipitó sal de hidrocloruro del producto deseado en forma de cristales blancos, brillantes (2,1 g, 87%).

Ejemplo 21

La Figura 7B ilustra un esquema general de reacción para preparar el grupo V de compuestos usados en la presente invención. De conformidad con la ilustración, fue añadida una solución de cloruro de benzoílo (0,14 g, 1 mmol) en THF (3 ml) durante un período de 15 minutos a una solución bajo agitación de ácido 2-[4(amino-metil)fenoxi]-2 metil-propiónico (0,24 g, 1 mmol) y NaOH (0,08 g, 2 mmol) en 10 ml de agua. Después de que se terminó la adición de cloruro de benzoílo, la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El THF fue evaporado al vacío. La acidificación del residuo suministró el compuesto deseado como un aceite que fue extraído con éter. La capa orgánica fue lavada con agua, salmuera, y secada sobre MgSO_{4} anhidro. La adición subsiguiente de éter de petróleo precipitó el ácido 2-[4-(benzoíl-amino)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{19}NO_{4}) en forma de un sólido blanco (0,15 g, 48%) de punto de fusión 176-179ºC.

NMR: (DMSO - \delta_{6}) \delta 1,45 (6H, s, 2CH_{3}), 4,4 (2H, d, CH_{2}), 6,8 - 7,2 (4H, dd, J = 9 Hz, H aromático, 7,4 - 8 (5 H, m, H aromático), 9, 1 H, br, t, NH).

Ejemplo 22

El procedimiento del Ejemplo 21 es repetido usando cloruro de 2-cloro-benzoílo (1 mmol) en lugar de cloruro de benzoílo. En este caso, el producto (un rendimiento de 58%) es ácido 2-[4-(((2-cloro-benzoílo)amino)metil)fenoxi]-2-metil propiónico, punto de fusión 135-137ºC, (C_{18}H_{18}ClNO_{4}).

Ejemplo 23

El procedimiento del Ejemplo 21 es repetido, excepto que 1 mmol de cloruro 3-cloro-benzoílo sustituye al cloruro de benzoílo. En este caso, el producto (un rendimiento de 53%) es ácido 2-[4-(((3-cloro-benzoílo)amino)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{18}ClNO_{4}), punto de fusión 145-146ºC.

Ejemplo 24

El procedimiento del Ejemplo 21 se repitió, excepto que 1 mmol de cloruro de 4-cloro-benzoílo sustituye al cloruro de benzoílo. En este caso, el producto (un rendimiento de 63%) es ácido 2-[4-(((4-cloro-benzoílo)amino)metil)fenoxi]-2-metil propiónico, (C_{18}H_{18}ClNO_{4}), punto de fusión 186-189ºC.

Ejemplo 25

El procedimiento de Ejemplo 21 es repetido, excepto que 1 mmol de cloruro 3,4-dicloro-benzoílo sustituye al cloruro de benzoílo. En este caso, el producto (un rendimiento de 57%) es ácido 2-[4-(((3,4-cloro-benzoílo)amino)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}NO_{4}), punto de fusión 186-189ºC.

Ejemplo 26

El procedimiento del Ejemplo 20 es repetido, excepto que 1 mmol de cloruro de 3,5-dicloro-benzoílo sustituye al cloruro de benzoílo. En este caso, el producto (un rendimiento de 43%) es ácido 2-[4-(((3,5-dicloro-benzoílo)amino)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}NO_{4}), punto de fusión 110-113ºC.

Ejemplo 27

El procedimiento del Ejemplo 20 es repetido, excepto que 1 mmol de cloruro de 3,4,5-tricloro-benzoílo sustituye al cloruro de benzoílo. En este caso, el producto es ácido 2-[4-(((3,4,5-tricloro-benzoílo) amino) metil) fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{16}Cl_{3}NO_{4}) de punto de fusión 151-152ºC.

Los ejemplos 1 hasta 27 dan una idea general de los procedimientos de síntesis para producir algunos compuestos dentro de la familia de compuestos definidos por la fórmula estructural general de la Figura 1a. Específicamente, los Ejemplos 1-19 revelan los procedimientos de síntesis de los compuestos de los grupos 1-4 dentro del subconjunto definido por la fórmula estructural de la Figura 1b, y los Ejemplos 20-27 revelan los procedimientos de síntesis de los compuestos del Grupo 5 dentro del subconjunto definido por la fórmula estructural de la Figura1c. La solicitud de patente de los EE.UU. Nº 07 / 623,346 a nombre de Abraham et al. presentada el 7 de diciembre de 1990, describe procedimientos de síntesis de los compuestos del Grupo 6 dentro del subconjunto definido por la fórmula estructural de la Figura 1c. Debe ser comprendido que los otros compuestos dentro de la familia de compuestos usada en la presente invención pueden fácilmente ser sintetizados cambiando los materiales de partida. Todos los compuestos dentro de la familia tendrían un modo similar de enlace y, deberían tener por tanto el efecto de desplazar el equilibrio alostérico de la hemoglobina hacia favorecer el estado de "T" de baja afinidad.

La amplia familia de compuestos considerados para uso en la presente invención incluye compuestos definidos por la fórmula:

3

en el que R_{2} es un aromático sustituido o no sustituido como fenilo, naftilo, o indanilo, o heterociclo aromático, o un compuesto de anillo alquílico sustituido o no sustituido, como ciclohexilo o adamantilo, o un compuesto ftalimida sustituido o no sustituido en el que X es un carboxilo, Y es un nitrógeno y R_{2} completa el compuesto de ftalimida estando enlazado tanto con X como con Y, y en el que X, Y, y Z son CH_{2}, NH, CO, O o N con la advertencia de que X, Y, y Z son restos cada uno diferente del otro, y en el que R_{1} tiene la fórmula:

4

en la que R_{1} puede estar conectado con cualquier posición sobre el anillo fenilo y R_{3} y R_{4} son hidrógeno, halógeno, grupos metilo o etilo y estos restos podrían ser los mismos o diferentes, o restos alquilos como parte de un anillo alifático que conecte R_{3} y R_{4}, y R_{5} es un hidrógeno, alquilo inferior como metilo, etilo o propilo, o un catión salino como sodio, potasio o amonio. En este extremo, los compuestos, que tienen un grupo naftilo, adamantilo o indanilo en R_{1} en lugar de fenil sustituido, como se muestra en la Figura 1a, se han preparado usando esencialmente las mismas rutas sintéticas como ya se describió anteriormente.

Para ensayar los compuestos de la presente invención en su actividad fisiológica, fue obtenida sangre humana del Banco Central de Sangre, Richmond, Virginia. Los métodos de extracción, cromatografía, y caracterización de hemoglobina aislada, usados por los inventores fueron idénticos a los descritos por Dozy & Huisman en J. of Chromatography, Vol 32, (1968) pp. 723 y en The Chromatography of Hemoglobin, H.J. Schroeder and D.H.J. Huisman, Ed. Marcel Dekker Inc. N.Y. (1980). La pureza de la hemoglobina normal (HbA) fue determinada por electroforesis de gel, usando una cámara Gelman de semimicroelectroforésis. La concentración de hemoglobina fue determinada de acuerdo con el método de la cian-met-hemoglobina descrito en Zijlstra, Clin. Chem. Acta., Vol 5, pp. 719-726 (1960), y en Zijlstra & Van Kamper, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Vol. 19, p. 521 (1981). Todas las disoluciones purificadas de hemoglobina fueron guardadas en nitrógeno líquido. Los reactivos y los búferes fueron adquiridos en las siguientes fuentes: Fischer Scientific, Sigma Chemical Company, y Pharmacia and Research Chemicals, Inc. lyse

Las curvas de equilibrio de oxígeno fueron determinados en un analizador de disociación de oxígeno AMINCO^{TM} HEM-O-SCAN disponible en los laboratorios Travenol. La HbA fue preparada de la siguiente manera: 20 ml de sangre entera de un donante no fumador (banco de sangre, Richmond, Virginia) fue pasada a un Vacutainer heparinizado. La sangre fue guardada inmediatamente en hielo (para prevenir la formación de Met-Hb) y luego centrifugada (10 minutos a 2500 rpm) para separar el plasma, y fue envasada la capa de leucocitos de los eritrocitos. Después de que fuese terminada la centrifugación, el plasma y la capa de leucocitos fueron retirados por aspiración, y las células lavadas tres veces con 0,9% de NaCl, que contenía 40 miligramos de EDTA/l, y luego una vez con NaCl 1,0% que contenía 40 miligramos de EDTA/l. Las células fueron desintegradas por adición de uno a dos volúmenes de agua deionizada que contenía 40 mg de EDTA/l. La mezcla se le dejó reposar 30 minutos con un mezclado ocasional, antes de ser centrifugada durante dos horas a 10,000 rpm, y 4ºC durante dos horas para quitar el estroma remanente de las células. El sobrenadante fue purificado por filtración con gel de Sephadex G - 25 o por diálisis versus búfer de pH 8,6 tris (50 mM, que contenía 40 mg. de EDTA/l). La solución de hemoglobina libre de cloruro de sodio fue cromatografiada en resina de intercambio iónico DEAE - Sephacel (sigma), preequilibrada con búfer (pH 8,6 Tris, 50 mM, que contenía 40 miligramos de EDTA/l), la fracción de HbA fue luego eluída con búfer pH 8,4 Tris. La fracción pura de HbA (identificada por electroforesis) fue concentrada usando un instrumento de bolsa de colodión de Schleicher y Schuell (Schleicher y Schuell, Inc.), con búfer HEPES (150 mM, pH 7,4), como búfer de intercambio. Luego la concentración de hemoglobina fue determinada usando el método referido anteriormente de ciano-met-hemoglobina. La concentración de hemoglobina generalmente se encontraba en ese momento alrededor de 35% g, o aproximadamente 5,5 mM. Una concentración de met-hemoglobina menor que 5% fue notada incluso después de varios días a 4ºC.

Todos los compuestos fueron mezclados con un equivalente de bicarbonato de sodio (NaHCO_{3}) (este proceso convierte el resto de ácido carboxílico a una sal sódica; véase la Fig. 6a), luego se disolvieron en el búfer HEPES para dar soluciones de 20 mM. Sólo antes de obtener la curva de equilibrio de oxígeno, la hemoglobina y el fármaco fueron mezclados en una proporción de 1:1 (50 \mul de hemoglobina más 50 \mul de fármaco) para dar 2,75 mM de hemoglobina con una concentración de fármaco de 10 mM. El control fue preparado por adición de 50 \mul de hemoglobina a 50 \mul del búfer HEPES.

La Figura 8 presenta el valor medido de P_{50}, el valor P_{50} del control, y la relación del valor de P_{50} medido respecto al control (P_{50} / P_{50}c) para la hemoglobina normal tratada con varios compuestos sintetizados. Es de notar que el valor P_{50} del control es inferior al de la hemoglobina normal bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo., 26,5) porque aquí el P_{50} se realizó respecto a la hemoglobina en solución (fuera de los glóbulos rojos). Cada muestra de hemoglobina tratada con uno de los compuestos, que caen dentro de la familia definida por la presente invención, tenía un valor de P_{50} del fármaco que era mayor que el P_{50} del control. Esta respuesta indica que el equilibrio alostérico para la hemoglobina ha sido desplazado hacia el favorecimiento del estado "T" de baja afinidad hacia el oxígeno de la hemoglobina debido a la presencia de los compuestos. En el fondo de la Figura 8, se presenta una fila (34) para el bezafibrato (BZF), un modificador alostérico de la hemoglobina conocido como "desplazador hacia la derecha". Al igual que con todos los modificadores de hemoglobina alostérico "desplazadores hacia la derecha" recién descubiertos, la hemoglobina tratada con BZF tenía un P_{50} superior para la muestra que el P_{50} del control. La Fig. 8 presenta diferentes restos R_{6-10} para los compuestos fenil sustituido ensayados, y cuando un compuesto no tenía un fenil sustituido, el nombre del compuesto se encuentra escrito a lo largo de R_{-6-10} (por ejemplo, naftilo, adamantilo, indanilo). Los restos R_{3-4} fueron grupos metilo en cada compuesto evaluado y el resto R_{5} fue un catión de sodio en cada compuesto evaluado (derivado del tratamiento con NaHCO_{3}, antes de hacer las pruebas). Debido a que otros compuestos dentro de la familia tendrían un modo similar de enlace (e.g, aquellos con diferentes restos R_{3-10}), puede ser esperado que su efecto sobre el valor de P_{50} sea el mismo. La estructura de ftalimida definida por las Figuras 16a-b y el Ejemplo 29 tendría un valor medio de P_{50} (por ejemplo, P_{50 \ Fármaco}/P_{50 \ Control}) de 1,08, lo que indica que el equilibrio alostérico para la hemoglobina fue desplazado hacia favorecer el estado "T" de baja afinidad hacia el oxígeno de la hemoglobina por el compuesto de ftalimida.

La Figura 9 indica el efecto que tienen algunos de los compuestos sobre la disociación de oxígeno de la hemoglobina normal en los glóbulos rojos humanos intactos (RBC, por las siglas de su expresión inglesa, Red Blood Cells). La primera anotación suministra el valor de P_{50} obtenido para un control RBC de ser humano a solas. Las próximas dos entradas proporcionan los valores P_{50} obtenidos cuando los RBC a los valores de una solución de milimolar (10 mM) están mezclados con la sal de sodio de cualquier ácido 2-[4-((((3,5 di-clorofenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}N O_{4}) (discutido en el Ejemplo 10) o ácido 2-[4((((3,5 dimetilofenil)amino)carbonil) metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}) (discutido en el Ejemplo 15), respectivamente. Nótese que los valores P_{50} de la hemoglobina en los RBC intactos tratados con los compuestos son en mucho mayores que el valor de P_{50} para la hemoglobina sin tratar en condiciones fisiológicas (es decir, que el control 27). Además, fue determinado que el valor de P_{50} fue elevado de 27 a 31 en presencia de 1 mM de ácido 2-[4((((3,5 di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico y hasta 42 en presencia de 2 mM de ácido 2-[4((((3,5 di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico. Estos datos establecen la permeabilidad de la membrana celular a los compuestos, y que la albúmina de suero no interfiere con la influencia del fármaco sobre la curva de disociación de oxígeno de la hemoglobina. Las entradas 23 y 24 en la Figura 9 suministran los valores P_{50} correspondientes a RBC intactas tratadas con 10 mM de los mismos dos compuestos usados en las entradas 21 y 22, respectivamente, excepto que las RBC fueron lavadas con un exceso en 240 veces de una solución salina al 0,9%. El descenso relativamente leve del valor de P_{50} después de la solución salina, el cual representa una retención alta del efecto alostérico, muestra que los compuestos usados en la presente invención tienen una alta afinidad enlazante a la hemoglobina.

La Figura 10 es un gráfico que ilustra las curvas de disociación de oxígeno producidas, cuando se evalúa una solución de 5,4 milimolar de hemoglobina normal a pH 7,4 usando HEPES como búfer en un analizador de disociación de oxígeno HEM-O-SCAN. Como se describió anteriormente, los valores de P_{50} mostrados en la Figura 8 fueron determinados a partir de curvas como las mostradas en la Figura 10. Con referencia especial a la Figura 10, el por ciento de saturación de oxígeno (sobre el eje vertical, SO_{2}, por las siglas de su expresión inglesa, Oxygen Saturation) se representa contra la presión parcial de oxígeno (sobre el eje horizontal, PO_{2}, por las siglas de su expresión inglesa, Pressure of Oxygen). La curva número 1 indica la curva de disociación de oxígeno (ODC, por las siglas de su expresión inglesa, Oxygen Dissociation Curve) en ausencia de un agente de modificación alostérico. La curva número 2 muestra que el ODC ha sido desplazado a la derecha cuando a la hemoglobina son añadidos 10 mM de bezafibrato (un conocido agente de desplazamiento a la derecha) solubilizado con una cantidad equimolar de NaHCO_{3}. Debe ser notado que cuando la curva es desplazada hacia la derecha a un estado de inferior afinidad hacia el oxígeno, aumenta el valor de P_{50}. La curva número 3 muestra el desplazamiento hacia la derecha causado añadiendo una concentración de 10 mM de ácido 2-[4-((((4 clorofenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{18}ClNO_{4}) (descrito en el Ejemplo anterior 8) a la hemoglobina. La curva número 4 muestra el desplazamiento hacia la derecha causado añadiendo una concentración 10 mM de ácido 2-[4-((((3,5-di-metil-fenil)amino)carbonil)metil) fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}) (descrito en el Ejemplo 15) a la hemoglobina. Finalmente, la curva número 5 muestra el desplazamiento hacia la derecha causado añadiendo una concentración 10 mM de ácido 2-[4-((((3,5 di-cloro-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}N O_{4}) (descrito en el Ejemplo 10) a la hemoglobina. El efecto de desplazamiento hacia la derecha mostrado en la Figura 10 indica que los compuestos pueden ser usados para bajar la afinidad hacia el oxígeno en la hemoglobina.

La Figura 11 ilustra el efecto de compuestos particulares sobre el ODC de sangre humana entera. De la misma manera que la Figura 10, el por ciento de saturación de oxígeno es representado contra la presión parcial de oxígeno. Como se describió anteriormente, los valores P_{50} informados en la Figura 9 fueron determinados de curvas como las mostradas en la Figura 11. Para obtener estas curvas, fueron mezclados 50 \mul de sangre humana entera con una solución de 50 \mul del compuesto de prueba en la memoria intermedia de HEPES a pH 7,4. La curva número 1 indica el ODC de hemoglobina en sangre entera sin reaccionar. Las curvas 2 y 3 ilustran el desplazamiento hacia la derecha provocado, respectivamente, por sales de una concentración de 10 mM de ácido 2-[4-((((3,5 di-metil-fenil)amino]carbonil]metil]fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}) (descrito en el Ejemplo 15) o una concentración de 10 mM de ácido 2-[4-((((3,5 di-cloro-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{18}H_{17}Cl_{2}NO_{4}) (descrito en el Ejemplo 10) sobre la hemoglobina en sangre entera.

La Figura 12 muestra las curvas de ODC de hemoglobina humana (5,4 mM) en la memoria intermedia de HEPES a pH 7,4 que fueron obtenidas de una manera similar a la descrita conjuntamente con la Figura 10. De la misma manera que las Figuras 10 y 11, el por ciento de saturación de oxígeno es representado contra la presión parcial de oxígeno. La curva número 1 indica la ODC de hemoglobina humana en ausencia de cualquier agente de modificación alostérica. Las curvas 2 y 3 muestran el desplazamiento hacia la derecha provocado por concentraciones de 1 mM y 10 mM de ácido 2-[4-((((3,5 di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}) (descrito en el Ejemplo 15) sobre la hemoglobina humana. Por tanto, este compuesto fuerza a la hemoglobina a un estado de inferior afinidad hacia el oxígeno. La curva número 4 indica el efecto del desplazamiento hacia la derecha de 2,5 mM de 2,3-difosfo-glicerato (2,3-DPG), que es un efector alostérico natural de la hemoglobina. La curva número 5 muestra el efecto combinado de dos efectores, por ejemplo., 1 mM de ácido 2-[4-((((3,5 di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi)-2-metil propiónico y 2,5 mM de 2,3- DPG, que resulta más grande que el obtenido con cualquier efector por separado. El efecto sinérgico puede ser utilizado de forma que cantidades más pequeñas de fármaco sean añadidas a la sangre.

La Figura 13 ilustra el utilidad del ácido 2-[4-((((3,5 di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (denominado RSR - 13) en la preservación de la afinidad hacia el oxígeno de la hemoglobina en la sangre durante almacenamiento. Fue añadido RSR-13, 1 mM y 2 mM, a muestras de RBC humanas (células almacenadas) que fueron guardadas a 4ºC en formulación de adsol estándar durante 40-70 días. Como puede ser visto de la Figura 13, la ODC de sangre sin tratar se desplaza hacia la izquierda en el transcurso del tiempo (demostrado por una caída del valor de P_{50}) a un estado de alta afinidad hacia el oxígeno. El aumento de la afinidad hacia el oxígeno de la sangre bajo almacenamiento es atribuido a una concentración reducida de 2,3- DPG. El valor de P_{50} de las muestras sin tratar mantenidas durante 40 días se desplazó hacia 32; sin embargo, muestras tratadas con 1 mM de RSR- 13 se quedaban relativamente iguales (P_{50} = 90) y las tratadas con 2 mM de RSR - 13 fueron desplazadas hacia la derecha (P_{50}= 45). La Figura 13 indica efectos similares dependientes de la concentración de RSR - 13 sobre las ODC de células mantenidas durante 50, 60, 70 días. Debido al metabolismo glicolítico, el pH de los glóbulos rojos sin tratar cayó durante un período de tiempo de 40 días de 6,85 a 6,6 para las muestras con 70 días de almacenamiento, y esto explicaría posiblemente el leve desplazamiento hacia la derecha en muestras sin tratar con 70 días de almacenamiento en comparación con las muestras a los 40 días de almacenamiento bajo el efecto Bohr. El pH de los glóbulos rojos tratados con RSR - 13 fue constantemente inferior que el de las muestras sin tratar, lo que sugería que RSR-13 reduciría favorablemente la tasa del metabolismo glicolítico. El RSR-13 no tenía ningún efecto adverso sobre la estabilidad de las RBC como se demuestra por los recuentos consecuentes de RBC en las muestras tratadas y sin tratar. De forma semejante, la cantidad de hemólisis era consecuente en las muestras tanto tratadas como las sin tratar de las células almacenadas.

La Figura 14 indica los porcentajes de oxígeno, \DeltaY, entregados por las células almacenadas. Los cambios en la saturación de oxígeno, \DeltaY, fueron calculados por la ecuación de Hill (discutida en Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 1975, Chapter 4, pp, 71-94, que es incluida en la presente solicitud como referencia), a 100 hasta 30 torr. La columna 1 indica los \DeltaY (59) que corresponden a los glóbulos rojos almacenados sin tratar. La columna 2 indica los \DeltaY (50) de glóbulos rojos almacenados guardados durante 40 días a 4ºC en la mejor formulación adsol disponible. La columna 3 muestra que \DeltaY = 58 para las células almacenadas durante 40 días tratadas con RSR-13 (1 mM), lo cual era comparable a las células frescas almacenadas. Nótese que el decrecimiento (aproximadamente 10%) en la entrega de oxígeno por las células almacenadas es corregido por la adición de 1 mmol de RSR - 13.

La Figura 15 muestra el cambio en los valores de P_{50} de glóbulos rojos almacenados, caducados, en el tratamiento con ácido 2-[4-((((3,5-di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (RSR - 13). 50 \mul de glóbulos rojos con 40, 50, y 60 días de almacenamiento fueron mezclados con 50 \mul de RSR - 13 para obtener concentraciones finales de RSR - 13 de 1 mmol y 2 mmol. Las muestras de control fueron preparadas mezclando a razón de 1:1 las células almacenadas y el búfer. Como se puede ver en la Figura 15, el valor P_{50} de las muestras sin tratar fue constantemente inferior al de las muestras tratadas con RSR - 13. Además, la comparación de los resultados de glóbulos rojos frescos con glóbulos rojos que fueron envejecidos durante 40, 50, y 60 días indica una disminución rápida en el valor de P_{50} con la tiempo. Los valores de P_{50} de muestras de glóbulos rojos, tratados con 1 mmol de RSR - 13, a los 40, 50 y 60 días fueron comparables con el valor de P_{50} = 38 encontrado para los glóbulos rojos frescos. Estos resultados muestran que la adición de RSR - 13 a los glóbulos rojos sometidos a almacenamiento restaura la afinidad hacia el oxígeno de los glóbulos.

Ya que los compuestos considerados por la presente invención son capaces de la modificación alostérica de la hemoglobina con el propósito de que sea favorecido el estado de "T" de baja afinidad hacia el oxígeno (desplazamiento hacia la derecha de la curva de equilibrio, como lo demuestra la columna de P_{50} en la Figura 8-9), estos compuestos serán útiles en el tratamiento de una variedad de estados de enfermedad en mamíferos incluyendo seres humanos, en los que los tejidos sufren de baja tensión de oxígeno, como cáncer e isquemia. Como señalan Hirst et al. en Radiat. Res., Vol. 112, (1987), pp. 164, se ha demostrado que la disminución de la afinidad al oxígeno de la hemoglobina en la sangre en circulación es beneficiosa en la radioterapia de tumores. Los compuestos pueden ser administrados a pacientes, en los que la afinidad de la hemoglobina hacia el oxígeno sea excepcionalmente alta. Las condiciones particulares incluyen ciertos hemoglobinopatías y ciertos síndromes de afecciones respiratorias en bebés recién nacidos agravados por niveles de hemoglobina fetal alta, y cuando es reducida la disponibilidad de hemoglobina/oxígeno para los tejidos, (por ejemplo, en afecciones isquémicas como enfermedad vascular periférica, obstrucción coronaria, accidentes vasculares cerebrales, o trasplante de tejidos). Los compuestos también pueden ser usados para impedir la agregación de plaquetas y pueden ser usados para propósitos antitrómbicos y curación de heridas. La aplicación tópica podría ser usada para la curación de heridas. Además, los compuestos pueden ser usados para tratar trastornos relacionados con baja cantidad de oxígeno en el cerebro, como la enfermedad de Alzheimer, depresión y esquizofrenia. Puede ser deseable administrar los compuestos a un paciente antes de, y/o simultáneamente con, la transfusión de sangre entera tratada o de glóbulos rojos a fin de evitar diferencias sustanciales en la afinidad hacia el oxígeno de la hemoglobina debido a la dilución, las que ocurren cuando se administra la sangre.

Los compuestos pueden ser añadidos a la sangre entera o a células almacenadas preferentemente en el momento de almacenamiento, o en el momento de transfusión, a fin de facilitar la disociación del oxígeno de la hemoglobina y mejorar la capacidad de entrega de oxígeno por la sangre. Preferentemente, los compuestos serían añadidos en una cantidad desde aproximadamente 50 mg hasta 1 g por unidad de sangre (473 ml) o a unidad de células almacenadas (235 ml). Cuando la sangre se almacena, la hemoglobina en sangre tiende a incrementar su afinidad hacia el oxígeno perdiendo 2,3-difosfo-glicéridos. Como se describió anteriormente, los compuestos de la presente invención son capaces de deshacer y/o prevenir la anormalidad funcional de hemoglobina, que se observa cuando son almacenadas sangre entera o células envasadas. Los compuestos pueden ser añadidos a sangre entera o a fracciones de glóbulos rojos en un sistema cerrado que use un recipiente apropiado, en el que el compuesto es puesto antes del almacenamiento, o que está presente en la solución de anticoagulante en la bolsa de recolección de la sangre.

La administración puede ser realizada de forma oral, por inyección intravenosa, intraperitoneal, o rectal dentro de un supositorio, donde la dosis y el régimen de medicación son variadas de acuerdo con la sensibilidad individual y el tipo de estado de enfermedad que está siendo tratada. Los estudios con ratones han mostrado que es tolerada bien una dosis de mg/kg/día de ácido 2-[4((((3,5 di-metil-fenil)amino)carbonil)metil)fenoxi]-2-metil propiónico (C_{20}H_{23}NO_{4}) (discutido ya en el Ejemplo 15) administrado por vía intraperitoneal. Si los compuestos son usados para la curación de heridas, los compuestos podrían ventajosamente ser aplicados tópicamente directamente al área de herida. Además, los compuestos pueden ser mezclados con sangre afuera del cuerpo de un paciente antes de, y/o simultáneamente con, una transfusión. Los compuestos pueden ser administrados en forma pura o en una formulación aceptable farmacéuticamente incluyendo elíxires, aglutinantes apropiados, y análogos, o como sales aceptables y otros derivados farmacéuticos. Debe ser comprendido que las formulaciones aceptables farmacéuticamente y las sales incluyen materiales líquidos y sólidos convencionalmente utilizados para preparar fórmulas de dosis inyectables y fórmulas de dosis sólidas como las pastillas y cápsulas. El agua puede ser usada para los preparados de composiciones inyectables que también pueden incluir búferes convencionales y agentes volver la composición inyectable isotónica. Diluentes sólidos y excipientes incluyen almidón de lactosa, agentes desintegrantes convencionales, reecubrimientos.

Claims

1. Un compuesto con la fórmula estructural general (I),

5

en la que X, Y, y Z son CH_{2}, NH, CO, O, o N con la advertencia de que los restos X, Y, y Z son diferentes uno del otro,

en la que R_{1} tiene la fórmula

6

en la que R_{1} puede estar conectado a cualquier posición del anillo fenilo, y R_{3} y R_{4} son hidrógeno, halógeno, grupos metilo o etilo y estos restos podrían ser los mismos o diferentes, o restos alquílicos como parte de un anillo alifático conectando R_{3} y R_{4}, y

en la que R_{5} es un hidrógeno, halógeno, alquilo inferior C_{1-3}, o un catión salino,

caracterizado porque

R_{2} es un resto aromático que tiene la fórmula

7

2. Un compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque X y Z son CH_{2}, NH, CO o O, e Y es CO o NH.

3. Una composición que comprende un compuesto según la reivindicación 1 o 2.

4. Uso de la composición según la reivindicación 3 para la fabricación de un medicamento.

5. Uso según la reivindicación 4, en la que el medicamento es un medicamento para el tratamiento de enfermedades que involucren deficiencia de oxígeno, isquemia, cáncer, hemoglobinopatías y trastornos relacionados con baja entrega de oxígeno al cerebro y la curación de heridas.

6. Uso de la composición según la reivindicación 3 en la preparación de sustitutos de la sangre fuera de un cuerpo humano o animal.

7. Uso de la composición según la reivindicación 3 en el almacenamiento de sangre fuera de un cuerpo humano o animal.